CN113717985B - 一种创制高萝卜硫素含量青花菜新种质的方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种创制高萝卜硫素含量青花菜新种质的方法，及利用该方法培育青花菜新品种的应用，它包括如下步骤：黑芥子酶基因bolmyr‑01编码序列合成；带酶切位点bolmyr‑01扩增；过表达载体构建；遗传转化；过表达bolmyr‑01青花菜阳性株系筛选；过表达bolmyr‑01青花菜自交纯合；过表达bolmyr‑01青花菜纯合系萝卜硫素含量测定及农艺性状评价。结果显示，相同生长条件下，在青花菜不同种质材料中过表达bolmyr‑01不影响花球形状、产量，但可显著提高种质材料中萝卜硫素的含量。过表达bolmyr‑01青花菜种质材料中萝卜硫素的含量可达到对照的5‑10倍。本发明公开的方法，对于高效、快速、定向的进行青花菜新种质创制，丰富青花菜种质资源，培育青花菜新品种具有重要价值。
Description
技术领域
本发明涉及生物育种领域中一种创制高萝卜硫素含量青花菜新种质的方法，及其在培育高萝卜硫素含量青花菜新品种中的应用。
背景技术
青花菜，又名西兰花、罗马花椰菜，是十字花科芸苔属甘蓝种的一个变种，其营养丰富，素有“蔬菜皇冠”的美誉，是我国常见的大宗蔬菜种类之一。大量的研究表明，青花菜中富含生物活性物质萝卜硫素（Sulforaphane，SFN）。萝卜硫素是十字花科植物所含硫苷水解后的一种小分子异硫氰酸盐，分子式为C6H11NOS2，具有C=N=S结构，相对分子质量为177.29。萝卜硫素在高纯度状态下为黄色油状液体，易溶解在乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷等有机溶剂，不易溶于水。体内外实验表明，萝卜硫素可以预防及治疗各种癌症、降低心血管疾病的风险，并有助于治疗自闭症和糖尿病，是目前蔬菜中发现的抗癌活性最强的物质之一，具有极高的经济价值。
日本福家洋子教授团队的研究结果表明萝卜硫素可以治疗癌症，并首次确认萝卜硫素可以杀死白血病细胞。萝卜硫素的抗癌活性与细胞分子传感器Nrf2及Keap1 复合体之间有直接的联系，Nrf2-Keap1复合体调节Ⅱ型酶的诱导，II型抗毒酶如谷胱甘肽转移酶、环氧化物水解酶、醌还原酶等的产生可以阻断致癌物产生致癌效应所需的代谢途径；阻断癌细胞的***与生长途径；促进其他可杀死癌细胞的蛋白质分泌，阻断致癌物诱导癌症的作用。最近的研究发现萝卜硫素对MicroRNA（miRNAs）的调节对提高抗癌效果有重要意义。miRNAs是一种小的非编码RNA分子，负责基因转录后的调控，参与许多生物学过程，如增殖、凋亡、分化和细胞周期调控。因此，miRNAs与疾病特别是癌症的发展有关。萝卜硫素能抑制miRNA-155、miRNA-9、miRNA-23b、miRNA-92b、miRNA-381、miRNA-382、miRNA-19a、miRNA-19b、miRNA-21和miRNA-616-5p的表达，但能增强miRNA-326、miRNA-9-3、miRNA-214、miRNA-124和miRNA-200c的表达，导致急性髓细胞白血病、胃癌、肺癌和乳腺癌等细胞的生存和增殖能力下降。
肥胖与许多疾病如糖尿病、心血管疾病和癌症等的发病有关。目前世界范围内肥胖率逐年上升，肥胖已经成为全球性问题。脂肪细胞肥大和增生可诱导前脂肪细胞向脂肪细胞分化，是引起肥胖的原因。萝卜硫素可抑制脂肪细胞分化，促进脂肪分解。对3T3-L1前脂肪细胞的研究表明，20μmol/L的萝卜硫素对脂肪细胞在发育早期的分化有抑制作用，且萝卜硫素能够以浓度依赖的方式减少脂肪细胞中的脂滴数量和甘油三酯的积累。最近的研究表明，萝卜硫素在40-80μmol/L浓度范围内处理的3T3-L1前脂肪细胞以剂量和时间依赖的方式减少。此外，研究表明每天皮下注射0.5mg/kg的萝卜硫素溶液3周后的小鼠与未经治疗的饲喂高脂高糖饮食的小鼠相比，体重减轻，血浆瘦素水平降低，胰岛素敏感性增加。
此外，萝卜硫素还具有显著的抑菌活性，作为一种抗菌剂具有广阔的前景。研究发现，萝卜硫素在体外和体内均抑制幽门螺旋杆菌的生存，并减轻了幽门螺旋杆菌在小鼠和人类中引起的胃炎。不仅是幽门螺旋杆菌，萝卜硫素也对革兰氏阳性菌枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和粪肠球菌以及革兰氏阴性菌大肠杆菌和肺炎克雷伯菌有明显抑制作用。
