CN112415104B - 一种有柄石韦药材及其饮片、标准汤剂、配方颗粒的特征图谱、构建方法和检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种有柄石韦药材及其饮片、标准汤剂、配方颗粒的特征图谱、构建方法和检测方法，属于中药检测技术领域，通过高效液相色谱法建立有柄石韦药材及其饮片、标准汤剂、配方颗粒的特征图谱，包括其相应的供试品的溶液制备，对照品的选取和对照溶液的制备进行的研究，得到相应的特征图谱，可以快速判断是否是有柄石韦的药材或饮片或标准汤剂或配方颗粒，同时填补了现有技术中药材有柄石韦质量控制的空白，特别是在有柄石韦药材至有柄石韦配方颗粒成品的整个工艺过程中，质量的整体评价和控制的空白，为之后中药‑有柄石韦的研究提供有效研究基础。

Description

一种有柄石韦药材及其饮片、标准汤剂、配方颗粒的特征图 谱、构建方法和检测方法

技术领域

本发明涉及属于中药检测技术领域，具体的涉及一种有柄石韦药材及其饮片、标准汤剂、配方颗粒的特征图谱、构建方法和检测方法。

背景技术

有柄石韦Pyrrosia petiolosa (Christ) Ching为中国药典收载的中药石韦三个基源之一。

目前，《中国药典》2020年版一部石韦项下仅收载采用高效液相色谱法测定绿原酸单一成分含量的方法，尚未进行其特征图谱控制。其他有部分文献研究报道建立了石韦药材、配方颗粒的指纹图谱，如：高贝，程丹丹，辛晓伟，等.HPLC法测定有柄石韦及华北石韦中绿原酸和木犀草素的含量及不同浸提物的指纹图谱分析[J].中国野生植物资源，2015，34（1）：19-21。如：王婧，王娇娇，赵帆帆，等.石韦配方颗粒HPLC-DAD特征图谱研究[J].河北科技大学学报，2017，38（1）：39-45.等。

现有文献报道的不同基源石韦的指纹图谱研究仅针对药材，未见其标准汤剂的报道，关于石韦配方颗粒的特征图谱研究未区分基源，且特征图谱峰指认较少。

因此，现有的检测方法难以有效对比和分析有柄石韦药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒特征图谱的差异与变化，难以深入认识有柄石韦药效物质基础在从药材到配方颗粒的工艺过程的传递情况，难以整体评价和控制从有柄石韦药材到有柄石韦配方颗粒成品的工艺过程。

发明内容

本发明的目的在于提供一种有柄石韦药材及其饮片、标准汤剂、配方颗粒的特征图谱、构建方法和检测方法，可以解决现有技术中难以整体评价和控制从有柄石韦药材到有柄石韦配方颗粒成品的工艺过程，以达到填补现有技术中的空白，生产中对有柄石韦质量检测全面、可靠，同时检测时间用时较短，便于大规模推广应用。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种有柄石韦药材及其饮片、标准汤剂、配方颗粒的特征图谱的构建方法，包括以下步骤：

a. 对照品溶液的制备：取新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C的对照品，加溶剂溶解，得到对照品溶液；

b. 供试品溶液的制备：分别制备有柄石韦药材、饮片、标准汤剂以及其配方颗粒的供试品溶液；

c. 将所述对照品溶液和供试品溶液注入高效液相色谱仪中进行检测，以对照品溶液的特征图谱为参照图谱，从供试品溶液的特征图谱中选择共有峰，构建有柄石韦药材及其饮片、标准汤剂、配方颗粒的特征图谱。

进一步地，所述步骤a中，对照品溶液的制备方法包括：取新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C对照品，分别加50%甲醇，制成每1ml各含40μg对照品的溶液。

进一步地，所述步骤b中，所述有柄石韦药材供试品溶液的制备方法包括：取本品粉末，过二号筛，精密称定0.5g，加入水15ml，煎煮30分钟，加入甲醇10ml，密塞，超声处理10分钟，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，得有柄石韦药材供试品溶液。

