CN113717860A

CN113717860A - 黄篮状菌在三七总皂苷转化为小极性人参皂苷中的应用

Info

Publication number: CN113717860A
Application number: CN202110770076.2A
Authority: CN
Inventors: 杨晓艳; 梁应忠; 崔秀明; 娄灯吉; 郭敏; 邵琳娇; 李银飞
Original assignee: Kunming University of Science and Technology
Current assignee: Kunming University of Science and Technology
Priority date: 2021-07-07
Filing date: 2021-07-07
Publication date: 2021-11-30
Anticipated expiration: 2041-07-07
Also published as: CN113717860B

Abstract

本发明公开黄篮状菌在三七总皂苷转化为小极性人参皂苷中的应用，黄篮状菌菌株分离自新鲜三七根部土壤，具有转化三七总皂苷中5种皂苷单体混合物为小极性人参皂苷的活性，转化产物丰富，包含10种稀有小极性人参皂苷；黄篮状菌发酵工艺简单，室温、持续通氧培养即可，具有广阔的工业化应用前景；对比底物以及产物化学结构发现，该株黄篮状菌酶体系同时兼具水解原人参二醇和三醇型皂苷C‑20位上葡萄糖基、生成20(R/S)‑人参皂苷立体异构体、氧化C‑20位羟基生成(20,21)型和(20,22)型双键3种活性，这一特性在具有人参皂苷转化活性的天然真菌中也是首次发现。

Description

黄篮状菌在三七总皂苷转化为小极性人参皂苷中的应用

技术领域

本发明涉及将黄篮状菌应用于高效转化三七总皂苷中5种单体皂苷(人参皂苷Rb₁、Rd、 Re、Rg₁、三七皂苷R₁)，属于微生物技术应用领域。

技术背景

三七是五加科人参属植物三七Panax Notoginseng(Burk)F.H.Chen的干燥根以及根茎，长期以来三七根一直作为传统入药部位被使用，天然三七根中主要含人参皂苷Rb₁、Rd、Re、 Rg₁、三七皂苷R₁，它们的含量总和占三七总皂苷80％以上。这5种天然皂苷都因其母核侧链上连接有不同种类和数量的糖基，而表现出较大的极性，虽然口服三七根粉后，其中的天然皂苷在肠道菌群的作用下会发生脱糖基作用，转化成利于吸收的小极性人参皂苷(稀有人参皂苷)，但受个体差异及其他因素的影响，转化率很低。通过体外转化促进天然人参皂苷转化为小极性人参皂苷的方法备受人们关注。而相比化学合成，加热转化，微波降解、酸水解等体外转化法，微生物转化法具有反应温和、目标明确，产物稳定，后期处理简单等优势，一直受到研究者们的青睐。

篮状菌属(Talaromyces)是一类重要的植物残体分解菌，可分泌高效的纤维素酶来水解植物中的木质纤维，以增加土壤中的腐殖质。篮状菌分泌的纤维素酶是一种复合酶，包括内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶等胞外酶，其中的β-葡萄糖苷酶类在人参皂苷的水解转化中研究广泛，且不同来源的β-葡萄糖苷酶具有不同的特异性。

大量的体内外研究已经表明，含糖基数量较少的小极性人参皂苷在抗肿瘤方面表现出较好的细胞毒活性，如人参皂苷Rg₃对肺癌细胞A549、黑色素瘤细胞、直肠癌细胞SW480、胆囊癌细胞等具有抑制作用；人参皂苷Rh₁具有重要的抗炎、抗氧化作用，部分研究还表明人参皂苷Rh₁对于神经退行性疾病具有积极的治疗作用；人参皂苷Rg₅的药理活性研究尚处于起步阶段，但在抗癌、抗过敏及抗炎、改善记忆力、抗抑郁、促细胞生长等方面都有药理活性发现；人参皂苷Rh₄可诱导直肠癌细胞、肝癌细胞HepG2发生细胞凋亡来发挥抗肿瘤活性；人参皂苷F₄可诱导人类淋巴细胞瘤JK细胞发生细胞凋亡等。但小极性人参皂苷的传统获取方式具有含量低、成本高、环境污染等弊端。现在也没有一种可靠的方法能将三七根部的主要天然皂苷高效转化为小极性人参皂苷。

发明内容

本发明提供了一种黄篮状菌的新应用，将黄篮状菌应用于促进三七总皂苷中5种单体皂苷 (人参皂苷Rb₁、Rd、Re、Rg₁、三七皂苷R₁)高效转化为小极性人参皂苷，克服了小极性人参皂苷传统获取方式中含量低，成本高，环境污染等弊端，具有转化工艺简单，作用底物多样，转化产物丰富，实际应用价值较高等优势。

