CN113646003A - 多配体官能化的聚合物泡囊 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于与细胞表面结合的纳米颗粒或微米颗粒,其中该纳米颗粒或微米颗粒包含:(i)在其外表面上的多种不同的配体类型,该配体类型能够与所述细胞表面上的不同的相应受体类型结合;和(ii)在其外表面上的聚合物刷。本发明还涉及包含多个本发明的纳米颗粒或微米颗粒的药物组合物、这种纳米颗粒或微米颗粒的医药用途以及包含这种纳米颗粒或微米颗粒的疫苗。
Description
技术领域
本发明涉及用于与细胞表面结合的纳米颗粒或微米颗粒,其中该纳米颗粒或微米颗粒包含:(i)在其外表面上的多种不同的配体类型,该配体类型能够与所述细胞表面上的不同的相应受体类型结合;和(ii)在其外表面上的聚合物刷。本发明还涉及包含多个本发明的纳米颗粒或微米颗粒的药物组合物、这种纳米颗粒或微米颗粒的医药用途以及包含这种纳米颗粒或微米颗粒的疫苗。
背景技术
有效的小分子疗法的一个关键特征是药物能够尽可能选择性地与其生物靶相互作用,事实上,大多数药物发现工具都经过改进以识别那些以最高亲和力结合的分子。现今,药物发现非常复杂,“组学”技术(例如基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学)的出现使个性化治疗成为可能(Aronson and Rehm,Nature,2015,526(7573),336-342)。近年来,将药物有效地递送到其体内作用部位的能力也得到了显著提高。因此,现在活性分子的高选择性可以与配备有必要的属性来导航生物环境的分子工程化载体(例如纳米颗粒或微米颗粒)结合(Cheng et al.,Science,2012,338(6109),903-910)。这种在纳米医学上的努力的一个关键要素是引入能够靶向和选择性地引导载体跨越生物屏障的配体。这项技术有可能将药物递送到无法通过简单的被动扩散进入的靶生物大分子,例如细胞内部(Akincand Battaglia,Cold Harb Spring Perspect Biol,2013,5(11),a016980)或中枢神经***(Fullstone et al.,Int Rev Neurobiol,2016,130,41-72)。
今天,我们创造无论是用于给药目的还是简单的靶向目的的配体的能力都非常先进,并且可以延伸到几乎任何生物单元。然而,在大多数疾病中,其中以癌症作为最典型的,失能与内源性的且因此健康和患病细胞皆表达的受体相关。这种混乱是许多药物与不良副作用相关以及许多药物未能通过临床开发线路继续前进的主要原因。这通常也是药物载体可能无法将药物递送到所需作用部位反而被免疫***吸收的原因。这种情况需要提高我们将药物引导到其预期靶部位的能力。
因此,期望提供更有效地将治疗剂递送至目标位点的药剂,并且特别是能够在难以克服非特异性相互作用的高度拥挤的环境中对一个特定的靶部位具有高选择性的药剂。这将能够使得在使用较低剂量的药剂时,实现相同或更好的治疗结果,和/或减少不希望的副作用。本发明解决了这些问题并且提供了用于将活性剂治疗地递送至其预期作用部位的改进的药物。
发明内容
本发明通过提供用于与细胞表面结合的多工(multiplex)纳米颗粒或微米颗粒来解决这些问题,该多工纳米颗粒或微米颗粒即包含以下的纳米颗粒或微米颗粒:(i)在其外表面上的多种不同的配体类型,该配体类型能够与所述细胞表面上的不同的相应受体类型结合;和(ii)在其外表面上的聚合物刷。本发明人惊奇地发现,纳米颗粒-或微米颗粒-细胞通过多种不同的配体类型结合导致纳米颗粒或微米颗粒内携带的药物货物的递送选择性增强,从而减少不希望的脱靶结合。本发明的另一个优点是,通过使用多工纳米颗粒或微米颗粒,靶细胞(例如癌细胞)上的细胞表面受体不那么容易能够以某种方式突变,使得随着时间的推移而会阻止纳米颗粒或微米颗粒有效结合。这在一些疾病的治疗过程持续相当长的时间(即数月或数年)时是特别有益的。此外,可以预测纳米颗粒或微米颗粒表面上各个不同配体类型的最佳数量,使与靶细胞表面的最佳结合成为可能。
据此,在一方面,本发明提供了一种用于与细胞表面结合的纳米颗粒或微米颗粒,其中该纳米颗粒或微米颗粒包含在其外表面上的至少第一配体类型和在其外表面上的至少第二配体类型,其中所述第一配体类型能够与所述细胞表面上的第一受体类型结合,并且所述第二配体类型能够与所述细胞表面上的第二受体类型结合,并且其中该纳米颗粒或微米颗粒包含第一配体类型的2个至1000个配体和第二配体类型的2个至1000个配体。纳米颗粒或微米颗粒通常是聚合物泡囊、脂质体、合成体或胶束,并且其通常包含在其外表面上的聚合物刷。
在另一方面,本发明提供了一种药物组合物,该药物组合物包含多个根据本发明的纳米颗粒或微米颗粒,以及一种或多种药学上可接受的赋形剂或稀释剂。
在又一方面,本发明提供根据本发明的纳米颗粒或微米颗粒,或根据本发明的药物组合物在治疗疾病(例如癌症)中的用途。
在又一方面,本发明提供一种治疗人类患者的癌症的方法,其中所述方法包括向有需要的患者施用根据本发明的纳米颗粒或微米颗粒、或根据本发明的药物组合物。
在又一方面,本发明提供根据本发明的纳米颗粒或微米颗粒,或根据本发明的药物组合物在制备用于治疗患者的癌症的药物中的用途。
在又一方面,本发明提供一种疫苗,该疫苗包含根据本发明的纳米颗粒或微米颗粒和抗原。
附图说明
图1:超选择性理论。示意图示出了聚合物泡囊支架上的多工配体策略(a)和聚合物泡囊支架上的高亲和力单价配体、低亲和力单价配体和多价配体的配体-受体亲和曲线(b);
图2:聚合物刷的示例。糖萼多配体蛋白聚糖4和LRP1受体的示意图。两种蛋白质都使用计算方法用原子分辨率重建,并被最小化以显示刷构象。插图示出了LRP1靠近四个硫酸乙酰肝素链的末端部分的细节(a)。用Angiopep肽装饰的POEGMA-PDPA聚合物泡囊的示意图。使用单个嵌段的最小化原子模型重建聚合物泡囊,这些最小化原子模型进而组装成50nm囊泡。插图细节示出了肽很好地嵌入聚环氧乙烷(PEO)刷中;
图3:聚合物泡囊表征。通过动态光散射测量POEGMA-PDPA/Angiopep(a)、POEGMA-PDPA/PMPC(b)和POEGMA-PDPA/PMPC+Angiopep(c)聚合物泡囊的粒径分布。POEGMA-PDPA/Angiopep(25个配体)制剂(d)和POEGMA-PDPA/PMPC(1000个配体)(e)制剂的代表性透射电子显微照片;
图4:选择性细胞摄取。孵育1小时后与脑内皮细胞结合的Angiopep-聚合物泡囊的示例(a)。细胞DNA用DAPI染料(蓝色)染色,聚合物泡囊用Cy5染料(红色)标记。聚合物泡囊与脑内皮细胞(线A)、淋巴细胞和巨噬细胞(线B)孵育1小时后测量的每个细胞的平均荧光随Angiopep肽(b)和PMPC链(c)的配体数量的变化。线C示出了使用脑内皮细胞作为靶细胞和使用巨噬细胞作为岗哨细胞而计算的选择性指数;
图5:脑内皮细胞的超选择性验证。标绘以示出用Angiopep肽和PMPC链装饰的多工聚合物泡囊与脑内皮细胞的结合;
图6:排斥空间势。用Angiopep肽装饰并靶向LRP1(a)、和用PMPC链装饰并靶向SRB1受体(b)、以及使用两种配体并靶向两种受体(c)的多价POEGMA-PDPA聚合物泡囊的结合示意图。Angiopep和LRP1(d)以及PMPC和SRB1(e)之间相互作用的细节由PEO和糖萼刷调节。相应的排斥空间势施加在PEO刷中的LRP1***(f)和糖萼刷中的聚合物泡囊***(g)。这些分别作为聚合物泡囊半径R和PEO链***参数δP以及糖萼硫酸乙酰肝素链***参数δG的函数进行计算;
图7:抗原呈递细胞的靶向。示出了健康组织和肿瘤组织中SRB1、TFRC、LRP1和甘露糖受体的表达的蜘蛛图;
图8:嗜中性粒细胞的靶向。示出了健康组织和发炎组织中SRB1、FCAR和SLFN12L受体的表达的蜘蛛图;
图9:肿瘤细胞的靶向。蜘蛛图示出了健康的肝脏(a)、结肠直肠(b)和女性生殖器(c)以及与肝脏(a)、结肠直肠(b)和宫颈(c)相关的三种不同癌症中SRB1、EGFR和TFRC受体的表达。注意,只有肿瘤组织示出了所有三种受体均以中/高水平表达,而在健康组织中,只有一种或两种受体类型以中等水平表达;
图10:LRP-1、GLUT1、EGFR和PDGFR-α受体的全身(a)和躯体脑和内皮(b)表达水平。这些可用于生成超选择性蜘蛛图(c),该超选择性蜘蛛图示出了受体密度组合,以实现仅靶向BEC和胶质瘤细胞;
图11:吸附概率随配体数量的变化;理论数据与实验数据的比较。已使用实施例7中描述的方程(2)计算理论曲线,使用基于受体数量和配体数量的(双)泊松(Poisson)平均值,其平均值(对于接枝密度σ0=1)用作拟合参数。误差棒以三次独立测量的平均值计算。
具体实施方式
纳米颗粒和微米颗粒
