CN113652379A - 一种芽孢杆菌胞壁解聚giec及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种芽孢杆菌胞壁解聚GIEC及其应用，属于生物技术领域，所述胞壁解聚GIEC于2021年2月5日保存于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏编号为GDMCC No:61501。本发明通过多个实验证明胞壁解聚GIEC能够有效降解细胞壁，例如利用该菌株降解螺旋藻，所得解聚液中碳水化合物回收率≥40％；利用该菌株降解杂交狼尾草、矮象草、玉米秸秆，所得降解液中碳水化合物≥2g/L,蛋白质≥0.7g/L,纤维素降解率≥17％、半纤维素降解率≥19％、木质素降解率为≥16％。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种芽孢杆菌胞壁解聚GIEC及其应用。
背景技术
螺旋藻是一种蓝细菌，富含蛋白质、多糖、脂质、维生素和矿物质，还有叶绿素、类胡萝卜素和不饱和脂肪酸等高价值物质。螺旋藻具有典型抗性细胞壁，其细胞壁是由葡聚糖和肽聚糖聚合物的多层组成，并在外部覆盖有酸性多糖的鞘。木质纤维类生物质的细胞壁由纤维素、半纤维素、果胶、木质素、细胞壁蛋白以及其他组分组成，它们之间存在非常复杂的共价键和非共价键作用。
由于细胞壁结构复杂，细胞壁的限制会直接导致对于生物质的高值化利用效果不佳。为了实现对于螺旋藻和木质纤维类生物质的资源化利用，各种预处理手段是细胞壁破碎必不可少的步骤。
预处理的方法主要有物理方法、化学方法、物理化学方法以及生物方法。目前国内外厂家大多采用化学法对微藻和木质纤维类生物质进行预处理。采用化学预处理最大的劣势在于强碱高温会破坏微藻内源物质的活性，并在对于木质纤维类生物质预处理过程中产生黑液。生物发酵法的原理是利用微生物在以螺旋藻、木质纤维生物质等为养分的代谢过程中会产生多种酶，将构成细胞壁大分子物质降解为小分子、水溶性物质。微生物发酵不需要物理法的能耗和高压，也不需要化学法的强碱和高温，是一种温和的预处理方式。因此，本发明旨在筛选能够高效解聚细胞壁的微生物。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种芽孢杆菌(Bacillus sp.)，命名为胞壁解聚GIEC，该菌于2021年2月5日保存于广东省微生物菌种保藏中心，地址为广东省广州市越秀区先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编为：510070，其保藏编号为GDMCC No:61501。
本发明的胞壁解聚GIEC，菌落大小10-18mm，无色透明，圆形，边缘整齐，表面光滑湿润，显微镜下观察菌为杆状，芽孢中生，革兰氏反应阳性。并结合全基因组的分析，鉴定其为芽孢杆菌(Bacillus)。实验证明本发明的胞壁解聚GIEC具有较强的细胞壁解聚能力，尤其是能够高效降解螺旋藻复杂的细胞壁结构。
本发明的第二个目的是提供一种微生物制剂，是以本发明所述胞壁解聚GIEC的培养物或其发酵液作为活性成分。
本发明的第三个目的是提供本发明所述的胞壁解聚GIEC或其微生物制剂在解聚生物质细胞壁中的应用；
优选地，所述的生物质为螺旋藻、杂交狼尾草、矮象草或玉米秸秆的任意一种；
进一步地，本发明所述的胞壁解聚GIEC或其微生物制剂在解聚生物质细胞壁以制备食品或饲料或添加剂中的应用。
本发明的第四个目的是提供一种解聚生物质细胞壁方法，包括以下步骤：
a.发酵培养基的配制：取生物质加去离子水，即得所需发酵培养基；
b.接种并发酵：将本发明胞壁解聚GIEC接种到发酵培养基中发酵。
优选地，所述发酵培养基的成分为生物质100-150重量份，加去离子水至1000重量份；
优选地，所述的接种是将所述的胞壁解聚GIEC从保存的液体培养基转接于新鲜液体培养基进行活化，其条件是：摇床37℃，150r/min，振荡培养48h；
