CN113677979B - 光片显微镜和用于确定样本空间中的物体折射率的方法 - Google Patents

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Abstract

一种光片显微镜，其包括：样本空间，在该样本空间中可布置盖玻片或载玻片，该盖玻片或载玻片具有限定部分反射界面的表面；光学***，该光学***带有面向所述盖玻片或载玻片的物镜；被设计用于产生光片的照明机构；传感器；和处理器。所述光片显微镜形成用于检测测量变量的测量装置。该测量装置被设计用于，将所述光片穿过所述光学***倾斜入射地转向到所述盖玻片或载玻片上，通过部分地在所述界面处反射所述光片来产生反射光束，接收穿过所述光学***的反射光束并转向到所述传感器上。所述传感器被设计用于检测所述反射光束的强度和/或入射位置。所述处理器被设计用于基于所述反射光束的所检测的强度和/或入射位置来确定测量变量。

Description

光片显微镜和用于确定样本空间中的物体折射率的方法
技术领域
本发明涉及一种光片显微镜。本发明还涉及一种借助光片显微镜获取测量变量的方法。
背景技术
在光片显微镜中，如果盖玻片或载玻片在光片显微镜的样本空间中被布置在样本和成像物镜之间，则样本的成像受到盖玻片或载玻片的影响。样本的图像还受到两种光学介质的影响，这些介质从相对侧与盖玻片或载玻片邻接。例如，这些光学介质由浸没介质和包围样本的包埋介质形成，该浸没介质既邻接盖玻片，又邻接物镜，该包埋介质邻接背离物镜的盖玻片表面。
特别是对于像差的有效校正，一方面希望知道盖玻片的厚度，因为该厚度决定了待由物镜检测的探测光在穿过盖玻片时所历经的光路长度。另一方面，希望知道在显微镜的样本空间中彼此邻接的各种不同的光学介质的折射率。这些光学介质由于它们不同的折射率，形成了折射率急剧变化的界面。这些界面中的每一个对光学成像都有不同的影响，这取决于那里的折射率突变有多大。
另一个光学参数是盖玻片或载玻片与成像物镜之间的距离。例如，要实现自动对焦***，就需要了解该距离。
文献US 8 5082 203B2公开了一种光片显微镜，其具有用于产生光片的照明机构且具有物镜。光片布置在样本中，使得形成光片的照明光的传播方向不垂直于显微镜物镜的光轴。因此，这种光片显微镜也被称为斜平面显微镜(OPM：斜平面显微镜)。
文献DE 10 2016 119 268 B3公开了一种光片显微镜，其具有在中间图像空间中产生光片的照明机构和将光片成像到样本中的传输光学器件。
文件WO 2017/210159 A1和WO 2015/109323 A2各自公开了一种带有照明机构的光片显微镜，该照明机构被设计用于产生光片并将其横向移动穿过样本。这种光片显微镜也被称为SCAPE显微镜(SCAPE：扫描共焦对齐平面激发)。
文献DE 10 2010 030 430 A1公开了一种用于显微镜的三角自动对焦机构。这种自动对焦机构借助来自近红外光的测量光束在样本上生成狭缝图像，该狭缝图像成像到位置敏感的探测器上。通过由探测器检测到的入射位置来控制自动对焦。
因此，在光片显微术领域中，希望以特别简单的方式获取允许确定上述类型的光学参数的测量变量。
发明内容
因此，本发明的目的是，提出一种光片显微镜和一种允许简单且精确地确定这种测量变量的方法。
光片显微镜包括：样本空间，在该样本空间中可布置盖玻片或载玻片，该盖玻片或载玻片具有限定部分反射界面的表面；带有面向盖玻片或载玻片的物镜的光学***；被设计用于产生光片的照明机构；传感器；和处理器。两个界面的形成方式为，两个光学介质可安置到样本空间中，这些光学介质邻接盖玻片或载玻片的两个表面。光片显微镜经过设计方式，从而它形成用于检测测量变量的测量装置。特别地，该测量装置被设计用于，使得光片穿过光学***以倾斜入射方式转向到盖玻片或载玻片上，通过在界面处部分地反射光片来产生反射光束，并接收通过光学***的反射光束，并转向到传感器上。传感器被设计用于，检测反射光束的强度和/或入射位置。处理器被设计用于，基于检测到的强度和/或反射光束的入射位置来确定测量变量。
在本申请中，术语盖玻片或载玻片特别是指覆盖样本的盖玻片、载物台、皮氏培养皿底部或微量滴定板空穴的底部。形成界面的盖玻片或载玻片的表面可以是面向物镜的表面，或者是盖玻片或载玻片的背离物镜的表面。
传感器优选地设计为位置敏感的传感器，即设计为适合于检测强度和入射位置的传感器。
