CN113717245A - 含有2,8,9-三取代-9h-嘌呤结构片段的egfr降解剂及其盐和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了含有2,8,9‑三取代‑9H‑嘌呤结构片段的EGFR降解剂及其盐和应用，属于抗癌药物技术领域。该类化合物结构新颖，具有显著的降解表皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶的活性，对于人肺癌细胞HCC827(EGFR单突变)和H1975(EGFR双突变)的生长均具有显著的抑制活性，可用于与EGFR突变相关的癌症的治疗，而且其合成原料易得、合成方法容易实现。

Description

含有2,8,9-三取代-9H-嘌呤结构片段的EGFR降解剂及其盐和 应用
技术领域
本发明属于抗癌药物技术领域，具体涉及一种含有2,8,9-三取代-9H-嘌呤结构片段的EGFR降解剂及其盐和应用。
背景技术
目前癌症的主要治疗手段仍然是手术治疗、放射治疗及药物治疗，但在很大程度上仍是以药物治疗为主。传统的抗肿瘤药物活性强，但缺乏选择性，毒性大，患者无法长期用药。因此，研究开发新的抗癌药物具有重要意义。
近年来，随着肿瘤分子生物学研究的进展，对肿瘤发病机理有了更多的认识，找到了许多抗癌药物作用的新靶点，如表皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶、 PI3Ks、BTK等。在非小细胞肺癌中，约有50％的患者呈现EGFR的突变。针对这一特点，已经开发了第一代EGFR酪氨酸激酶抑制剂，如吉非替尼、埃罗替尼、埃克替尼、第二代EGFR酪氨酸激酶抑制剂阿法替尼、第三代EGFR酪氨酸激酶抑制剂奥希替尼，用作抗癌药物。但是，一些患者在使用激酶抑制剂一年左右后，基因容易突变，产生获得性耐药，使激酶抑制剂的抗肿瘤作用大大降低。因此，开发新的抗肿瘤疗法，具有重要意义。
近年来，蛋白降解技术有望成为继小分子抑制剂、免疫疗法等成功抗癌疗法之后的又一重磅疗法。蛋白降解靶向联合体(proteolysis targeting chimeras， PROTACs)是一个双功能分子，由结合靶蛋白的配体、连接体(linker)和E3连接酶配体三部分组成。PROTAC的一端结合靶蛋白(target Protein)，一端结合E3 连接酶(E3 ligase)，三元复合物形成后，靶蛋白被泛素化，并最终经过泛素蛋白酶体***(UPS)降解，PROTAC分子在蛋白降解后可以释放出来并进入下一个降解循环。PROTAC相较于小分子抑制剂有其独特的优势，包括可以靶向一些不可成药的蛋白，克服耐药性以及较低的药物浓度即可产生需要的药理学效应等。近年来，PROTAC技术得到长足的发展和广泛应用，已有二十多种靶蛋白被降解，部分PROTACs的抗细胞增殖活性达到皮摩尔级，远高于相应的小分子抑制剂，前景一片大好。
EGFR是一种跨膜蛋白，也可被PROTAC降解，但目前仍然没有取得较好的效果，尤其对双突变EGFR(L858R/T790M)，跨膜蛋白降解剂的研究仍面临巨大挑战。
针对EGFR单突变体，文献已研究了含喹唑啉(附图1中A)以及吡啶并[3,4-d] 嘧啶(附图1中B)片段的降解剂，该类降解剂只对单突变EGFR有较好的降解作用，但是并未报道对双突变EGFR的降解活性。针对EGFR双突变体，文献报道了含喹唑啉(附图1中D)以及吡啶酮并[2,3-d]嘧啶(附图1中E)片段的降解剂，活性较弱。发明人所在实验室也报道了含嘌呤片段的EGFR突变体降解剂 (附图1中C)。虽然这些双突变EGFR降解剂有一定的效果，但是抗肿瘤细胞增殖的活性普遍较差，只停留在微摩尔水平。