CN113736677B - 高产生育三烯酚的重组解脂亚罗酵母、其构建方法及应用 - Google Patents

高产生育三烯酚的重组解脂亚罗酵母、其构建方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供高产生育三烯酚的重组解脂亚罗酵母，所述重组解脂亚罗酵母含有生育三烯酚合成底物香叶基香叶基二磷酸(GGPP)积累的关键基因和经密码子优化的生育三烯酚合成基因，所述经密码子优化的生育三烯酚合成基因编码的蛋白质为2‑甲基‑6‑香叶基香叶基苯醌甲基转移酶、生育酚环化酶和γ‑生育酚甲基转移酶。本发明通过实验确认所得重组菌株进行发酵培养，总生育三烯酚的产量最高可达到2423.7μg/g DCW，其中其中γ‑生育三烯酚含量为1675.2μg/g DCW，α‑生育三烯酚的含量为748.5μg/g DCW，显著高于现有研究的最高产量。

Description

高产生育三烯酚的重组解脂亚罗酵母、其构建方法及应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，特别涉及一种高产生育三烯酚的重组解脂亚罗酵母，还涉及所述菌株的构建方法及应用。
技术背景
维生素E是两亲性分子，也是一种异戊二烯醌醇类的强氧化剂。维生素E包含生育酚和生育三烯酚两种不同类型，它们都具有苯并二氢吠喃衍生物的结构，由一个细胞膜上的极性芳香环头部和膜脂相关的疏水性尾巴组成。它们的主要差别在于它们碳水化合物类异戊二烯基侧链尾部结构的饱和程度上，生育酚三烯(tocotrienol)在碳3,7和11的位置上各有一个反式双键，而生育酚(tocopherol)是饱和的。而根据芳香环上甲基的数量和位置的区别，每种类型又有4种不同的组分，即α、β、γ、δ四种。
最近研究表明，生育三烯酚可能具有更好的降低胆固醇、预防糖尿病、促进骨吸收(生育三烯酚独有)、抗氧化、抗癌、抗炎症、心脏保护和神经保护等功能。尽管生育三烯酚占VE家族成员的半数，但对其研究尚少。生育三烯酚产品主要从油棕(Elaeis guineensis)果实里的粗棕桐油中提取，由于其来源比较稀少，目前市场价格高昂，相关产品也比较少，随着人们对生育三烯酚强大功能认知度的增加，生育三烯酚的市场需求也会越来越大。开展生育三烯酚的研究，改良植物生育三烯酚含量和组成成分将有利于功效的进一步发挥。其中利用基因工程改良是有效合成生育三烯酚的方法之一。德国斯图加特大学的研究人员通过引入光合生物来源的生育三烯酚合成途径基因，对大肠杆菌进行了代谢改造，获得了产15μg/g(细胞干重)δ-生育三烯酚的工程菌株[ALBERMANN C,GHANEGAONKAR S,LEMUTH K,etal.Biosynthesis of the vitamin E compound delta-tocotrienol in recombinantEscherichia coli cells[J].Chembiochem,2008,9(15):2524-33.]。该课题组在2013年又通过基因组整合和增强MEP途径，构建了产1425μg/g(细胞干重)生育三烯酚共同前体MGGBQ的工程菌株[GHANEGAONKAR S,CONRAD J,BEIFUSS U,et al.Towards the in vivoproduction of tocotrienol compounds:engineering of a plasmid-free Escherichiacoli strain for the heterologous synthesis of 2-methyl-6-geranylgeranyl-benzoquinol[J].J Biotechnol,2012,164(2):238-47.]。另外国内于洪魏团队沈斌的研究中[沈斌.酿酒酵母中异源合成维生素E(生育三烯酚)的研究[D].浙江大学,2019.]，结合酿酒酵母中内源的莽草酸途径和MVA途径，构建出异源合成维生素E(生育三烯酚)的代谢途径，以酿酒酵母为研究平台，克隆来源于拟南芥的关键基因并结合密码子优化，获得了244.2μg/g干重的产量，其中γ-生育三烯酚的产量为172.9μg/g干重，α-生育三烯酚为71.3μg/g干重。
针对上述现有生育三烯酚合成方法不明确、产量低的问题，本发明根据目前已清晰的生育三烯酚的合成途径，以解脂亚罗酵母菌为研究平台，对生育三烯酚合成关键基因2-甲基-6-香叶基香叶基苯醌甲基转移酶、生育酚环化酶和γ-生育酚甲基转移酶进行基因挖掘并结合密码子优化，在此基础上过表达生育三烯酚合成途径中的关键基因BrHPPD，GaHPT，SmMPBQMT，DcTC和Boγ_TMT，以及生育三烯酚合成底物香叶基香叶基二磷酸(GGPP)积累的关键基因HMG1和CrtE，以期进一步提高生育三烯酚的产量。
