CN113717188A

CN113717188A - 一类生物碱化合物及其用途

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Publication number: CN113717188A
Application number: CN202111056784.6A
Authority: CN
Inventors: 李丽梅
Original assignee: Southwest Minzu University
Current assignee: Southwest Minzu University
Priority date: 2021-09-09
Filing date: 2021-09-09
Publication date: 2021-11-30
Anticipated expiration: 2041-09-09
Also published as: CN113717188B

Abstract

本发明公开了中国水仙鳞茎中一类新生物碱化合物。经体外细胞活性研究表明，从中国水仙鳞茎中分离得到的这类新化合物对T细胞具有较好的抑制活性，可将该化合物开发制备成免疫抑制药物。

Description

一类生物碱化合物及其用途

技术领域

本发明涉及一类具有免疫抑制活性的新化合物，属多花水仙碱型生物碱化合物。

背景技术

中国水仙(Narcissus tazetta var.chinensis)是石蒜科(Amaryllidaceae)水仙属(Narcissus)多年生草本植物，其鳞茎具有清热解毒、散结消肿功效。研究表明中国水仙鳞茎中主要含有生物碱、黄酮、黄烷及其衍生物和木脂素等成分，其中石蒜生物碱是其特有的次生代谢产物，结构类型丰富，根据环的类型不同分为石蒜碱类、网球花胺类、多花水仙碱类、水仙环素类和加兰他敏类等。

为了提高中国水仙药用植物资源的综合利用效率，发明人对其鳞茎部分的生物碱成分进行了***研究，以期能够发现具有生物活性的提取物或化合物。

发明内容

发明人通过对中国水仙鳞茎部分生物碱进行提取纯化，最终获得了一类具有良好生物活性的生物碱类化合物。

具体地，本发明提供了如式I所述的化合物、其药学上可接受的盐或氘代化合物，其结构式如下：

其中，R选自H、C1-C5烷基、-C(O)-R1、糖基；

所述R1选自C5-C11、C13-C23的饱和或不饱和烷基。

本发明中，C1-C5烷基可以选自甲基、乙基、丙基、丁基等；可进一步选自C1-C3的烷基。

本发明中，糖基可以选自天然提取物中常见的糖基，例如木糖基、甘露糖基、葡萄糖基、半乳糖基、***糖基、葡萄糖醛酸基，半乳糖醛酸基、鼠李糖基等。

当R选自糖基时，该化合物即为糖苷类结构，糖苷键可以是植物种天然存在，亦可通过常规的糖基化反应制备。

本发明中，所述-C(O)-的结构为羰基。

其中，当R1选自C5-C11的饱和或不饱和烷基时，-C(O)-R1基团可以来源于中链脂肪酸，如己酸、辛酸、癸酸、月桂酸。

当R1选自C13-C23的饱和或不饱和烷基时，-C(O)-R1基团可来源于长链脂肪酸，如棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸。

当R选自-C(O)-R1时，该化合物可以通过从植物种分离提取得到，亦可通过常规的酯化反应制备。

本发明中所述免疫抑制剂，是对机体的免疫反应具有抑制作用的药物，能抑制与免疫反应有关细胞(T细胞和B细胞等巨噬细胞)的增殖和功能，能降低抗体免疫反应。

T淋巴细胞(T lymphocyte)简称T细胞，是由来源于骨髓的淋巴干细胞，在胸腺中分化、发育成熟后，通过淋巴和血液循环而分布到全身的免疫器官和组织中发挥免疫功能。

该类生物碱化合物具有免疫抑制活性，可用于制备免疫抑制药物。因此，本发明还提供一种药物组合物，其活性成分包括该类生物碱化合物，以及药学上可接受的辅料。

所述的药物组合物含有药学上各种常用添加剂(如赋形剂等)，以制成药物制剂。根据治疗目的，可将该药物组合物制成各种类型的给药单位剂型，如片剂、丸剂、粉剂、液体、混悬剂、凝胶、乳液、乳膏、颗粒剂、硬胶囊、栓剂和针剂(溶液及悬浮液，一般为注射剂)等。优选地，该药物组合物的剂型为注射剂，用于局部注射(如皮下、神经周围、关节内腔等)；或者，该药物组合物的剂型为凝胶、乳液、乳膏等，可涂覆于局部；或者，该药物组合物的剂型为片剂、丸剂、粉剂、颗粒剂、硬胶囊等，通过口服给药达到免疫抑制效果。