进一步地，所述步骤b中，所述有柄石韦饮片供试品溶液的制备方法包括：取本品粉末，过二号筛，精密称定0.5g，加入水15ml，煎煮30分钟，加入甲醇10ml，密塞，称定重量，超声处理10分钟，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，得有柄石韦饮片供试品溶液。

进一步地，所述步骤b中，所述有柄石韦标准汤剂供试品溶液的制备方法包括：取本品冻干粉，精密称定0.3g，分别精密加入50%甲醇20ml，密塞，超声处理30分钟，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，得有柄石韦标准汤剂供试品溶液。

进一步地，所述步骤b中，所述有柄石韦配方颗粒供试品溶液的制备方法包括：取本品颗粒适量，研细后精密称定取约0.3g，精密加入50%甲醇20ml，密塞，超声30分钟，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，得有柄石韦配方颗粒供试品溶液。

所述高效液相色谱检测条件满足：

色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱长为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm；柱温：30℃；流速：1.0ml/min；进样量：10μl；检测波长为：330 nm；流动相A为乙腈，流动相B为0.5%磷酸水溶液，梯度脱洗。

所述梯度洗脱过程为：

0～5min，流动相A为5～8%，流动相B为95～92%，

5～20min，流动相A为8～11%，流动相B为92～89%，

20～25min，流动相A为11%，流动相B为89%，

25～28min，流动相A为11～15%，流动相B为89～85%，

28～38min，流动相A为15～19%，流动相B为85～81%，

38～50min，流动相A为19～20%，流动相B为81～80%，

50～55min，流动相A为20～28%，流动相B为80～72%，

55～60min，流动相A为28～30%，流动相B为72～70%，

60～65min，流动相A为30%，流动相B为70%。

一种有柄石韦药材及其饮片、标准汤剂、配方颗粒的特征图谱，包括采用有柄石韦药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒特征图谱的构建方法得到的有柄石韦药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒的特征图谱。

所述特征图谱包含7个共有峰，7个共有峰中包括新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C的特征峰。

一种有柄石韦药材及其饮片、标准汤剂、配方颗粒的鉴别方法，包括以下步骤：

a.取待鉴定的有柄石韦药材或其饮片或其标准汤剂或其配方颗粒，并分别制备有柄石韦药材或其饮片或其标准汤剂或其配方颗粒的样品溶液；

b.将步骤a中制得的样品溶液，分别进行高效液相色谱检测，即得对应的待鉴定的特征色谱；

c.将步骤b中得到的待鉴定的特征色谱与权利要求1所述方法构建得到的对应的特征图谱进行比对，若待鉴定的特征色谱与之对应的构建得到的特征色谱一致，则鉴别为质量合格。

本技术方案的有益效果如下：

（1）、本发明提供了一种适用于有柄石韦药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒的特征图谱检测方法，确定了7个共有峰，对7个共有峰进行化学成分的指认，确定特征峰分别为新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C，比现有技术指认的色谱峰多。所构建的HPLC特征图谱，色谱峰实现较好分离，特征图谱信息丰富，色谱峰形好，可以全面的反应有柄石韦的主要化学成分信息，检测方法具有良好的稳定性和重复性，便于大规模推广应用。

（2）、本发明构建的有柄石韦药材及其饮片、标准汤剂、配方颗粒的检测方法，能整体控制有柄石韦药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒中的特征成分，确保有柄石韦药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒整体质量的稳定。

（3）、本发明填补了现有技术中药材有柄石韦质量控制的空白，特别是在有柄石韦药材至有柄石韦配方颗粒成品的整个工艺过程中，质量的整体评价和控制的空白，为之后中药-有柄石韦的研究提供有效研究基础。