优选地，所述发酵的条件为温度37℃，振荡转速140-150rpm，通气量N2:CO2＝4:1。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明所述芽孢杆菌具有较强的细胞壁解聚能力，利用该菌株降解螺旋藻，所得解聚液中碳水化合物回收率≥40％；
(2)本发明所述芽孢杆菌具有较强的细胞壁解聚能力，利用该菌株降解杂交狼尾草、矮象草、玉米秸秆，所得降解液中碳水化合物≥2g/L,蛋白质≥0.7g/L,纤维素降解率≥17％、半纤维素降解率≥19％、木质素降解率为≥16％。
本发明的Bacillus sp.胞壁解聚GIEC，于2021年2月5日保存于广东省微生物菌种保藏中心，地址为广东省广州市越秀区先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编为：510070，其保藏编号为GDMCC No:61501。
附图说明
图1为胞壁解聚GIEC菌体形态(A)以及螺旋藻状态(B)镜检图。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
下面结合实施例对本发明作进一步说明，下述实施例中试验方法如无特殊说明，均为常规试验方法，下述实施例中所述的实验试剂及耗材如无特殊说明，均来自常规生化试剂公司。
实施例1菌株的筛选与鉴定
1.1菌株胞壁解聚GIEC的筛选
将从市场上购买得到的益生菌胶囊用适量无菌水稀释后进行稀释平板涂布，挑选生长出来的菌落到液体培养基中，即得目标菌落。液体培养基是将对数培养期的螺旋藻稀释到合适浓度后经115℃，20min高压灭菌后得到的；固体培养基是在上述液体培养基中加入1％琼脂得到的。
1.2菌株胞壁解聚GIEC的鉴定
菌株形态特征：菌落大小10-18mm，无色透明，圆形，边缘整齐，表面光滑湿润，显微镜下观察菌为杆状，芽孢中生，革兰氏反应阳性。并结合全基因组的分析，鉴定其为芽孢杆菌(Bacillus)。
因此结合形态学、分子生物学和生理生化特征，将菌株命名为Bacillus sp.胞壁解聚GIEC，于2021年2月5日保存于广东省微生物菌种保藏中心，地址为广东省广州市越秀区先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编为：510070，其保藏编号为GDMCC No:61501。
实施例2胞壁解聚GIEC解聚螺旋藻细胞壁
(1)胞壁解聚GIEC种子活化
将实施例1筛选得到的胞壁解聚GIEC从保存的液体培养基转接于新鲜液体培养基，摇床37℃，150r/min振荡培养48h。种子质量标准：在波长600nm下测得OD值达到0.5，镜检菌体饱满。接种量10％。保存的液体培养基是是将对数培养期的螺旋藻稀释到合适浓度后经115℃，20min高压灭菌后得到的。
(2)配制发酵培养基
收集对数生长时期的螺旋藻(干重约为1.7mg/ml)，即得所需发酵培养基。
(3)接种并发酵
将10％胞壁解聚GIEC接种到发酵培养基中发酵，即得生物质降解液。发酵参数控制如下：发酵温度：37℃；振荡转速：150rpm；通气量；N2:CO2＝4:1(v/v)，分别在接种后0、3、6、24小时取样，然后每隔24小时取一次样，镜检菌体形态以及螺旋藻状态，结果如图1所示。然后将样品8000rpm离心5min,分离出上清和渣并分别保存。
实施例3胞壁解聚GIEC解聚杂交狼尾草细胞壁
(1)胞壁解聚GIEC种子活化
将实施例1筛选得到的胞壁解聚GIEC从保存的液体培养基转接于新鲜液体培养基，摇床37℃，150r/min振荡培养48h。种子质量标准：OD600值达到0.5，镜检菌体饱满。接种量10％。
(2)杂交狼尾草粉碎
用粉碎机将杂交狼尾草粉碎10min。
(3)发酵培养基的配制
取粉碎的杂交狼尾草100g，加去离子水至1000ml，即得所需发酵培养基。
(4)接种并发酵