发明内容
本发明的目的是进一步提高生育三烯酚的产量，通过选择更优的生育三烯酚合成关键基因2-甲基-6-香叶基香叶基苯醌甲基转移酶、生育酚环化酶和γ-生育酚甲基转移酶，同时过表达生育三烯酚合成途径中的关键基因BrHPPD，GaHPT，SmMPBQMT，DcTC和Boγ_TMT，以及生育三烯酚合成底物香叶基香叶基二磷酸(GGPP)积累的关键基因HMG1和CrtE。提供高产生育三烯酚的重组解脂亚罗酵母。
为了实现上述目的，本发明提供高产生育三烯酚的重组解脂亚罗酵母，所述重组解脂亚罗酵母含有重组质粒，所述重组质粒含有生育三烯酚合成底物香叶基香叶基二磷酸(GGPP)积累的关键基因和经密码子优化的生育三烯酚合成基因，所述生育三烯酚合成底物香叶基香叶基二磷酸(GGPP)积累的关键基因为HMG1和CrtE，所述经密码子优化的生育三烯酚合成基因编码的蛋白质为2-甲基-6-香叶基香叶基苯醌甲基转移酶、生育酚环化酶和γ-生育酚甲基转移酶。
在本发明中，所述2-甲基-6-香叶基香叶基苯醌甲基转移酶来自核桃、花生、山嵛菜、木豆或卷柏；所述生育酚环化酶来自荠菜、山嵛菜、甘蓝、油菜、柑橘或石斛；所述γ-生育酚甲基转移酶来自荠菜、山嵛菜、甘蓝和油菜。
根据一种特别优选的实施方式，所述2-甲基-6-香叶基香叶基苯醌甲基转移酶来自卷柏，其密码子优化序列如SEQ ID NO.1所示；所述生育酚环化酶来自石斛，序列如SEQID NO.2所示；所述γ-生育酚甲基转移酶来自甘蓝，序列如SEQ ID NO.3所示。
基于此，本发明还提供上述重组解脂亚罗酵母的构建方法，所述方法包括以下步骤：
(1)构建含有HPPD基因和HPT基因的解脂亚罗酵母工程菌
获取并合成来源于油菜的HPPD基因(BrHPPD)和来源于蓝藻的HPT基因(GaHPT)序列，与载体ploxpura3loxp经酶切连接获得重组质粒ploxpura3loxp-BrHPPD-GaHPT，将重组质粒酶切线性化后，采用酵母转化试剂盒方法转入解脂亚罗酵母工程菌polf中，获得重组菌株polf-BHGH，所得重组菌株经通过菌落PCR验证正确；
(2)构建含有2-甲基-6-香叶基香叶基苯醌甲基转移酶基因的重组质粒
获取并合成来源于核桃(JrMPBQMT)、花生(AhMPBQMT)、山嵛菜(EsMPBQMT)、木豆(CcMPBQMT)和卷柏(SmMPBQMT)的2-甲基-6-香叶基香叶基苯醌甲基转移酶基因序列，分别以NdeⅠ/SpeⅠ为酶切位点双酶切载体ploxpura3loxp和所述2-甲基-6-香叶基香叶基苯醌甲基转移酶基因，分别连接获得重组质粒ploxpura3loxp-JrMPBQMT、ploxpura3loxp-AhMPBQMT、ploxpura3loxp-EsMPBQMT、ploxpura3loxp-CcMPBQMT和ploxpura3loxp-SmMPBQMT，将所得重组质粒用限制性酶SmaI酶切线性化，采用酵母转化试剂盒方法转入解脂亚罗酵母工程菌polf-BHGH中，分别获得重组菌株1、2、3、4、5，所得重组菌株经通过菌落PCR验证正确；
(3)构建含有生育酚环化酶基因的重组质粒
获取并合成来源于荠菜(CrTC)、山嵛菜(EsTC)、甘蓝(BoTC)、油菜(BnTC)、柑橘(CcTC)和石斛(DcTC)的生育酚环化酶基因序列，分别以NdeⅠ/SpeⅠ为酶切位点双酶切载体ploxpura3loxp和所述生育酚环化酶基因，分别连接获得重组质粒ploxpura3loxp-CrTC、ploxpura3loxp-EsTC、ploxpura3loxp-BoTC、ploxpura3loxp-BnTC、ploxpura3loxp-CcTC和ploxpura3loxp-DcTC，所得重组质粒分别用限制性酶SmaI酶切线性化，通过酵母转化试剂盒方法分别转入步骤(1)得到的重组菌株1-5中，获得重组菌株6、7、8、…、34、35，所得重组菌株经通过菌落PCR验证正确；
(4)构建含有γ-生育酚甲基转移酶基因的重组质粒
获取并合成来源于荠菜(Crγ-TMT)、山嵛菜(Esγ-TMT)、甘蓝(Boγ-TMT)和油菜(Bnγ-TMT)的γ-生育酚甲基转移酶基因序列，分别以NdeⅠ/SpeⅠ为酶切位点双酶切载体ploxpura3loxp和γ-生育酚甲基转移酶基因，分别连接获得重组质粒ploxpura3loxp-Crγ-TMT、ploxpura3loxp-Esγ-TMT、ploxpura3loxp-Boγ-TMT和ploxpura3loxp-Bnγ-TMT，所得重组质粒分别用限制性酶SmaI酶切线性化，采用酵母转化试剂盒方法转入步骤(3)的重组菌株6-35中，获得高产生育三烯酚的重组解脂亚罗酵母。