光片显微镜使用反射光束，即光片在盖玻片或载玻片的表面上的部分反射，以便检测测量变量。因此，用于确定测量变量的反射光束的波长通常与从样本发出的探测光的波长相差几纳米，即所谓的斯托克斯位移。斯托克斯位移大约为5～20nm，在不寻常的荧光团的情况下更大。这尤其意味着，当确定与波长有关的测量变量时，不需要将测量变量换算为探测光的波长，并且无需对色散进行假设。由此可以特别可靠地确定测量变量。
特别地，确定成像误差所需的那些测量变量与波长有关，例如通过盖玻片或载玻片的光路长度或折射率。所提出的光片显微镜因此可以用于提高光片显微镜的成像质量，其方式为，借助所确定的测量值来设定光片显微镜的合适的操纵变量。
光片的部分反射也在先前已知的光片显微镜中发生。在此，该部分反射是一种干扰变量，该干扰变量通过截止滤光器与探测光分离。因此，所提出的光片显微镜以特别有利的方式利用了本身对于改善图像质量不利的干扰变量。因此，通过相应地配置已有的光片显微镜，可毫不费力地实现这里描述的解决方案。
由于光片的横截面垂直于其传播方向基本上是线性的，所以光片在盖玻片或载玻片上的反射也呈现线性。在本光片显微镜中，光片因此实现了与例如根据DE 10 2010 030430 A1在已知的自动聚焦机构中的通过狭缝光阑形成的测量光束相同的功能。
在优选的实施方式中，处理器被设计用于基于反射光束的检测到的入射位置来确定盖玻片或载玻片沿物镜的光轴相距该物镜的距离作为测量变量。在该实施方式中，测量装置可以用作自动聚焦机构或作为其一部分。
特别地，通过该实施方式也可以确定盖玻片或载玻片的倾斜度作为测量变量。为此，在盖玻片或载玻片的表面上规定了至少三个形成一个平面的测量点。对于三个测量点中的每一个，求取相应测量点沿物镜光轴相距该物镜的距离。然后，基于所求取的距离，确定由三个测量点形成的平面相对于物镜光轴的倾斜度作为盖玻片表面的倾斜度。
这里假设由至少三个测量点形成的平面与盖玻片或载玻片的所述表面共面。因此，该平面相对于物镜光轴的倾斜反映了盖玻片或载玻片的倾斜。至少三个测量点中的每一个分别由三个坐标确定，其中一个坐标表示测量点沿物镜光轴相距该物镜的待确定的距离，而另外两个坐标确定相应测量点在盖玻片表面上的位置。
在另一优选的实施方式中，盖玻片或载玻片具有另一表面，该另一表面限定另一部分反射的界面。两个界面在此布置在相距物镜不同的距离处。此外，在该实施方式中，测量装置被设计用于通过在另一界面处部分地反射光片来产生另一反射光束，并且接收通过物镜的另一反射光束并将其转向到传感器上。传感器被设计用于检测另一反射光束的强度和/或入射位置。处理器被设计用于基于两个反射光束的所检测的强度和/或入射位置来确定测量变量。
由此可以确定测量变量，其确定不可能仅基于一个唯一的反射光束的检测到的强度和/或入射位置。这种测量变量特别是盖玻片或载玻片的厚度及与盖玻片或载玻片邻接的光学介质的折射率。这增加了光片显微镜的灵活性。
在一个优选实施方式中，处理器被设计用于基于两个反射光束的所检测的入射位置来确定盖玻片或载玻片的厚度作为测量变量。在此，盖玻片或载玻片的所确定的厚度由两个部分反射的界面的沿物镜光轴的距离给出。为了确定该距离，利用了转向到盖玻片或载玻片上的光片通过测量装置在两个界面处所经历的两个部分反射，这些界面由盖玻片或载玻片的彼此相反的表面以及与其邻接的光学介质形成。由于盖玻片或载玻片的折射率与两个邻接的光学介质的折射率不同，因此在两个界面处分别会发生导致部分反射的折射率突变。由于两个界面彼此间隔开，并且光片相对于物镜的光轴倾斜地落到界面上，因此在界面上产生的两个反射光束发生空间分离。这种空间分离反映在两个反射光束射到探测器上的所在入射点上。因此，反射光束的所检测的入射位置与两个部分反射界面沿物镜光轴所具有的距离明显相关，这用于厚度测量。
此处应注意，在该优选实施方式中，两个反射光束中的在背离物镜的界面处产生的反射光束，在它进入物镜中之前，首先穿过盖玻片或载玻片本身，并在随后穿过的面向透镜的界面处折射。由此导致焦点偏移，这意味着，确定盖玻片或载玻片的光学厚度作为测量变量。
在一个特殊的实施方式中，测量装置被设计用于将两个反射光束同时转向到探测器上，并借助两个反射光束的不同入射位置之间的相互距离来确定盖玻片或载玻片的厚度。该特殊实施方式特别是针对相对于物镜放大率较薄的盖玻片或载玻片而设计的。在这种情况下，两个反射光束的空间分开度相应地很小，从而可以同时在探测器上检测到两者。
在替代的实施方式中，测量装置被设计用于将两个反射光束彼此相继地转向到探测器上。这意味着，测量装置在给定的时间点仅分别检测在探测器上的反射光束之一。这种实施方式特别是针对相对于物镜放大率较厚的盖玻片或载玻片而设计的。在这种情况下，两个界面(在这些界面处产生反射光束)相互间的距离如此之大，致使这些反射光束的随之产生的空间分开使得不可能在探测器上同时接收两个反射光束。