为了使片剂形式的药物组合物成形，可使用本领域任何已知的并广泛使用的赋形剂。例如，载体，如乳糖、白糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、淀粉、碳酸钙、高岭土、结晶纤维素和硅酸等；粘合剂，如水、乙醇、丙醇、普通糖浆、葡萄糖溶液、淀粉溶液、明胶溶液，羧甲基纤维素、紫胶、甲基纤维素和磷酸钾、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解剂，如干淀粉、藻酸钠、琼脂粉和海带粉、碳酸氢钠、碳酸钙、聚乙烯脱水山梨醇的脂肪酸酯、十二烷基硫酸钠、硬脂酸单甘酯、淀粉和乳糖等；崩解抑制剂，如白糖、甘油三硬脂酸酯、椰子油和氢化油；吸附促进剂，如季胺碱和十二烷基硫酸钠等；润湿剂，如甘油、淀粉等；吸附剂，如淀粉、乳糖、高岭土、膨润土和胶体硅酸等；以及润滑剂，如纯净的滑石，硬脂酸盐、硼酸粉和聚乙二醇等。如果需要，还可以用通常的涂渍材料使片剂作为糖衣片剂、涂明胶膜片剂、肠衣片剂、涂膜片剂、双层膜片剂及多层片剂。

为了使丸剂形式的药物组合物成形，可使用本领域任何已知的并广泛使用的赋性剂，例如，载体，如乳糖、淀粉、椰子油、硬化植物油、高岭土和滑石等；粘合剂，如***树胶粉、黄著胶粉、明胶和乙醇等；崩解剂，如琼脂和海带粉等。

为了使栓剂形式的药物组合物成形，可使用本领域任何已知并广泛使用的赋性剂，例如、聚乙二醇、椰子油、高级醇、高级醇的酯、明胶和半合成的甘油酯等。

为了制备针剂形式的药物组合物，可将溶液和悬浮液消毒，并最好加入适量的氯化钠、葡萄糖或甘油等，制成与血液等渗压的针剂。在制备针剂时，也可使用本领域内任何常用的载体，例如，水、乙醇、丙二醇、乙氧基化的异硬脂醇、聚氧基化的异硬脂醇和聚乙烯脱水山梨醇的脂肪酸酯等。此外，还可加入通常的溶解剂、缓冲剂和止痛剂等。

本发明提供的这类生物碱化合物及其药学上可接受的盐在药物组合物中的含量无特殊限制，可在很宽的范围内进行选择，通常可为质量百分比0.1～99.9％，较佳的为质量百分比1～70％，更佳的为质量百分比1～30％。

本发明中，所述的药物组合物的给药方法没有特殊限制。可根据病人年龄、性别和其它条件及症状，选择各种剂型的制剂给药。例如，片剂、丸剂、溶液、悬浮液、乳液、颗粒剂和胶囊是口服给药；针剂可以单纯用针剂进行肌肉、皮内、皮下或腹内注射；栓剂为给药到直肠。

本发明中，可以根据服药方法、病人年龄、性别和其它条件以及症状适当地选择用药剂量。通常的给药剂量可为：约0.01～300mg药物活性成分/kg体重/天。一般来说，每个给药单位剂型可含1～200mg的药物活性成分。在不违背本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实施例。

本发明组合中还可以包括其他免疫抑制剂，例如(1)糖皮质激素类，如可的松和强的松；(2)微生物代谢产物，如环孢菌素和藤霉素等；(3)抗代谢物，如硫唑嘌呤和6-巯基嘌呤等；(4)多克隆和单克隆抗淋巴细胞抗体，如抗淋巴细胞球蛋白和OKT3等；(5)烷化剂类，如环磷酰胺等。中的一种或多种。

除另有说明，本发明中公开的术语和缩写具有它们标准的含义。

本发明中，所述氘代化合物，是指本发明生物碱类化合物分子中的一个或多个氢被同位素氘取代后的化合物。

氘是自然界存在的氢同位素。将氢替换为氘后，可能改善药物的药代动力学参数，同时保证疗效。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为化合物1的核磁共振氢谱(¹H NMR)；

图2为化合物1的核磁共振碳谱(¹³C NMR)；

图3为化合物2的核磁共振氢谱(¹H NMR)；

图4为化合物2的核磁共振碳谱(¹³C NMR)；

图5为化合物1和2的主要HMBC相关；

图6为该化合物1和2的主要NOESY相关。

具体实施方式

实施例1

新鲜水仙鳞茎40公斤，用切菜机将其反复切碎，用甲醇60℃提取2次，提取液浓缩得到浸膏，用水分散，以氨水调节pH＝10，用等体积正丁醇萃取得到总生物碱(105g)，进行正相硅胶柱层析，以氯仿-甲醇(1:0-0:1)梯度洗脱(每个梯度3个柱体积)，TLC分析合并相似组分，依次得到A-G 7个部分。

B部分(14g)进一步进行正相硅胶柱层析，以石油醚-丙酮(15:1-1:1)梯度洗脱(每个梯度3个柱体积)，浓缩后点板合并相似组分，得到B-1～B-6等6个部分。

