CN113687087A - 一种甲状旁腺激素快速检测卡及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种甲状旁腺激素快速检测卡及其制备方法,检测卡包括底板以及设置在底板上的滤血垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫;滤血垫经预处理液处理后制得;结合垫上吸附有荧光微球标记的抗PTH第一抗体和荧光标记的鸡IgY抗体,抗PTH第一抗体为生物素和抗生物素标记的抗人PTH单克隆抗体;硝酸纤维素膜上设有检测线和质控线,检测线上包被有PTH包被抗体;质控线上包被有兔抗鸡IgY抗体。本发明,可直接、快速地检测全血、血清、血浆样本,结构简单,小巧便携,采用生物素和抗生物素标记的抗人PTH单克隆抗体作为抗PTH第一抗体,提高了标记物的稳定性和高效性,可以避免抗体空间位阻的影响,提高了灵敏度、特异性和准确性。
Description
技术领域
本发明涉及甲状旁腺激素检测技术领域,具体涉及一种甲状旁腺激素快速检测卡及其制备方法。
背景技术
甲状旁腺激素(PTH)是甲状旁腺主细胞分泌的碱性单链多肽类激素,其主要功能是调节脊椎动物体内钙和磷的代谢,促进血钙水平升高,血磷水平下降。PTH促使血浆钙离子浓度升高,其作用的主要靶器官是骨和肾脏。它动员骨钙入血,促进肾小管对钙离子的重吸收和磷酸盐的***,使血钙浓度增加和血磷浓度下降。PTH测定能帮助判断甲状旁腺功能。PTH的检测方法有化学发光免疫测定法、放射免疫法和酶联免疫法。
但是,目前全段甲状旁腺激素检测试剂盒主要是以进口产品为主,产品多为酶联免疫吸附法(ELISA)、化学发光法(CLIA)。酶联免疫吸附法(ELISA)只能检测血清或血浆,不能检测全血。而且操作繁琐,样本前期处理步骤较多,检测所需时间较长。化学发光法(CLIA)所需的检测仪器均为大型仪器,价格昂贵且通用性差,需要200μL以上的样本体积才能进行检测,配套试剂需2~8℃保存,不能满足床边快速检测的要求。
为此,中国发明专利CN109188000A提供了一种便携式检测人甲状旁激素的试纸条及其制备方法,包括横向水平设置的条形的硝酸纤维素膜垫,所述硝酸纤维素膜垫纵向间隔且相互平行的分别设置有条形的检测线和条形的质控线,其中,所述硝酸纤维素膜垫靠近质控线一端抵接有一横向水平设置的条形的吸水垫,所述硝酸纤维素膜靠近检测线的一端抵接有一横向水平设置的条形的样品垫,所述结合垫内含有胶体金或荧光微球标记的抗人PTH抗体,所述检测线包被有可与PTH特异性结合的检测抗体,质控线包被有可与游离的抗人PTH特异性结合的质控抗体。
但是,该方案采用胶体金或荧光微球标记的抗人PTH抗体与PTH结合,检测卡的检测灵敏性和稳定性较差,在测试过程中,由于PTH与抗人PTH抗体结合,容易造成空间位阻效应,影响检测结果的准确性。
有鉴于此,急需对吸纳有检测人甲状旁腺激素的试纸条及其制备方法进行改进,以提高PTH检测试纸条检测结果的准确性精度和检测灵敏度。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是现有PTH检测试纸检测稳定性和灵敏度低、测量结果准确性较差的问题。
为了解决上述技术问题,本发明所采用的技术方案如下:
一种甲状旁腺激素快速检测卡,包括底板以及设置在所述底板上的滤血垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫,所述滤血垫、所述结合垫、所述硝酸纤维素膜和所述吸水垫在所述底板上依次搭接设置;
所述滤血垫经预处理液处理后制得;
所述结合垫上吸附有荧光微球标记的抗PTH第一抗体和荧光标记的鸡IgY抗体,所述抗PTH第一抗体为生物素和抗生物素标记的抗人PTH单克隆抗体;
所述硝酸纤维素膜上设有检测线和质控线,所述检测线设置在所述硝酸纤维素膜上靠近所述结合垫的一端,所述检测线上包被有PTH包被抗体;所述质控线设置在所述硝酸纤维素膜上靠近所述吸水垫的一端上,所述质控线上包被有兔抗鸡IgY抗体。