本发明黄篮状菌Talaromyces flavus为子囊菌门Ascomycota、散囊菌目Eurotiales、发菌科 Trichocomaceae、篮状菌属Talaromyces真菌，分离自新鲜三七根部土壤中。

本发明黄篮状菌(Talaromyces flavus)F44，基因序列已提交至NCBI数据库，并通过其中的Bankit工具申请到GenBank登录号MW947260，利用软件MEGA6构建***发育树，并结合菌落形态观察及菌丝显微形态观察确定F44为黄篮状菌(Talaromyces flavus)。

本发明黄篮状菌(Talaromyces flavus)已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNO.22438，保藏日期为2021年6月7日。

本发明黄篮状菌高效转化三七总皂苷为小极性人参皂苷的方法，具体步骤为：

(1)PDB液体培养基的配制：培养基中各成分的比例为马铃薯浸出粉5g/L、葡萄糖15g/L，在101kPa、115℃高温高压灭菌30min；

(2)吸取1mL预先制备好的黄篮状菌菌悬液，将其接种到PDB液体培养基中，室温，持续通入无菌空气培养4d，让菌体数量得到一定累积；

(3)底物添加：称取三七总皂苷用质量分数75％的乙醇溶解，在超净工作台中，用无菌注射器吸取三七总皂苷乙醇溶液，连接上0.22μm无菌过滤器向含有菌体的PDB液体培养基中添加，使每1mL液体培养基中含有0.05mg三七总皂苷，继续通入无菌空气培养21d后，转化出小极性人参皂苷。

所述三七总皂苷为人参皂苷Rb₁、Rd、Re、Rg₁、三七皂苷R₁相同质量混合而成。

所述小极性人参皂苷为20-(R)-Rg₂或20-(S)-Rg₂、20-(S)-Rh₁、Rg₆、F₄、Rk₃、Rh₄、20-(S)-Rg₃、 20-(R)-Rg₃、Rk₁、Rg₅的混合物。

本发明所述黄篮状菌培养于PDA固体培养基上时，菌落呈淡黄色略带红色，与其产生的色素有关，菌落质地绒状边缘整齐，菌核多呈土黄色，分生孢子梗呈单轮生或双轮生帚状，分生孢子圆形，子囊孢子椭圆形，大小2～3×1～2μm，表面具有突起可让子囊孢子粘连在一起。

本发明的黄篮状菌(Talaromyces flavus)F44的酶体系同时兼具水解原人参二醇和三醇型皂苷C-20位上葡萄糖基、生成20(R/S)-人参皂苷立体异构体、氧化C-20位羟基生成(20，21)型和(20,22)型双键3种活性，可以促进三七总皂苷为小极性人参皂苷。

附图说明

图1为菌株F44的***发育进化树；

图2为菌株F44的菌落形态；

图3为菌株F44的分生孢子梗形态；

图4为菌株F44的子囊孢子形态；

图5为菌株F44发酵产物的薄层色谱分析结果；

图6为菌株F44发酵产物的高效液相色谱分析结果；

图7原人参二醇型皂苷结构转化反应演示图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

黄篮状菌(Talaromyces flavus)F44分离自新鲜三七根部土壤中，该菌按照以下步骤进行分离纯化：

(1)马丁培养基配制：培养基中各成分的比例为葡萄糖20g/L、酵母浸膏2g/L、蛋白胨5g/L、 MgSO₄ 0.5g/L、KH₂PO₄ 1g/L、琼脂25g/L，其余为水，pH自然，用高压蒸汽灭菌锅121℃，灭菌30min，灭菌结束后取出培养基放入超净工作台，待培养基温度冷却至45℃左右，将提前配好的1％的链霉素水溶液，按每1L培养基对应3mL1％的链霉素水溶液的比例，用无菌注射器吸取后连接0.22μm无菌过滤器进行添加，最后摇匀、倒平板即可；

(2)PDA固体培养基：培养基中各成分的比例为马铃薯浸出粉5g/L、葡萄糖15g/L、琼脂25g/L，其余为水，pH自然；配制PDA斜面培养基配制时需将琼脂浓度调至30g/L，其余成分比例与 PDA固体培养基一致；

(3)菌株的分离：称取三七根部土壤10g，置于250mL锥形瓶中，加入100mL无菌水，振荡混匀后静置，待溶液澄清后，用无菌吸管吸取1mL澄清液至另一无菌试管中，并用无菌水稀释至10mL，依此法连续稀释5次后得被稀释10⁵倍的含菌稀释液，取200mL含菌稀释液涂布至含有链霉素的马丁培养基上，置于恒温培养箱中25℃培养5d；