附图说明

本发明的前述和下文具体描述在结合以下附图阅读时变得更清楚，附图中：

图1为实施例4中特征图谱建立过程中吸收波长考察的特征图谱。

图2为实施例5中特征图谱建立过程中柱温考察的特征图谱。

图3为实施例6中特征图谱建立过程中流速考察的特征图谱。

图4为实施例7中有柄石韦药材提取方法考察的特征图谱。

图5为有柄石韦药材进行提取溶剂考察的特征图谱。

图6为有柄石韦药材进行提取时提取时间考察的特征图谱。

图7为有柄石韦药材进行提取时供试品提取取样量考察的特征图谱。

图8为有柄石韦药材标的标准汤剂进行检测时的色谱峰指认图。

图9为有柄石韦药材的特征图谱建立过程中不同色谱仪考察的特征图谱。

图10为有柄石韦的特征图谱建立过程中色谱柱耐用性考察的特征图谱。

图11为有柄石韦标准汤剂对照特征图谱。

图12为有柄石韦配方颗粒对照特征图谱。

图13为有柄石韦药材对照特征图谱。

图14为有柄石韦饮片对照特征图谱。

图15是本发明中有柄石韦药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒对照特征图谱对比图（峰1：新绿原酸，峰2（S）：绿原酸，峰3：隐绿原酸，峰4：咖啡酸，峰5：异绿原酸B，峰6：异绿原酸A，峰7：异绿原酸C）。

具体实施方式

本发明提供一种有柄石韦药材及其饮片、标准汤剂、配方颗粒的特征图谱、构建方法和检测方法，为是本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处描述的具体实施例仅仅用以理解本发明，并不用于限定本发明。

以下通过具体实施例对本发明做进一步说明。

实施例中所涉及的实验仪器及材料如下：

高效液相色谱仪：岛津LC-20AD型高效液相色谱仪、安捷伦1260型高效液相色谱仪、Waters e2695型高效液相色谱仪；

电子天平：ME204E/02、MS205DΜ、XP26(梅特勒-托利多仪器有限公司)；

超纯水机：细胞型1810A（上海摩勒科学仪器有限公司）；

超声波清洗器：KQ600DB型（600W，40KHz；昆山市超声仪器有限公司）；

色谱柱：Agilent 5 TC-C18 250×4.6mm、Kromasil 100-5-C18 4.6×250mm、InertStain C18 5μm 4.6×250mm、Inertsil ODS-3 3μm 4.6×250mm；

试剂：乙腈、磷酸为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯；

新绿原酸（四川省维克奇生物科技有限公司，批号：wkq18030107，含量以98.0%计）；绿原酸（中国食品药品检定研究院，批号：110753-201817，含量以96.8%计）；隐绿原酸（中国食品药品检定研究院，批号：17061401 ，含量以97.8%计）；咖啡酸（中国食品药品检定研究院，批号：110885-201703，含量以99.7%计）；异绿原酸B（四川省维克奇生物科技有限公司，批号：wkq17060705，含量以98.0%计）；异绿原酸A（成都曼斯特生物科技有限公司，批号：MUST-18032601，含量以98.0%计）；异绿原酸C（四川省维克奇生物科技有限公司，批号：wkq17120111，含量以98.0%计）；

有柄石韦药材批号：XLS201808882、XLS201808883、XLS201808884、XLS201808885、XLS201808886、XLS201808887、XLS201808888、XLS201808889、XLS201808890、XLS201808891、XLS201903139、XLS201903140、XLS201903141、XLS201903142、XLS201903143、XLS201903144、XLS201903145、XLS201903146、XLS201903147、XLS201903148；

有柄石韦饮片批号：SW181210、SW181211、SW181212、SW181213、SW181214、SW181215、SW181216、SW181217、SW181218、SW181219、SW190301、SW190302、SW190303、SW190304、SW190305、SW190306、SW190307、SW190308、SW190309、SW190310；

有柄石韦标准汤剂冻干粉批号：SWBT181210、SWBT181211、SWBT181212、SWBT181213、SWBT181214、SWBT181215、SWBT181216、SWBT181217、SWBT181218、SWBT181219、SWBT190301、SWBT190302、SWBT190303、SWBT190304、SWBT190305、SWBT190306、SWBT190307、SWBT190308、SWBT190309、SWBT190310；

有柄石韦配方颗粒批号：SY1907003、SY1907001、SY1907002。

实施例1

本实施例涉及有柄石韦药材及其饮片、有柄石韦标准汤剂、有柄石韦配方颗粒制剂的供试品，具体制备工艺如下：

有柄石韦药材供试品溶液的制备方法包括：取本品粉末，过二号筛（筛孔内径850μm±29μm，24目），约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入水15ml，称定重量，煎煮30分钟，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，精密加入甲醇10ml，密塞，称定重量，超声处理（功率600W，频率40kHz）10分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