近日，European Journal ofMedicinal Chemistry(2021，218，113328)报道了基于卡奈替尼的EGFR双突变体降解剂(附图1中F)，化合物F诱导双突变EGFR降解活性和细胞水平抗增殖活性均达到了纳摩尔水平。即使如此，EGFR双突变体降解剂仍然未能得到充分的开发，发现活性好选择性高的EGFR双突变体降解剂有望解决第一代EGFR抑制剂用药后的耐药问题，以及规避第三代EGFR抑制剂使用后发生的EGFR第三次突变。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种含有2,8,9-三取代-9H-嘌呤结构片段的EGFR降解剂及其盐和应用。该类化合物结构新颖，降解 EGFR酪氨酸激酶单突变(del19)和双突变(L858R/T790M)的活性明显提高，具有显著的抗人肺癌细胞HCC827和H1975增殖的活性，可应用于抗癌药物制剂的制备，而且其合成原料易得、合成方法容易实现。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
本发明公开了一种含有2,8,9-三取代-9H-嘌呤结构片段的EGFR降解剂，其结构式为：
Figure BDA0003252821240000031
式中，R1为丙烯酰基吡咯烷基或丙烯酰基哌啶基；R2为氢或氟；R3为甲基或氢；连接臂为烷基酰基。
优选地，R1为N-丙烯酰基-3-吡咯烷基或N-丙烯酰基-3-哌啶基。
进一步优选地，所述的N-丙烯酰基-3-吡咯烷基和N-丙烯酰基-3-哌啶基中的手性中心为S-型。
优选地，所述的连接臂为5-取代戊酰基、6-取代己酰基、7-取代庚酰基、8- 取代辛酰基、9-取代壬酰基、6-(2-取代乙酰氨基)己酰基或7-(2-取代乙酰氨基)庚酰基。
本发明还公开了基于上述含有2,8,9-三取代-9H-嘌呤结构片段的EGFR降解剂的可药用盐，所述可药用盐为盐酸盐、氢溴酸盐、硝酸盐、磷酸盐、硫酸盐、醋酸盐、富马酸盐、苹果酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、马来酸盐、乳酸盐、枸橼酸盐、樟脑磺酸盐、苯甲酸盐、葡糖酸盐、谷氨酸盐、羟乙磺酸盐、琥珀酸盐或甲磺酸盐。
本发明还公开了基于上述含有2,8,9-三取代-9H-嘌呤结构片段的EGFR降解剂或上述含有2,8,9-三取代-9H-嘌呤结构片段的EGFR降解剂的可药用盐在制备抗癌药物制剂中的应用。
优选地，所述抗癌药物制剂为能降解单突变的EGFR或能降解双突变的 EGFR的抗癌药物制剂。
进一步优选地，所述单突变的EGFR为人肺癌细胞HCC827所携带；双突变的EGFR为人肺癌细胞H1975所携带。
优选地，所述抗癌药物制剂为注射剂、片剂或胶囊剂。
进一步优选地，所述抗癌药物制剂中，每支、每片或每粒制剂中含10～300mg 的2,8,9-三取代-9H-嘌呤结构片段的EGFR降解剂或其可药用盐。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供的含有2,8,9-三取代-9H-嘌呤结构片段的EGFR降解剂或其盐类化合物具有降解表皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶的活性。化合物结构中含丙烯酰胺片段，可与EGFR突变体发生共价结合。与EGFR突变体强的结合力使得该类化合物易促进三元复合物(EGFR：PROTAC：E3)的形成，使EGFR 突变体被有效泛素化，继而被降解。对于EGFR单突变人肺癌细胞HCC827和 EGFR双突变人肺癌细胞H1975均有显著的抗增殖作用，IC50值为纳摩尔级，可用于与EGFR突变相关的癌症的治疗。