在上述方案中,优选的,所述预处理液为0.1%~1.2%Tris缓冲液,包含有0.01~0.4mg/ml鼠抗RBC抗体、0.1~1.5mg/ml阻断剂、0.1%~1%表面活性剂,其pH值为7.4。
在上述方案中,优选的,所述预处理液为0.1M Tris缓冲液,包含有0.08mg/ml鼠抗RBC抗体、0.4mg/ml阻断剂、1%S17和1%Tween 20,其pH值为7.4。
在上述方案中,优选的,所述底板为PVC板,所述滤血垫由致密玻璃纤维素膜制成。
在上述方案中,优选的,所述底板的底面上设有二维码和检测卡编码,用于记录和查询该甲状旁腺激素快速检测卡的检测结果。
在上述方案中,优选的,所述质控抗体为兔抗鸡IgY抗体。
一种甲状旁腺激素检测卡的制备方法,包括以下步骤:
取荧光微球标记的抗PTH第一抗体和荧光微球标记的鸡IgY抗体,将荧光微球标记的抗PTH第一抗体和荧光微球标记的鸡IgY抗体喷涂在玻璃纤维膜上,制得结合垫,其中,所述抗PTH第一抗体为生物素和抗生物素标记的抗人PTH单克隆抗体;
将PTH包被抗体包被在硝酸纤维素膜上作为检测线,将兔抗鸡IgY抗体包被在硝酸纤维素膜上作为质控线;
用预处理液对滤血垫进行处理,在底板上依次粘贴滤血垫、结合垫和吸水垫,获得甲状旁腺激素快速检测卡。
在上述方案中,优选的,所述荧光微球标记的抗PTH第一抗体的喷涂量为4μL/cm,所述荧光微球标记的鸡IgY抗体的喷涂量为4μL/cm。
在上述方案中,优选的,所述荧光微球标记的抗PTH第一抗体的制备包括以下步骤:
取活化后的荧光微球加入抗生物素抗体,在室温下避光反应,获得荧光标记的抗生物素抗体;
取生物素加入到含有抗人PTH单克隆抗体的缓冲液中,在室温下避光反应,获得生物素标记的抗人PTH单克隆抗体;
取生物素标记的抗人PTH单克隆抗体与获得的荧光标记的抗生素抗体混合,室温避光反应后,得到荧光微球标记的抗生物素抗体和生物素标记的抗人PTH单克隆抗体。
在上述方案中,优选的,所述检测线上PTH包被抗体的包被浓度为0.5~2mg/ml,喷涂量为1μL/cm;所述质控线上兔抗鸡IgY抗体的包被浓度为0.2~1mg/ml,喷涂量为1μL/cm。
与现有技术相比,本发明提供的甲状旁腺激素快速检测卡及其制备方法具有以下优点:
(1)可直接、快速地检测全血、血清、血浆样本,只需对样本简单处理即可检测,可在短时间内快速出具检测结果,大大提高了检测效率;
(3)结构简单,小巧便携,无需配备大型检测机器,满足现场(如床边)快速检验或POCT(point-of-care testing)的需求;
(4)可在2~30℃的条件下保存,无需低温保存,降低了对检测卡保存条件的限制,扩大了检测卡的使用范围;
(5)采用生物素和抗生物素标记的抗人PTH单克隆抗体作为抗PTH第一抗体,在制备过程中,荧光微球与抗生物素结合,生物素与抗人PTH单克隆抗体结合,然后利用抗生物素抗体与生物素的特异性结合,提高了标记物的稳定性和高效性,可以避免抗体空间位阻的影响,提高了灵敏度、特异性和准确性。
附图说明
图1为本发明中甲状旁腺激素快速检测卡的结构示意图;
图2为本发明中实施例2中甲状旁腺激素快速检测卡检测结果的示意图;
图3为本发明中实施例2中样品采用罗氏电化学发光试剂盒的检测结果。
具体实施方式
本发明提供了一种甲状旁腺激素快速检测卡及其制备方法,采用双抗夹心原理,采用生物素和抗生物素标记的抗人PTH单克隆抗体作为抗PTH第一抗体,大大提高了甲状旁腺激素检测的精确度和稳定性。下面结合说明书附图和具体实施方式对本发明做出详细说明。
如图1所示,本发明提供的甲状旁腺激素快速检测卡及其制备方法,甲状旁腺激素快速检测卡包括底板1以及依次搭接在底板1上的滤血垫2、结合垫3、硝酸纤维素膜4和吸水垫5。