如果测量装置将两个反射光束彼此相继地转向到探测器上，则有利的是，测量装置被设计用来检测首先被引导到探测器上的反射光束的入射点，随后设定光片显微镜的工作参数，使后续被引导到探测器上的反射光束的入射位置与先前检测到的入射位置重合，然后借助工作参数来确定盖玻片或载玻片的厚度。
在前述实施方式中，处理器优选地被设计用于将盖玻片或载玻片与物镜之间的距离定为工作参数。沿着物镜的光轴测量的这个距离可以例如通过合适的调节装置如所谓的z-驱动器予以改变。在这种情况下产生z-驱动器的两个设定值，可以由这些设定值的差来确定盖玻片或载玻片的光学厚度。
替代地，测量装置被设计用于，将设置在光片显微镜中的可移位的聚焦透镜的位置设定为工作参数。根据该可移位的聚焦透镜的位置变化，考虑到光学成像条件，然后可以确定盖玻片或载玻片的光学厚度作为测量变量。
在另一实施方式中，处理器被设计用于，借助光学厚度，考虑到盖玻片或载玻片的折射率和既邻接物镜又邻接盖玻片或载玻片的光学介质的折射率，来确定盖玻片或载玻片的机械厚度，作为测量变量。前述光学介质例如是位于盖玻片或载玻片与物镜之间的浸没介质。如果盖玻片或载玻片和浸没介质的折射率已知，则盖玻片或载玻片的机械厚度可以根据以下关系式基于先前确定的光学厚度来计算：
其中，dmech是机械厚度，dopt是光学厚度，ng是盖玻片或载玻片的折射率，nim是浸没介质的折射率。
如果要特别精确地确定盖玻片或载玻片的机械厚度，则还要考虑样本空间中光片主光束的数值孔径。这优选地根据以下关系式进行：
其中，NA表示样本空间中光片主光束的数值孔径。
数值孔径NA由浸没介质的折射率nim和入射角的乘积给出，从物镜射出的测量光束相对于光轴以该入射角落在盖玻片或载玻片上。此外，在计算机械厚度时可以考虑通常的成像误差。
在优选的实施方式中，两个界面的形成方式为，样本空间中的两个光学介质邻接盖玻片或载玻片的两个表面。此外，处理器被设计用于，基于两个反射光束的所检测的强度来确定两个光学介质之一的折射率作为测量变量。
两个反射光束的强度取决于光片在两个界面处的反射和透射，这两个界面由盖玻片或载玻片和从相对侧与盖玻片或载玻片邻接的两个光学介质限定。两个在空间上彼此分开的反射光束的强度最终所基于的反射和透射过程因此主要由盖玻片或载玻片的折射率以及邻接盖玻片或载玻片的光学介质的折射率确定。如果盖玻片或载玻片的折射率以及两个与其邻接的光学介质之一的折射率已知，则可以根据由探测器检测到的强度，在了解测量光束在样本空间中的入射角度的情况下，可靠地确定另一种介质的折射率。
在此，两个反射光束在空间上分开的产生方式为，测量装置将光片倾斜地转向到盖玻片或载玻片上。由于两个部分反射的界面轴向地彼此错开，即沿物镜光轴彼此间隔开，因此光片倾斜地入射到两个界面上确保了两个反射光束在不同的光路上被反射回到物镜中。结果，两个反射光束在探测器上在不同的入射位置彼此分开地被检测。
处理器优选地被设计用于，基于两个反射光束的强度的比率来确定一种光学介质的折射率作为测量变量。因此，折射率的测量可以说是自我参考。这意味着，可以独立于测量光束的强度来确定折射率，即不需要了解该强度。
其折射率将借助测量装置作为测量变量予以确定的光学介质优选是用于样本的包埋介质，该包埋介质与盖玻片或载玻片的两个表面之一邻接。在这种情况下，其折射率从一开始就已知的另一光学介质优选地是浸没介质，该浸没介质一方面邻接盖玻片或载玻片的另一表面，另一方面邻接物镜。然而，也可以借助测量装置来确定任何介质的折射率，只要该介质直接与盖玻片或载玻片的两个表面之一邻接，并由此形成部分反射的界面。
在优选的实施方式中，测量装置被设计用于，通过光片在界面处产生测量图案，并且通过反射光束将测量图案成像到传感器上。此外，传感器设计用于以空间强度分布的形式检测测量图案，并且测量装置设计用于由空间强度分布确定反射光束的强度。
优选地，以空间强度分布的形式检测成像到探测器上的测量图案，由该强度分布确定反射光束的强度。如果成像到探测器上的测量图案例如通过光片的垂直于其传播方向的横截面的图像给出，则上述强度分布的获得方式为，在探测器上的相应图像在平行于光片横截面的纵向方向的方向上积分。
传感器优选是平面探测器或线列探测器。线列探测器允许特别便宜地制造测量装置。平面探测器提高了测量装置的灵活性，并且可以例如已经作为光片显微镜的探测单元存在。
在优选的实施方式中，光片显微镜包括探测机构，该探测机构具有另一传感器和分光器单元，该另一传感器用于检测从样本发出的探测光，该分光器单元被设计用于将反射光束转向到传感器上并且将探测光转向到另一传感器上。在本实施方式中，光片显微镜包括两个传感器，这些传感器分别仅具有一个功能。这允许使用专门的传感器，从而更可靠地既检测反射光束又检测探测光。由此使得对测量变量的确定更加可靠。