本发明提供的含有2,8,9-三取代-9H-嘌呤结构片段的EGFR降解剂及其盐类化合物，能够应用于制备抗癌药物制剂，其中每支、每片或粒该药物制剂中含有10～100mg。在利用本发明给出的活性化合物制备抗癌药物制剂时，可以将该药物制成注射剂、片剂或胶囊剂。这些药物制剂可按照各种制剂的常规制备工艺制成。对于片剂或胶囊剂，优选的含量为50～100mg。并且本发明涉及的口服制剂中可含有药用辅料，包括添加剂、稳定剂、增溶剂、润滑剂、崩解剂等，如淀粉、糊精、葡萄糖、乳糖、纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、交联聚乙烯吡咯烷酮、果胶、环糊精、土温-80、聚乙烯醇、硬脂酸镁、滑石粉等。
附图说明
图1为文献报道的EGFR降解剂；其中，A为针对EGFR单突变体的含喹唑啉片段的降解剂；B为含吡啶并[3,4-d]嘧啶片段的降解剂；C为含嘌呤片段的 EGFR突变体降解剂；D为针对EGFR双突变体的含喹唑啉片段的降解剂；E为含吡啶酮并[2,3-d]嘧啶片段的降解剂；F为基于卡奈替尼的EGFR双突变体降解剂；
图2为9-位含有丙烯酰氨基片段的-9H-嘌呤类化合物的合成路线；其中，步骤一为b在酸存在下脱保护基得到c；步骤二为c经过丙烯酰化得到d；步骤三为在碱存在下，d水解得到e；步骤四为在缩合剂存在下，e与f或g缩合可得到目标物T；
图3为化合物诱导EGFR突变体降解的活性；其中，A为化合物诱导 EGFRL858R/T790M双突变体降解的活性；B为化合物诱导EGFRdel19单突变体降解的活性；
图4为化合物3诱导EGFRL858R/T790M降解的时效关系；
图5为化合物3诱导EGFR突变体降解的量效关系；其中，A为化合物3诱导EGFRL858R /T790M降解的量效关系；B为化合物3诱导EGFRdel19降解的量效关系；
图6为化合物3对A431细胞中野生型EGFR的影响；
图7为化合物3对EGFR及其下游效应分子磷酸化的影响；其中，A为化合物3对EGFRL858R/T790M及其下游效应分子磷酸化的影响；B为化合物3对EGFRdel19及其下游效应分子磷酸化的影响。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、***、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
下面结合附图2对本发明做进一步详细描述：
1、合成化合物1-7的具体实施例
代表性化合物的结构式、编号如下：
Figure BDA0003252821240000071
下面给出上述化合物合成的实施例，化合物的结构经HRMS表征。
实施例一：(2S，4R)-1-((S)-2-(7-(4-(4-((9-((S)-1-丙烯酰基-3- 吡咯烷基)-8-苯氨基-9H-2-嘌呤基)氨基)苯基)-1-哌嗪基)庚酰氨基)-3-(3， 3-二甲基)-丁酰基)-4-羟基-N-(4-(4-甲基-5-噻唑基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺 (结构式1)的合成
步骤一：(S)-2-((4-(4-(7-乙氧基-7-氧庚基)-1-哌嗪基)苯基)氨基) -8-苯氨基-9-(3-吡咯烷基)-9H-嘌呤(c1)的合成
Figure BDA0003252821240000081
参考文献J.Med.Chem.2012,55,10685-10699，Eur.J.Med.Chem.2020,186,111888及Eur.J.Med.Chem.2020,208,112781合成中间体b1；参考文献Eur.J.Med.Chem.2020,186,111888制备c1，收率60％。
步骤二：(S)-2-((4-(4-(7-乙氧基-7-氧庚基)-1-哌嗪基)苯基)氨基) -8-苯氨基-9-(N-丙烯酰基-3-吡咯烷基)-9H-嘌呤(d1)的合成
Figure BDA0003252821240000082