本发明的纳米颗粒和微米颗粒可以是适合于将药物货物递送至体内作用靶部位的任何纳米颗粒或微米颗粒。如本文所定义,“纳米颗粒”是尺寸在1nm至100nm之间的任何颗粒。如本文所定义,“微米颗粒”是尺寸在0.1μm至100μm之间的任何颗粒。用于本发明的合适的纳米颗粒或微米颗粒包括落入上述尺寸范围内的聚合物泡囊、脂质体、合成体、胶乳、胶束、纳米晶体、量子点、金属纳米颗粒、氧化物纳米颗粒、二氧化硅纳米颗粒、蛋白质笼、纳米凝胶和微凝胶、树枝状聚合物、病毒样颗粒、蛋白质、聚合物或任何其他胶体材料。然而,通常,用于本发明的纳米颗粒或微米颗粒是聚合物泡囊、脂质体、合成体或胶束。通常,纳米颗粒或微米颗粒是自组装结构。
本发明的纳米颗粒和微米颗粒可以具有任何可行的几何形状,例如,基本上球形、椭圆形、圆柱形或双层形式,但它们通常为基本上球形的。本发明的纳米颗粒或微米颗粒的典型(最大)直径在50nm至5000nm的范围内。更通常地,该直径在50nm到1000nm的范围内。通常,本发明的纳米颗粒或微米颗粒的数均直径小于300nm,优选小于250nm,最优选小于200nm或150nm。在一方面,本发明的纳米颗粒或微米颗粒是纳米颗粒。可选择地,本发明的纳米颗粒或微米颗粒是微米颗粒。通常,粒径是使用透射电子显微镜(Transmissionelectron microscopy,TEM)测量的。通常,粒径分布是使用动态光散射(Dynamic lightscattering,DLS)测量的。
优选地,本发明的纳米颗粒或微米颗粒是聚合物泡囊。聚合物泡囊是由两亲性嵌段共聚物形成的合成囊泡。聚合物泡囊的实例描述于US 2010/0003336 A1、WO 2017/144849、WO 2017/158382、WO 2017/199023和WO 2017/191444中,它们各自通过引用全部内容并入本文。在过去的15年中,聚合物泡囊由于其具有胶体稳定性、可调节的膜特性以及包封或整合其他分子的能力,因此作为通用载体而受到了广泛的研究关注(对于代表性综述文章,参见JControl Release 2012 161(2)473-83,其通过引用全部内容并入本文)。
聚合物泡囊通常是自组装结构。聚合物泡囊通常包含两亲性嵌段共聚物,即包含亲水性嵌段和疏水性嵌段的嵌段共聚物。例如,聚合物泡囊可以包含至少两种彼此不同的此类两亲嵌段共聚物。
这种共聚物能够模仿生物磷脂。这些聚合物的分子量比天然存在的磷脂基表面活性剂高得多,因此它们可组装成更加缠卷的膜(J.Am.Chem.Soc.2005,127,8757,其通过引用全部内容并入本文),从而提供具有改善的机械性能和胶体稳定性的最终结构。此外,共聚物合成的柔性性质允许在宽范围的分子量以及由此宽范围的膜厚度上应用不同的组成和官能性。因此,将这些嵌段共聚物用作递送溶媒提供了显著的优势。
聚合物泡囊通常是基本上球形的。聚合物泡囊通常包含两亲性膜。该膜通常由两亲性分子的两个单层形成,该两亲性分子的两个单层对齐并缠卷以形成封闭的核,其中亲水性头基面对核和囊泡的外部,而亲水性尾基形成膜的内部。
双层的厚度通常为2nm至100nm,更通常地为2nm至50nm(例如5nm至20nm)。这些尺寸可常规地测量,例如通过使用透射电子显微镜(TEM)和/或小角度X射线散射(SmallAngle X-ray Scattering,SAXS)来测量(参见,例如,J.Am.Chem.Soc.2005,127,8757,其通过引用全部内容并入本文)。
当聚合物泡囊由不止一种不同类型的共聚物形成时,聚合物泡囊的不同区域通常具有不同的双层厚度。例如,如果聚合物泡囊由两种不同类型的共聚物形成,则第一区域的聚合物泡囊双层的厚度优选为1nm至10nm,更优选为2nm至5nm。优选地,第二区域的聚合物泡囊双层的厚度为5nm至50nm,例如,10nm至40nm。更优选地,第二区域的聚合物泡囊双层的厚度为5nm至20nm。优选地,第一区域的聚合物泡囊双层的厚度小于第二区域的聚合物泡囊双层的厚度。可选择地,共聚物可以具有相同的厚度但不同的化学组成,这进而产生两种不同的渗透性,其中一种共聚物形成比另一种共聚物渗透性更低的双层。
在水溶液中,通常在不同类型的结构之间,例如在聚合物泡囊和胶束之间存在平衡。优选溶液中结构的至少80wt%、更优选至少90wt%或95wt%、最优选所有结构均以聚合物泡囊形式存在。这可使用本文概述的方法来实现。
已知当两种不同的形成聚合物泡囊的共聚物混合形成杂化囊泡时,它们相分离并因此产生包含对应于离散共聚物的离散区域的聚合物泡囊。例如,在ACS NANO,5(3),1775-1784 2011中详细描述了这种现象,其通过引用全部内容并入本文。通过应用这些已知的合成原理,可以容易地制造聚合物泡囊。
聚合物泡囊优选能够在其到达目标组织(即靶组织)时解离和释放包封的药物。非限制性的示例性目标组织将在后面更详细地讨论,包括血脑屏障之外的细胞(例如CNS细胞)、免疫细胞和癌细胞。优选地,聚合物泡囊能够在其通过内吞作用在靶细胞(例如,CNS细胞、免疫细胞或癌细胞)内被内化后聚合物泡囊解离和释放该包封的药物。
可以通过多种机制促进解离,例如嵌段共聚物的pH敏感性、嵌段共聚物的热敏感性、嵌段共聚物的水解敏感性(即嵌段共聚物的水敏感性)和/或氧化还原敏感性。
包含在聚合物泡囊中的共聚物的疏水性嵌段还可以包含侧悬的可阳离子化的部分作为侧基。可阳离子化部分为,例如伯胺、仲胺或叔胺以及咪唑基团,其能够在低于3至6.9范围内的pH值下被质子化。可选择地,该基团可以是膦。
优选地,聚合物泡囊的疏水性嵌段的聚合度至少为50,更优选地至少为70。优选地,疏水性嵌段的聚合度不大于250,甚至更优选地,不大于200。通常,亲水性嵌段的聚合度至少为10,优选至少为15,更优选至少为20。优选地,亲水性嵌段与疏水性嵌段的聚合度的比例在1:2.5至1:8范围内。所有这些限制促进了聚合物泡囊的形成,而不是胶束的形成。
亲水性嵌段可以基于缩聚物,例如,聚酯、聚酰胺、聚酐、聚氨酯、聚醚(包括聚亚烷基二醇,尤其是聚乙二醇(PEG))、聚亚胺、多肽、类多肽、聚脲、聚缩醛和多糖。优选地,亲水性嵌段基于选自以下的聚合物:聚(亚烷基二醇)、聚(乙烯基吡咯烷酮)(poly(vinylpyrrolidone),PVP)、聚(2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱)(poly(2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine),PMPC)、聚(甘油)、聚(氨基酸)、聚肌氨酸、聚(2-恶唑啉)、聚[低聚(乙二醇)甲基丙烯酸甲酯]和聚(N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺)。最优选地,亲水性嵌段基于PEG、聚(丙二醇)或聚[低聚(乙二醇)甲基丙烯酸甲酯]。亲水性嵌段可以具有两性离子侧基,在这种情况下,两性离子侧基可以存在于单体中并且在聚合过程中保持不变。可选择地,可以在聚合之后使单体的官能化侧基衍生化以使其变为两性离子侧基。
本发明的聚合物泡囊可以包含WO 2017/144849、WO 2017/158382、WO 2017/199023和WO 2017/191444的任一个中描述的聚合物泡囊的任何结构和/或功能特征,其各自通过引用全部内容并入本文。
在本发明的一个实施方式中,形成疏水性嵌段的单体是甲基丙烯酸2-(二异丙基氨基)乙酯(DPA)或甲基丙烯酸2-(二乙基氨基)乙酯(DEA)。
在另一个实施方式中,疏水性嵌段由甲基丙烯酸2-(二异丙基氨基)乙酯(DPA)或甲基丙烯酸2-(二乙氨基)乙酯(DEA)形成,并且亲水性嵌段基于聚酯、聚酰胺、聚酐、聚氨酯、聚醚、聚亚胺、多肽、类多肽、聚脲、聚缩醛或多糖。优选地,疏水性嵌段由2-(二异丙基氨基)乙基甲基丙烯酸酯(DPA)或2-(二乙氨基)乙基甲基丙烯酸酯(DEA)形成,并且亲水性嵌段基于PEG、聚(丙二醇)或聚[低聚(乙二醇)甲基丙烯酸甲酯]。更优选地,本发明的聚合物泡囊包含二嵌段PEG-PDPA,其中PEG是聚(乙二醇),以及PDPA是聚(2-(二异丙基氨基)乙基甲基丙烯酸酯)。或者,本发明的聚合物泡囊包含二嵌段POEGMA-PDPA,其中POEGMA是聚[低聚(乙二醇)甲基丙烯酸甲酯],以及PDPA是聚(2-(二异丙基氨基)乙基甲基丙烯酸酯)。特别优选的二嵌段共聚物是(P[(OEG)10MA20]-PDPA100)。这些共聚物具有在水或PBS中自组装并产生具有可以装入药物的水腔的囊泡的能力。PEG官能团提供了充当使聚合物简单/可靠地被配体官能化的手柄的侧悬羟基基团(如下所述),同时避免蛋白质调理作用(使聚合物泡囊循环时间长且非特异性结合低)。与此同时,PDPA是一种pH敏感嵌段,在pH值低于6.4(这是早期内吞作用的典型pH)时触发聚合物泡囊的解组装。pH敏感性允许药物有效载荷在聚合物泡囊在细胞内内化后释放到细胞胞质溶胶中。
该嵌段共聚物可以是简单的A-B嵌段共聚物,或者也可以是A-B-A或B-A-B嵌段线性三嵌段共聚物或(A)2B或A(B)2星型共聚物(其中A为疏水性嵌段,B为亲水性嵌段)。该嵌段共聚物也可以是A-B-C、A-C-B或B-A-C嵌段线性三嵌段共聚物或ABC星型共聚物(嵌段由同一端连接在一起),其中C是不同类型的嵌段。C嵌段可以例如,包括官能化的,例如交联或离子基团,以允许共聚物发生反应,例如在新的组成中发生反应。交联反应,尤其是A-C-B型共聚物的交联反应,可以赋予聚合物泡囊有用的稳定性。交联可以是共价的,有时也可以实质上是静电式的。交联可以涉及添加单独的试剂以连接官能团,例如使用双官能烷化剂来连接两个氨基基团。可选择地,嵌段共聚物可以是具有亲水或疏水核的星型分子,或者可以是具有亲水主链(嵌段)和疏水侧链或反之亦然的梳状聚合物。这种聚合物可以例如通过单不饱和大分子单体与单体的无规共聚形成。