底板1为PVC板,PVC是聚氯乙烯的简称,是氯乙烯单体在过氧化物、偶氮化合物等引发剂或在光、热作用下按自由基聚合反应机理聚合而成的聚合物。PVC具有良好的防火耐热作用以及物理化学稳定性和延展性,广泛应用于一次性医疗器械产品。底板1的底面上设有二维码和检测卡编码,用于记录和查询该甲状旁腺激素快速检测卡的检测结果。
滤血垫2由致密玻璃纤维素膜制成,滤血膜可快速分离全血中的血浆而无溶血现象,使检测人员在使用时无需将血液离心为血清,节省检测时间、增加效率,检测时刻可直接使用末梢血或新鲜血液,从而提高测试纸的便携性和使用的便捷性。滤血垫2经预处理液处理后制得,预处理液为0.1%~1.2%Tris缓冲液,包含有0.01~0.4mg/ml鼠抗RBC抗体、0.1~1.5mg/ml阻断剂、0.1%~1%表面活性剂,其pH值为7.4。
在本发明的另一个实施例中,预处理液为0.1M Tris缓冲液,包含有0.08mg/ml鼠抗RBC抗体、0.4mg/ml阻断剂、1%S17和1%Tween 20,其pH值为7.4。
结合垫3上吸附有荧光微球标记的抗PTH第一抗体和荧光标记的鸡IgY抗体,其中,抗PTH第一抗体为生物素和抗生物素标记的抗人PTH单克隆抗体,结合垫3用于PTH与抗PTH第一抗体的结合。
硝酸纤维素膜4上设有检测线41和质控线42,检测线41设置在硝酸纤维素膜4上靠近结合垫3的一端,检测线41上包被有PTH包被抗体;质控线42设置在硝酸纤维素膜4上靠近吸水垫5的一端上,质控线42上包被有兔抗鸡IgY。
吸水垫5位于检测卡的末端,其主要功能是作为试纸槽,用来吸收层析涌动过来的检测样品,以防反应后的样品反向回流,从而避免反向回流导致的测试报告解读过晚时假阳性的出现。吸水垫由具有强大吸水力和大吸水体积的亲水材料制成,具有高吸收率、高强度、高稳定的特点。
本发明中甲状旁腺激素快速检测卡,基于双抗夹心原理构建,待测样品中的甲状旁腺激素(PTH)与结合垫上的荧光微球标记的抗生素抗体和生物素标记的PTH单克隆抗体形成复合物;经过检测线时,复合物与检测线上的PTH包被抗体结合形成荧光微球标记的抗生物素抗体和生物素标记的抗PTH第一抗体-PTH-PTH包被抗体的双抗夹心复合物。检测线上的条带显色程度与待测样本中PTH浓度成正比,可定量检测待测样本中PTH的含量。
下面结合具体实施方式对本发明做出详细说明。
实施例1
(一)结合垫的制备
(1)取适量的羟基修饰的荧光微球用0.1M、pH值为5.0的MES缓冲液进行洗涤并离心后,弃上清,用1mL 0.1M、pH值为5.0的MES缓冲液重悬后,加入EDC至终浓度为10mM、加入NHS至终浓度为10mM,在室温条件下避光活化30分钟,获得活化后的荧光微球;
(2)用100mM、pH值为5.0的MES缓冲液洗涤活化后的荧光微球,加入50μL 1mg/ml抗生物素抗体,室温避光反应30分钟,然后离心用分离后,去除非结合的抗生物素抗体,重悬,获得荧光微球标记的抗生物素抗体;
(3)取50μL 1mg/ml溶于DMF的生物素,加入到0.05M的PBS缓冲液中,其中PBS缓冲液含有0.3mg抗人PTH单克隆抗体,PBS缓冲液的pH值为7.2;将加入生物素的缓冲液在室温条件下避光反应1小时,在4℃透析过夜后,与步骤(2)中获得的荧光微球标记的抗生物素抗体混合,在室温条件下避光反应2小时后,加入终浓度为1%的BSA进行封闭;封闭完成后,用0.05M、pH值为7.2的PBS缓冲液洗涤、重悬,得到荧光微球标记的抗PTH第一抗体,在4℃条件下保存待用;
(4)将步骤(3)获得的荧光微球标记的抗PTH第一抗体,喷涂至玻璃纤维膜上,其中喷涂量为4μL/cm,在37℃条件下烘干过夜,获得结合垫。
(二)滤血垫的制备
用含有0.08mg/ml鼠抗RBC抗体、0.4mg/ml阻断剂的预处理液(预处理玻璃纤维膜,其中,预处理液为0.1M Tris缓冲液,Tris缓冲液包含有1%表面活性剂,Tris缓冲液的pH值为7.4,在温度为37℃的干燥箱中烘干过夜,获得滤血垫。
(三)甲状旁腺激素快速检测卡的制备