因此，源于青花菜的萝卜硫素作为潜在的抗癌新药、新型抗菌剂及功能产品的主要原料具有广阔的市场空间，其提取制备具有极高的经济价值。但是，尽管青花菜与其它含硫苷产物的植物相比，其中萝卜硫素的含量较高，但实际上在所有含硫苷植物，包括青花菜本身中萝卜硫素的含量都非常低，其已成为对萝卜硫素进行规模化提取的主要瓶颈。为此，创制高萝卜硫素含量的青花菜新种质，在此基础上进行高萝卜硫素青花菜新品种培育及种植，大幅提高单位重量青花菜中萝卜硫素的提取得率，是萝卜硫素相关抗癌药物、抗菌剂及功能产品研制的源头性保障，具有十分重要经济价值。此外，青花菜在我国是外来种，种质资源十分匮乏，目前我国是全球青花菜种植面积最大，总产量最高的国家。但我国种植的青花菜90%品种源于国外。因此，青花菜是我国种业中亟待解决的“卡脖子”问题。本发明公开的高萝卜硫素含量青花菜新种质创制方法及其在新品种培育中的应用，对拓宽我国优质青花菜种质资源，培育具有市场竞争力的青花菜新品种，打破国外对我国青花菜种业市场的垄断，破解我国青花菜种业的“卡脖子”难题具有重要的社会价值和效益。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种创制高萝卜硫素含量青花菜新种质的方法，及利用上述方法培育高萝卜硫素含量青花菜新品种的应用。
为实现上述目的，本发明公开了如下的技术方案：
一种黑芥子基因bolmyr-01编码序列，它由序列5’ ATGAAGCTTCTTCATGGACTCGCTTTAGTTTTTCTATTAGCTGCTGCGAGTTGCAAAGCTGATGAAGAAATTACTTGCGAAGAGAACAATCCATTCACATGTAGTAACACTGATATTTTAAGCAGTAAAAACTTCGGAAAAGATTTCATTTTCGGTGTTGCATCTTCTGCTTACCAGATTGAAGGAGGGAGAGGTCGTGGTGTTAACGTTTGGGATGGCTTCAGTCACCGATACCCAGAGAAATCAGGGTCAGATTTGAAGAATGGAGACACTACTTGTGAGTCATACACGAGAATGGGCGAACTCAATACTACTGGCTTCACCTTTGCGTGGCCAAGAATCTTTCCAAAAGGAAAGGTGAGTAGGGGAGTGAACCAAGGAGGTCTTGATTACTACCACCCACTCATAGATGCACTCCTCGAAAAGAATACGCCTTTCGTTAGCCTCTTTCACTGGGATCTTCCTCAAACACTCCAAGATGAGTATGAAGGTTTCTTGGACCGCAAGATCATACAAGATTTCAAAGACTACGCGGATCTATTTTTCACCGAATTTGGTGGAAAGGTATGGATCACCATCAACCAGCTATACACAGTGCCTACAAGAGGCTATGCTATCGGAACAGATGCAAATACCAAGCCCAGGTGTTACGGTGGAAATTCTTCACCCTACATCGGTGCACATAACCAGCTTCTTGCTCATGCCACGCTCGTCGATCTTTACTGGACCAAATACAAGTTCCAACCAGGGAAGATTGGACCTGTGATGATTACAAGATGGTTTCTTCCATCTGATGAGTCTGATCCTGCCTCCATAGAAGCAGCTGAGAGGATGAACAAATTCTTCCATGGATGGTACATGGAGCCGCTAACAAAGGGTAGATACCCAGACATCATGAGGCAGATTGTGGGTAGTAGGCCTAACCTCACCGAGGAAGAAGCAGGACTCGTTGCTGGTTACGTCACTCAATACGCCCAGCCAAAACCTAACCCATATCCTTCAGAGACACACACTGCCATGATGGACGCTGTAAAGCTCAGATATGATAATTCACGTGGTGAATTTCTTGGTCCACTGTTTGTTGAAGACAAAGTAAGCGGCAACAGCTATTACTACCCAAAAGGCATTTATTACGTTATGGACTACTTCAAAACCAAAAACGGCGACCCTTATGTCACCGAAAATGGATTTAGTACCCCCAGTTCAGAAAACCGTGAGCAAGCTATTGCCGATTACAAGCGAATCGATTATCTATGCAGCCCTCTATTTTTTCTCCGCAAGGTCATCAAGGAGAAGGGTGTCAACGTGAGAGGATACTTTGCATGGGCTCTTGGAGATAATTATGAATTCTGCAAAGGTTTCACCGTCAGATTTGGACTCAGTTACGTTAATTGGGAAGATCTGGACGACAGAAACCTCAAAGAATCTGGCAAATGGTACCAGAGATTCATTAACGGGACTGTCAAGAATTCTGCGAAACAAGATTTCCTCCGCTCAAGCCTCTCTTCCCAGAGTCAGAAGAAGAGGCTCGCTGATGCATGA3’组成（SEQ ID NO：1）。
本发明进一步公开了利用上述基因编码序列定向创制高萝卜硫素含量青花菜新种质的方法，它包括如下步骤：