(4)菌株的纯化：在超净工作台中，用无菌竹签挑取马丁氏培养基上形态各异的单菌落，以平板划线法将其逐一接种到新配制的多个PDA固体培养基上，倒置于25℃恒温配养箱中，培养5d后观察是否长出不同的菌落，若有不同菌落出现，则继续重复挑取单菌落，并用平板划线法将其接种到新的培养基上，直至纯化到只有一种形态的菌落为止，将纯化所得的菌株接种到PDA斜面培养基上，进行一个临时性的编号，置于4℃冰箱保存，本实施例中的黄篮状菌 (Talaromyces flavus)起初的编号是F44。

菌株F44的分子生物学及显微形态鉴定：

(1)真菌ITS测序鉴定：将本实施例分离纯化到的菌株送至北京擎科生物科技有限公司进行ITS扩增测序，最后将测定结果提交至NCBI数据库进行BLAST同源比对，并选择相近种属的菌株利用软件MEGA6中的邻近法(Neighbor-joining)构建得如图1所示的菌株***发育树，从发育树可以初步判断菌株F44与发菌科篮状菌属的真菌相似度最高。

(2)菌落形态鉴定：挑取少量菌丝匀称地接种于PDA固体培养基的3个点上，25℃培养4d 后观察到如2所示的菌落形态，从菌落形态可看出该菌落表面呈淡黄色略带红色，这可能与其产生的色素有关，菌落质地绒状边缘整齐，菌核多呈土黄色，这与文献关于篮状菌的报道是相吻合的。

(3)显微形态鉴定：用光学显微镜对菌株的菌丝进行制片观察，得如图3所示的分生孢子梗形态，从图可以看出菌株的分生孢子梗呈单轮生或双轮生帚状，分生孢子为圆形，进一步借助扫描电子显微镜对菌株的子囊孢子形态进行观察，得如图4所示的子囊孢子形态，从图中可以看出子囊孢子为椭圆形，大小2～3×1～2μm，表面具有突起，可让子囊孢子粘连在一起。显微形态的观察结果与相关文献描述一致，所以综合上述所有数据确定该菌株为发菌科篮状菌属黄篮状菌(Talaromyces flavus)。

篮状菌属真菌能分泌高效的复合酶—纤维素酶，发现将篮状菌属真菌应用于人参皂苷转化领域的研究尚未被报道。

实施例2

黄篮状菌(Talaromyces flavus)F44的应用研究，将F44应用于三七总皂苷转化上，通过菌株与三七总皂苷的混合发酵，并借助薄层色谱(TLC)分析、高效液相色谱分析手段对产物中小极性人参皂苷进行检测，具体步骤如下：

(1)PDB液体培养基的配制：培养基中各成分的比例为马铃薯浸出粉5g/L、葡萄糖15g/L，自然pH，压力101kPa，115℃高温高压灭菌30min；

(2)在超净工作台中，从实施例1中的PDA固体培养基上挑取少量菌丝到步骤(1)的PDB 液体培养基中培养5d，吸取1mL菌悬液，将其接种到新的步骤(1)PDB液体培养基中，以室温，持续通入无菌空气的条件培养4d，使菌体得到一定积累，以抵抗三七总皂苷添加后对菌株早期生长的抑制；

(3)皂苷转化活性试验设计：设置三个组进行三七总皂苷转化活性的研究，分别是菌株对照组(只有菌体)、皂苷对照组(只有皂苷)、皂苷转化组(菌体+皂苷)，称取三七总皂苷(人参皂苷Rb₁、Rd、Re、Rg₁、三七皂苷R₁单体相同质量混合而成)用质量分数75％的乙醇溶解，在超净工作台中，用无菌注射器吸取皂苷混合物溶液，连接上0.22μm无菌过滤器向皂苷转化组、皂苷对照组中添加三七总皂苷，使每1mL液体培养基中含有0.05mg三七总皂苷，菌株对照组接种步骤(2)中的菌悬液后即可，不添加三七总皂苷，三组继续培养21d；

(4)转化产物薄层色谱(TLC)分析：取出菌液置于离心管内，加入等体积水饱和正丁醇涡旋振荡2min，充分萃取发酵液中皂苷类化合物，以5000r/min的转速离心3min，促进菌体沉降及溶液分层，用毛细管吸取上层澄清液，进行薄层色谱分析，展开剂为三氯甲烷-甲醇-水 (V:V:V，6.2:3.0:0.2)，显色剂为10％硫酸-乙醇，TLC分析结果见图5从图中可以看出，相比皂苷对照组和菌株对照组，皂苷转化组出现多个新的显色点且位置高于底物，说明这些物质具有较小的极性，以致于在薄层色谱板显示出较大的迁移距离，这一结果提示可能有小极性人参皂苷生成；