将c1(0.27g，0.57mmol)混悬于丙酮(2mL)中，冰浴冷却搅拌5min，然后将丙烯酰氯(70μL，0.86mmol)溶于丙酮(3mL)滴入上述混合物中，滴毕后撤去冰浴，室温搅拌10min，然后加入几滴饱和碳酸钠溶液猝灭反应，蒸干溶剂，向残留物中加入水(10mL)及饱和碳酸钠溶液(20mL)，DCM萃取(5×30 mL)，有机相用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤掉硫酸钠，滤液蒸除溶剂后用硅胶柱色谱分离(DCM：MeOH＝30:1-10:1)，所得产物用乙酸乙酯结晶得d1，收率48％。
步骤三：(S)-7-(4-(4-(8-苯氨基-9-(N-丙烯酰基-3-吡咯烷基)-9H-2-嘌呤氨基)苯基)-1-哌嗪基)庚酸(e1)的合成
Figure BDA0003252821240000091
将d1(0.10g，0.15mmol)混悬于无水乙醇(4mL)和水(2mL)的混合溶剂中，冰浴冷却搅拌5min，然后加入NaOH(0.12g，3.0mmol)固体颗粒，维持冰浴搅拌2h。反应毕后用3mol·L-1HCl调pH至7，蒸干溶剂，加入水(3mL)，然后用1mol·L-1HCl调pH至4，析出固体，抽滤，水洗，干燥得e1，收率75％。
步骤四：(2S，4R)-1-((S)-2-(7-(4-(4-((9-((S)-1-丙烯酰基-3-吡咯烷基)-8-苯氨基-9H-2-嘌呤基)氨基)苯基)-1-哌嗪基)庚酰氨基)-(3，3-二甲基)-丁酰基)-4-羟基-N-(4-(4-甲基-5-噻唑基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺(1) 的合成
Figure BDA0003252821240000092
参考文献Eur.J.Med.Chem.2020,208,112781制备1，收率29％。HRMS(ESI)；计算值：1050.55001[M+H]+，测量值：1050.55514。
实施例二：(2S，4R)-1-((S)-2-(7-(4-(4-((9-((S)-1-丙烯酰基-3- 哌啶基)-8-苯氨基-9H-2-嘌呤基)氨基)苯基)-1-哌嗪基)庚酰氨基)-(3，3- 二甲基)丁酰基)-4-羟基-N-(4-(4-甲基-5-噻唑基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺(结构式2)的合成
化合物2的制备同实施例一。HRMS(ESI)：计算值：1064.56566[M+H]+，测量值：1064.57031。
实施例三：(2S，4R)-1-((S)-2-(8-(4-(4-((9-((S)-1-丙烯酰基-3- 哌啶基)-8-苯氨基-9H-2-嘌呤基)氨基)苯基)-1-哌嗪基)辛酰氨基)-(3，3- 二甲基)丁酰基)-4-羟基-N-(4-(4-甲基-5-噻唑基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺(结构式3)的合成
化合物3的制备同实施例一。HRMS(ESI)：计算值：1078.58131[M+H]+，测量值：1078.58234。
实施例四：(2S，4R)-1-((S)-2-(6-(2-(4-(4-((9-((S)-1-丙烯酰基 -3-哌啶基)-8-苯氨基-9H-2-嘌呤基)氨基)苯基)-1-哌嗪基)乙酰氨基)己酰氨基)-(3，3-二甲基)丁酰基)-4-羟基-N-(4-(4-甲基-5-噻唑基)苄基)吡咯烷 -2-甲酰胺(结构式4)的合成
化合物4的制备同实施例一。HRMS(ESI)：计算值：1107.57147[M+H]+，测量值：1107.57479。