B-5(3.3g)进一步进行ODS反相柱层析，以甲醇-水(0:1-1:1)梯度洗脱(每个梯度4柱体积)，浓缩后点板合并相似组分，得到B-5-1～B-5-5等5个部分。

B-5-2(55mg)以20％甲醇水(1‰TFA)洗脱，半制备HPLC(C18柱10×250mm,10μm)得到化合物2(16mg,1mL/min,Rt＝8min)。

G部分(40g)进行ODS反相柱层析，以甲醇-水(0:1-1:0)梯度洗脱(每个梯度4柱体积)，浓缩后点板合并相似组分，得到G-1～G-4等4个部分。

其中G-1(1.0g)进行氨基硅胶柱层析，以氯仿/甲醇40:1-20:1梯度洗脱(每个梯度2柱体积)，得到化合物1(10mg)(化合物1是在30:1梯度段中获得)。

所得化合物1、2的理化性质和光谱数据如下：

化合物1：白色无定型粉末，易溶于甲醇、氯仿；

UV(MeOH)λ_max(logε)：206(4.17),241(3.26),291(3.35)；¹H and ¹³C NMR数据见表1；HRESIMS m/z288.1236[M+H]⁺(calcd for C₁₆H₁₈NO₄,288.1230)。命名为：3-O-demethyl-6a-deoxynortazettine，化学名为(3S,4aS,6aR,13bS)-3,4,4a,5,6,6a-hexahydro-8H-[1,3]dioxolo[4',5':6,7]isochromeno[3,4-c]indol-3-ol

化合物2：白色无定型粉末，易溶于甲醇、氯仿；

UV(MeOH)λ_max(logε)：207(4.28),241(3.36),293(3.47)；¹H and ¹³C NMR数据见表1；HRESIMS m/z302.1392[M+H]⁺(calcd for C₁₇H₂₀NO₄,302.1387)。命名为6a-deoxynortazettine，化学名为(3S,4aS,6aR,13bS)-3-methoxy-3,4,4a,5,6,6a-hexahydro-8H-[1,3]dioxolo[4',5':6,7]isochromeno[3,4-c]indole。

化合物1、2的结构式如下：

表1.化合物1和2的¹H NMR(400MHz)和¹³C NMR(100MHz)数据(in CD₃OD)

新化合物的结构确认：

化合物1为白色无定形粉末，溶于甲醇；与改良碘化铋钾显色反应阳性，提示可能为生物碱类化合物；HR-ESI-MS给出其准分子离子峰为m/z:288.1236[M+H]⁺(计算值为C₁₆H₁₈NO₄,288.1230)，确定分子量为287。结合氢谱、碳谱推断分子式为C₁₆H₁₇NO₄，不饱和度为9。¹H-NMR(400MHz,CD₃OD)在芳香质子区域给出两个单峰δ_H 6.72(1H,s)和δ_H 7.07(1H,s)，显示存在一个有对位氢的四取代苯环；给出一对顺式取代双键质子δ_H 6.38(1H,d,J＝10.0Hz)和δ_H 6.29(dd,J＝10.0,4.8Hz)；给出亚甲基质子信号δ_H 5.98(s)，结合碳谱δ_C103.1的亚甲基碳信号，显示该化合物具有亚甲二氧基。此外，¹³C-NMR谱(100MHz,CD₃OD)和HMQC谱显示，此化合物中还有3个脂肪亚甲基，3个脂肪次甲基，4个芳香季碳，1个饱和季碳，初步推测为多花水仙碱型生物碱，与已知化合物nortazettine核磁数据对比(The Journalof Organic Chemistry,1968,33(8):3105-3109.)，化合物1少了1个饱和季碳(δ_C 101.4)多了1个脂肪次甲基(δ_C 78.5,δ_H 4.17)，另外还少了1个甲氧基，提示化合物1可能为3-O-demethyl-6a-deoxynortazettine。在HMBC谱中，H-4a与C-6、C-6a相关，H-6a与C-12a相关，H-1与C-3、C-4a相关，H-3与C-4a相关，证明了以上推测的合理性(如图5所示)。在NOESY谱中，H-4a与H-6a、H-6β相关，H-3α与H-6α相关，确定了化合物1的相对立体构型与nortazettine相同(如图6所示)。因此，化合物1被鉴定为3-O-demethyl-6a-deoxynortazettine。其¹H NMR和¹³C NMR数据见表1。