在另一优选实施方式中，光片显微镜包括连接在传感器上游的滤光器，该滤光器对于反射光束是不可透过的。这防止反射光束影响检测从样本发出的探测光。由于滤光器可切换，传感器可以既用于检测反射光束，又用于检测探测光。
光片显微镜优选地包括扫描部件，该扫描部件被设计用于沿着扫描轴移动光片。扫描部件例如是可移动的光栅反射镜。
替代地或附加地，光片显微镜具有电子的聚焦机构，该聚焦机构被设计用于将光片聚焦到样本空间中的不同平面上。由此也可以使得光片沿扫描轴移动。
如果扫描沿物镜的光轴进行，则光片显微镜通常称为OPM(OPM：斜面显微镜)。如果扫描横向于物镜光轴进行，则光片显微镜通常也称为SCAPE显微镜(SCAPE：扫描共焦对齐平面激发)。然而，这些术语并不总是明确使用。也存在所谓的载物台扫描显微镜(ssOPM)，其中，物体台将样本横向于光轴移动。
测量装置优选地被设计用于使得光片穿过物镜倾斜入射地转向到盖玻片或载玻片上，和/或接收穿过物镜的反射光束并将其转向到传感器上。在该实施方式中，物镜形成用于照明和探测的共同物镜。替代地，光学***包括另一个物镜，并且测量装置被设计用于使得光片穿过该另一个物镜倾斜入射地转向到盖玻片或载玻片上。在该替代的实施方式中，另一个物镜形成单独的照明物镜。
光片显微镜优选地包括传输光学器件，该传输光学器件被设计用于将由照明机构在中间图像空间中产生的光片成像到样本中。
处理器优选地包括存储器，在该存储器中可存储用于确定测量变量的参数。
盖玻片或载玻片的两个表面优选地设计成彼此平面平行。
本发明还涉及一种借助光片显微镜获取测量变量的方法。该方法具有上述优点，并且可以按相同的方式特别是通过与光片显微镜相关的特征予以改进。
附图说明
其它的特征和优点从以下描述中可得到，其结合附图更详细地解释了几个实施方式。
图1示出了根据一种实施方式的光片显微镜的示意图，其规定了横向于物镜光轴的扫描；
图2示出了根据一种具有两个传感器的实施方式的光片显微镜的示意图，其规定了横向于物镜光轴的扫描；
图3示出了根据一种实施方式的光片显微镜的示意图，其规定了沿物镜光轴的扫描；
图4示出了根据一种具有两个传感器的实施方式的光片显微镜的示意图，其规定了沿物镜光轴的扫描；
图5为示出了光片显微镜的样本空间的示意图；
图6示出了由光片显微镜的位置敏感的探测器检测到的强度分布，其具有一个强度最大值；
图7示出了另一个示意图，其示出了光片显微镜的样本空间；和
图8示出了由光片显微镜的位置敏感的探测器检测到的强度分布，其具有两个强度最大值。
具体实施方式
图1示出了在一种特殊实施方式中的光片显微镜100的示意图，其规定了横向于物镜120的光轴O2的扫描。如从下面的描述中可看出，除了光片显微成像之外，光片显微镜100还能够实现获取影响成像的测量变量。在这方面，光片显微镜100同时形成用于该测量变量的测量装置。
光片显微镜100包括照明机构102、传输光学器件104和探测机构106，它们一起形成光学***107。探测机构106的光轴O3相对于传输光学器件104的光轴O2倾斜了倾斜角度α。照明机构102的光轴O1垂直于探测机构106的光轴O3，使得照明机构102的光轴O1相对于传输光学器件104的光轴O2倾斜了90°-α的角度。三个前述光轴O1、O2、O3在中间图像空间108中相交。在光片显微镜100的样本空间116中，布置了盖玻片或载玻片，在下文中简称为盖玻片118，并且布置了两个光学介质117、119，这些光学介质分别与盖玻片118邻接。光片显微镜100还具有处理器110。
照明机构102包括光源112和照明物镜114。光源112例如借助在图1中未明确示出的柱面透镜产生光片，其中，参照图1中所示的斜角坐标系，该光片沿光传播方向A和与其垂直的延展方向B伸展。替代地，光源112也可以借助专门为此设置的扫描部件产生准静态光片。照明物镜114将光片成像到中间图像空间108中。替代地，光片也可以直接输入到传输光学器件104中。
从样本空间116看，传输光学器件104包括面向盖玻片118的物镜120、第一管透镜122、第一目镜124、第二目镜126、第二管透镜128和投影物镜130，它们沿着传输光学器件104的光轴O2布置。在第一目镜124和第二目镜126之间设置了扫描装置，该扫描装置在所示实施方式中由光栅反射镜132形成，传输光学器件104的光轴O2在光栅反射镜上偏转。借助于可移动的光栅反射镜132，光片可以沿着垂直于传输光学器件104的光轴O2的扫描方向C移动。