在WO 03/074090中可以找到合适的用于聚合单体的方法的更多细节,其通过引用全部内容并入本文。
可用于聚合单体的示例性方法是原子转移自由基聚合(Atom-transfer radicalpolymerisation,ATRP)(参见,例如,Journal of the American Chemical Society 127,17982-17983中描述的示例性方法)、活性自由基聚合方法、具有有效的聚合后改性的官能化NCA(N-羧基酸酐)聚合和开环聚合(Ring opening polymerisation,ROP)。通过凝胶渗透色谱法判断,已发现活性自由基聚合提供了多分散度(分子量)小于1.5的单体的聚合物。该嵌段或每个嵌段的多分散度在1.2至1.4的范围内是优选的。可以使用pH变化***、电穿孔或膜水合来装入聚合物泡囊。在pH变化***过程中,聚合物以离子化形式分散在水性液体中,其中聚合物以相对高的浓度溶解而不形成聚合物泡囊。随后改变pH,使得离子化基团中的一些基团或所有基团变为去质子化的,使得它们呈非离子形式。在第二pH下,嵌段的疏水性增加,聚合物泡囊自然形成。
形成在核中具有包封的材料(例如,包封的药物)的聚合物泡囊的方法可以涉及以下步骤:(i)将两亲性共聚物分散在水性介质中;(ii)酸化步骤(i)中形成的组合物;(iii)将待包封的材料添加到酸化的组合物中;以及(iv)将pH值提高至中性附近以包封材料。
该方法优选包括预备步骤,其中在反应容器中将两亲性共聚物分散在有机溶剂中,然后蒸发溶剂以在反应容器内部形成膜。
酸化组合物的步骤(ii)通常将pH值降低至低于侧基的pKa的值。
形成在核中具有包封的材料的聚合物泡囊的另一种方法可以涉及以下步骤:(i)在反应容器中将两亲性共聚物以及待包封的材料(当需要时)分散在有机溶剂(例如,2:1的氯仿:甲醇混合物)中;(ii)蒸发溶剂以在反应容器内部形成膜;以及(iii)用任选地包含增溶的待包封的材料的水溶液将膜再水化。
形成在核中具有包封的材料的聚合物泡囊的另一种方法可以涉及以下步骤:(i)在反应容器中将两亲性共聚物以及待包封的材料(当需要时)分散在有机溶剂中;(ii)添加水性溶剂,使溶剂能够转换和在反应容器内部能够形成聚合物泡囊;以及(iii)任选地对获得的聚合物泡囊进行电穿孔以允许对水溶性生物活性分子进行包封。
使用本领域公知的技术,可以使用UV光谱法和HPLC色谱法来计算包封效率。用于形成具有包封的材料的聚合物泡囊的可选择的方法可以涉及在水中对材料和聚合物囊泡进行简单电穿孔。例如,药物可以固体形式与聚合物囊泡的水分散体接触,并施加电场以允许在聚合物泡囊膜上形成孔。然后,可溶的材料分子可以通过孔进入聚合物泡囊囊泡。随后是膜自我修复过程,其中材料分子连续被包埋在聚合物泡囊内部。
可选择地,可以将溶解在有机溶剂中的材料乳化成聚合物囊泡的水分散体,从而将溶剂和材料纳入囊泡的核中,随后从***中蒸发掉溶剂。
本发明中使用的聚合物泡囊可以由两种或更多种不同的嵌段共聚物形成。在该实施方式中,在形成聚合物泡囊的方法中,使用两种或更多种嵌段共聚物的混合物。
例如,在上述方法中,将0.01%至10%(w/w)的待包封的材料与共聚物混合。
可选择地,本发明的纳米颗粒或微米颗粒可以是脂质体。脂质体是具有至少一个脂质双层的球形囊泡。通常,脂质体包含磷脂,例如卵磷脂,但也可以包括其他脂质,例如卵磷脂酰乙醇胺,只要它们与脂质双层结构相容。脂质体的主要类型包括多层囊泡(Multilamellar vesicle,MLV,具有多个层状相脂质双层)、小单层脂质体囊泡(Smallunilamellar liposome vesicle,SUV,具有一个脂质双层)、大单层囊泡(Largeunilamellar vesicle,LUV)和蜗状囊泡。
通常,脂质体是融合脂质体。这意味着它们能够与膜,例如靶细胞的细胞表面膜或细胞内核内体膜融合。融合脂质体双层与细胞表面膜的融合导致脂质体双层并入细胞表面膜,并且溶酶体内包含的药物货物释放到细胞胞质溶胶中。可选择地,脂质体可以通过内吞作用被内化在靶细胞内,并且脂质体中携带的药物货物在脂质体双层与核内体膜融合后被释放。核内体中的pH值是微酸性的,因此脂质体对pH值敏感是有利的,例如,脂质体结构的稳定性在较低的pH下降低,这促进了与核内体膜的融合。具有低pH的其他环境也可触发此类脂质体的融合,例如,可见于肿瘤或炎症部位的低pH。
脂质体可以是两性离子结构。可选择地,脂质体可以是两性脂质体。这意味着脂质体具有等电点,并且在更高的pH值下带负电,在更低的pH值下带正电。pH敏感脂质体中典型的pH响应元件包括胆固醇半琥珀酸酯(CHEMS)、棕榈酰高半胱氨酸、二油酰甘油半琥珀酸酯(DOG-Succ)等。
可选择地,本发明的纳米颗粒或微米颗粒可以是合成体(synthosome)。合成体是一种特殊类型的聚合物泡囊,其被工程改造以包含通道(跨膜蛋白),该通道选择性地允许某些化学物质穿过膜,进入或离开囊泡。
可选择地,本发明的纳米颗粒或微米颗粒可以是胶束。胶束是分散在液体中的具有亲水区域和疏水区域的分子聚集体(或超分子组装体)。通常在水溶液中,聚集的胶束排列成使得分子的疏水区域被隔离在胶束的中心,而分子的亲水区域存在于胶束的外表面上,并与水性溶剂接触。通常,胶束的形状为基本上球形,但也可能是其他形状,例如椭圆形、圆柱形、圆环面和盘形。
可选择地,本发明的纳米颗粒或微米颗粒可以是能够包封和/或缀合任何类型的生物活性分子(例如,抗癌药物、蛋白质、肽(天然的或非天然的)、抗体、抗体片段、染料等等)的任何物体。
包封的药物
本发明的纳米颗粒或微米颗粒可以包括包封在纳米颗粒或微米颗粒内的药物。为避免疑义,也可以将多种不同的药物包封在单个纳米颗粒或微米颗粒中,或者提供多个各自包含特定包封的药物的纳米颗粒或微米颗粒。
很容易理解,根据要治疗的失调来选择包封的药物。在本公开的别处描述了此类失调的非限制性实例。
药物的非限制性实例包括:对治疗或预防脑失调有效的药物;对治疗或预防免疫和/或炎性失调有效的药物;以及对治疗或预防癌症有效的药物。对药物的身份没有特别限制,因此在任何给定的实施方式中,药物可以选自本领域已知的用于治疗或预防目标失调的药物。
药物的非限制性实例包括:神经保护剂、免疫调节药物(“免疫调节剂”)、非甾体抗炎药(Non-steroidal anti-inflammatory drug,NSAID)、皮质类固醇、缓解疾病的抗风湿药(Disease-modifying antirheumatic drug,DMARD)、免疫抑制剂、TNF-α抑制剂和抗癌药。
可以包封的特定药物的示例性和非限制性实例包括:富马酸盐和富马酸酯、谷氨酸拮抗剂(例如,***、人参皂甙Rd、孕酮、辛伐他汀、美金刚)、抗氧化剂(例如,乙酰半胱氨酸、藏红花素、鱼油、米诺环素、吡咯喹啉醌(Pyrroloquinoline quinone,PQQ)、白藜芦醇、长春西汀、维生素E)、刺激剂(例如,司来吉兰、尼古丁、咖啡因)、半胱天冬酶抑制剂、营养因子(例如,CNTF、IGF-1、VEGF和BDNF)、抗蛋白聚集剂(例如,4-苯基丁酸钠、海藻糖和聚Q结合肽)、***、锂、肌肽、积雪草酸、黄酮类(例如,黄腐酚、柚皮素、高良姜精、非瑟酮和黄芩苷)、***类(例如,WIN55,212-2、JWH-133和TAK-937)、胞磷胆碱、米诺环素、脑活素、人参皂苷-Rd、粒细胞集落刺激因子、Tat-NR2B9c、镁、白蛋白、扑热息痛、阿司匹林、胆碱和水杨酸镁、塞来昔布、双氯芬酸(例如双氯芬酸钾、双氯芬酸钠)、双氟尼酸、依托度酸、非诺洛芬、氟比洛芬、布洛芬、吲哚美辛、酮洛芬、甲氯芬那酸盐、甲芬那酸、美洛昔康、萘丁美酮、萘普生(包括萘普生钠)、奥沙普嗪、吡罗昔康、罗非考昔、双水杨酸酯、水杨酸钠、苏灵大、托美丁、伐地考昔、皮质类固醇、阿仑单抗、干扰素β-1b、芬戈莫德、醋酸格拉替雷、那他珠单抗、plegridy、聚乙二醇化干扰素β-1a、特立氟胺、氨甲蝶呤、柳氮磺吡啶、来氟米特、阿达木单抗、依那西普、戈利木单抗、优特克单抗、硫唑嘌呤、环孢菌素、英夫利昔单抗、戈利木单抗、塞妥珠单抗、羟氯喹、氨甲蝶呤、硫唑嘌呤、麦考酚酯、维生素A酸、羟基脲、异维A酸、麦考酚酸酯、柳氮磺吡啶、6-硫鸟嘌呤、钙泊三醇、骨化三醇、他卡西醇、他克莫司、吡美莫司、蒽三酚、恩达莫司汀(endamustine)、苯达莫司汀、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、达卡巴嗪、异环磷酰胺、美法仑、丙卡巴肼、链脲菌素、替莫唑胺、卡培他滨、5-氟尿嘧啶、氟达拉滨、吉西他滨、甲氨蝶呤、培美曲塞、雷替曲塞、放线菌素D、博来霉素、多柔比星、表柔比星、丝裂霉素、米托蒽醌、依托泊苷、多西他赛、伊立替康、紫杉醇、拓扑替康、长春碱、长春新碱、长春瑞滨、艾日布林、卡铂、顺铂、奥沙利铂、阿法替尼、阿柏西普、BCG、贝伐珠单抗、本妥昔单抗、西妥昔单抗、克唑替尼、狄诺塞麦、埃罗替尼、吉非替尼、伊马替尼、干扰素、易普利姆玛、拉帕替尼、帕尼单抗、帕妥珠单抗、利妥昔单抗、舒尼替尼、索拉非尼、曲妥珠单抗美坦、西罗莫司脂化物、曲妥珠单抗、维莫非尼、氯膦酸盐、伊班膦酸、帕米膦酸钠、唑来膦酸、阿纳托唑、阿比特龙、蓓萨罗丁、比卡鲁胺、布舍瑞林、环丙孕酮、地加瑞克、依西美坦、氟他胺、亚叶酸、氟维司群、戈舍瑞林、兰瑞肽、来那度胺、来曲唑、亮丙瑞林、甲羟孕酮、甲地孕酮、美司钠、奥曲肽、己烯雌酚、他莫昔芬和沙利度胺。