作为一种特别优选的实施方式，构建重组解脂亚罗酵母时，包括以下步骤：
(1)构建含有HPPD基因和HPT基因的解脂亚罗酵母工程菌
获取并合成来源于油菜的HPPD基因(BrHPPD)和来源于蓝藻的HPT基因(GaHPT)序列，与载体ploxpura3loxp经酶切连接获得重组质粒ploxpura3loxp-BrHPPD-GaHPT，将重组质粒酶切线性化后，采用酵母转化试剂盒方法转入解脂亚罗酵母工程菌polf中，获得重组菌株polf-BHGH，所得重组菌株经通过菌落PCR验证正确；
(2)构建含有2-甲基-6-香叶基香叶基苯醌甲基转移酶基因的重组质粒
获取并合成来源于卷柏(SmMPBQMT)的2-甲基-6-香叶基香叶基苯醌甲基转移酶基因序列，以NdeⅠ/SpeⅠ为酶切位点双酶切载体ploxpura3loxp和所述2-甲基-6-香叶基香叶基苯醌甲基转移酶基因，分别连接获得重组质粒ploxpura3loxp-SmMPBQMT，将所得重组质粒用限制性酶SmaI酶切线性化，采用酵母转化试剂盒方法转入解脂亚罗酵母工程菌polf-BHGH中，获得重组菌株5，所得重组菌株经菌落PCR验证正确；
(3)构建含有生育酚环化酶基因的重组菌株
获取并合成来源于石斛(DcTC)的生育酚环化酶基因序列，以NdeⅠ/SpeⅠ为酶切位点双酶切载体ploxpura3loxp和所述生育酚环化酶基因，连接获得重组质粒ploxpura3loxp-DcTC，所得重组质粒用限制性酶SmaI酶切线性化，通过酵母转化试剂盒方法分别转入步骤(2)得到的重组菌株5中，获得重组菌株35，所得重组菌株经菌落PCR验证正确；
(4)构建含有γ-生育酚甲基转移酶基因的重组菌株
获取并合成来源于甘蓝(Boγ-TMT)的γ-生育酚甲基转移酶基因序列，分别以NdeⅠ/SpeⅠ为酶切位点双酶切载体ploxpura3loxp和γ-生育酚甲基转移酶基因，连接获得重组质粒ploxpura3loxp-Boγ-TMT，所得重组质粒分别用限制性酶SmaI酶切线性化，采用酵母转化试剂盒方法转入步骤(2)的重组菌株35中，获得重组菌株38，所得重组菌株经菌落PCR验证正确；
(5)构建含有HMG1和CrtE基因的重组菌株
获取并合成HMG1和CrtE基因序列，设计引物从解脂亚罗酵母工程菌po1f的基因组DNA扩增目的片段，所得目的片段连接到载体pJN44的多酶切位点上，分别得到质粒pJN44-HMG1和pJN44-CrtE；所得质粒分别转入菌株38中，获得重组菌株40，所得重组菌株经菌落PCR验证正确；
(6)目的基因的过表达
将前述获得的目的基因BrHPPD，GaHPT，SmMPBQMT，DcTC和Boγ_TMT分别连接到载体pJN44的多酶切位点上，分别得到质粒pJN44-BrHPPD，pJN44-GaHPT，pJN44-SmMPBQMT，pJN44-DcTC，和pJN44-Boγ_TMT；将获得的质粒通过酶切验证后转入步骤(5)的重组菌株40中，得到高产生育三烯酚的重组解脂亚罗酵母，所得重组菌株经菌落PCR验证正确。
在本发明中，作为一种优选的实施方式，所述方法还包括步骤(7)去除ura3标记：
所得重组解脂亚罗酵母在SD-LEU培养基上培养，所述SD-LEU培养基上生长的单菌落即为高产生育三烯酚的重组解脂亚罗酵母。
在本发明中，ploxpura3loxp载体可参见《重组解脂亚罗酵母合成菜油甾醇的研究》(谭思远)中的记载，pJN44载体可参见《重组解脂亚罗酵母合成微生物油脂的研究(董桂茹)中的记载。
在本发明中，菌落PCR验证的反应体系如下：
反应体系：
Figure BDA0003255485700000061
PCR程序：
Figure BDA0003255485700000062
Figure BDA0003255485700000071
本发明的重组解脂亚罗酵母用于生产生育三烯酚中，在α-生育三烯酚与γ-生育三烯酚的生产中都具备显著优势。