(1)包被有检测线(T线)和质控线(C线)的硝酸纤维素膜(NC膜)的制备:
分别用包被蛋白稀释液将PTH包被抗体(T线抗体)稀释成1mg/ml、兔抗鸡IgY抗体(C线抗体)稀释成0.8mg/ml,在湿度为50%~65%的条件下喷量设置为1μL/cm,在硝酸纤维素膜上划线。划线后50℃干燥2小时,在湿度低于35%的条件下装入密封袋中备用。
(2)检测卡的组装:在PVC板上依次粘贴经过处理的滤血垫、吸附有荧光标记的抗PTH第一抗体的结合垫、包被有检测线和质控线的硝酸纤维素膜和吸水垫,组装后得到试纸大板,按照使用需要切割成4mm宽,将试纸装入塑料卡内形成结构如图1所示的甲状旁腺激素快速检测卡。
实施例2
对于甲状旁腺激素快速检测卡的准确度检测试验,包括以下步骤:
(1)取实施例1制备的甲状旁腺激素快速检测卡,利用荧光免疫分析仪进行检测。
(2)荧光免疫分析仪参数的设定:在荧光免疫分析仪上设定好检测卡工艺参数后,取上述组装好的检测卡,分别用0、11.3、35.1、117、225、994pg/mL的甲状旁腺激素校准品,用检测卡进行测定,得到各校准品的荧光强度值,将结果输入到分析仪的参数中,完成分析仪的参数的设定。
(3)主要检测材料:临床样本由相关医院获得,共300份电化学发光法定值样本,其中血清样本100份,血浆样本100份,全血样本100份,甲状旁腺激素含量分布区间为10~2000pg/mL之间。
(4)检测方法:
步骤1:将甲状旁腺激素快速检测卡及样本平衡至室温,取出检测卡,平放;
步骤2:加样:取30μL全血样本加入样本稀释液,或,取20μL血清/血浆样本加入样本稀释液,震荡混匀后取100μL垂直滴加至检测卡加样处;取样时注意不要吸入气泡;加样后将快速检测卡静置15min;
步骤3:读卡:打开试剂卡检测仪器,选择与试剂盒批号相对应的项目文件;选择样本类型,“全血”或“血清/血浆”;将底板1上的二维码朝里***试剂卡检测仪器,在仪器上读取结果。
(5)试验结果分析:
临床样本检测试剂制备完成后,按检测方法对所有临床样本进行检测,并分析检测结果。
(6)试验结果:
部分样本的检测结果如图2所示,以实验***的检测值为Y轴,以对照***的测验值为X轴,绘制散点图,并进行相关性分析。临床样本检测对300份临床定值样本检测,样本平均偏差值小于10%,最大偏差小于20%,R2>0.92。
对样品采用罗氏电化学发光试剂盒进行检测,检测结果如图3所示。如图3所示,PTH灵敏度为8.9pg/ml,线性范围为8.9~1051pg/ml。
比照图2与图3,结果表明,本发明提供的甲状旁腺激素快速检测卡的检测结果与定值样本浓度无明显差异,准确度较高,适合用于临床检测,满足不同客户不同检测场合的差异化需要。经检测,本发明提供的甲状旁腺激素快速检测卡的结果符合率、检出限、特异性等指标均大于90%,具有较低的对阳性患者的漏检率以及较低的正常人群误检率,检测结果的准确性高。
现有技术中的PTH检测卡的检测结果容易因空间位而产生偏差。阻效应空间位阻效应又称立体效应,是指分子中某些原子或基团彼此接近而引起的空间阻碍作用,由于分子中靠近反应中心的原子或基团占有一定的空间位置,会导致影响分子反应活性的情况发生。在检测过程中,由于抗体与抗原结合,受空间位阻效应影响,可能导致抗原与抗体结合的结构被埋藏在一个大型的蛋白质结构中,从而阻碍抗原与抗体充分结合,从而影响检测数据的准确性。
与现有技术相比,本发明提供的甲状旁腺激素快速检测卡引入生物素与抗生物素抗体,利用荧光微球与抗生物素结合,生物素与抗人PTH单克隆抗体,然后利用抗生物素抗体与生物素的特异性结合,缓解了检测过程中存在的空间位阻效应,提高了标记物的稳定性和高效性,从而提高甲状旁腺检测卡检测结果的准确性。
本发明,可直接快速地检测全血、血清、血浆样本,无需对样本进行复杂处理,可在短时间内快速出具检测结果,结构简单,小巧便携,大大提高了PTH激素检测的效率,可广泛应用于病房、术后PTH检测。试剂卡检测仪器读取底板上的二维码,可将检测结果与检测卡编码进行同步,方便对检测结果进行查询。