靶向配体
纳米颗粒或微米颗粒上包含在其外表面上的至少两种不同的配体类型。“配体”在本文中也可称为“靶向部分”。“在其外表面上”意指每个配***于使其能够与其靶标相互作用的位置(而不是位于阻止与靶标相互作用的不可接近的位置,例如通过被包封在纳米颗粒或微米颗粒内)。
通常,本发明的纳米颗粒或微米颗粒用于与细胞的表面结合,并且包含在其外表面上的至少第一配体类型以及在其外表面上的至少第二配体类型,其中所述第一配体类型能够与所述细胞表面上的第一受体类型结合,并且所述第二配体类型能够与所述细胞表面上的第二受体类型结合。通常,本发明的纳米颗粒或微米颗粒包含在其外表面上的2种至7种不同的配体类型,每一种配体类型都能够与细胞表面上的互补受体类型结合。优选地,本发明的纳米颗粒或微米颗粒包含在其外表面上的2种至6种不同的配体类型,更优选3种至5种不同的配体类型,最优选4种不同的配体类型。
不希望受任何特定理论的束缚,据信以这种方式在纳米颗粒或微米颗粒表面上使配体多工化赋予了靶细胞“超选择性”的特性。
如图1b所示,单价配体使受体饱和的概率(即结合颗粒分数,θ=1,图1b右侧)随着细胞膜上表达的受体数量(ρ)线性增加。这意味着配体-受体结合的亲和力越强,配体关联越强。然而,这意味着如果配体对其靶受体具有低亲和力,则需要非常高剂量的配体才能在靶(即患病)细胞中产生响应。相反,如果配体对其靶受体具有高亲和力,则大部分配体将与表达较少数量的靶受体的任何细胞结合(即会出现不希望的脱靶效应)。
然而,如果相同类型的多个配体被限制在纳米级支架上,例如聚合物泡囊,则结合会遵循S型函数随着受体密度非线性增加(图1b,绿线)。这对应于“开-关”关联,其中结合仅发生在高于给定的起始受体密度时。这种超选择性关联能够创建纳米级或微米级的更明确地靶向目标细胞群的多工聚合物泡囊。然而,即使是这些支架也会受到一些脱靶效应的影响,并且需要在靶细胞表面上达到中等至高水平的受体表达。此外,仅依赖于与单个靶受体的结合使得靶细胞表面(例如肿瘤细胞的表面)上的受体可能随着时间的推移而发生突变以逃避与纳米颗粒/微米颗粒结合。本发明的纳米颗粒和微米颗粒通过支架表面上配体的多工化(即支架表面上存在多种不同的配体类型)克服了这些问题。该策略被认为进一步提高了纳米颗粒/微米颗粒对其靶细胞的选择性,从而仅靶向非常特定的细胞群(即患病细胞),而其他(健康)细胞不受影响。
对于在纳米颗粒和微米颗粒的背景下观察到的超选择性相互作用,每个配体单独具有对其靶受体的非常低的结合亲和力也是有利的。实际上,与靶受体具有如此低的结合能的选择性配体并不容易获得。本发明人已经发现,这个问题可以通过也在纳米颗粒或微米颗粒的表面上提供与靶细胞表面产生干扰空间势的部分(例如聚合物刷)来克服。通常,聚合物刷可以包含天然存在的聚合物,例如多肽或多糖,或合成聚合物,例如上述任何两亲性嵌段共聚物。靶细胞外表面上的组分,例如,聚糖、糖蛋白和糖脂(统称为“糖萼”),也被认为有助于这种排斥空间势。聚合物刷的优选聚合物组分包括聚(乙二醇)(PEG)、聚(乙烯基吡咯烷酮)(PVP)、聚(2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱)(PMPC)、聚(甘油)、聚(硫代甜菜碱)、聚(羧基甜菜碱)、聚(氨基酸)、聚肌氨酸、聚(2-恶唑啉)、聚(N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺)、聚二醇、肝素、葡聚糖、聚(乙二醇)-聚(2-(二异丙基氨基)乙基甲基丙烯酸酯)和/或聚(低聚(乙二醇)甲基醚甲基丙烯酸酯)(POEGMA)。图2示出了细胞表面(a)和纳米颗粒外表面(b)上的聚合物刷的一些实例。
优选地,聚合物刷的聚合度至少为5,更优选地至少为10。优选地,聚合物刷的聚合度不大于500,例如,不大于300,或不大于200。优选地,聚合物刷的长度为1.5nm至350nm,更优选为3nm至210nm。
因此,据信用两种或更多种配体类型(每种配体类型对其靶受体具有相对低的亲和力)进行官能化的聚合物泡囊可以避免靶向不期望的细胞,而仍然有效结合靶细胞以进行药物递送。此外,细胞表面受体的突变不太可能导致逃避纳米颗粒或微米颗粒的检测。本发明中采用的配体结合方案的示意图在图1a中示出。
纳米颗粒或微米颗粒的外表面上的每种类型的配体的数量是纳米颗粒/微米颗粒设计中的一个重要参数。本发明人已经发现,当配体-受体***的某些物理参数已知时,可以以非常简单的方式计算每种配体类型的最佳配体数量。本领域技术人员可以容易地确定这些相关参数。具体地,纳米颗粒或微米颗粒的外表面上的第i种配体类型(li)的配体的最佳数量根据以下方程(1)定义:
其中:
a是所述纳米颗粒或微米颗粒的活性,计算为a=[P]VPNA,其中[P]是纳米颗粒或微米颗粒在本体溶液中的摩尔浓度,NA是阿伏伽德罗常数,以及VP是几何体积;
kB是玻尔兹曼常数;
T是绝对温度;
EB(i)是第i种配体-受体对结合的总能量,由以下的总和得出:(a)配体/受体结合亲和力kBTlnKD(i),其中,KD(i)是第i种受体/配体偶合的解离常数;和(b)纳米颗粒或微米颗粒与所述细胞表面之间的空间干扰Es;以及
ri是细胞表面上的i型受体的密度。
因此,该方程提供了一种有用且新颖的经验工具,用于确定根据本发明的纳米颗粒或微米颗粒的外表面上的每种配体类型的最佳数量。
在球形(或基本上球形)颗粒的情况下,参数a可以计算为a=[P]NA(π/3)[3(R+d)3-2R3)],其中R是纳米颗粒或微米颗粒的半径,d是配体系链长度。
聚合物泡囊外表面上的每种类型配体的数量(和密度)通常可以在聚合物泡囊合成过程中通过改变配体结合的共聚物和“原始”共聚物(即没有连接配体的二嵌段共聚物)的比例来控制。对于任何给定的***,每个聚合物泡囊的配体数量由共聚物自组装参数(与聚合物分子量和堆积因子相关)和聚合物泡囊尺寸给出。通常可以使用质谱法来验证聚合物泡囊的外表面上每种类型的配体的数量(以及因此得出的受体密度)。
通常,配体与纳米颗粒或微米颗粒外表面上的聚合物组分连接。在聚合物泡囊的情况下,配体通常连接到两亲性二嵌段共聚物的亲水性嵌段上。因此,配体系链长度d由亲水性嵌段的分子质量给出。通常,d=0.3N nm,其中N是亲水性嵌段的聚合度。
总空间势Es是由细胞表面的糖萼刷产生的空间势和由覆盖纳米颗粒的聚合物刷产生的空间势之和。两者的大小取决于配体和受体的可及性如何。这进而又取决于:(i)受体相对于细胞表面的聚糖/糖蛋白/糖脂等链的相对高度(δGhG,其中hG是聚糖/糖蛋白/糖脂长度,δG介于0至1之间并且是受体埋在糖萼中的量度);和(ii)配体的系链长度相对于纳米颗粒外表面上的刷的聚合物链的长度(δPhPP,其中hP是聚合物链长度,δP介于0和1并且是配体埋在聚合物刷中多少的量度)。对于任何给定***,这些参数可以容易地从本领域已知的结构生物学数据库中获得。
通常,纳米颗粒或微米颗粒包含第一配体类型的2个至1000个配体。优选地,纳米颗粒或微米颗粒包含第一配体类型的5个至1000个配体,更优选地,第一配体类型的10个至500个配体,甚至更优选地,第一配体类型的20个至200个配体,最优选地,第一配体类型的50个至100个配体。
通常,纳米颗粒或微米颗粒包含第二配体类型的2个至1000个配体。优选地,纳米颗粒或微米颗粒包含第二配体类型的5个至1000个配体,更优选地,第二配体类型的10个至500个配体,甚至更优选地,第二配体类型的20个至200个配体,最优选地,第二配体类型的50个至100个配体。
通常,纳米颗粒或微米颗粒包含后续(即第三或更多)配体类型的2个至1000个配体。优选地,纳米颗粒或微米颗粒包含后续配体类型的5个至1000个配体,更优选地,后续配体类型的10个至500个配体,甚至更优选地,后续配体类型的20个至200个配体,最优选地,后续配体类型的50个至100个配体。
通常,纳米颗粒或微米颗粒表面上的配体的组合导致总结合能从8kBT到30kBT,其中kB是玻尔兹曼常数,T是温度。这得到了纳米颗粒或微米颗粒的开-关关联曲线,其中受体仅在高于给定的起始受体密度时饱和,而纳米颗粒或微米颗粒在较低的受体密度下根本不结合。
每种配体类型都适用于使纳米颗粒或微米颗粒能够与靶结合。通常,配体与靶标选择性结合。靶标是位于目标组织上或目标组织附近(并且从而使纳米颗粒或微米颗粒能够在优先于其他部位的目标组织处特异性积聚)的化学物质。靶标优选是受体,例如,在目标靶组织中以特别高的量存在的受体。最优选地,靶标是细胞表面膜上或细胞表面膜内的受体。