传输光学器件104将来自中间图像空间108的光片成像到样本空间116中。在此，光片相对于传输光学器件104的光轴O2平行错开地伸展。以此方式，光片134被引导到物镜120的入射光瞳136的部分区域中，该部分区域相对于传输光学器件104的光轴O2并且进而相对于入射光瞳136的中心侧向地错开(参见图5和图7)。物镜120的入射光瞳136因此被分散地照明，这导致，光片相对于光轴O2以角度β倾斜地偏转到样本空间116中。传输光学器件104以相同的角度将中间图像空间108成像到样本空间116中。这尤其意味着，β＝90°-α。
倾斜入射地引入到样本空间116中的光片，如下面参照图5和7详述，在盖玻片118的一个或两个表面138、140上反射，由此产生引回到物镜120中的反射光束142。反射光束142由传输光学器件104从样本空间116成像到中间图像空间108中。
从中间图像空间108看，探测机构106包括探测物镜144、管透镜146、上游滤光器148和优选位置敏感的传感器150。反射光束142的位于中间图像空间108中的中间图像通过探测物镜144和管透镜146成像到位置敏感的传感器150上。上游滤光器148可以被引入到探测机构106的光路中，并且因此连接在位置敏感的传感器150的上游。由此可以防止反射光束142落到位置敏感的传感器150上，如果该传感器要用于检测从样本空间116中的样本发出的探测光。由此避免了通过反射光束142产生的不期望的干扰反射。
处理器110与光源112、光栅反射镜132、位置敏感的传感器150和所谓的z-驱动器111连接，该驱动器可以例如通过移动显微镜台来改变盖玻片118沿物镜120的光轴O2的位置。处理器110被设计用于基于检测到的反射光束142的光强和/或入射位置来确定测量变量。处理器110还具有存储器154，在该存储器中可存储用于确定测量变量的参数。
图2示出光片显微镜200的示意图，其规定了横向于物镜120的光轴O2的扫描。该光片显微镜200是具有两个传感器150、202的改型的实施方式。根据图2的光片显微镜200与根据图1的实施方式的区别因而主要在于另一个传感器202以及分光器单元204，该分光器单元被设计用来使得反射光束142转向到位置敏感的传感器150上，并使得探测光转向到另一个传感器202上。相同的和相同作用的部件在图1和图2中用相同的附图标记表示。
在图1和图2所示的实施方式中，以如下方式对光片进行扫描：使得光片在横向于物镜120的光轴O2的扫描方向C上移动。相比之下，图3中示出了作为改型实施方式的光片显微镜300，其与根据图1的实施方式的主要区别在于，通过光片轴向地即沿传输光学器件104的光轴O2进行扫描。相同的和相同作用的部件在图1～3中用相同的附图标记表示。
在图3所示的实施方式中，从中间图像空间108看，传输光学器件104包括投影物镜130、两个管透镜122、128和面向盖玻片118的物镜120。投影物镜130具有电子的聚焦机构302，该聚焦机构被设计用于将光片134聚焦在样本空间116中的不同平面上。
在根据图3的实施方式中，扫描装置由电子的聚焦机构302形成。通过电子的聚焦机构302，光片及同时与其共面的探测平面可沿着传输光学器件104的光轴O2移动。
图4示出了根据一种具有两个传感器150、202的实施方式的光片显微镜400的示意图，其规定了沿120的光轴O2的扫描。根据图4的光片显微镜400的实施方式与根据图3的光片显微镜300的实施方式的不同之处主要在于另一个传感器202和分光器单元204。相同的和相同作用的部件在图1～4中用相同的附图标记表示。
图5是示出光片显微镜100、200、300、400的样本空间116的示意图。图5中示出了如何通过光片134首先在盖玻片118的表面138、140之一上的反射来产生反射光束142。
根据图5，分散地照射物镜120的入射光瞳136的光片134，通过物镜120，相对于光轴O2以角度β倾斜地转向到盖玻片118的面向物镜120的、在图5中用138表示的前表面上。由于盖玻片118和与其前表面138邻接的浸没介质119具有不同的折射率，因此盖玻片118的前表面138和与其邻接的浸没介质119形成了界面，在该界面处，入射光片134被部分反射。测量光束134的在该界面处反射的部分产生了反射光束142，该反射光束被引回到物镜120中。
图6示出了反射光束54在位置敏感的探测器150上产生的强度分布V。在此，根据图6的曲线图的横坐标表示在探测器150上的入射位置，而纵坐标表示在相应的入射位置处测得的强度。根据图6的强度分布V示出了峰值P，该峰值的位置X可在位置敏感的探测器150上相对于参考位置Xref确定，是作为测量变量要确定的距离z的量度，盖玻片118的表面138、140沿着光轴O2相距物镜120具有该距离。此外，P下面的面积是在表面138、140上反射的光的强度的量度。