（1）黑芥子酶基因bolmyr-01的合成。经过序列优化的黑芥子酶基因bolmyr-01编码序列（SEQ ID NO：1）由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。合成序列溶于50 μL无菌水中，终浓度为200ng/μL。
（2）带酶切位点黑芥子酶基因bolmyr-01扩增。利用带有Nco I和 BstE II酶切位点序列的引物bolmyr-01-F和bolmyr-01-R，所述合成的序列为模板进行PCR扩增，获得带有酶切位点的bolmyr-01编码序列。
bolmyr-01-F引物，由序列5’ AACACGGGGGACTCTTGACCATGGATGAAGCTTCTTCTTCATGGACTCGC3’组成（SEQ ID NO：2）。
bolmyr-01-R引物，由序列5’ ATCGGGGAAATTCGAGCTGGTCACCTCATGCATCAGCGAGCCTCTT3’组成（SEQ ID NO：3）。上述序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
PCR扩增体系为（50 μL）：KOD FX Buffer 25μL、黑芥子酶基因bolmyr-01合成序列2μL （400 ng）、bolmyr-01-F引物 1.5μL (0.5 μmol/L)、bolmyr-01-R引物 1.5μL (0.5 μmol/L)、dNTPs 2μL (10 mmol/L) 、KOD酶 1μL、ddH2O 17μL。PCR扩增程序：94℃ 5 min，后进入98℃ 10 s、58℃ 30 s、68℃ 1.5 min循环，共计 30 个。最后68℃ 7 min。扩增产物采用1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，预期片段在1.5 kb。
（3）黑芥子酶基因bolmyr-01过表达载体构建：将pCAMBIA3301质粒采用Nco I和Bst EII双酶切，30 μL酶切体系中含有质粒2 μg（10 μL）、10×T buffer 3 μL、Nco I（100U/μL）1.0 μL、Bst EII（200 U/μL）1.0 μL，无菌水15 μL, 37度孵育6 h，随后利用0.8%的琼脂糖凝胶回收酶切后的pCAMBIA3301载体；对步骤（2）扩增获得的带酶切位点黑芥子酶基因bolmyr-01序列采用Nco I和Bst EII双酶切，酶切体系及方法同pCAMBIA3301质粒酶切，并回收酶切产物。将酶切后回收的pCAMBIA3301质粒和酶切后回收的黑芥子酶基因bolmyr-01序列产物进行连接，连接体系如下：在0.2 mL的离心管中加入酶切后pCAMBIA3301质粒3 μL（500 ng）、目的片段4 μL (800 ng)、10×ligase buffer（连接缓冲液） 1 μL、Ligase（连接酶） 1 μL、无菌水补至10 μL，16℃ 水浴保温24 h。将连接产物采用热冲击法转入大肠杆菌DH5α感受态细胞，37℃倒置培养12 h左右。挑取单克隆置于含Kan的LB培养液中反复吹打几次，放于37℃摇床，180 rpm孵育8 h左右，进行扩大培养。按照质粒提取试剂盒操作说明提取阳性重组质粒，取1 μg阳性质粒转于农杆菌EHA105。 将转化的农杆菌涂于YEB平板（含80mg/L Rif（利福平）、120 mg/L Str（链霉素） 和100 mg/L Kan（卡那霉素））；28℃倒置培养2d。挑取白色克隆于1 mL YEB培养基（含80 mg/L Rif、120 mg/L Str 和100 mg/L Kan），28℃，220 rpm 培养1-2 d。提取农杆菌阳性质粒进行双酶切鉴定；取经鉴定的阳性菌株菌液500 μL加入500 μL 40% 甘油YEB培养基，震荡混匀后于-20℃保存备用。
（4）黑芥子酶基因bolmyr-01过表达载体遗传转化青花菜：挑取圆润饱满的青花菜种子溶于含适量多菌灵的溶液中，于摇床上振荡2 h；紫外灭菌后用75%酒精消毒2 min，再用2%的次氯酸钠消毒15 min；无菌水清洗2 min，重复5-7次； 用镊子将种子放于灭菌的滤纸上，待表面水吸干，点种在MS培养基上。青花菜种子生长3-5 d后，用剪刀将子叶和根剪掉，只余下胚轴，切成5-7 mm左右的茎段，平铺于分化培养基（MS+1 mg/L NAA+1 mg/L 6-BA+0.5 mg/L ZT）上，光照下预培养2 d。取100-200 µL含有重组质粒的农杆菌菌液接种于5mL含有50 mg/L Rif和100 mg/L Kan的YEB液体培养基中，28℃，180 rpm摇床中过夜培养，取活化后的菌液接种于50 mL的YEB液体培养基至菌液变浑，当OD600 = 0.6-0.8时，5000rpm离心10 min，收集菌体，用加AS的MS液体培养液重悬菌体备用；将预培养的下胚轴转移到侵染液中，侵染30 s，放于滤纸上吸干，最后将灭菌的滤纸平铺在培养基上，将下胚轴放于共培养培养基（MS+1 mg/L NAA+1 mg/L 6-BA+200 mg/mL AS+0.5 mg/L ZT）上暗培养2d。将下胚轴放于无菌水中清洗2 min，重复5-7次，滤纸吸干表面水分后将下胚轴放于脱菌培养基（MS+1 mg/L NAA+1 mg/L 6-BA+Cef 200 mg/L）中生长，培养10 d左右