每种配体类型可以是与靶标特异性结合的任何配体。如本领域众所周知的,例如发达的生物缀合物的领域,多种多样的物质可用作配体,例如,以便靶向受体。
在一个实施方式中,每个配体是连接到纳米颗粒或微米颗粒外表面的部分。合适的配体的例子包括抗体、抗体片段、适体、寡核苷酸、小分子、肽和碳水化合物。肽、蛋白质、抗体和抗体片段配体是特别优选的。然而,任何这样的部分都可以用作本发明中的配体。可以使用常规测定方法来确定任何给定部分靶向任何给定受体的适用性,这涉及测试该部分与受体特异性结合的能力。
配体的一个实例是适于使纳米颗粒或微米颗粒能够穿过血脑屏障(Blood-brainbarrier,BBB)的配体。配体的这种特性通过配体与血脑屏障处的靶标(例如受体)结合的能力而产生,其中该靶标(例如受体)介导跨血脑屏障的转胞吞作用。
在形成血脑屏障的内皮细胞上高表达的用于受体介导的转胞吞作用的受体的实例包括低密度脂蛋白受体相关蛋白1(LRP-1)、B类清道夫受体成员1(SCARB1)、胰岛素受体(IR)和转铁蛋白受体1(TFRC),所有这些都是靶向部分的合适靶标。
在一个实施方式中,配体类型中的至少一种,优选一种配体类型,靶向LRP-1受体。LRP-1是LDL受体家族的成员,其在各种生物过程中发挥着不同的作用,包括脂蛋白代谢、蛋白酶降解、溶酶体酶的激活以及细菌毒素和病毒的细胞进入。LRP-1基因的缺失导致小鼠致死,揭示了在发育中的关键但尚未确定的作用。组织特异性基因缺失研究揭示了LRP-1在脉管***、中枢神经***中、在巨噬细胞中以及在脂肪细胞中的重要贡献。LRP-1的三个重要特性决定了它在生理学中的多种作用:第一,它能够识别三十多种不同的配体;第二,它能够通过位于其胞质结构域上的决定簇以磷酸化特异性方式结合大量的胞质衔接蛋白;以及第三,它能够与其他跨膜受体(例如整联蛋白和受体酪氨酸激酶)相关联并调节其活性。
已经发现,提供特征为具有靶向LRP-1受体的配体的纳米颗粒或微米颗粒使纳米颗粒或微米颗粒都能够穿过BBB并将包封的药物有效地递送到CNS实质和CNS细胞中。特别是,已经发现内皮转胞吞机制不涉及膜贩运细胞器中纳米颗粒或微米颗粒的酸化,这对于避免聚合物泡囊的过早崩解和包封的药物的伴随释放很重要。此外,LRP-1受体与CNS细胞中的传统内吞作用相关,这在导航穿过BBB之后有助于药物在其细胞溶质内的递送(通过纳米颗粒或微米颗粒的分解)。特别是,已发现提供靶向LRP-1受体的配体使得纳米颗粒或微米颗粒能够在中风治疗中实现有效的神经保护作用。
与受体LRP-1结合的肽是本领域已知的。例如,Angiochem(加拿大蒙特利尔)已开发出在与药物货物结合时利用LRP-1介导的途径穿过血脑屏障的肽。适用于本发明的肽的一个具体实例是Angiopep-2,其是具有序列TFFYGGSRGKRNNFKTEEY的肽。合适的靶向部分的其他实例公开于WO2013/078562,其通过引用全部内容并入本文(并且,特别地,其中公开的配体肽通过引用并入本文)。
在一个实施方式中,配体类型中的至少一种,优选一种配体类型,靶向SCARB1受体。该基因编码的蛋白质是高密度脂蛋白(High density lipoprotein,HDL)胆固醇的质膜受体。编码的蛋白质介导胆固醇与HDL之间的转移。此外,该蛋白质是丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus)糖蛋白E2的受体。
恶性肿瘤显示出显著的异质性,即使在同一组织部位,也可能发现具有不同遗传背景的不同类型的细胞。相比之下,已发现,大多数肿瘤细胞一直过表达相对一致的标志物B1型清道夫受体(Scavenger receptor type B1,SR-B1)。B类I型清道夫受体(ScavengerReceptor Class B Type I,SR-BI)是一种高密度脂蛋白(HDL)受体,其促进从循环脂蛋白中摄取胆固醇酯。其他发现表明了SR-BI在胆固醇代谢、信号传导、运动性和癌细胞增殖中的关键作用,因此对癌变和转移具有潜在的主要影响。最近的发现表明,SR-BI表达水平与乳腺癌和***癌的侵袭性和存活率差相关。此外,基因组数据表明,根据癌症的类型,SR-BI的高表达或低表达可能导致存活率差。SR-BI被认为是癌症的诊断和预后指标,有助于阐明该蛋白质对癌症发展、进展和生存的贡献。
与SCARB1结合的配体是本领域已知的。一种这样的配体是聚(2-(甲基丙烯酰氧基)乙基磷酰胆碱)(PMPC)。
优选地,纳米颗粒或微米颗粒支架上的一种配体类型靶向LRP-1,并且支架上的另一种配体类型靶向SCARB1。
在另一个实施方式中,配体类型中的至少一种,优选一种配体类型,是适于使纳米颗粒或微米颗粒能够与癌细胞结合的配体。癌细胞通常具有高密度的膜受体。这种靶向部分的说明性和非限制性实例包括蛋白质(主要是抗体及其片段)、肽、核酸(适体)、小分子、维生素和碳水化合物。
在肿瘤细胞上高表达的受体介导的转胞吞作用的受体的例子包括LRP-1、SCARB1、TFRC、叶酸受体1(Folate receptor 1,FOLR1)和表皮生长因子受体(Epidermal growthfactor receptor,EGFR)。例如,SCARB1在HeLa细胞(***)和FaDu细胞(下咽部鳞状细胞癌)中高表达。
在一个实施方式中,配体类型中的至少一种,优选一种配体类型,靶向LRP-1。在另一个实施方式中,配体类型中的至少一种,优选一种配体类型,靶向SCARB1。在另一个实施方式中,配体类型中的至少一种,优选一种配体类型,靶向TFRC。在另一个实施方式中,配体类型中的至少一种,优选一种配体类型,靶向FOLR1。在另一个实施方式中,配体类型中的至少一种,优选一种配体类型,靶向EGFR。
在一个实施方式中,配体类型中的至少一种,优选一种配体类型,靶向TFRC受体。该基因编码通过受体介导的内吞作用过程进行细胞铁摄取所必需的细胞表面受体。该受体是红细胞生成和神经发育所必需的。
铁作为一种重要元素,在各种生理和病理过程中起着至关重要的作用。铁代谢表现在全身和细胞两个水平,这两个水平通常处于平衡状态。铁代谢平衡的失调与多种疾病有关,这些疾病包括阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease)、骨质疏松症和各种癌症。在受铁调素-铁转运蛋白轴(Hepcidin-ferroportin axis)调节的全身性铁代谢中,血浆铁与转铁蛋白(Transferrin,TF)结合,转铁蛋白(TF)具有两个高亲和力的三价铁结合位点。通用细胞铁代谢由铁的摄入、利用和流出组成。在通用细胞的铁摄入过程中,转铁蛋白受体(Transferrin receptor,TFR)充当最重要的受体介导的控制。TFR1和TFR2是TFR的两种亚型,它们与铁转铁蛋白复合物结合以促进铁进入细胞。TFR1在通用细胞表面遍在地表达,而TFR2在肝细胞中特异性表达。TFR1因在脊椎动物和无脊椎动物中具有不同的功能而比TFR2受到更多的关注。最近的报道表明,TFR1与多种疾病有关,包括贫血、神经退行性疾病和癌症。最重要的是,TFR1已被证实在各种癌症中异常表达。因此,TFR1被假定为用于癌症治疗的诊断和治疗中的潜在分子靶标。
在一个实施方式中,配体类型中的至少一种,优选一种配体类型,靶向叶酸受体1(FOLR1)。该基因编码的蛋白质是叶酸受体家族的成员。该基因家族的成员结合叶酸及其还原衍生物,并将5-甲基四氢叶酸转运到细胞中。该基因产物是一种分泌蛋白,它通过糖基-磷脂酰肌醇键锚定在膜上,或者以可溶形式存在。该基因的突变与由于脑叶酸转运缺陷的神经变性有关。
叶酸循环维持关键的代谢反应并且对快速生长的细胞至关重要。在生理条件下,外源性还原叶酸(水溶性B族维生素)主要通过低亲和力、高容量、遍在表达的还原叶酸载体(Reduced folate carrier,RFC;双向阴离子交换机制)转运到细胞中。一旦进入细胞,叶酸就在嘌呤和胸苷的生物合成中发挥重要作用,而这又是DNA合成、甲基化和修复所必需的。叶酸也通过高亲和力FR转运。在人类中,FR有四种亚型(FRα、FRβ、FRγ和Frδ)。FRα、FRβ和FRδ通过糖基磷脂酰肌醇锚连接在细胞表面,而FRγ是一种分泌蛋白。由于FRα以肿瘤特异性方式在细胞表面表达,因此它提供不仅可以定位肿瘤,还可以选择性地将治疗剂递送至恶性组织的潜力,从而最大限度地减少附带的毒副作用。
利用FR作为诊断和治疗靶标有许多独特的优势。首先,FRα位于大多数增殖的非肿瘤组织中上皮细胞的腔表面,并且无法进入循环。相比之下,FRα在恶性组织的整个细胞中表达,并可通过循环接近。其次,FR具有与叶酸结合的能力,叶酸是一种相对无害的小分子,可以快速穿透实体瘤,并且可以与其他分子进行化学缀合。一旦叶酸缀合物与FR结合,它就会被内化到细胞中,并且FRα通过FR介导的内吞途径迅速循环到细胞表面。这些因素都强调了FRα在特定肿瘤类型的诊断和治疗中的潜在作用。