本发明通过分别构建经密码子优化的不同来源的生育三烯酚合成基因2-甲基-6-香叶基香叶基苯醌甲基转移酶、生育酚环化酶和γ-生育酚甲基转移酶重组质粒；将重组质粒整合至工程菌基因组中，筛选在SD-LEU培养基上长出的单菌落，去除ura3标记即得到提高生育三烯酚产量的重组菌。在此基础上过表达生育三烯酚合成途径中的关键基因BrHPPD，GaHPT，SmMPBQMT，DcTC和Boγ_TMT，以及生育三烯酚合成底物香叶基香叶基二磷酸(GGPP)积累的关键基因tHMG1和CrtE。通过比较发现，重组菌株41进行发酵培养生产生育三烯酚，总生育三烯酚的产量最高可达到2423.7μg/g DCW，其中其中γ-生育三烯酚含量为1675.2μg/g DCW，α-生育三烯酚的含量为748.5μg/g DCW，显著高于现有研究的最高产量2085.3μg/g DCW。
【附图说明】
图1生育三烯酚生物合成途径；
图2各重组菌株γ-生育三烯酚含量比较；
图3各重组菌株各类生育三烯酚含量比较。
【具体实施方式】
以下实施例用于非限制性地解释本发明的技术方案。
在本发明中，如无特殊说明，用于说明浓度的“％”均为质量百分比，用于说明用量比例的“：”均为质量比。
本发明涉及以下培养基：
SD-LEU培养基：葡萄糖2％，(NH4)2SO4 0.5％，YNB 0.17％，Drop-out mixsynthetic minus leucil w/o yeast nitrogen base 0.2％，固体培养基另加入2.5％的琼脂粉，于121℃高压蒸汽灭菌20min。
YPD液体培养基：葡萄糖2％，酵母粉1％，蛋白胨2％，酪氨酸0.1％，于121℃高压蒸汽灭菌20min。
本发明涉及以下基因：
表1 2-甲基-6-香叶基香叶基苯醌甲基转移酶基因及其来源
Figure BDA0003255485700000081
表2生育酚环化酶基因及其来源
Figure BDA0003255485700000082
表3γ-生育酚甲基转移酶及其来源
Figure BDA0003255485700000083
本发明涉及以下引物：
Figure BDA0003255485700000084
Figure BDA0003255485700000091
本发明涉及的菌落PCR验证的反应体系如下：
反应体系：
Figure BDA0003255485700000092
PCR程序：
Figure BDA0003255485700000101
实施例1构建含有2-甲基-6-香叶基香叶基苯醌甲基转移酶(MPBQMT)基因的重组质粒
从NCBI上获取来源于油菜的HPPD基因(BrHPPD)(Gene ID：103843547)和来源于蓝藻的HPT基因(GaHPT)序列(GenBank:MBR8827918.1)，送生工优化合成后与载体ploxpura3loxp经酶切连接获得重组质粒ploxpura3loxp-BrHPPD-GaHPT，将重组质粒酶切线性化后，采用酵母转化试剂盒方法转入解脂亚罗酵母工程菌polf中，获得重组菌株polf-BHGH，验证方法采用菌落PCR的方式。
根据表1的记载，从NCBI上获取来源于核桃(JrMPBQMT)、花生(AhMPBQMT)、山嵛菜(EsMPBQMT)、木豆(CcMPBQMT)和卷柏(SmMPBQMT)的MPBQMT基因序列，送生工优化合成。
分别以NdeⅠ/SpeⅠ为酶切位点双酶切载体ploxpura3loxp和基因MPBQMT并连接获得重组质粒ploxpura3loxp-JrMPBQMT、ploxpura3loxp-AhMPBQMT、ploxpura3loxp-EsMPBQMT和ploxpura3loxp-CcMPBQMT和ploxpura3loxp-SmMPBQMT。将以上重组质粒用限制性酶SmaI酶切线性化，采用酵母转化试剂盒方法转入解脂亚罗酵母工程菌polf-BHGH中，获得重组菌株1、2、3、4、5，通过菌落PCR的方式验证正确。
重组菌株1-5基因型为：
Figure BDA0003255485700000102
Figure BDA0003255485700000111
实施例2构建含有生育酚环化酶(TC)基因的重组质粒
根据表2的记载，从NCBI上获取来源于荠菜(CrTC)、山嵛菜(EsTC)、甘蓝(BoTC)、油菜(BnTC)、柑橘(CcTC)和石斛(DcTC)的TC基因序列，送生工优化合成。分别以NdeⅠ/SpeⅠ为酶切位点双酶切载体ploxpura3loxp和基因TC并连接获得重组质粒ploxpura3loxp-CrTC、ploxpura3loxp-EsTC、ploxpura3loxp-BoTC、ploxpura3loxp-BnTC、ploxpura3loxp-CcTC和ploxpura3loxp-DcTC，将以上重组质粒用限制性酶SmaI酶切线性化，采用酵母转化试剂盒方法分别转入上述重组菌株中，获得重组菌株6、7、8…34、35，通过菌落PCR的方式验证正确。
重组菌株6-35基因型为：