实施例五：(2S，4R)-1-((S)-2-(7-(2-(4-(4-((9-((S)-1-丙烯酰基 -3-哌啶基)-8-苯氨基-9H-2-嘌呤基)氨基)苯基)-1-哌嗪基)乙酰氨基)庚酰氨基)-(3，3-二甲基)丁酰基)-4-羟基-N-(4-(4-甲基-5-噻唑基)苄基)吡咯烷 -2-甲酰胺(结构式5)的合成
化合物5的制备同实施例一。HRMS(ESI)：计算值：1121.58712[M+H]+，测量值：1121.58943。
实施例六：(2S，4R)-1-((S)-2-(8-(4-(4-((9-((S)-1-丙烯酰基-3- 哌啶基)-8-苯氨基-9H-2-嘌呤基)氨基)苯基)-1-哌嗪基)辛酰氨基)-(3，3- 二甲基)丁酰基)-4-羟基-N-((S)-1-(4-(4-甲基-5-噻唑基)苯基)乙基)吡咯烷-2-甲酰胺(结构式6)的合成
化合物6的制备同实施例一。HRMS(ESI)：计算值：1092.59696[M+H]+，测量值：1092.60196。
实施例七：(2S，4R)-1-((S)-2-(8-(4-(4-((9-((S)-1-丙烯酰基-3- 哌啶基)-8-(4-氟苯氨基)-9H-2-嘌呤基)氨基)苯基)-1-哌嗪基)辛酰氨基) -(3，3-二甲基)丁酰基)-4-羟基-N-(4-(4-甲基-5-噻唑基)苄基)吡咯烷-2- 甲酰胺(结构式7)的合成
化合物7的制备同实施例一。HRMS(ESI)：计算值：1096.57189[M+H]+，测量值：1096.57643。
2、细胞活性
为了验证本发明的含2,8,9-三取代-9H-嘌呤结构片段的EGFR降解剂及其盐的抗癌活性，以AZD9291(奥希替尼)为阳性对照药物，采用体外MTT法测定了化合物1-7对三种人癌细胞HCC827(EGFRdel19)，H1975(EGFRL858R/T790M)和 A431(EGFRWT)的生长抑制作用。
验证方法：将肿瘤细胞培养在含10％胎牛血清的RPMI1640培养基中，内含青霉素有100U·mL-1，链霉素100μg·mL-1，于37℃、5％CO2培养箱中传代培养。取0.25％胰酶消化贴壁的肿瘤细胞，含10％胎牛血清的RPMI1640培养液配制细胞悬液，浓度为2.5×104个细胞/毫升。于96孔培养板内每孔接种200μL(约含 5000个肿瘤细胞)，37℃培养24h。给药组加入不同浓度药物，每药设定0.0003、 0.001、0.003、0.01、0.03、0.1、0.3、1、3和10μmol·L-1 10个浓度梯度，每组设 3个平行孔。对照组加入与药等体积的溶剂，置于37℃、5％CO2培养箱中培养 72h后弃去培养液，每孔加入20μL 5mg·mL-1的MTT溶液，孵育4h后，弃去上清液，每孔加入DMSO 200μL，轻度振荡后用酶标仪在490nm下测定光密度值(OD)。
结果计算：以溶剂对照处理的肿瘤细胞为对照组，按照下式求药物对肿瘤细胞的抑制率：
Figure BDA0003252821240000121
并进一步采用线性回归法求出半数抑制浓度(IC50)，测定结果见表1。
表1.化合物对三种人癌细胞的抗增殖活性(IC50，nmol·L-1)
Figure BDA0003252821240000122
表中IC50为三次试验的平均值，“ND”代表未测定。
表1的数据表明，本发明提供的化合物对H1975和HCC827细胞的增殖具有显著的抑制作用，而对A431细胞作用很弱，说明化合物的细胞选择性强。
3、Western Blotting分析
为了进一步验证本发明合成的9-位含有丙烯酰氨基片段的-9H-嘌呤类化合物诱导EGFR降解的活性，我们采用Western Blotting方法测定了化合物对EGFR 水平及下游信号转导的影响。