在一个实施方式中,配体类型中的至少一种,优选一种配体类型,靶向表皮生长因子受体(EGFR)。该基因编码的蛋白质是一种跨膜糖蛋白,它是蛋白激酶超家族的成员。这种蛋白质是表皮生长因子家族成员的受体。EGFR是一种与表皮生长因子结合的细胞表面蛋白。蛋白质与配体的结合诱导受体二聚化和酪氨酸自磷酸化并导致细胞增殖。
表皮生长因子受体(EGFR)是受体酪氨酸激酶(Tyrosine kinase,TK)的一个大家族,在包括乳腺癌、肺癌、食道癌和头颈癌在内的多种类型的癌症中表达。EGFR及其家族成员是调节癌细胞的生长、信号传导、分化、粘附、迁移和生存的复杂信号传导级联反应的主要贡献者。EGFR与其同源配体EGF结合,这进一步诱导酪氨酸磷酸化和受体与其他家族成员的二聚化,从而导致不受控制的增殖增强。由于EGFR及其家族成员在癌症进展中的多维作用,它们已成为抗癌治疗的有吸引力的候选者。具体而言,EGFR的异常活性已显示在肿瘤细胞的发育和生长中起关键作用,其中EGFR参与多种细胞反应,包括增殖和凋亡。表皮生长因子受体(EGFR)信号传导通路也是启动和确定许多呼吸疾病的临床结果的有力竞争者。导致异常EGFR信号传导的EGFR通路的失调与肺纤维化、癌症和多种气道分泌亢进疾病(包括COPD、哮喘和囊性纤维化)的早期发病机制有关。
用于与这些受体中的每种受体结合的配体是本领域公知的。LRP-1和SCARB1的示例配体在上面讨论过。TFRC的示例配体,例如TFR1,是转铁蛋白和转铁蛋白模拟肽。FOLR1的示例配体是叶酸。EGFR的一个示例配体是以下肽:YHWYGYTPQNVI肽。
配体的其他实例是适于使纳米颗粒或微米颗粒能够与免疫细胞结合的配体。这种配体的说明性和非限制性实例包括磷酰胆碱(如下文更详细讨论的)、肽聚糖、脂蛋白、糖脂、脂多糖、脂肽、合成化合物(例如,洛索立宾和溴匹立明)、肽聚糖、乙酰化/马来酰化蛋白、修饰的低密度脂蛋白、聚阴离子配体、硫酸化糖、甘露糖修饰的多糖、岩藻糖修饰的多糖、半乳糖修饰的多糖、蛋白质和β-葡聚糖。在免疫***细胞靶向中,特异性且精确的靶向需要特别高水平的辨别力/精确度,这可以由本发明的纳米颗粒和微米颗粒提供。
免疫细胞的靶向被认为在治疗免疫相关疾病(例如自身免疫性疾病和移植排斥)以及改进预防性/治疗性疫苗方面很重要。由于具有适量亲和力和多组合结合的通过进化选择的数百种不同的配体-受体相互作用,细胞膜提供了复杂生物相互作用的时空控制的代表性示例。
将抗原和佐剂包装到溶媒例如聚合物泡囊中聚合物泡囊可以代表一个主要优势。这种方法允许保护疫苗载体内容物免于可能的降解并防止过早的不希望的受体相互作用,例如核酸与清道夫受体的相互作用。聚合物泡囊被认为是未来疫苗制剂的良好选择。聚合物颗粒可以克服脂质体的一般稳定性问题,与病毒样颗粒相比,聚合物颗粒构成非免疫原性溶媒,这将允许可能的初免-加强方案。由于抗原和刺激物在同一吞噬体中共定位,因此改善了抗原加工和呈递,这可以解释为什么共递送抗原和佐剂可以改善T细胞应答。同时,这种方法确保激活已经看到抗原的细胞,这对于有效的CD8+T细胞启动至关重要。支持共靶向抗原和佐剂的主要论点在于更可控的疫苗应用和不良反应(例如自身免疫反应、耐受性诱导或不需要的全身细胞因子释放)的风险降低。
这个概念可以应用于数种不同的病理,例如将靶向APC细胞的靶向配体应用在抗癌疫苗中。配体的其他实例是适于使纳米颗粒或微米颗粒能够与嗜中性粒细胞结合的配体。中性粒细胞是炎症的关键效应细胞,并且在中和入侵病原体方面发挥重要作用。在炎症消退期间,嗜中性粒细胞在被巨噬细胞清除之前会经历细胞凋亡,但如果细胞凋亡被延迟,嗜中性粒细胞会导致广泛的组织损伤和慢性疾病。促进嗜中性粒细胞凋亡是治疗持续性炎症的潜在治疗方法,但已证明嗜中性粒细胞难以在实验中操纵。
靶向防御***成分(例如嗜中性粒细胞和嗜中性粒细胞相关效应物)的疗法有望用于辅助宿主导向疗法,以提高抗生素疗效,即在结核病治疗中,并减少治疗时间和长期病理后遗症。
然而,已证明嗜中性粒细胞非常难以操纵,并且据本发明人所知,不存在能够在其短寿命内有效地在细胞内递送货物而不影响其活力和活化状态的商业上可用的运载体。
高水平的包括嗜中性粒细胞在内的免疫细胞的表达与数种实体瘤的有害结果有关,目前正在临床开发新的降低其存在和活性的策略。因此,嗜中性粒细胞是本发明的纳米颗粒和微米颗粒的理想靶标。
可以使用常规技术将配体连接到纳米颗粒或微米颗粒的外表面,例如通过采用将配体连接到聚合物、药物、核酸、抗体和其他物质的众所周知的方法。连接可以是非共价的(例如静电的)或共价的,尽管优选是共价的。例如,当纳米颗粒或微米颗粒是聚合物泡囊时,可以通过使靶向部分上的合适的官能团(包括但不限于胺基、羧基和硫醇基)与形成或将形成聚合物泡囊的共聚物中的至少一种上的相应的官能团反应来连接靶向部分。连接可以在由共聚物形成聚合物泡囊结构之前或在聚合物泡囊形成之后进行。
在特别优选的实施方式中,纳米颗粒或微米颗粒是在其外表面上包含聚合物刷和各配体类型的聚合物泡囊,该聚合物刷包含聚(乙二醇)-聚(2-(二异丙基氨基)乙基甲基丙烯酸酯)。因此,通常通过使用溶剂转换方法,将配体***由聚(乙二醇)-聚(2-(二异丙基氨基)乙基甲基丙烯酸酯)制成的聚合物泡囊的聚合物刷中。通常,刷内配体的密度也可以变化。
还可以通过首先化学活化配体和共聚物中的任一个或两者来提供配体与共聚物的连接。例如,肽配体可以通过将反应性物类添加到肽末端之一来进行活化,所述反应性物类例如半胱氨酸部分(众所周知其硫醇基容易与官能团例如广泛使用的马来酰亚胺部分反应)。类似地,可以通过用反应性物类(例如,当靶向部分带有硫醇基时的马来酰亚胺部分)对共聚物进行官能化来活化共聚物。可以通过共聚物本身的官能化,或通过在形成共聚物的聚合之前提供合适的单体,或通过为聚合提供合适的引发剂,来为共聚物提供这种反应性物类。
在特别优选的实施方式中,纳米颗粒或微米颗粒是聚合物泡囊,其中该聚合物泡囊的外表面上的一个或多个配体与聚(乙二醇)分子共价结合。以这种方式将配体栓系到不同链长的PEG分子上能够控制聚合物刷内配体***的深度。这反过来影响配体和靶细胞表面受体之间的空间排斥势Es。如上所述,该空间势是确定纳米颗粒或微米颗粒表面上用于与特定细胞类型结合的配体的最佳数量的重要因素。
配体可以直接连接到纳米颗粒或微米颗粒的外表面,或者它可以通过化学间隔物连接。
当纳米颗粒或微米颗粒是聚合物泡囊时,配体也可以是聚合物泡囊所包含的聚合物(即,形成聚合物泡囊本身的共聚物中的至少一种)的侧基。显然,在该实施方式中,不需要进行单独的合成步骤来将配体连接到共聚物或所得的聚合物泡囊上。
合适的侧基通常包括对应于本文别处定义的配体的任何基团。在一个说明性实施方式中,靶向部分是磷酰胆碱部分,即具有下式的基团
磷酰胆碱部分是两性离子部分,其可在形成聚合物泡囊中所包含的共聚物的单体中的一种或多种中构成侧基。
磷酰胆碱部分选择性靶向由巨噬细胞和其他免疫细胞过表达的B类清道夫受体成员1(SCARB1);特别是B类清道夫受体成员1使具有磷酰胆碱部分特征的聚合物泡囊能够进入这种细胞。因此,具有磷酰胆碱靶向部分特征的聚合物泡囊特别适用于治疗炎性和/或免疫失调。
药物组合物
可以使用本领域已知的常规技术将本发明的纳米颗粒或微米颗粒配制为药物组合物。例如,已经用于配制纳米颗粒或微米颗粒(例如聚合物泡囊)或含药物脂质体的药物组合物。
该药物组合物包含多个本发明的纳米颗粒或微米颗粒。该药物组合物还包含一种或多种药学上可接受的赋形剂或稀释剂。一种或多种药学上可接受的赋形剂或稀释剂可以是任何合适的赋形剂或稀释剂。药物组合物通常是水性的,即其含有水(特别是无菌水)。
水性药物组合物的典型pH为7.0至7.6,优选7.2至7.4。可以使用药学上可接受的缓冲剂来达到所需的pH。药物组合物可以是无菌水性等渗盐溶液的形式。
通常,该药物组合物是可注射的组合物,例如该药物组合物适用于静脉递送,例如该药物组合物适用于输注。
纳米颗粒或微米颗粒的医药用途
本发明的纳米颗粒或微米颗粒能够靶向组织,包括但不限于越过血脑屏障的细胞(例如CNS细胞)、免疫细胞和癌细胞,并且一旦定位在靶标处就释放药物。如上所述,靶向的高效率至少部分地通过在纳米颗粒或微米颗粒的外表面上存在多种不同的配体类型(即靶向部分)(例如作为聚合物本身的一部分或作为与其连接的不同部分)而出现。
因此,本发明的纳米颗粒或微米颗粒可用于改善疾病和其他病理状况的靶向治疗的方法中。
很容易理解,根据要治疗的疾病选择配体和包封的药物。例如,如果失调是脑失调,那么配体是适合于使纳米颗粒或微米颗粒穿过BBB并且通常进入越过BBB的细胞(例如CNS细胞)的配体,而药物是有效治疗或预防脑失调的药物。如果失调是免疫和/或炎性失调,那么配体可以是适于使纳米颗粒或微米颗粒能够结合(并且通常进入)免疫细胞的配体,而药物是有效治疗或预防免疫和/或炎性失调的药物。如果病症是癌症,那么配体可以是适于使纳米颗粒或微米颗粒能够结合(并且通常进入)癌细胞的配体,而药物是有效治疗或预防癌症的药物。
脑失调的例子包括中风、神经退行性疾病、创伤性脑损伤(Traumatic braininjury,TBS)、脊髓损伤和食入神经毒素(例如,甲基***过量)。神经退行性疾病包括诸如肌萎缩侧索硬化、帕金森病(Parkinson’s disease)、阿尔茨海默病和亨廷顿病(Huntington’s disease)的状况。中风可以是缺血性中风或出血性中风。