Figure BDA0003255485700000112
Figure BDA0003255485700000121
通过检测发酵液中γ-生育三烯酚的含量，筛选出高产γ-生育三烯酚的重组菌株。检测方法如下：
检测样品的制备:取1mlSD发酵液于1.5ml离心管中，12000rpm离心5min，取上清于新的离心管，并加入40ml冰醋酸，再用0.22um水系针孔式滤头过滤。
HPLC检测条件:流动相:0.01M KH2PO4溶液(A)和甲醇(B)；比例:90％A/10％B；流速:0.8ml/min；检测波长:290nm；色谱柱:YMC-Pack ODS-AQ(4.6×250mm)。
标准曲线制备方法如下：
γ-生育三烯酚标准曲线的制作：用万分之一天平称取10mgγ-生育三烯酚，溶于10ml纯甲醇溶液中，浓度定为1g/L的母液，依次用纯甲醇溶液梯度稀释，稀释得到浓度分别为250mg/L，100mg/L,50mg/L，20mg/L,5mg/L的γ-生育三烯酚溶液，并用相同的方法再稀释出两批同浓度的γ-生育三烯酚溶液，对所有样品经0.22um有机系针孔式滤头过滤，再进行HPLC分析。
结果如图2所示，比较各重组菌株的生育三烯酚含量，发现重组菌株35的γ-生育三烯酚含量最高，为2014.5μg/g DCW，因此选择来源于卷柏的MPBQMT基因和石斛的TC基因构建的重组菌株35(polf-BHGH-SmMPBQMT-DcTC)进行后续研究。
实施例3构建表达含有γ-生育酚甲基转移酶的重组菌株
根据表3的记载从NCBI上获取来源于荠菜(Crγ-TMT)、山嵛菜(Esγ-TMT)、甘蓝(Boγ-TMT)和油菜(Bnγ-TMT)的γ-TMT基因序列，送生工优化合成。分别以NdeⅠ/SpeⅠ为酶切位点双酶切载体ploxpura3loxp和基因TC并连接获得重组质粒ploxpura3loxp-Crγ-TMT、ploxpura3loxp-Esγ-TMT、ploxpura3loxp-Boγ-TMT和ploxpura3loxp-Bnγ-TMT，将以上重组质粒用限制性酶SmaI酶切线性化，采用酵母转化试剂盒方法分别转入重组菌株35(polf-BHGH-SmMPBQMT-DcTC)中，获得重组菌株36、37、38、39，所得菌株经PCR验证正确。
重组菌株36-39的基因型为：
Figure BDA0003255485700000131
通过检测发酵液中α-生育三烯酚的含量，来筛选生育三烯酚含量最高的重组菌株，HPLC检测方法同γ-生育三烯酚方法，标准曲线制备方法同γ-生育三烯酚标准曲线的制作。
α-生育三烯酚的含量检测方法如下：
将各重组菌株在添加0.1％(w/v)酪氨酸的50ml YPD液体培养基中，220rpm 30℃恒温摇床里培养96h，然后取5ml发酵液离心并收集菌体，研磨破胞后，用2ml丙酮分两次萃取，离心取上清，过滤后，进HPLC分析。以丙酮为提取溶剂，从发酵液中萃取生育三烯酚。
表4各重组菌株发酵液中各种生育三烯酚含量
Figure BDA0003255485700000132
结果如图3、表4所示，重组菌株38(polf-BHGH-SmMPBQMT-DcTC-Boγ_TMT)的α-生育三烯酚含量最高，达到453.6μg/g DCW，γ-生育三烯酚含量为1260.9μg/g DCW。由此可见，来源于卷柏的MPBQMT基因(序列如SEQ ID NO.1所示)、石斛的TC基因(序列如SEQ IDNO.2所示)和来源于甘蓝的γ-TMT基因(序列如SEQ ID NO.3所示)构建的重组菌株所得生育三烯酚产量最高，总量达到1714.5μg/g DCW，显著优于现有技术的记载。
实施例4过表达关键基因
根据NCBI数据库中HMG1和CrtE基因序列(GeneID:854900，GeneID:37543877)设计引物从Y.lipolytica po1f菌株的基因组DNA扩增目的片段。将目的片段连接到载体pJN44的多酶切位点上，分别得到质粒pJN44-HMG1和pJN44-CrtE。验证好的表达质粒pJN44-HMG1和pJN44-CrtE分别转入菌株38中，获得重组菌株40，通过菌落PCR的方式验证正确。
将前述获得的目的基因BrHPPD，GaHPT，SmMPBQMT，DcTC和Boγ_TMT连接到载体pJN44的多酶切位点上，分别得到质粒pJN44-BrHPPD，pJN44-GaHPT，pJN44-SmMPBQMT，pJN44-DcTC，和pJN44-Boγ_TMT。将获得的重组表达质粒通过酶切验证后转入菌株40中，得到高产生育三烯酚的重组菌株41，命名为重组解脂亚罗酵母polf-(MTT)+HC-ura3，通过菌落PCR的方式验证正确。