（5）过表达黑芥子酶基因bolmyr-01青花菜阳性株系筛选:将下胚轴转移至筛选分化培养基（MS+1 mg/L NAA+1 mg/L 6-BA+Basta 3 mg/L+Cef 200 mg/L）上，约30 d以后，转化成功的小苗在培养基中会生出不定芽，待不定芽长至3-5 cm时，用剪刀切下不定芽，放入生根培养基（1/2 MS）中继续培养，获得表现为抗Basta的阳性苗。待小苗生根长至健壮时，取其叶片提取DNA，用组合引物及目的基因上下游引物进行PCR鉴定；鉴定为阳性植株后，利用bolmyr-01定量引物进行qRT-PCR表达分析，最终获得过表达bolmyr-01的青花菜阳性材料。
（6）过表达黑芥子酶青花菜自交纯合：将筛选获得的过表达bolmyr-01青花菜阳性材料于10月种植于温室中，次年2-3月进行自交授粉，获得自交种。对自交种进行单粒播种，在幼苗期采用bolmyr-01上下游引物进行快速PCR鉴定。选择PCR鉴定为阳性的株系进行进一步的自交，收获自交种，最终经过5-6代自交获得过表达bolmyr-01青花菜纯合种质材料。
（7）过表达黑芥子酶青花菜纯合系萝卜硫素含量测定及综合农艺性状评价：采用液相色谱法检测对过表达bolmyr-01青花菜纯合种质材料中的萝卜硫素含量进行检测，进一步在过表达bolmyr-01青花菜纯合种质材料中筛选获得萝卜硫素含量显著提高的纯合材料，并对其花球产量、外观及植株生长势、抗病性等综合农艺性状进行评价。最终筛选、获得萝卜硫素含量比对照提高5-10倍，并且花球产量、外观及植株生长势、抗病性等综合农艺性状优良的高萝卜硫素青花菜新种质。
利用本发明公开的一种高萝卜硫素含量青花菜新种质创制方法，创制产出的新种质可直接做为亲本之一，通过杂交育种手段培育高萝卜硫素含量青花菜新品种。
本发明重点解决了目前高萝卜硫素含量青花菜种质资源匮乏及种业市场对高萝卜硫素青花菜新品种的迫切需求。
本发明所述青花菜下胚轴分化培养基指的是含有MS+1 mg/L NAA+1 mg/L 6-BA+0.5 mg/L ZT的混合物。
本发明同时也公开了黑芥子酶基因bolmyr-01编码序列（SEQ ID NO：1）在创制高萝卜硫素含量青花菜新种质中的应用，及创制的新种质在培育高萝卜硫素含量青花菜新品种中的应用。试验结果显示：相同的生长条件下，在现有青花菜不同种质材料中过表达经过序列优化的黑芥子酶基因bolmyr-01不影响花球形状、产量及生长期，但可以显著提高转化种质材料中萝卜硫素的含量。过表达黑芥子酶基因青花菜种质材料中萝卜硫素的含量可达到对照的5-10倍以上，表明本发明公开的一种创制高萝卜硫素含量青花菜新种质的方法对于高效、快速、定向的进行青花菜新种质创制，拓宽青花菜种质资源，培育具有高市场竞争力的青花菜新品种具有重要价值。
本发明公开的一种创制高萝卜硫素含量青花菜新种质的方法及应用与现有技术相比所具有的积极效果在于：
利用经过序列优化的黑芥子酶基因，在不改变青花菜中硫苷代谢通路的情况下，采用基因工程手段，实现快速、高效的获得高萝卜硫素含量青花菜新种质，满足种业市场对高萝卜硫素含量青花菜新品种的迫切需求。
遗传转化效率高、操作简单，转化不受青花菜基因型影响，可以实现在短期内对任意原有青花菜种质资源进行定向改良，在不改变原有种质资源材料农艺性状的同时，定向提高其萝卜硫素含量，大幅提高原有青花菜种质资源的利用价值。
操作简单、适应性强，本发明公开的方法除适用于高萝卜硫素含量青花菜新种质创制及新品种培育，在青花菜的近缘种如十字花科芸苔属的花椰菜、甘蓝、萝卜、卷心菜等中同样适用，解决这些含硫苷蔬菜作物中高萝卜硫素含量种质资源匮乏，高萝卜硫素含量新品种急缺的难题。
附图说明
图1（A、B、C、D、E） bolmyr-01过表达载体构建电泳结果；A： bolmyr-01扩增结果，M是DNA Marker 2000；B：bolmyr-01经Nco I和BstE II酶切后电泳结果，M是DNA Marker5000，1是质粒对照，2和3是bolmyr-01双酶切电泳结果；C：pCAMBIA3301经Nco I和BstE II酶切后电泳结果，M是DNA Marker 15000；D：重组质粒转化大肠杆菌PCR电泳结果，M是DNAMarker 2000，1、3、5是p35S与bolmyr-01下游引物扩增结果，2、4、6是bolmyr-01上下游引物扩增结果；E：重组质粒转化农杆菌PCR电泳结果，M是DNA Marker 5000，1、3、5是p35S与bolmyr-01下游引物扩增结果，2、4、6是BoMyr上下游引物扩增结果。