有柄石韦饮片供试品溶液的制备方法包括：取本品粉末（过二号筛）约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入水15ml，称定重量，煎煮30分钟，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，精密加入甲醇10ml，密塞，称定重量，超声处理（功率600W，频率40kHz）10分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

有柄石韦标准汤剂供试品溶液的制备方法包括：取有柄石韦标准汤剂的冻干粉，约0.3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入50%甲醇20ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

有柄石韦配方颗粒供试品溶液的制备方法包括：取本品适量，研细，取约0.3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入50%甲醇20ml，密塞，称定重量，超声30分钟，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

实施例2

本实施例涉及有柄石韦药材及其饮片、有柄石韦标准汤剂、有柄石韦配方颗粒制剂得到指纹图谱建立，具体包括以下步骤：

a. 对照品溶液的制备：取新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C的对照品，加溶剂溶解，得到对照品溶液；

b. 供试品溶液的制备：分别制备有柄石韦药材、饮片、标准汤剂以及其配方颗粒的供试品溶液；

c. 检测：将所述对照品溶液和供试品溶液注入高效液相色谱仪中进行检测，以对照品溶液的特征图谱为参照图谱，从供试品溶液的特征图谱中选择共有峰，构建有柄石韦药材及其饮片、标准汤剂、配方颗粒的特征图谱。

所述高效液相色谱检测条件满足：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱长为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm；柱温：30℃；流速：1.0ml/min；进样量：10μl；检测波长为：330 nm；流动相A为乙腈，流动相B为0.5%磷酸水溶液，梯度脱洗。理论板数按绿原酸峰计算应不低于3000。

梯度脱洗过程为：

0～5min，流动相A为5～8%，流动相B为95～92%，

5～20min，流动相A为8～11%，流动相B为92～89%，

20～25min，流动相A为11%，流动相B为89%，

25～28min，流动相A为11～15%，流动相B为89～85%，

28～38min，流动相A为15～19%，流动相B为85～81%，

38～50min，流动相A为19～20%，流动相B为81～80%，

50～55min，流动相A为20～28%，流动相B为80～72%，

55～60min，流动相A为28～30%，流动相B为72～70%，

60～65min，流动相A为30%，流动相B为70%。

d. 以步骤c中对照品溶液的特征图谱为参照图谱，从供试品溶液的特征图谱中选择共有峰，构建有柄石韦药材及其饮片、标准汤剂、配方颗粒的特征图谱。

构建有柄石韦药材的特征图谱共有7个特征峰，其中与绿原酸参照物相应的峰为S峰。计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％之内。规定值为：0.633（峰1）、1.067（峰3）、1.117（峰4）、2.058（峰5）、2.156（峰6）、2.354（峰7）。

构建的有柄石韦饮片的供试品色谱中应呈现7个特征峰，与绿原酸参照物相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％之内。规定值为：0.633峰1）、1.066（峰3）、1.117（峰4）、2.057（峰5）、2.154（峰6）、2.352（峰7）。

构建的有柄石韦标准汤剂的供试品色谱中应呈现7个特征峰，与绿原酸参照物相应的峰为S峰，计算各特征峰S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％之内。规定值为：0.633（峰1）、1.066（峰3）、1.117（峰4）、2.053（峰5）、2.150（峰6）、2.348（峰7）。

构建的有柄石韦配方颗粒的供试品色谱中应呈现7个特征峰，与绿原酸参照物相应的峰为S峰。计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％之内。规定值为：0.62（峰1）、1.06（峰3）、1.10（峰4）、2.10（峰5）、2.19（峰6）、2.40（峰7）。