本发明并不局限于上述最佳实施方式,任何人应该得知在本发明的启示下做出的结构变化,凡是与本发明具有相同或相近的技术方案,均落入本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种甲状旁腺激素快速检测卡,其特征在于,包括底板以及设置在所述底板上的滤血垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫,所述滤血垫、所述结合垫、所述硝酸纤维素膜和所述吸水垫在所述底板上依次搭接设置;
所述滤血垫经预处理液处理后制得;
所述结合垫上吸附有荧光微球标记的抗PTH第一抗体和荧光标记的鸡IgY抗体,所述抗PTH第一抗体为生物素和抗生物素标记的抗人PTH单克隆抗体;
所述硝酸纤维素膜上设有检测线和质控线,所述检测线设置在所述硝酸纤维素膜上靠近所述结合垫的一端,所述检测线上包被有PTH包被抗体;所述质控线设置在所述硝酸纤维素膜上靠近所述吸水垫的一端上,所述质控线上包被有兔抗鸡IgY抗体。
2.根据权利要求1所述的甲状旁腺激素快速检测卡,其特征在于,所述预处理液为0.1%~1.2%Tris缓冲液,包含有0.01~0.4mg/ml鼠抗RBC抗体、0.1~1.5mg/ml阻断剂、0.1%~1%表面活性剂,其pH值为7.4。
3.根据权利要求1所述的甲状旁腺激素快速检测卡,其特征在于,所述预处理液为0.1MTris缓冲液,包含有0.08mg/ml鼠抗RBC抗体、0.4mg/ml阻断剂、1%S17和1%Tween 20,其pH值为7.4。
4.根据权利要求1所述的甲状旁腺激素快速检测卡,其特征在于,所述底板为PVC板,所述滤血垫由致密玻璃纤维素膜制成。
5.根据权利要求1所述的甲状旁腺激素快速检测卡,其特征在于,所述底板的底面上设有二维码和检测卡编码,用于记录和查询该甲状旁腺激素快速检测卡的检测结果。
6.根据权利要求1所述的甲状旁腺激素快速检测卡,其特征在于,所述质控抗体为兔抗鸡IgY抗体。
7.一种甲状旁腺激素快速检测卡的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
取荧光微球标记的抗PTH第一抗体和荧光微球标记的鸡IgY抗体,将荧光微球标记的抗PTH第一抗体和荧光微球标记的鸡IgY抗体喷涂在玻璃纤维膜上,制得结合垫,其中,所述抗PTH第一抗体为生物素和抗生物素标记的抗人PTH单克隆抗体;
将PTH包被抗体包被在硝酸纤维素膜上作为检测线,将兔抗鸡IgY抗体包被在硝酸纤维素膜上作为质控线;
用预处理液对滤血垫进行处理,在底板上依次粘贴滤血垫、结合垫和吸水垫,获得甲状旁腺激素快速检测卡。
8.根据权利要求7所述的甲状旁腺激素快速检测卡的制备方法,其特征在于,所述荧光微球标记的抗PTH第一抗体的喷涂量为4μL/cm,所述荧光微球标记的鸡IgY抗体的喷涂量为4μL/cm。
9.根据权利要求7所述的甲状旁腺激素快速检测卡,其特征在于,所述荧光微球标记的抗PTH第一抗体的制备包括以下步骤:
取活化后的荧光微球加入抗生物素抗体,在室温下避光反应,获得荧光标记的抗生物素抗体;
取生物素加入到含有抗人PTH单克隆抗体的缓冲液中,在室温下避光反应,获得生物素标记的抗人PTH单克隆抗体;
取生物素标记的抗人PTH单克隆抗体与获得的荧光标记的抗生素抗体混合,室温避光反应后,得到荧光微球标记的抗生物素抗体和生物素标记的抗人PTH单克隆抗体。
10.根据权利要求7所述的甲状旁腺激素快速检测卡,其特征在于,所述检测线上PTH包被抗体的包被浓度为0.5~2mg/ml,喷涂量为1μL/cm;
所述质控线上兔抗鸡IgY抗体的包被浓度为0.2~1mg/ml,喷涂量为1μL/cm。
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