图2（A、B、C、D） bolmyr-01过表达青花菜阳性株的分子鉴定；A：p35S与bolmyr-01下游引物PCR电泳结果，1是对照组，2-11、13、16、17为转基因阳性株，12、14、15为未转化成功的植株，M是DL5000 marker；B：对照组和转基因阳性青花菜bolmyr-01定量结果，**表示与对照组相比有极显著性差异(P < 0.01)；C：阳性株在花盆中炼苗；D：移栽到大田的阳性转基因青花菜3个月生长状况。
图3（A、B） bolmyr-01过表达青花菜和对照叶片中萝卜硫素含量检测结果；A和B分别是对照组青花菜植株叶片和过表达bolmyr-01青花菜株系叶片中萝卜硫素色谱图。
实施方式
这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册（NewYork: Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989）中所述的条件。本发明所有生化试剂、酶、载体、菌株均可在各个生物试剂公司中购买。
本发明所需生化试剂及酶等来源见下表：
实施例1
黑芥子基因bolmyr-01编码序列，它由序列5’ ATGAAGCTTCTTCATGGACTCGCTTTAGTTTTTCTATTAGCTGCTGCGAGTTGCAAAGCTGATGAAGAAATTACTTGCGAAGAGAACAATCCATTCACATGTAGTAACACTGATATTTTAAGCAGTAAAAACTTCGGAAAAGATTTCATTTTCGGTGTTGCATCTTCTGCTTACCAGATTGAAGGAGGGAGAGGTCGTGGTGTTAACGTTTGGGATGGCTTCAGTCACCGATACCCAGAGAAATCAGGGTCAGATTTGAAGAATGGAGACACTACTTGTGAGTCATACACGAGAATGGGCGAACTCAATACTACTGGCTTCACCTTTGCGTGGCCAAGAATCTTTCCAAAAGGAAAGGTGAGTAGGGGAGTGAACCAAGGAGGTCTTGATTACTACCACCCACTCATAGATGCACTCCTCGAAAAGAATACGCCTTTCGTTAGCCTCTTTCACTGGGATCTTCCTCAAACACTCCAAGATGAGTATGAAGGTTTCTTGGACCGCAAGATCATACAAGATTTCAAAGACTACGCGGATCTATTTTTCACCGAATTTGGTGGAAAGGTATGGATCACCATCAACCAGCTATACACAGTGCCTACAAGAGGCTATGCTATCGGAACAGATGCAAATACCAAGCCCAGGTGTTACGGTGGAAATTCTTCACCCTACATCGGTGCACATAACCAGCTTCTTGCTCATGCCACGCTCGTCGATCTTTACTGGACCAAATACAAGTTCCAACCAGGGAAGATTGGACCTGTGATGATTACAAGATGGTTTCTTCCATCTGATGAGTCTGATCCTGCCTCCATAGAAGCAGCTGAGAGGATGAACAAATTCTTCCATGGATGGTACATGGAGCCGCTAACAAAGGGTAGATACCCAGACATCATGAGGCAGATTGTGGGTAGTAGGCCTAACCTCACCGAGGAAGAAGCAGGACTCGTTGCTGGTTACGTCACTCAATACGCCCAGCCAAAACCTAACCCATATCCTTCAGAGACACACACTGCCATGATGGACGCTGTAAAGCTCAGATATGATAATTCACGTGGTGAATTTCTTGGTCCACTGTTTGTTGAAGACAAAGTAAGCGGCAACAGCTATTACTACCCAAAAGGCATTTATTACGTTATGGACTACTTCAAAACCAAAAACGGCGACCCTTATGTCACCGAAAATGGATTTAGTACCCCCAGTTCAGAAAACCGTGAGCAAGCTATTGCCGATTACAAGCGAATCGATTATCTATGCAGCCCTCTATTTTTTCTCCGCAAGGTCATCAAGGAGAAGGGTGTCAACGTGAGAGGATACTTTGCATGGGCTCTTGGAGATAATTATGAATTCTGCAAAGGTTTCACCGTCAGATTTGGACTCAGTTACGTTAATTGGGAAGATCTGGACGACAGAAACCTCAAAGAATCTGGCAAATGGTACCAGAGATTCATTAACGGGACTGTCAAGAATTCTGCGAAACAAGATTTCCTCCGCTCAAGCCTCTCTTCCCAGAGTCAGAAGAAGAGGCTCGCTGATGCATGA3’组成（SEQ ID NO：1）。