实施例3

本实施例涉及一种有柄石韦药材及其饮片、标准汤剂和配方颗粒的鉴别。具体步骤如下：

a.取待鉴定的有柄石韦药材及其饮片、标准汤剂和配方颗粒，按实施例2的步骤b供试品的制备方法，分别制备有柄石韦药材及其饮片、标准汤剂和配方颗粒的样品溶液；

b.将步骤a中得到的样品溶液，按实施例2中步骤c的检测条件，分别进行高效液相色谱检测，即得对应的待鉴别的特征图谱；

c. 将步骤b得到的待鉴别的特征图谱，与实施例2步骤d构建得到的对应的特征图谱进行比对，若待鉴别的特征图谱与之对应的构建得到的特征图谱一致，则鉴别为质量合格。

实施例4

波长的考察

在以上拟定的实验条件基础上，利用二极管阵列检测器分别对新绿原酸对照品溶液、绿原酸对照品溶液、隐绿原酸对照品溶液、咖啡酸对照品溶液、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C对照品溶液、供试品溶液进行全波段扫描，并提取供试品溶液在230nm、254nm、270nm、290nm、310nm、330nm、360nm波长下的色谱图。结果表明，在检测波长为330nm时色谱峰信息量较大，故检测波长确定为330nm。如图1所示，是有柄石韦标准汤剂不同的波长图，可供参考。

实施例5

柱温的考察

在以上拟定的色谱条件上，对柱温为25℃、30℃、35℃时进行考察。见图2和表1。

表1

结果表明，在柱温为25、30、35℃时，色谱图峰形均对称，分离度均符合要求。故选择柱温30℃进行后续考察。

实施例6

流速的考察

在以上拟定的色谱条件上，对流速为0.8ml/min、1.0ml/min、1.2ml/min时进行考察。见图3和表2。

表2

结果表明，流速分别为0.8ml/min、1.0ml/min时，各特征峰的相对保留时间色谱图峰形均对称，分离度均符合要求。选择流速1.0ml/min进行后续考察。

实施例7

提取方法考察

取本品（批号SWBT181216）约0.3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入50%甲醇20ml，密塞，称定重量，分别考察提取方式回流、超声，提取时间30min，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。见图4。

结果表明，对供试品进行超声提取比回流提取时效果更好。故供试品提取方法确定为超声提取。

实施例8

提取溶剂的考察

取本品（批号SWBT181216）约0.3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别加入供试品提取溶剂为甲醇、80%甲醇、50%甲醇、水、乙醇、50%乙醇各20ml，密塞，称定重量，超声提取30分钟，放冷，再称定重量，用相应提取溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。见图5。

结果表明，在提取溶剂为50%甲醇时，色谱峰信息量大，分离度好。故供试品提取溶剂确定为50%甲醇。

实施例9

提取时间的考察

取本品（批号SWBT181216）约0.3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入50%甲醇20ml，密塞，称定重量，超声提取，分别对供试品提取时间为20分钟、30分钟、40分钟时进行考察，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。见图6。

结果表明，在提取时间为20分钟即可，但为了保证溶液能充分提取，结合常规的中药提取工艺，故供试品提取时间确定为30分钟。

实施例10

物料比考察

分别取本品（批号SWBT181216）约0.2g，0.3g ，0.4g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入50%甲醇20ml，密塞，称定重量，超声提取30分钟，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。见图7。

结果表明，在取样量为0.3g时，色谱峰高比例较适宜。故供试品提取取样量确定为0.3g。

综上所述，有柄石韦标准汤剂特征图谱供试品溶液的制备方法确定为：取本品约0.3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇20ml，密塞，称定重量，超声提取30分钟，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

实施例11

色谱峰的指认

供试品溶液的制备：按以上拟定的实验条件，制备有柄石韦标准汤剂供试品溶液。

参照物溶液的制备：取新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C分别加50%甲醇制成每1ml各含40μg的溶液，即得。

阴性对照溶液的制备：按以上拟定的实验条件，制备缺有柄石韦标准汤剂阴性对照溶液。

对有柄石韦标准汤剂特征图谱峰进行指认。见图8。

结果表明，峰1为新绿原酸，峰2为绿原酸，峰3为隐绿原酸，峰4为咖啡酸，峰5为异绿原酸B，峰6为异绿原酸A，峰7为异绿原酸C，在以下方法学考察中，对图8样品图谱中的7个峰进行考察。