化合物2为白色无定形粉末，溶于甲醇；与改良碘化铋钾显色反应阳性，提示可能为生物碱类化合物；HR-ESI-MS给出其准分子离子峰为m/z:302.1392[M+H]⁺(计算值为C₁₇H₂₀NO₄,302.1387)。结合氢谱、碳谱推断分子式为C₁₇H₂₀NO₄，不饱和度为9。通过仔细比较，发现化合物2和1具有几乎一致的¹H NMR和¹³C NMR数据，唯一的区别在于化合物2比1多了一个甲氧基。提示化合物2可能比化合物1在C-3位多了1个甲氧基。在HMBC谱中H-OMe与C-3相关，H-3与C-1、C-4a相关，证实了以上推测，其他HMBC相关及NOESY相关与化合物1一致(如图5、图6所示)，因此，化合物2被鉴定为6a-deoxynortazettine。

实施例2：

新化合物的免疫抑制活性及有益效果：

下面结合细胞试验对本发明提供的两个生物碱类化合物在免疫抑制方面的效果进行评价。

1)T细胞分离与纯化方案

取健康献血员的外周血，Ficoll密度梯度离心法分离PBMC。采用免疫磁珠分离法，通过阴性选择从PBMC中获得“未改变的”(untouched)CD4+T细胞。具体操作参照Miltenyi公司Pan T Cell Isolation Kit II(Human)说明书。纯化的CD4+T细胞，通过流式细胞术检测，细胞阳性率大于95％方可用于后续试验。

2)T细胞刺激方案

使用anti-CD3/CD28 mAbs刺激T细胞，具体试验步骤均按常规操作进行。

3)免疫抑制活性的检测

采用免疫磁珠分离法从人外周血单个核细胞(PBMC)获得T细胞。铺96孔板，2×10⁵/孔。以anti-CD3/CD28 mAbs刺激T活化增殖，96hr后，该类生物碱化合物(1和2，浓度依次为0.2,1,5,25μM)，孵育72hr，CFSE染色结合流式细胞术检测样品，通过与阴性对照(DMSO)进行比较，判定样品对活化T细胞增殖的抑制作用。

4)试验结果

试验结果表明，该类生物碱化合物显示出很好的免疫抑制活性，其对T细胞增殖抑制活性的IC₅₀分别为26.3,21.5μM(表2)，揭示了本发明提供的这类生物碱化合物在制备免疫抑制药物中有良好的应用前景。

表2

结论：本发明提供的这类生物碱化合物是首次被分离出来的新化合物，通过旋光、紫外、核磁共振和质谱测定方法确定了其为多花水仙碱型石蒜生物碱类化合物，并表征了具体结构。经免疫抑制活性检测试验，结果显示该化合物对T细胞增殖具有显著抑制活性，IC₅₀分别为26.3,21.5μM，由此说明该类化合物具有较好的免疫抑制活性，揭示了该类化合物在制备免疫抑制药物中有良好的应用前景，可作为免疫抑制药物的先导化合物，有助于自身免疫性疾病和免疫排斥的治疗。

Claims

1.如式I所述的化合物、其药学上可接受的盐或氘代化合物，其结构式如下：

其中，R选自H、C1-C5烷基、-C(O)-R1、糖基；

所述R1选自C5-C11、C13-C23的饱和或不饱和烷基。

2.根据权利要求1所述的化合物、其药学上可接受的盐或氘代化合物，其结构式如下：

3.根据权利要求1或2所述的化合物、其药学上可接受的盐或氘代化合物，其特征在于：所述C1-C5烷基选自甲基、乙基、丙基、丁基。

4.根据权利要求1或2所述的化合物、其药学上可接受的盐或氘代化合物，其特征在于：

R1选自C5-C11的饱和或不饱和烷基时，-C(O)-R1来源于己酸、辛酸、癸酸、月桂酸；

R1选自C13-C23的饱和或不饱和烷基时，-C(O)-R1来源于棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸。

5.根据权利要求1或2所述的化合物、其药学上可接受的盐或氘代化合物，其特征在于：R选自H或甲基。

6.权利要求1-4任意一项所述化合物、其药学上可接受的盐或氘代化合物在制备免疫抑制剂中的用途。

7.权利要求1-4任意一项所述化合物、其药学上可接受的盐或氘代化合物在制备T细胞抑制剂中的用途。

8.权利要求1-4任意一项所述化合物、其药学上可接受的盐或氘代化合物在制备治疗自身免疫性疾病的产品中的用途；进一步地，所述自身免疫性疾病选自类风湿性关节炎、红斑狼疮、皮肤真菌病、膜肾球肾炎、炎性肠病、自身免疫性溶血贫血、免疫排斥。

9.一种药物组合物，其特征在于：包括权利要求1-4任意一项所述的化合物或其药学上可接受的盐。

10.根据权利要求9所述的药物组合物，其特征在于：还包括糖皮质激素类免疫抑制剂、微生物代谢产物类免疫抑制剂、抗代谢物类免疫抑制剂、多克隆和单克隆抗淋巴细胞抗体类免疫抑制剂、烷化剂类免疫抑制剂中的一种或多种。