图7是示出光片显微镜100、200、300、400的样本空间116的示意图。在图7中，现在示出了是如何通过光片134在盖玻片118的两个表面138、140上的反射产生反射光束142的。
因此，分散地照射物镜120的入射光瞳136的光片134，通过物镜120，相对于光轴O2以角度β倾斜地转向到盖玻片118的面向物镜120的前表面138上。光片的在图7中由134a表示的第一部分，在由盖玻片118的前表面138和与其邻接的浸没介质119形成的第一界面处被部分反射。在该第一界面处反射的部分测量光束产生了被引回到物镜120中的第一反射光束142a。
光片134的透射第一界面的另一部分152，在其进入盖玻片118时折射离开物镜120的光轴O2，并与该光轴夹成大于角度β的角度γ。光片134的该透射部分152在第二界面处被部分反射，该第二界面由盖玻片118的后表面140和邻接它的包埋介质117限定，该包埋介质具有与盖玻片118不同的折射率。通过光片134在第二界面处的该第二部分反射，产生了第二反射光束142b，其穿过盖玻片118的前表面138，然后返回到物镜120中。
如根据图7的视图中所示，光片134倾斜地入射到样本空间116中确保了，通过在盖玻片118的前表面138和后表面140上的两次部分反射产生的反射光束142a、142b，在不同的光路上返回到物镜120中。以此方式，两个反射光束142a、142b在不同的入射位置射到位置敏感的探测器150上，如果确保两个反射光束142a、142b同时落在探测器150上。换言之，光片134的横截面的在盖玻片118的前表面138和后表面140上产生的两个图像，在空间上彼此分开地成像到位置敏感的探测器150上，如根据图8的如下曲线图中所示。
图8示出了两个反射光束142a、142b共同在位置敏感的探测器150上产生的示例性强度分布V。在此，曲线图的横坐标表示在探测器150上的入射位置，纵坐标表示在相应入射位置测得的强度。根据图8的强度分布V示出了两个峰值，其中标记为P1的峰值分配给第一反射光束142a，并且标记为P2的峰值分配给第二反射光束142b。从峰值P1比峰值P2更高且更尖锐的事实可以看出，在根据图7的示例中，光片134聚焦到盖玻片118的前表面138上。相反，在盖玻片188的后表面140上的第二部分反射发生在横向于光轴O2与其错开的点处。在图8中所示的峰值P1、P2下方的面积均是相应反射光束142a、142b的强度的量度。例如，根据它们的比率，可以将两个光学介质117、119之一的折射率确定为测量变量。
在根据图8的示例中，示出了两个反射光束142a、142b同时落到位置敏感的探测器150上的情况。这意味着，两个反射光束142a、142b的与玻璃盖118的厚度对应的空间分开度相对较小。换句话说，在根据图8的示例中，盖玻片118的作为测量变量要被检测的厚度相对于物镜放大率来说相对较小。然而，也可以想到这样一种情况，其中反射光束142a、142b的与盖玻片118的待检测的厚度对应的空间分开度如此之大，致使无法由位置敏感的探测器150同时检测两个反射光束142a、142b。
尽管已经描述了在所述装置的范畴内的一些方面，但是很明显，这些方面也是对相应方法的描述，其中，一个方框或装置对应于一个方法步骤或一个方法步骤的功能。类似地，在方法步骤的范畴内描述的方面也是对相应方框或部件或相应装置的特性的描述。部分或全部方法步骤可以通过(或使用)硬件装置来执行，例如处理器、微处理器、可编程计算机或电子电路都可以。在一些实施例中，一个或多个最重要的方法步骤可以由这样的装置执行。
根据某些实施要求，本发明的实施例可以用硬件或软件来实施。实施可以通过非易失性存储介质来进行，如软盘、DVD、蓝光、CD、ROM、PROM和EPROM、EEPROM或闪存存储器，在该存储介质上存储着电子可读的控制信号，这些控制信号与可编程的计算机***配合作用(或可以配合作用)，从而执行相应的方法。因此，数字存储介质可以是计算机可读的。
根据本发明的一些实施例包括数据载体，该数据载体具有电子可读的控制信号，这些控制信号可以与可编程的计算机***配合作用，从而执行这里所述的方法之一。
一般而言，本发明的实施例可以被实施为具有程序代码的计算机程序产品，其中，当计算机程序产品在计算机上运行时，该程序代码对于执行方法之一是有效的。程序代码例如可以存储在机器可读的载体上。
其它的实施例包括用于执行这里描述的方法之一的计算机程序，其存储在机器可读的载体上。
换言之，本发明的实施例因此是具有程序代码的计算机程序，用于当计算机程序在计算机上运行时执行这里描述的方法之一。