(5)转化产物高效液相色谱(HPLC)分析：将萃取液的正丁醇上层取出以50℃旋干，用1mL 色谱级甲醇进行溶解，再过0.45μm有机系滤膜，之后用高效液相色谱仪进行分析，高效液相分析条件是C₁₈柱(5μm，250mm×4.6mm)；检测波长203nm；柱温30℃；体积流量1.0mL/min；进样量20μL；流动相水溶液(A)-乙腈(B)；洗脱程序是0～25min，20％B；25～73min，20％～38％B；73～78min，38％～46％B；78～80min，46％～49％B；80～90min，49％～56％B； 90～92min，56％～62％B；92～102min，62％～75％B；102～105min，75％～100％B；分析结果见图6，从图中可以看出相比皂苷对照组和菌株对照组，皂苷转化组中出现了许多新的紫外吸收峰，通过与15种稀有人参皂苷对照品比对后，确定转化产物有包括20-(R)-Rg₂或20-(S)-Rg₂、20-(S)-Rh₁、Rg₆、F₄、Rk₃、Rh₄、20-(S)-Rg₃、20-(R)-Rg₃、Rk₁、Rg₅在内的10种小极性人参皂苷生成；

(6)人参皂苷结构转化反应分析：大量天然微生物转化人参皂苷的文献表明，达玛烷型四环三萜皂苷的转化，只会发生原人参二醇型皂苷之间或原人参三醇型皂苷之间，目前未见报道天然微生物能促使原人参二醇、三醇型皂苷之间发生相互转化的研究，基于这样的事实以及本发明内容中转化底物只有Rb₁、Rd两种原人参二醇型皂苷，转化产物有20(S)-Rg₃、20(R)-Rg₃、 Rk₁、Rg₅四种原人参二醇型皂苷的现实，通过对比结构的差异知：在该株菌酶体系作用下，人参皂苷Rb₁ C-20位上末端葡萄糖基被水解后生成人参皂苷Rd，人参皂苷Rd C-20位上末端葡萄糖基再被水解后生成人参皂苷Rg₃，人参皂苷Rg₃的手性碳(C-20)发生异构化，生成一对立体异构体20(S)-Rg₃和20(R)-Rg₃，人参皂苷Rg₃ C-20位上的羟基(-OH)被氧化生成(20,21) 双键型人参皂苷Rk₁和(20，22)双键型人参皂苷Rg₅，具体的转化反应见演示图7，从原理上证实了黄篮状菌(Talaromyces flavus)F44的酶体系同时兼具水解原人参二醇和三醇型皂苷C-20 位上葡萄糖基、生成20(R/S)-人参皂苷立体异构体、氧化C-20位羟基生成(20,21)型和(20,22) 型双键3种活性。

本发明首次将篮状菌属真菌应用于三七总皂苷转化领域，且从产物来看可获得10种稀有人参皂苷(小极性人参皂苷)，说明黄篮状菌在转化天然人参皂苷制备稀有人参皂苷方面具有较大的应用价值。相比单个皂苷转化出单个产物而言，本发明具有更大的推广应用价值，因为在实际生产中转化的原料多为三七根提取物，而提取物本身就是多种皂苷的混合品，通过购买三七根中主要皂苷单体来混合制得三七总皂苷，并进行微生物转化的研究将有利于更好地模拟实际生产环境，本发明为工业化生产奠定可靠的理论基础。

Claims

1.黄篮状菌在三七总皂苷转化为小极性人参皂苷中的应用。

2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述黄篮状菌Talaromyces flavus为子囊菌门Ascomycota、散囊菌目Eurotiales、发菌科Trichocomaceae、篮状菌属Talaromyces真菌。

3.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述黄篮状菌分离自新鲜三七根部土壤中。

4.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述黄篮状菌已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO.22438，保藏日期为2021年6月7日。

5.根据权利要求1所述应用，其特征在于，具体步骤为：

(1)PDB液体培养基的配制：培养基中各成分的比例为马铃薯浸出粉5g/L、葡萄糖15g/L，在101kPa、115℃灭菌30min；

(2)吸取1mL预先制备好的黄篮状菌菌悬液，将其接种到PDB液体培养基中，室温，持续通入无菌空气培养4d；

(3)底物添加：将三七总皂苷用质量分数75％的乙醇溶解，在超净工作台中，用无菌注射器吸取三七总皂苷乙醇溶液，连接上0.22μm无菌过滤器向含有菌体的PDB液体培养基中添加，使每1mL液体培养基中含有0.05mg三七总皂苷，继续通入无菌空气培养21d后，转化出小极性人参皂苷。

6.根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述三七总皂苷为人参皂苷Rb₁、Rd、Re、Rg₁、三七皂苷R₁相同质量混合而成。

7.根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述小极性人参皂苷为20-(R)-Rg₂或20-(S)-Rg₂、20-(S)-Rh₁、Rg₆、F₄、Rk₃、Rh₄、20-(S)-Rg₃、20-(R)-Rg₃、Rk₁、Rg₅的混合物。