实施例12

精密度的考察

取有柄石韦标准汤剂（批号SWBT181216）供试品溶液，按拟定实验方法连续进样6次，每次10μl，计算保留时间及峰面积，见表3和表4。

表3：精密度考察-保留时间

表4：精密度考察-峰面积

结果表明，各特征峰保留时间和峰面积的RSD值符合要求，该仪器精密度良好。

实施例13

重复性的考察

精密称取有柄石韦标准汤剂冻干粉（批号SWBT181216）6份，按拟定实验方法进行制备及测定。见表5和表6。

表5：重复性考察-相对保留时间

表6：重复性考察-相对峰面积

结果表明，各特征峰相对保留时间和相对峰面积的RSD值符合要求，表明该方法重复性良好。

实施例14

中间精密度考察

不同人员和时间考察

在以上拟定的实验条件基础上，分别在不同人员（A、B）和不同时间（T1 、T2）条件下精密称取有柄石韦标汤冻干粉（批号SWBT181216）各两份，制备供试品，进行测定。结果见表7和表8。

表7：人员和时间考察-相对保留时间

表8：人员和时间考察-相对峰面积

结果表明，由不同的人员在不同的时间对同一个样品进行测定，方法稳定性较好。

实施例15

不同仪器考察

在以上拟定的实验条件基础上，分别精密称取有柄石韦标准汤剂冻干粉（批号SWBT181216）两份，制备供试品溶液，分别在岛津LC-20AD型高效液相色谱仪、安捷伦1260型高效液相色谱仪、Waters 2695-2996型高效液相色谱仪上进行测定（色谱柱均为Agilent 5TC-C18 250×4.6mm）。见图9、表9-10。

表9：仪器耐用性考察-相对保留时间

表10：仪器耐用性考察-相对峰面积

结果表明，不同仪器条件下，各特征峰相对保留时间的RSD在0.51%～4.05%；各特征峰相对峰面积的RSD在0.26%～11.12%，故3个品牌仪器耐用性良好。

实施例16

色谱柱耐用性考察

在以上拟定的实验条件基础上，分别对色谱柱为Phenomenex Luna 5um C18(2)100A 4.6×250mm、InertSustain C18 5μm 4.6×250mm、Inertsil ODS-3 3μm 4.6×250mm时进行考察。结果见图10，表11-12。

表11：色谱柱耐用性考察-相对保留时间

表12：色谱柱耐用性考察-相对峰面积

结果表明，用上述3种色谱柱对样品进行检测，特征峰相对保留时间的RSD在2.68%～7.01%，特征峰相对峰面积的RSD在2.23%～29.36%。

实施例17

稳定性考察

在以上拟定的实验条件基础上，取同一供试品溶液，分别于0h，4h、8h，12h，18h，24h时测定。见表13和表14。

表13：稳定性考察-保留时间

表14：稳定性考察-峰面积

结果表明，其相对应的特征峰保留时间的RSD在0.08%～0.18%，样品溶液在24小时内较稳定。

综上所述，各特征峰相对保留时间的RSD在以上各项考察中均符合要求，该方法良好。

实施例18

标准汤剂特征图谱验证

按实施例1中标准汤剂的供试品溶液的制备方法，对本品20批样品进行特征图谱的测定，计算相对保留时间、相对峰面积，验证结果见表15-16。

表15：20批有柄石韦标准汤剂保留时间

表16：20批有柄石韦标准汤剂相对峰面积

根据相对保留时间稳定及各批次样品均能检出且峰相对较高的原则，共选择了7个重复性较好的峰作为特征峰。结果表明，当峰2作为S峰时，20批次有柄石韦标准汤剂特征峰相对保留时间RSD均小于2.0％。最终规定：供试品色谱中应呈现7个特征峰，并与对照药材参照物色谱峰中的7个特征峰的保留时间相对应，其中与绿原酸参照物相应的峰为S峰，计算各特征峰S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％之内。规定值为：0.633（峰1）、1.066（峰3）、1.117（峰4）、2.053（峰5）、2.150（峰6）、2.348（峰7）。