高产生育三烯酚的重组菌株40、41的基因型为：
Figure BDA0003255485700000141
将重组菌株41在SD-LEU培养基上培养以去除ura3标记，SD-LEU培养基上生长的单菌落即为高产生育三烯酚的重组解脂亚罗酵母，命名为polf-(MTT)+HC。
对所得高产生育三烯酚的重组菌株polf-(MTT)+HC进行了4次发酵，对4次发酵结果进行检测α-生育三烯酚和γ-生育酚的含量，结果如表5显示重组菌株polf-(MTT)+HC的α-生育三烯酚含量最高达到748.5ug/g DCW，γ-生育三烯酚含量为1675.2μg/g DCW，总生育三烯酚含量为2423.7μg/g DCW。其平均总生育三烯酚产量达到2286.8μg/g DCW，相对于现有技术有显著提高。由此可见，在基因挖掘的基础上过表达生育三烯酚合成途径中的关键基因对生育三烯酚产量的提高有明显作用。
表5重组菌株polf-(MTT)+HC发酵液中各种生育三烯酚含量
Figure BDA0003255485700000151
序列表
<110> 西安海斯夫生物科技有限公司
<120> 高产生育三烯酚的重组解脂亚罗酵母、其构建方法及应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1047
<212> DNA
<213> 2-甲基-6-香叶基香叶基苯醌甲基转移酶基因(Selaginella sp.)
<400> 1
atggccatgg ccatggctgc cgccgccccc cgaaccgtcc aggccctcga gtgcggcgcc 60
tccggctccg agctgccccg aatcgcccga atttctgccc gacttccctc ccgaaagggc 120
ttccgaggcc tggccgtcgc cgcccgaatg cgacgaaact ccccgctggt gcgatgcgcc 180
gccgcccagt ccgcctccgc ctccccccga cccgccatgc agccccgatt catccagcac 240
aagcaggagg ccttctggtt ctaccgattc ctgtctatca tctacgacca catcatcaac 300
cccggtcact ggactgagga catgcgtgac gatgccctgg agcccgccga cctgtctgac 360
cgaaacctgg tcgtcgtcga cgtcggcggc ggcaccggct tcaccaccct gggcatcgtg 420
aagcacgtcg acgcccgaaa cgtgaccatt ctggaccagt ccccccacca gctggccaag 480
gccaaggaga aggagcccct gaaggagtgc aagatcatcg agggtgacgc tgaggacctg 540
ccctttgaga ctgattacgc tgacagatac gtttctgctg gttccatcga gtactggcct 600
gatccccagc gaggaattaa ggaggcttac agagtgctga agaagggcgg caaggcctgc 660
ctgatcggcc ccgtgcaccc caccttctgg ctgtcccgat tcttcgccga catgtggatg 720
ctgttcccca aggaggagga gtacattgac tggttcacca aggccggctt ccaggacgtc 780
cagctgaagc gaatcggtcc aaagtggtac cgaggtgtgc gtagacatgg tcttattatg 840
ggttgtagtg tgactggtgt taagcctgag gccggcgact ctcccctgga cctgggcccc 900
aaggccgagg acgtccaggc cccctctaac cccctgacct tcttcttccg attcctggtc 960
ggcggcatcg cctccctgta cttcgtcctg gtccccatct acatgtggct gaaggacctg 1020
atcaccccca agggccagcc catctaa 1047
<210> 2
<211> 1458
<212> DNA
<213> 生育酚环化酶基因(Dendrobium sp.)