利用上述基因编码序列定向创制高萝卜硫素含量青花菜新种质的方法，它包括如下步骤：
（1）黑芥子酶基因bolmyr-01的合成。经过序列优化的黑芥子酶基因bolmyr-01编码序列（SEQ ID NO：1）由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。合成序列溶于50 μL无菌水中，终浓度为200ng/μL。
（2）带酶切位点黑芥子酶基因bolmyr-01扩增。利用带有Nco I和 BstE II酶切位点序列的引物bolmyr-01-F和bolmyr-01-R，所述合成的序列为模板进行PCR扩增，获得带有酶切位点的bolmyr-01编码序列。
bolmyr-01-F引物，由序列5’ AACACGGGGGACTCTTGACCATGGATGAAGCTTCTTCTTCATGGACTCGC3’组成（SEQ ID NO：2）
bolmyr-01-R引物，由序列5’ ATCGGGGAAATTCGAGCTGGTCACCTCATGCATCAGCGAGCCTCTT3’组成（SEQ ID NO：3）。上述序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR扩增体系为（50 μL）：KOD FX Buffer 25μL、黑芥子酶基因bolmyr-01合成序列 2μL （400 ng）、bolmyr-01-F引物 1.5μL (0.5 μmol/L)、bolmyr-01-R引物 1.5μL (0.5 μmol/L)、dNTPs 2μL (10 mmol/L) 、KOD酶 1μL、ddH2O 17μL。PCR扩增程序：94℃ 5 min，后进入98℃ 10 s、58℃ 30 s、68℃ 1.5 min循环，共计 30 个。最后68℃ 7 min。扩增产物采用1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，预期片段在1.5 kb。
（3）黑芥子酶基因bolmyr-01过表达载体构建：将pCAMBIA3301质粒采用Nco I和Bst EII双酶切，30 μL酶切体系中含有质粒2 μg（10 μL）、10×T buffer 3 μL、Nco I（100U/μL）1.0 μL、Bst EII（200 U/μL）1.0 μL，无菌水15 μL, 37度孵育6 h，随后利用0.8%的琼脂糖凝胶回收酶切后的pCAMBIA3301载体；对步骤（2）扩增获得的带酶切位点黑芥子酶基因bolmyr-01序列采用Nco I和Bst EII双酶切，酶切体系及方法同pCAMBIA3301质粒酶切，并回收酶切产物 （图1A、B、C）。将酶切后回收的pCAMBIA3301质粒和酶切后回收的黑芥子酶基因bolmyr-01序列产物进行连接，连接体系如下：在0.2 mL的离心管中加入酶切后pCAMBIA3301质粒3 μL （500 ng）、目的片段4 μL (800 ng)、10×ligase buffer（连接缓冲液） 1 μL、Ligase（连接酶） 1 μL、无菌水补至10 μL，16℃ 水浴保温24 h。将连接产物采用热冲击法转入大肠杆菌DH5α感受态细胞，37℃倒置培养12 h左右。挑取单克隆置于含Kan的LB培养液中反复吹打几次，放于37℃摇床，180 rpm孵育8 h左右，进行扩大培养 (图1D)。按照质粒提取试剂盒操作说明提取阳性重组质粒，取1 μg阳性质粒转于农杆菌EHA105 (图1E)。 将转化的农杆菌涂于YEB平板（含80 mg/L Rif（利福平）、120 mg/L Str（链霉素） 和100 mg/L Kan（卡那霉素）；28℃倒置培养2 d。挑取白色克隆于1 mL YEB培养基（含80 mg/LRif、120 mg/L Str 和100 mg/L Kan），28℃，220 rpm 培养1-2 d。提取农杆菌阳性质粒进行双酶切鉴定；取经鉴定的阳性菌株菌液500 μL加入500 μL 40% 甘油YEB培养基，震荡混匀后于-20℃保存备用。
（4）黑芥子酶基因bolmyr-01过表达载体遗传转化青花菜：挑取圆润饱满的青花菜种子溶于含适量多菌灵的溶液中，于摇床上振荡2 h；紫外灭菌后用75%酒精消毒2 min，再用2%的次氯酸钠消毒15 min；无菌水清洗2 min，重复5次； 用镊子将种子放于灭菌的滤纸上，待表面水吸干，点种在MS培养基上。青花菜种子生长5 d后，用剪刀将子叶和根剪掉，只余下胚轴，切成6 mm左右的茎段，平铺于分化培养基（MS+1 mg/L NAA+1 mg/L 6-BA+0.5mg/L ZT）上，光照下预培养2 d。取150 µL含有重组质粒的农杆菌菌液接种于5 mL含有50mg/L Rif和100 mg/L Kan的YEB液体培养基中，28℃，180 rpm摇床中过夜培养，取活化后的菌液接种于50 mL的YEB液体培养基至菌液变浑，当OD600 = 0.6时，5000 rpm离心10 min，收集菌体，用加AS的MS液体培养液重悬菌体备用；将预培养的下胚轴转移到侵染液中，侵染30s，放于滤纸上吸干，最后将灭菌的滤纸平铺在培养基上，将下胚轴放于共培养培养基（MS+1mg/L NAA+1 mg/L 6-BA+200 mg/mL AS+0.5 mg/L ZT）上暗培养2 d。将下胚轴放于无菌水中清洗2 min，重复6次，滤纸吸干表面水分后将下胚轴放于脱菌培养基（MS+1 mg/L NAA+1mg/L 6-BA+Cef 200 mg/L）中生长，培养10 d左右