方法：将H1975细胞按8×105/孔的数量接种到六孔板中，在37℃、5％CO2培养箱中培养24h，加入2μL不同浓度梯度的化合物1～4的DMSO溶液，继续培养24h后，用含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的裂解液裂解细胞，12000rpm 离心20min，取上清，加入loadingbuffer混匀后在95℃水浴锅中加热10min变性，蛋白按每孔25μg上样量用8％SDS-PAGE分离并转移至PVDF膜，将PVDF 膜置于5％脱脂牛奶中封闭1h，然后于一抗溶液中4℃孵育过夜、二抗溶液中室温孵育1h，最后曝光拍照，结果如图3～图7所示，其中，图3说明化合物可以促进EGFR突变体的降解；图4说明给药48h后，化合物3降解EGFRL858R/T790M降解率达到最大；图5说明化合物3有强的诱导EGFR降解的作用，对双突变及单突变EGFR的DC50分别为1.56和0.49nmol·L-1；图6说明化合物不能使野生型EGFR降解，有较好的选择性。这些结果与细胞活性结果一致；图7说明降解剂3通过降解H1975细胞和HCC827细胞中EGFR，抑制了其信号通路的转导。
本发明没有详细叙述的测试方法为本领域内常用的测试方法或现有方法，在此不一一叙述。
以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种含有2,8,9-三取代-9H-嘌呤结构片段的EGFR降解剂，其特征在于，其结构式为：
Figure FDA0003252821230000011
式中，R1为丙烯酰基吡咯烷基或丙烯酰基哌啶基；R2为氢或氟；R3为甲基或氢；连接臂为烷基酰基。
2.如权利要求1所述的含有2,8,9-三取代-9H-嘌呤结构片段的EGFR降解剂，其特征在于，R1为N-丙烯酰基-3-吡咯烷基或N-丙烯酰基-3-哌啶基。
3.如权利要求2所述的含有2,8,9-三取代-9H-嘌呤结构片段的EGFR降解剂，其特征在于，所述的N-丙烯酰基-3-吡咯烷基和N-丙烯酰基-3-哌啶基中的手性中心为S-型。
4.如权利要求1所述的含有2,8,9-三取代-9H-嘌呤结构片段的EGFR降解剂，其特征在于，所述的连接臂为5-取代戊酰基、6-取代己酰基、7-取代庚酰基、8-取代辛酰基、9-取代壬酰基、6-(2-取代乙酰氨基)己酰基或7-(2-取代乙酰氨基)庚酰基。
5.权利要求1～4任一项所述的含有2,8,9-三取代-9H-嘌呤结构片段的EGFR降解剂的可药用盐，其特征在于，所述可药用盐为盐酸盐、氢溴酸盐、硝酸盐、磷酸盐、硫酸盐、醋酸盐、富马酸盐、苹果酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、马来酸盐、乳酸盐、枸橼酸盐、樟脑磺酸盐、苯甲酸盐、葡糖酸盐、谷氨酸盐、羟乙磺酸盐、琥珀酸盐或甲磺酸盐。
6.权利要求1～4任一项所述的含有2,8,9-三取代-9H-嘌呤结构片段的EGFR降解剂或权利要求5所述的含有2,8,9-三取代-9H-嘌呤结构片段的EGFR降解剂的可药用盐在制备抗癌药物制剂中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的抗癌药物制剂为能降解单突变的EGFR或能降解双突变的EGFR的抗癌药物制剂。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，单突变的EGFR为人肺癌细胞HCC827所携带；双突变的EGFR为人肺癌细胞H1975所携带。
9.如权利要求6～8所述的应用，其特征在于，所述抗癌药物制剂为注射剂、片剂或胶囊剂。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，抗癌药物制剂中，每支、每片或每粒制剂中含10～300mg的2,8,9-三取代-9H-嘌呤结构片段的EGFR降解剂或其可药用盐。
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