因此，本发明的另一实施例是一种存储介质(或数据载体或计算机可读的介质)，其包括存储在其上的计算机程序，用于当它由处理器执行时执行这里描述的方法之一。数据载体、数字存储介质或检测介质通常是有形的和/或不是无缝的。本发明的另一实施例是如这里所述的装置，该装置包括处理器和存储介质。
因此，本发明的另一实施例是数据流或信号序列，其形成用于执行在此描述的方法之一的计算机程序。数据流或信号序列可以例如以这样的方式配置，即它们通过数据通信连接例如通过互联网传输。
另一个实施例包括处理机构，例如计算机或可编程的逻辑装置，其被配置或适配为执行这里所述的方法之一。
另一个实施例包括计算机，在该计算机上安装了用于执行这里描述的方法之一的计算机程序。
根据本发明的另一个实施例包括一种装置或***，其被配置为向接收器(例如电子地或光学地)传输用于执行这里所述方法之一的计算机程序。接收器例如可以是计算机、移动装置、存储装置等。该装置或***例如可以包括用于将计算机程序传输到接收器的文件服务器。
在一些实施例中，可以使用可编程的逻辑装置(例如现场可编程门阵列，FPGA)，以便执行这里所述方法的一些或全部功能。在一些实施例中，现场可编程门阵列可以与微处理器协作，以便执行这里所述的方法之一。通常，这些方法优选地由任何硬件设备执行。
附图标记清单
100 光片显微镜
102 照明机构
104 传输光学器件
106 探测机构
107 光学***
108 中间图像空间
110 处理器
111z-驱动器
112 光源
114 照明物镜
116 样本空间
117 包埋介质
118 盖玻片或载玻片
119 浸没介质
120 物镜
122 管透镜
124、126 目镜
128 管透镜
130 投影物镜
132 光栅反射镜
134 光片
136 入射光瞳
138 前表面
140 后表面
142、142a、142b反射光束
144 探测物镜
146 管透镜
148 滤光器
150 传感器
152 光片的一部分
154 存储器
200 光片显微镜
202 传感器
204 分光器单元
300、400 光片显微镜
A光传播方向
B 延展方向
C 扫描方向
O1、O2、O3光轴
α、β、γ角度

Claims (15)

1.光片显微镜(100、200、300、400)包括：
样本空间(116)，在该样本空间中可设置盖玻片或载玻片(118)，该盖玻片或载玻片具有限定一个部分反射界面的表面(138、140)和限定另一个部分反射界面的另一表面(138、140)，其中，两个界面布置在相距所述光片显微镜的物镜(120)不同的距离处；
光学***(107)，该光学***带有面向所述盖玻片或载玻片(118)的所述物镜(120)；
被设计用于产生光片(134)的照明机构(102)；
传感器(150)；和
处理器(110)，其中，
两个界面的形成方式为，两个光学介质(117、119)可安置到所述样本空间(116)中，并与盖玻片或载玻片(118)的两个表面邻接，
其中，所述光片显微镜(100、200、300、400)形成用于检测多个测量变量的测量装置，该测量装置被设计用于，将所述光片(134)穿过所述光学***(107)倾斜入射地转向到所述盖玻片或载玻片(118)上，通过部分地在所述界面处反射所述光片(134)来产生反射光束(142、142a、142b)，通过部分地在所述另一个界面处反射所述光片(134)来产生另一反射光束(142、142a、142b)，接收穿过所述光学***(107)的两个反射光束(142、142a、142b)并转向到所述传感器(150)上，
所述传感器(150)被设计用于检测所述两个反射光束(142、142a、142b)的强度和/或入射位置，
所述处理器被设计用于基于所述两个反射光束(142、142a、142b)的所检测的强度和/或入射位置来确定所述多个测量变量中的第一测量变量，并且
所述处理器(110)被设计用于基于所述两个反射光束(142、142a、142b)的所检测的强度来确定所述多个测量变量中的第二测量变量，其中所述第二测量变量是所述两个光学介质(117、119)之一的折射率。
2.根据权利要求1所述的光片显微镜(100、200、300、400)，其中，所述处理器被设计用于基于所述两个反射光束(142、142a、142b)之一的所检测到的入射位置来确定所述第一测量变量，其中所述第一测量变量是所述盖玻片或载玻片(118)相距所述物镜(120)沿该物镜的光轴(O2)的距离。
3.根据权利要求1或2所述的光片显微镜(100、200、300、400)，其中，所述盖玻片或载玻片(118)的两个表面构造为彼此平面平行。