免疫和/或炎性失调的实例包括多发性硬化症、银屑病关节炎、类风湿性关节炎、红斑狼疮和牛皮癣。
癌症的实例包括:皮肤的癌症,例如黑色素瘤;***癌;乳腺癌;***;子宫癌;胃肠道癌;肺癌;卵巢癌;***癌;结肠癌;直肠癌;口癌;脑癌;头颈癌;喉癌;睾丸癌;甲状腺癌;肾癌;胰腺癌;骨癌;脾癌;肝癌;膀胱癌;喉癌;鼻道癌;与AIDS相关的癌症;血液和骨髓的癌症,例如多发性骨髓瘤和急性和慢性白血病,例如淋巴母细胞白血病、髓性白血病、淋巴细胞白血病和髓细胞白血病;晚期恶性肿瘤;淀粉样变性;成神经细胞瘤;脑膜瘤;血管外皮细胞瘤;多发性脑转移瘤;多形胶质母细胞瘤;胶质母细胞瘤;脑干胶质瘤;预后不良恶性脑肿瘤;恶性胶质瘤;复发性恶性胶质瘤;间变性星形细胞瘤;间变性少突胶质细胞瘤;神经内分泌瘤;直肠腺癌;杜克C&D结肠直肠癌(Dukes C&D colorectal cancer);无法切除的结肠直肠癌;转移性肝细胞癌;卡波西肉瘤(Kaposi′s sarcoma);核型急性成髓细胞白血病;慢性淋巴细胞白血病(Chronic lymphocytic leukemia,CLL);霍奇金淋巴瘤(Hodgkin′s lymphoma);非霍奇金淋巴瘤;皮肤T细胞淋巴瘤;皮肤B细胞淋巴瘤;弥漫性大B细胞淋巴瘤;低级别滤泡性淋巴瘤;转移性黑色素瘤(局部黑色素瘤,包括但不限于眼部黑色素瘤);恶性间皮瘤;恶性胸腔积液间皮瘤综合征;腹膜癌;***状浆液性癌;妇科肉瘤;软组织肉瘤,硬皮病,皮肤血管炎,朗格汉斯细胞组织细胞增生症(Langerhans cellhistiocytosis);平滑肌肉瘤;进展性骨化纤维发育不良;激素难治性***癌;切除的高危软组织肉瘤;无法切除的肝细胞癌;华氏巨球蛋白血症(Waldenstrom′smacroglobulinemia);阴燃性骨髓瘤;惰性骨髓瘤;输卵管癌;雄激素非依赖性***癌;雄激素依赖性IV期非转移性***癌;激素不敏感***癌;化疗不敏感***癌;甲状腺***状癌;甲状腺滤泡状癌;甲状腺髓样癌;和平滑肌瘤。
可能易于用本发明的纳米颗粒或微米颗粒进行治疗或预防的其他病症包括HIV、动脉粥样硬化、缺血性心脏病和阻塞性睡眠呼吸暂停。
当然,医药用途和治疗方法包括施用治疗有效量的纳米颗粒或微米颗粒。将治疗有效量的纳米颗粒或微米颗粒施用于患者。根据特定药物的活性、待治疗对象的年龄、体重和状况、疾病的类型和严重程度以及施用频率和施用途径,测量为药物重量的典型剂量为0.001mg至1000mg。优选地,每日剂量水平为0.001mg至4000mg。
本发明进一步提供了一种治疗或预防失调的方法,该方法包括向有需要的患者施用治疗有效量的本发明的纳米颗粒或微米颗粒。例如,本发明提供了治疗或预防选自本公开中指定的任何失调中的失调的方法,所述药物是能够治疗或预防所述失调(例如脑失调、免疫和/或炎性失调、或癌症)的药物。本发明还进一步提供了本发明的纳米颗粒或微米颗粒在制备用于治疗或预防上述失调的方法的药物中的用途。
本发明进一步提供包含本发明的纳米颗粒或微米颗粒和抗原的疫苗。抗原是引起动物体的免疫***产生免疫反应的任何药剂,例如,细菌、病毒或花粉。通常,将疫苗施用于人或动物受体以诱导适应性免疫***对疫苗中包含的特定抗原的记忆功能。优选地,疫苗中的纳米颗粒或微米颗粒选择性地与树突细胞结合。进一步优选地,疫苗是癌症疫苗。
实施例
通过以下实施例对本发明进行说明。然而,这些实施例并不限制本发明的范围。
实施例1:聚合物泡囊的制备
合成的囊泡是使用由聚(乙二醇)(PEG)作为疏水性嵌段和聚(2-(二异丙基氨基)乙基甲基丙烯酸酯)(PDPA)作为亲水性嵌段制成的两亲共聚物制成的。
如Tian et al.,Sci Rep,2015,5,11990(其全部内容通过引用并入本文)报道的那样合成了P[(OEG)10MA]20-PDPA100、Cy5-P[(OEG)10MA]20-PDPA100、Angiopep-P[(OEG)10MA]20-PDPA100和PMPC25-PDPA70共聚物。
聚合物泡囊表面上的Angiopep-2肽靶向LRP1受体,而PMPC配体靶向SCARB1受体。将约5%的POEGMA-PDPA链用Cy5染料标记以进行荧光定量。将Angiopep肽与POEGMA-PDPA共聚物缀合,这些以不同浓度与原始POEGMA-PDPA混合。由此产生的肽的布置在表面上表达并浸入低聚环氧乙烷链(Np=10)中,平均干扰参数δp=0.8。将PMPC链与DPA共聚形成PMPC24-PDPA70,这些与不同浓度的原始POEGMA-PDPA链混合。
为了制备10mg/mL聚合物泡囊,称量共聚物的量并使用pH为2的PBS溶解。一旦膜溶解,就将pH增加到5.0。然后添加肽官能化的共聚物,以避免酸性降解。pH逐渐增加到pH值6.8至7.0,最终停止在pH为7.4至7.5。在pH为6.8至7.0下长时间搅拌,期间形成聚合物泡囊。然后将聚合物泡囊在4℃下超声处理15分钟至30分钟。最终聚合物泡囊,通过预先填充有Sepharose 4B(Sigma Aldrich)的凝胶渗透色谱柱进行对聚合物泡囊的纯化。对于长期储存,聚合物泡囊可以保持在4℃,并且当聚合物泡囊缀合有染料时要避光。聚合物泡囊在临使用前新鲜制作的肽官能化的聚合物泡囊。在这方面,重要的是要注意,虽然POEGMA-PDPA链和PMPC-PDPA链可以进行相分离从而形成零散的聚合物泡囊(参见LoPresti etal.,ACS Nano,2011,5(3),1775-1784),但由于在制备后立即进行了细胞实验,因此没有给予足够的时间进行分离(3天至5天)。
聚合物泡囊的粒径分布通过动态光散射(DLS)测量(参见图3a至图3c)。所有制剂的平均半径为50nm(+/-10nm),并且如TEM和DLS所证实的,添加配体不会改变最终结构。通过使用磷钨酸作为染色剂的透射电子显微镜(FEI Tecnai G2)以及动态光散射(MalvernNanosizer)进一步表征了聚合物泡囊(参见图3d和图3e)。
实施例2:聚合物泡囊与脑内皮细胞结合
将脑内皮bEND.3细胞(ATCC CRL-2299)接种在预涂I型鼠尾胶原蛋白(SigmaAldrich,C3867)的T-75烧瓶中,在补充有2mM的L-谷氨酰胺、100IU/mL青霉素、100mg/ml链霉素和10%胎牛血清(Fetal calf serum,FCS)的DMEM培养基(杜氏改良伊格尔培养基-高糖(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium-high glucose),D5671-Sigma)中。达到100%汇合后,将培养物在37℃下维持在5%CO2和95%空气的气氛中,并使用0.02%(w/v)EDTA胰蛋白酶(5mL,37℃,5%CO2孵育5分钟)常规传代培养。LADMAC巨噬细胞购自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)(Manassas,VA,USA),并在补充有10%(v/v)FCS和2mM的L-谷氨酰胺的伊格尔基本必需培养基(Eagle′s minimal essentialmedium,EMEM)中培养。
将细胞置于带有图像读取塑料底的96孔板上,并用不同的聚合物泡囊制剂处理1小时。随后,再次补充他们的培养基。选择短的孵育时间以确保纳米颗粒/细胞相互作用在动力学上受结合控制,虽然可能发生内吞作用,但这在整个过程中仅占可忽略不计的部分。使用配备有与蔡司温度控制单元37-2和CO2控制器连接的孵化室的共聚焦激光扫描显微镜对细胞进行成像(在实验前将温度和CO2浓度稳定1小时至2小时)。共聚焦激光扫描显微镜检查在配备有以下激光器的ZEISS LSM 510显微镜上进行:Ar激光器,30mW;HeNe激光器,1mW;和HeNe激光器,5mW。使用的激光激发波长为:405nm(DAPI)和548nm(Cy5-聚合物泡囊)。对每种制剂的30张显微照片一式三份地进行荧光强度的量化。通过ImageJ,通过在细胞核周围创建特别目标区域(用DAPI预染色)并测量Cy5通道中的强度来分析图像。
结果如图4所示。在图4a中,示出了用于量化的显微照片的示例,以说明配体修饰的聚合物泡囊与脑内皮细胞的有效结合。图4b和图4c同时示出了与脑内皮细胞、巨噬细胞和淋巴细胞孵育1小时后测量的每个细胞的平均荧光。为了评估聚合物泡囊选择性靶向给定的细胞表型的能力,参数s(称为选择性指数)可以定义为:
其中FBE是脑内皮细胞(即靶细胞)中每个细胞的平均荧光,FS是淋巴细胞或巨噬细胞(此处认为是岗哨细胞)中每个细胞的平均荧光。s>1的制剂与靶细胞相互作用优先于与岗哨细胞相互作用,而s<0的制剂优先与岗哨细胞相互作用,而1≥s≥0的制剂是不加选择的,不会以高选择性结合靶细胞或岗哨细胞。
如图4b所示,与两种岗哨细胞类型相比,Angiopep装饰的聚合物泡囊优先与脑内皮细胞相互作用,当存在大约30个配体时,选择性达到峰值为2.5。正如预期的,在更高的配体数量下,选择性会丧失,并且聚合物泡囊与所有细胞群均等地发生相互作用。