（5）过表达黑芥子酶基因bolmyr-01青花菜阳性株系筛选:将下胚轴转移至筛选分化培养基（MS+1 mg/L NAA+1 mg/L 6-BA+Basta 3 mg/L+Cef 200 mg/L）上，约30 d以后，转化成功的小苗在培养基中会生出不定芽，待不定芽长至4 cm时，用剪刀切下不定芽，放入生根培养基（1/2 MS）中继续培养，获得表现为抗Basta的阳性苗。待小苗生根长至健壮时，取其叶片提取DNA，用组合引物及目的基因上下游引物进行PCR鉴定；鉴定为阳性植株后，利用bolmyr-01定量引物进行qRT-PCR表达分析，最终获得过表达bolmyr-01的青花菜阳性材料(图2)。
（6）过表达黑芥子酶青花菜自交纯合：将筛选获得的过表达bolmyr-01青花菜阳性材料于10月种植于温室中，次年2-3月进行自交授粉，获得自交种。对自交种进行单粒播种，在幼苗期采用bolmyr-01上下游引物进行快速PCR鉴定。选择PCR鉴定为阳性的株系进行进一步的自交，收获自交种，最终经过5-6代自交获得过表达bolmyr-01青花菜纯合种质材料。
（7）过表达黑芥子酶青花菜纯合系萝卜硫素含量测定及综合农艺性状评价：采用液相色谱法检测对过表达bolmyr-01青花菜纯合种质材料中的萝卜硫素含量进行检测（图3），进一步在过表达bolmyr-01青花菜纯合种质材料中筛选获得萝卜硫素含量显著提高的纯合材料，并对其花球产量、外观及植株生长势、抗病性等综合农艺性状进行评价。最终筛选、获得萝卜硫素含量比对照提高5-10倍，并且花球产量、外观及植株生长势、抗病性等综合农艺性状优良的高萝卜硫素青花菜新种质。
利用本发明公开的一种高萝卜硫素含量青花菜新种质创制方法，创制产出的新种质可可进一步直接做为亲本之一，通过杂交育种手段培育高萝卜硫素含量青花菜新品种。
结论：相同的生长条件下，在现有青花菜不同种质材料中过表达经过序列优化的黑芥子酶基因bolmyr-01不影响花球形状、产量及生长期，但可以显著提高转化种质材料中萝卜硫素的含量。过表达黑芥子酶基因青花菜种质材料中萝卜硫素的含量可达到对照的5-10倍以上。
SEQUENCE LISTING
<110> 南开大学
<120> 一种创制高萝卜硫素含量青花菜新种质的方法及应用
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1542
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atgaagcttc ttcatggact cgctttagtt tttctattag ctgctgcgag ttgcaaagct 60
gatgaagaaa ttacttgcga agagaacaat ccattcacat gtagtaacac tgatatttta 120
agcagtaaaa acttcggaaa agatttcatt ttcggtgttg catcttctgc ttaccagatt 180
gaaggaggga gaggtcgtgg tgttaacgtt tgggatggct tcagtcaccg atacccagag 240
aaatcagggt cagatttgaa gaatggagac actacttgtg agtcatacac gagaatgggc 300
gaactcaata ctactggctt cacctttgcg tggccaagaa tctttccaaa aggaaaggtg 360
agtaggggag tgaaccaagg aggtcttgat tactaccacc cactcataga tgcactcctc 420
gaaaagaata cgcctttcgt tagcctcttt cactgggatc ttcctcaaac actccaagat 480
gagtatgaag gtttcttgga ccgcaagatc atacaagatt tcaaagacta cgcggatcta 540
tttttcaccg aatttggtgg aaaggtatgg atcaccatca accagctata cacagtgcct 600
acaagaggct atgctatcgg aacagatgca aataccaagc ccaggtgtta cggtggaaat 660