将胞壁解聚GIEC接种到发酵培养基中发酵，即得生物质降解液。发酵参数控制如下：发酵温度：37℃；振荡转速：150rpm；通气量；N2:CO2＝4:1(v/v)，分别在接种后0、3、6、24小时取样，然后每隔24小时取一次样。然后将样品离心5min,分离出上清和渣并分别保存。
实施例4胞壁解聚GIEC解聚矮象尾草
(1)胞壁解聚GIEC种子活化
将实施例1筛选得到的胞壁解聚GIEC从保存的液体培养基转接于新鲜液体培养基，摇床37℃，150r/min振荡培养48h。种子质量标准：OD600值达到0.5，镜检菌体饱满。接种量10％。
(2)矮象尾草粉碎
用粉碎机将杂交狼尾草粉碎10min。
(3)发酵培养基的配制
取粉碎的杂交狼尾草150g，加去离子水至1000ml，即得所需发酵培养基。
(4)接种并发酵
将胞壁解聚GIEC接种到发酵培养基中发酵，即得生物质降解液。发酵参数控制如下：发酵温度：37℃；振荡转速：140rpm；通气量；N2:CO2＝4:1(v/v)，分别在接种后0、3、6、24小时取样，然后每隔24小时取一次样。然后将样品离心5min,分离出上清和渣并分别保存。
实施例5胞壁解聚GIEC解聚玉米秸秆
(1)胞壁解聚GIEC种子活化
将实施例1筛选得到的胞壁解聚GIEC从保存的液体培养基转接于新鲜液体培养基，摇床37℃，140r/min振荡培养48h。种子质量标准：OD600值达到0.5，镜检菌体饱满。接种量15％。
(2)矮象尾草粉碎
用粉碎机将杂交狼尾草粉碎10min。
(3)发酵培养基的配制
取粉碎的杂交狼尾草100g，加去离子水至1000ml，即得所需发酵培养基。
(4)接种并发酵
将胞壁解聚GIEC接种到发酵培养基中发酵，即得生物质降解液。发酵参数控制如下：发酵温度：37℃；振荡转速：140rpm；通气量；N2:CO2＝4:1(v/v)，分别在接种后0、6、24小时取样，然后每隔24小时取一次样。然后将样品离心5min,分离出上清和渣并分别保存。
分别对实施利用该菌株降解螺旋藻，所得解聚液中碳水化合物回收率≥40％；利用该菌株降解杂交狼尾草、矮象草、玉米秸秆，所得降解液中碳水化合物≥2g/L,蛋白质≥0.7g/L,可实现细胞壁中纤维素降解率大于17％、半纤维素降解率大于19％、木质素降解率大于16％。所述降解率的计算公式如下：
其中的C(F)和C(r)分别代表菌处理前后的纤维素、半纤维素和木质素的百分含量；m(F)和m(r)分别代表处理前后固体的质量。
Claims (8)
1.一种芽孢杆菌(Bacillus sp.)胞壁解聚GIEC，其特征在于，其保藏编号为GDMCC No:61501。
2.一种微生物制剂，其特征在于，以权利要求1所述胞壁解聚GIEC的培养物或其发酵液作为活性成分。
3.权利要求1所述的胞壁解聚GIEC或权利要求2所述的微生物制剂在解聚生物质细胞壁中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的生物质为螺旋藻、杂交狼尾草、矮象草或玉米秸秆的任意一种。
5.一种解聚生物质细胞壁方法，其特征在于，包括以下步骤：
a.发酵培养基的配制：取生物质加去离子水，即得所需发酵培养基；
b.接种并发酵：将权利要求1所述的胞壁解聚GIEC接种到发酵培养基中发酵。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基的成分为生物质100-150重量份，加去离子水至1000重量份。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的接种是将所述的胞壁解聚GIEC从保存的液体培养基转接于新鲜液体培养基进行活化，其条件是：摇床37℃，150r/min，振荡培养48h。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述发酵的条件为温度37℃，振荡转速140-150rpm，通气量N2:CO2＝4:1。
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