<400> 2
atggatcgat ctggttcctc tgccctgctg cgacagcccc tgaccgccgt ctgccccctg 60
cccccccgat tcctgatctt ccgaaaggtc cctattgcca acgtcgagtt tcgacgacga 120
ccccccaagc ccaaggccgc cacctcttcc tctgaggccg aaaagaccgg cgccgtgtcc 180
tcttcccccg tgtacatccc cacccctcga gaccgagagc tgcgaacccc ccactccggc 240
taccacttcg acggcaccgc tcgagttttc ttcgagggtt ggtacttcaa ggtctctatc 300
ccccactgtc gacagtcctt ctgcttcatg tactccgttg agaaccccgc cttttccgac 360
ggtatgggtg tactggaccg agccatgtac ggtcaccgat tcaccggcgt cggcgcccag 420
atcctgggcg ctgacgacaa gtacatctgc cagttctctg agaagtctaa gaacttctgg 480
ggttctcgac acgagctgat gctgggcaac actttcatcg ctggcaacaa ctccgccccc 540
cctaacggcg agctgccccc ccaggagttc cgaaagcgag tgctggaggg tttccaggtt 600
tctcccttct ggcaccaggg cttcattcgt gacgacggcc gatctaccta cgtccagacc 660
gtcaagaccg cccgatggga gtactccacc cgacctgtct acggttgggg cgacttcaag 720
tctaaacaga agtccaccgc cggttggctg gccgccttcc ccgtctttga gccccactgg 780
cagatttgca tggccggcgg cctgtccacc ggctggattg agtgggacgg cgagcgattc 840
gagttcgaga acgccccctc gtactccgag aagaactggg gcggcggctt cccccgaaag 900
tggttctggg tccagtgtaa cgtgttcaag ggtgcttccg gcgaggtggc tctcaccgcc 960
gccggtggtc tccgaaagct ggccggcctc gccgacaact acgagaacgc cgccctggtg 1020
ggcgtccatt acggcggcaa gttctacgag ttcgtcccct ggaacggttc tgtgtcctgg 1080
gagatctccc agtggggcta ctggcacatc tccgccgaga acaaccagaa catggtcgag 1140
ctggtcgcta ccgtcgagga gcccggtacc cccctgagag ctcctacaca ggaagcagga 1200
cttgttactg cttgtaagga tacttgttac ggtgacctta ccctgcaact atgggagaaa 1260
acttccgacg gtaaaaaggg aaagcttatc ctggaggcca cctctaacat ggccgccgtt 1320
gaagtcggag gtggcccctg gttttcgact tggaagggaa ctacctctat gcccgagctg 1380
gtctcctccg cccttcaggt tcctattgac gttgagtcct tcttccccgt cccactgttt 1440
aagccccctg gactgtaa 1458
<210> 3
<211> 1044
<212> DNA
<213> γ-生育酚甲基转移酶基因(Brassica oleracea)
<400> 3
atgaaggcca ccctggcccc cccctcctcc ctgatctccc tgccccgaca caaggtctcc 60
tccctgcgat ccccctccct gctgctccag tcccagcgac cctcctccgc cctgatgaca 120
accaccgcca cccgaggctc cgtcgccgtc accgccgccg ccacctcctc tgccgaggcc 180
ctgcgagagg gcatcgccga gttctacaac gagacctccg gcctgtggga ggagatctgg 240
ggcgaccaca tgcaccacgg tttctacgac cccgactcct ctgtccagct gtctgactcc 300
ggacaccgag aggcccagat ccgaatgatc gaggagtccc tgcgattcgc cggcgtgacc 360
gaggaggaga agaagatcaa gcgagttgtt gacgtcggct gtggtatcgg tggatcttct 420
cgatacattg cttctaagtt cggagctgag tgtattggca tcaccctgtc ccccgtgcag 480
gccaagcgag ctaacgacct ggccgctgcc cagtccctgt ctcacaaggt gtccttccag 540
gtcgccgacg ccctggacca gcccttcgag gacggaatct tcgacctcgt ctggtccatg 600
gagtctggtg agcacatgcc cgacaaggcc aagttcgtga aggagctggt ccgagtgacc 660