采用中药色谱指纹图谱相似度评价***（2012版）对20批有柄石韦标准汤剂进行合成，建立了有柄石韦标准汤剂特征图谱的对照特征图谱，可以较为准确地整体控制有柄石韦标准汤剂的质量。见图11。

实施例19

配方颗粒特征图谱验证

按实施例1中有柄石韦配方颗粒供试品溶液的制备方法，对本品3批样品进行特征图谱的测定，计算相对保留时间、相对峰面积，见表17-18。

表17：3批有柄石韦配方颗粒相对保留时间

表18：3批有柄石韦配方颗粒相对峰面积

根据相对保留时间稳定及各批次样品均能检出且峰相对较高的原则，共选择了7个重复性较好的峰作为特征峰。当峰2作为S峰时，3批次有柄石韦配方颗粒7个特征峰相对保留时间RSD均小于1.0%。最终规定：供试品色谱中应呈现7个特征峰，与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％之内。规定值为：0.62（峰1）、1.06（峰3）、1.10（峰4）、2.10（峰5）、2.19（峰6）、2.40（峰7）。

采用中药色谱指纹图谱相似度评价***（2012版）对3批有柄石韦配方颗粒进行合成，建立了有柄石韦配方颗粒特征图谱的对照图谱。见图12，其中峰1：新绿原酸，峰2（S）：绿原酸，峰3：隐绿原酸，峰4：咖啡酸，峰5：异绿原酸B，峰6：异绿原酸A，峰7：异绿原酸C。

实施例20

药材特征图谱验证

按照实施例1中有柄石韦药材的供试品溶液的制备方法，对其20批样品进行测定，计算相对保留时间、相对峰面积的比值。结果见表19和表20。

表19：20批有柄石韦药材特征图谱相对保留时间比值

表20：20批有柄石韦药材特征图谱相对峰面积

根据相对保留时间稳定及各批次样品均能检出且峰相对较高的原则，共选择了7个重复性较好的峰作为特征峰。当峰2作为S峰时，20批次有柄石韦药材7个特征峰相对保留时间RSD均小于2.0%。最终规定：供试品色谱中应呈现7个特征峰，与绿原酸参照物相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％之内。规定值为：0.633（峰1）、1.067（峰3）、1.117（峰4）、2.058（峰5）、2.156（峰6）、2.354（峰7）。

采用中药色谱指纹图谱相似度评价***（2012版）对上述样品进行合成，建立了有柄石韦药材特征图谱的对照特征图谱。见图13，其中峰1：新绿原酸，峰2（S）：绿原酸，峰3：隐绿原酸，峰4：咖啡酸，峰5：异绿原酸B，峰6：异绿原酸A，，峰7：异绿原酸C。

实施例21

饮片特征图谱验证

按照以上方法对20批样品进行测定，计算相对保留时间、相对峰面积的比值。结果见表21和表22。

表21：20批有柄石韦饮片特征图谱相对保留时间比值

表22：20批有柄石韦饮片特征图谱相对峰面积

根据相对保留时间稳定及各批次样品均能检出且峰相对较高的原则，共选择了7个重复性较好的峰作为特征峰。当峰2作为S峰时，20批有柄石韦饮片特征峰相对保留时间的RSD均小于1.0%。最终规定：供试品色谱中应呈现7个特征峰，与绿原酸参照物相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％之内。规定值为：0.633峰1）、1.066（峰3）、1.117（峰4）、2.057（峰5）、2.154（峰6）、2.352（峰7）。

采用中药色谱指纹图谱相似度评价***（2012版）对20批有柄石韦饮片特征图谱进行合成，建立了有柄石韦饮片特征图谱的对照图谱。见图14，其中峰1：新绿原酸，峰2（S）：绿原酸，峰3：隐绿原酸，峰4：咖啡酸，峰5：异绿原酸B，峰6：异绿原酸A，峰7：异绿原酸C。

实施例22

采用中药色谱指纹图谱相似度评价***（2012版）分别将20批有柄石韦药材特征图谱合成一张药材对照图谱，参照图15，20批有柄石韦饮片特征图谱合成一张饮片对照图谱，20批有柄石韦标准汤剂特征图谱合成一张标准汤剂对照图谱，3批有柄石韦配方颗粒特征图谱合成一张配方颗粒对照图谱。将以上有柄石韦药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒对照图谱进行对比，结果见图15，其中峰1：新绿原酸，峰2（S）：绿原酸，峰3：隐绿原酸，峰4：咖啡酸，峰5：异绿原酸B，峰6：异绿原酸A，峰7：异绿原酸C。