4.根据权利要求1或2所述的光片显微镜(100、200、300、400)，其中，所述处理器(110)被设计用于基于所述两个反射光束(142、142a、142b)的所检测到的入射位置来确定所述第一测量变量，其中所述第一测量变量是所述盖玻片或载玻片(118)的厚度。
5.根据权利要求1或2所述的光片显微镜(100、200、300、400)，其中，一个光学介质(119)是用于样本的包埋介质，该包埋介质与所述盖玻片或载玻片(118)的两个表面之一邻接。
6.根据权利要求1或2所述的光片显微镜(100、200、300、400)，其中，另一光学介质(119)是浸没介质，该浸没介质与所述盖玻片或载玻片(118)的另一表面和所述物镜(120)邻接。
7.根据权利要求1或2所述的光片显微镜(100、200、300、400)，其中，所述测量装置被设计用于，在所述界面处通过所述光片(134)产生测量图案，
通过所述反射光束(142、142a、142b)将所述测量图案成像到所述传感器(150)上，所述传感器(150)被设计用于以空间强度分布(V)的形式检测所述测量图案，并且
所述处理器(110)被设计用于根据所述空间强度分布(V)确定所述反射光束(142、142a、142b)的强度。
8.根据权利要求1或2所述的光片显微镜(100、200、300、400)，其中，所述传感器(150)是平面探测器或线列探测器。
9.根据权利要求1或2所述的光片显微镜(100、200、300、400)，包括探测机构(106)和分光器单元(204)，该探测机构具有用于检测从所述样本发出的探测光的另一传感器(202)，该分光器单元被设计用于将反射光束(142、142a、142b)转向到所述传感器(150)上并且将所述探测光转向到所述另一传感器(202)上。
10.根据权利要求1或2所述的光片显微镜(100、200、300、400)，其中，所述处理器(110)包括存储器(154)，用于确定所述多个测量变量的参数可存储在该存储器中。
11.根据权利要求1或2所述的光片显微镜(100、200、300、400)，包括连接在所述传感器(150)上游的滤光器(148)，该滤光器对于所述反射光束(142、142a、142b)是不可透过的。
12.根据权利要求1或2所述的光片显微镜(100、200、300、400)，包括扫描部件(132)，该扫描部件被设计用于沿着扫描轴移动所述光片(134)。
13.根据权利要求1或2所述的光片显微镜(100、200、300、400)，其中，所述测量装置被设计用于将所述光片(134)穿过所述物镜(120)倾斜入射地转向到所述盖玻片或载玻片(118)上，和/或接收通过物镜(120)的反射光束(142、142a、142b)并将其转向到所述传感器(150)上。
14.根据权利要求1或2所述的光片显微镜(100、200、300、400)，包括传输光学器件(104)，所述传输光学器件被设计用于把由所述照明机构(102)在中间图像空间中产生的光片(134)成像到所述样本中。
15.一种借助光片显微镜(100、200、300、400)检测多个测量变量的方法，其中，
在所述光片显微镜(100、200、300、400)的样本空间(116)中设置有盖玻片或载玻片(118)，该盖玻片或载玻片具有限定一个部分反射界面的表面(138、140)和限定另一个部分反射界面的另一表面(138、140)，
其中，把两个界面布置在相距所述光片显微镜的物镜(120)不同的距离处，
将光片(134)倾斜入射地转向到所述盖玻片或载玻片(118)上，
通过在所述界面处部分地反射所述光片(134)来产生反射光束(142、142a、142b)，
通过在另一个界面处部分地反射所述光片(134)来产生另一个反射光束(142、142a、142b)，
其中，两个界面的形成方式为，可把两个光学介质(117、119)引入到所述样本空间(116)中，并与盖玻片或载玻片(118)的两个表面邻接，
接收两个反射光束(142、142a、142b)并转向到所述光片显微镜的传感器(150)上，
检测所述两个反射光束(142、142a、142b)的强度和/或入射位置，并且，
基于所述反射光束(142、142a、142b)的所检测的强度和/或入射位置来确定所述多个测量变量中的第一测量变量，
基于所述两个反射光束(142、142a、142b)的所检测的强度来确定所述多个测量变量中的第二测量变量，其中所述第二测量变量是所述两个光学介质(117、119)之一的折射率。
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