gcccccggcg gtcgaatcat catcgtgacc tggtgccacc gaaacctgtc tcagggtgag 720
gagtctctgc agccctggga gcagaacctg ctggaccgaa tctgtaagac cttctacctg 780
cccgcctggt gctccacctc cgactacgtc gagctgctgc agtctctctc cctccaggac 840
attaagtgcg ccgactggtc tgagaacgtc gcccccttct ggcccgccgt gatccgaacc 900
gccctgacct ggaagggact ggtctccctg ctgcgatccg gtatgaagtc cattaagggc 960
gccctgacca tgcccctgat gatcgagggc tacaagaagg gcgtcatcaa gttcggcatc 1020
atcgcctgcc agaagcccct gtaa 1044

Claims (5)

1.高产生育三烯酚的重组解脂亚罗酵母，其特征在于所述重组解脂亚罗酵母含有重组质粒，所述重组质粒含有生育三烯酚合成底物香叶基香叶基二磷酸（GGPP）积累的关键基因和经密码子优化的生育三烯酚合成基因，所述生育三烯酚合成底物香叶基香叶基二磷酸（GGPP）积累的关键基因为HMG1和CrtE，所述经密码子优化的生育三烯酚合成基因编码的蛋白质为2-甲基-6-香叶基香叶基苯醌甲基转移酶、生育酚环化酶和γ-生育酚甲基转移酶；
所述2-甲基-6-香叶基香叶基苯醌甲基转移酶来自卷柏，其密码子优化序列如SEQ IDNO.1所示；所述生育酚环化酶来自石斛，序列如SEQ ID NO.2所示；所述γ-生育酚甲基转移酶来自甘蓝，序列如SEQ ID NO.3所示；所述HMG1和CrtE基因通过设计引物从解脂亚罗酵母工程菌po1f的基因组DNA扩增目的片段得到的；
所述重组质粒还含有Gene ID序号为103843547的来源于油菜的HPPD基因（BrHPPD）和GenBank序列号为MBR8827918.1的来源于蓝藻的HPT基因（GaHPT）。
2.权利要求1所述的重组解脂亚罗酵母的构建方法，所述方法包括以下步骤：
（1）构建含有HPPD基因和HPT基因的解脂亚罗酵母工程菌
获取并合成来源于油菜的HPPD基因（BrHPPD）和来源于蓝藻的HPT基因（GaHPT）序列，与载体ploxpura3loxp经酶切连接获得重组质粒ploxpura3loxp-BrHPPD-GaHPT，将重组质粒酶切线性化后，采用酵母转化试剂盒方法转入解脂亚罗酵母工程菌polf中，获得重组菌株polf-BHGH，所得重组菌株经通过菌落PCR验证正确；
（2）构建含有2-甲基-6-香叶基香叶基苯醌甲基转移酶基因的重组质粒
获取并合成来源于卷柏（SmMPBQMT）的2-甲基-6-香叶基香叶基苯醌甲基转移酶基因序列，以NdeⅠ/SpeⅠ为酶切位点双酶切载体ploxpura3loxp和所述2-甲基-6-香叶基香叶基苯醌甲基转移酶基因，分别连接获得重组质粒ploxpura3loxp-SmMPBQMT，将所得重组质粒用限制性酶SmaI酶切线性化，采用酵母转化试剂盒方法转入解脂亚罗酵母工程菌polf-BHGH中，获得重组菌株5，所得重组菌株经菌落PCR验证正确；
（3）构建含有生育酚环化酶基因的重组菌株
获取并合成来源于石斛（DcTC）的生育酚环化酶基因序列，以NdeⅠ/SpeⅠ为酶切位点双酶切载体ploxpura3loxp和所述生育酚环化酶基因，连接获得重组质粒ploxpura3loxp-DcTC，所得重组质粒用限制性酶SmaI酶切线性化，通过酵母转化试剂盒方法分别转入步骤（2）得到的重组菌株5中，获得重组菌株35，所得重组菌株经菌落PCR验证正确；
（4）构建含有γ-生育酚甲基转移酶基因的重组菌株
获取并合成来源于甘蓝（Boγ-TMT）的γ-生育酚甲基转移酶基因序列，分别以NdeⅠ/SpeⅠ为酶切位点双酶切载体ploxpura3loxp和γ-生育酚甲基转移酶基因，连接获得重组质粒ploxpura3loxp-Boγ-TMT，所得重组质粒分别用限制性酶SmaI酶切线性化，采用酵母转化试剂盒方法转入步骤（3）的重组菌株35中，获得重组菌株38，所得重组菌株经菌落PCR验证正确；
（5）构建过表达HMG1和CrtE基因的重组菌株
获取并合成HMG1和CrtE基因序列，设计引物从解脂亚罗酵母工程菌po1f的基因组DNA扩增目的片段，所得目的片段连接到载体pJN44的多酶切位点上，分别得到质粒pJN44-HMG1和pJN44-CrtE；所得质粒分别转入菌株38中，获得重组菌株40，所得重组菌株经菌落PCR验证正确；
（6）目的基因的过表达
将前述获得的目的基因BrHPPD，GaHPT，SmMPBQMT，DcTC和Boγ_TMT分别连接到载体pJN44的多酶切位点上，分别得到质粒pJN44-BrHPPD，pJN44-GaHPT，pJN44-SmMPBQMT，pJN44-DcTC，和pJN44-Boγ_TMT；将获得的质粒通过酶切验证后转入步骤（5）的重组菌株40中，得到高产生育三烯酚的重组解脂亚罗酵母41（polf-(MTT)＋HC-ura3），所得重组菌株经菌落PCR验证正确；
（7）去除ura3标记
所得重组解脂亚罗酵母41（polf-(MTT)＋HC-ura3）在SD-LEU培养基上培养，所述SD-LEU培养基上生长的单菌落是高产生育三烯酚的重组解脂亚罗酵母polf-(MTT)＋HC。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述菌落PCR验证的反应体系如下：
反应体系：
Figure QLYQS_1
PCR程序：
Figure QLYQS_2
。
4.权利要求1所述的重组解脂亚罗酵母在生产生育三烯酚中的应用。
5.权利要求2或3所述的构建方法得到的重组解脂亚罗酵母在生产生育三烯酚中的应用。
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