结果表明，有柄石韦药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒中均能检出7个特征峰，其物质基础一致，本发明方法可以准确高效地检测出有柄石韦药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒中的特征成分，实现整体控制有柄石韦药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒质量的目的。

综上，该种适用于有柄石韦药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒高效液相特征图谱的检测方法，能整体控制有柄石韦药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒中的特征成分，确保有柄石韦药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒质量的整体稳定，且方法操作简单，精密度高，稳定性好，重复性好，准确度高。

Claims (2)

1.一种有柄石韦药材及其饮片、标准汤剂、配方颗粒的特征图谱的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

a. 对照品溶液的制备：取新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C的对照品，加溶剂溶解，得到对照品溶液；

b. 供试品溶液的制备：分别制备有柄石韦药材、饮片、标准汤剂以及其配方颗粒的供试品溶液；

c. 将所述对照品溶液和供试品溶液注入高效液相色谱仪中进行检测，以对照品溶液的特征图谱为参照图谱，从供试品溶液的特征图谱中选择共有峰，构建有柄石韦药材及其饮片、标准汤剂、配方颗粒的特征图谱；

所述步骤a中，对照品溶液的制备方法包括：取新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C对照品，分别加50%甲醇，制成每1ml各含40μg对照品的溶液；

所述步骤b中，所述有柄石韦药材供试品溶液和有柄石韦饮片供试品溶液的制备方法包括：取有柄石韦药材或有柄石韦饮片粉末，过二号筛，精密称定0.5g，加入水15ml，煎煮30分钟，加入甲醇10ml，密塞，超声处理10分钟，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得有柄石韦药材供试品溶液或有柄石韦饮片的供试品溶液；

所述步骤b中，所述有柄石韦标准汤剂供试品溶液的制备方法包括：取本品冻干粉，精密称定0.3g，分别精密加入50%甲醇20ml，密塞，超声处理30分钟，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，得有柄石韦标准汤剂供试品溶液；

所述步骤b中，所述有柄石韦配方颗粒供试品溶液的制备方法包括：取本品颗粒适量，研细后精密称定取约0.3g，精密加入50%甲醇20ml，密塞，超声30分钟，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，得有柄石韦配方颗粒供试品溶液；

所述高效液相色谱检测条件满足：

色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱长为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm；

柱温：30℃；

流速：1.0ml/min；

进样量：10μl；

检测波长为：330 nm；

流动相A为乙腈，流动相B为0.5%磷酸水溶液，梯度脱洗；

所述梯度洗脱过程为：

0～5min，流动相A为5～8%，流动相B为95～92%，

5～20min，流动相A为8～11%，流动相B为92～89%，

20～25min，流动相A为11%，流动相B为89%，

25～28min，流动相A为11～15%，流动相B为89～85%，

28～38min，流动相A为15～19%，流动相B为85～81%，

38～50min，流动相A为19～20%，流动相B为81～80%，

50～55min，流动相A为20～28%，流动相B为80～72%，

55～60min，流动相A为28～30%，流动相B为72～70%，

60～65min，流动相A为30%，流动相B为70%。

2.一种有柄石韦药材及其饮片、标准汤剂、配方颗粒的鉴别方法，其特征在于，包括以下步骤：

a.取待鉴定的有柄石韦药材或其饮片或其标准汤剂或其配方颗粒，并分别制备有柄石韦药材或其饮片或其标准汤剂或其配方颗粒的样品溶液；

b.将步骤a中制得的样品溶液，分别进行高效液相色谱检测，即得对应的待鉴定的特征色谱；

c.将步骤b中得到的待鉴定的特征色谱与权利要求1所述方法构建得到的对应的特征图谱进行比对，若待鉴定的特征色谱与之对应的构建得到的特征色谱一致，则鉴别为质量合格。

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