tcttcaccct acatcggtgc acataaccag cttcttgctc atgccacgct cgtcgatctt 720
tactggacca aatacaagtt ccaaccaggg aagattggac ctgtgatgat tacaagatgg 780
tttcttccat ctgatgagtc tgatcctgcc tccatagaag cagctgagag gatgaacaaa 840
ttcttccatg gatggtacat ggagccgcta acaaagggta gatacccaga catcatgagg 900
cagattgtgg gtagtaggcc taacctcacc gaggaagaag caggactcgt tgctggttac 960
gtcactcaat acgcccagcc aaaacctaac ccatatcctt cagagacaca cactgccatg 1020
atggacgctg taaagctcag atatgataat tcacgtggtg aatttcttgg tccactgttt 1080
gttgaagaca aagtaagcgg caacagctat tactacccaa aaggcattta ttacgttatg 1140
gactacttca aaaccaaaaa cggcgaccct tatgtcaccg aaaatggatt tagtaccccc 1200
agttcagaaa accgtgagca agctattgcc gattacaagc gaatcgatta tctatgcagc 1260
cctctatttt ttctccgcaa ggtcatcaag gagaagggtg tcaacgtgag aggatacttt 1320
gcatgggctc ttggagataa ttatgaattc tgcaaaggtt tcaccgtcag atttggactc 1380
agttacgtta attgggaaga tctggacgac agaaacctca aagaatctgg caaatggtac 1440
cagagattca ttaacgggac tgtcaagaat tctgcgaaac aagatttcct ccgctcaagc 1500
ctctcttccc agagtcagaa gaagaggctc gctgatgcat ga 1542
<210> 2
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
aacacggggg actcttgacc atggatgaag cttcttcttc atggactcgc 50
<210> 3
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
atcggggaaa ttcgagctgg tcacctcatg catcagcgag cctctt 46
Claims (3)
1.一种黑芥子基因bolmyr-01，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.一种利用权利要求1所述基因编码序列提高萝卜硫素含量青花菜种质的方法，其特征在于按如下的步骤进行：
（1）黑芥子酶基因bolmyr-01的合成：经过序列优化的黑芥子酶基因bolmyr-01编码序列SEQ ID NO：1，合成序列溶于50 μL无菌水中，终浓度为200ng/μL；
（2）带酶切位点黑芥子酶基因bolmyr-01扩增：利用带有Nco I和 BstE II酶切位点序列的引物bolmyr-01-F和bolmyr-01-R，以所述合成的序列为模板进行PCR扩增，获得带有酶切位点的bolmyr-01编码序列；
bolmyr-01-F引物，由序列5’ AACACGGGGGACTCTTGACCATGGATGAAGCTTCTTCTTCATGGACTCGC3’组成，SEQ ID NO：2；
bolmyr-01-R引物，由序列5’ ATCGGGGAAATTCGAGCTGGTCACCTCATGCATCAGCGAGCCTCTT3’组成，SEQ ID NO：3；
（3）黑芥子酶基因bolmyr-01过表达载体构建；
（4）黑芥子酶基因bolmyr-01过表达载体遗传转化青花菜；
（5）过表达黑芥子酶基因bolmyr-01青花菜阳性株系筛选；
（6）过表达黑芥子酶青花菜自交纯合；
（7）过表达黑芥子酶青花菜纯合系萝卜硫素含量测定及综合农艺性状评价。
3.一种利用权利要求2所述提高萝卜硫素含量青花菜种质方法的应用，其中提高萝卜硫素含量青花菜种质方法的应用指的是利用创制的种质，采用杂交育种方法进行萝卜硫素青花菜品种的培育。
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