对于PMPC装饰的链,观察到非常不同的结果,其中巨噬细胞显示出最高的摄取,其次是淋巴细胞,最后是脑内皮细胞(尽管脑内皮细胞中的荧光输出与Angiopep聚合物泡囊中观察到的程度相似)。这里对脑内皮细胞的选择性是负的。
还合成了三种同时表达Angiopep和PMPC配体的PEG-PDPA聚合物泡囊,并将其与脑内皮细胞一起孵育。结果在图5中绘制。这些示出了预测经验方程(1)与实验数据之间具有良好的相关性,正如在该特定***中使用方程(1)表明了Angiopep配体的最佳数量为20至30,而PMPC配体的最佳数量为400至600(室温,25℃)。对于这个特定的***,方程(1)中应用的关键参数如下:
PMPC参数:
[P]=2nM
R=50nm
d=10nm
N(PEO)=10
PEO密度=0.5nm2
糖萼密度=5nm2
δP=0.6
δG=0.2
KD(PMPC)=5×10-8M
对于脑内皮细胞,<SRB1>密度=34um-2
对于岗哨细胞(白细胞),<SRB1>密度=24um-2
Angiopep参数:
[P]=2nM
R=50nm
d=10nm
N(PEO)=10
PEO密度=0.5nm2
糖萼密度=5nm2
δP=0.65
δG=0.95
KD(Angiopep)=3.13×10-7M
对于脑内皮细胞,<LRP1>密度=14um-2
对于岗哨细胞(白细胞),<LRP1>密度=28um-2
作为聚合物泡囊半径R和***参数δG和δP的函数的空间势Es聚合物泡囊的计算如图6所示。图6a示出了用若干个Angiopep配体装饰的聚合物泡囊,图6b示出了用PMPC链装饰的聚合物泡囊。图6c示出了结合在一起的两种配体。在所有三种情况下,EP聚合物泡囊与分散在脑内皮细胞的糖萼中的LRP1受体(图6d)和/或SRB1受体(图6e)相互作用,所述糖萼包括多配体蛋白聚糖4,所述多配体蛋白聚糖4是包含四个聚合度为100的硫酸乙酰肝素链的糖蛋白。图6f和图6g中,分别对作为R和δP或δG的函数的***到聚合物泡囊上的聚环氧乙烷刷中的LRP1施加的空间干扰U空间和对***糖萼的聚合物泡囊施加的空间干扰U空间进行了数学建模。Es是对***PEO刷的LRP1施加的U空间和对***糖萼的聚合物泡囊施加的U空间的总和。
有趣的是,实验结果表明,这两种配体协同作用,允许使用本身不会对应于任何相互作用的配体数进行靶向。还通过经验方程(1)准确预测了这些有效配体数的下限。这验证了配体多工化策略是一种设计用于靶向药物递送的纳米颗粒或微米颗粒的高效方法。
实施例3:聚合体与抗原呈递细胞结合
在这里,我们举例说明了将靶向APC细胞的靶向配体应用在抗癌疫苗中。
已经使用来自人蛋白质图谱的数据对抗原呈递细胞中表达的交叉匹配受体进行了生物信息学搜索。结果在图7的蜘蛛图中示出,其显示了清道夫受体B1(SRB1)、转铁蛋白(TFRC)、脂蛋白受体相关蛋白1(LRP1)和甘露糖受体在健康组织和肿瘤组织中的表达。数据显示,只有肿瘤组织中三种受体均高表达,而健康组织中仅一种或两种受体高表达。
将使用连接在聚合物泡囊表面上的临床批准的配体靶向这些受体,以产生所需的超选择性作用。
实施例4:聚合物泡囊与中性粒细胞结合
已经使用来自人蛋白质图谱的数据对抗原呈递细胞中表达的交叉匹配受体进行了生物信息学搜索。图8示出了显示出健康和发炎组织中SRB1、FCAR和SLFN12L受体的表达的蜘蛛图。数据显示出在发炎组织中SRB1和SLFN12L的表达水平特别高。
将使用连接在聚合物泡囊表面上的临床批准的配体靶向这些受体,以产生所需的超选择性作用。
实施例5:聚合物泡囊与肿瘤细胞结合
腹膜癌扩散(Peritoneal carcinomatosis,PC)是肿瘤细胞向腹腔内壁和腹腔内器官的转移性侵入。PC是一种罕见的原发性肿瘤,发生在60%的胃肿瘤、40%的卵巢肿瘤和35%的结肠恶性肿瘤中。中位生存期为1至3个月。建议使用化疗和免疫调节的平衡组合然后用“发现并杀死我(find and kill-me)”信号启动免疫***以攻击肿瘤转移来***。
已经识别出三种不同的受体,即清道夫受体B1(SRB1)、转铁蛋白(TFRC)和表皮生长因子(EGFR),它们一起由肿瘤组织过表达。图9中的蜘蛛图示出了这些受体在健康腹膜组织(肝脏、结肠和女性生殖器)和三种最常见的PC相关肿瘤(胃肿瘤、结肠直肠肿瘤和卵巢肿瘤)中的表达。数据显示,只有肿瘤组织中三种受体均高表达,而健康组织中仅一种或两种受体高表达。
将使用连接在本发明的颗粒(聚Nauts(polyNauts)颗粒)的表面上的临床批准的配体靶向这些受体,以产生所需的超选择性作用。临床批准的配体是针对SRB1的聚(2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱)(PMPC)、针对FOLR1的叶酸和针对EGFR的西妥昔单抗(Cetuximab)。PMPC被批准用于支架、隐形眼镜和导管的涂层,并且已在临床中使用了十年。叶酸,也称为维生素B9,是一种常见的经FDA批准的食品补充剂,也是数种抗癌疗法中使用的配体。最后,西妥昔单抗是一种单克隆抗体,被批准用于治疗野生型KRAS结肠癌,并且正处于对其他数种恶性肿瘤进行的临床评估中。
实施例6:聚合物泡囊与胶质瘤细胞结合
药物递送不良和低效是儿童脑肿瘤治疗失败的主要原因。血脑屏障(BBB)的完整性可能会导致一些儿科肿瘤(例如弥漫性中线胶质瘤)对药物疗法完全耐药,在BBB(例如,成神经管细胞瘤和室管膜瘤)部分被破坏的情况下,也是如此。还需要高剂量的全身化疗,这会导致显著的和剂量限制的副作用。因此,以肿瘤特异性方式改善穿过BBB的药物转运可能会提高存活率并降低全身毒性。
创建既能穿过BBB又能进入脑肿瘤的靶向制剂的挑战限制了潜在受体的选择。已经使用来自人蛋白质图谱的数据对在脑内皮细胞和胶质瘤细胞中高水平表达但在其他组织中不一起表达的交叉匹配受体进行了生物信息学搜索。数据如图10a和图10b所示,确定了BBB标志物低密度脂蛋白受体相关蛋白1(LRP1)和葡萄糖转运蛋白(GLUT1)也在胶质瘤细胞中表达。LRP1与已建立的成人癌症相关标志物表皮生长因子受体(EGFR)的表达水平相匹配。相似地,儿科肿瘤标志物血小板衍生生长因子受体α(PDGFR-α)在BEC中高水平表达。这些数据表明,有可能创建必要的结合图谱以仅靶向这两类细胞。如图10c中的蜘蛛图所示,该数据可以通过超选择性设计将正确的配体成分调整到聚合物泡囊表面(使用方程(1)描述的经验模型)以实现选择性靶向这些细胞。
实施例7:聚合物泡囊表面上的配体最佳数量的确定
进行实验以确定聚合物泡囊表面上Angiopep-2配体的密度对靶细胞吸附程度的影响。将该实验的结果与理论模型所预测的趋势进行了比较,如图11所示。
A.理论模型
如之前所示(参见,例如Martinez-Veracoeachea and Frenkel,PNAS,2011,108(27),10963-10968,以及Angioletti-Urberti,Phys Rev Lett,2017,118(6):068001),纳米颗粒与细胞表面结合的吸附概率θ可以通过朗缪尔(Langmuir)型表达式来描述:
其中Nx=L,R分别是配体和受体的数量,ΔG是键自由能(在整个实施例中,总是认为能量是由热能kBT缩放的,其中kB是玻尔兹曼常数,T是温度)。<>表示泊松分布的平均值。该平均值用于考虑受体和/或配体空间分布的不均匀性,这可能与接枝程序或与表面上的粘合剂流动性有关。z是纳米颗粒在本体溶液中的活性,其对于均匀包覆的纳米颗粒和稀释溶液可以取等于数密度(参见Martinez-Veracoeachea and Frenkel,PNAS,2011,108(27),10963-10968)。
方程(2)中的中心参数是q,即结合状态下纳米颗粒的配分函数,它取决于可用于结合的配体和受体的数量,以及它们的键强度。该配分函数可以写成q=v结合exp(-Ftot),其中v结合=π(Rnp)2L是吸收位点的结合体积,其中Rnp是纳米颗粒的大小,以及L是颗粒可以结合的距离范围,L可近似于配体系链的回转半径。Ftot是吸附自由能并且等于Fatt(配体-受体键形成产生的吸引力贡献)和Frep(由于纳米颗粒的不同组分与结合区域的拥挤环境内的靶细胞之间的空间排斥(例如受体与纳米颗粒表面上的聚合物刷的相互作用以及配体与细胞糖萼的相互作用)引起的排斥贡献)的总和。
假设聚合物泡囊对其靶受体的吸附自由能的吸引力贡献Fatt由配体和受体之间的键形成支配,我们可以写出:
其中总和是具有键数的所有配置ΔG是单个键(取决于所选的特定配体-受体对)的能量,是具有特定键数的配置数量。为了计算这个数量,必须选择特定的结合方案。不同的结合场景因允许的配置数量(通过=kBln(Ω)测量亲合力熵)的不同而不同。最弱的可能结合贡献是“无差别结合”(如Kitov and Bundle,J Am Chem Soc,2003,125(52),16271-16284中所述)。在这种情况下,在任何时候只有单个配体可以与受体结合,得到其中NR是细胞表面上受体的数量,NL是聚合物泡囊表面上配体的数量,并且这得到Fatt=-ln(NR)-ln(NL)+ΔG。对于径向结合的情况,则所有配体都可以与所有受体结合(但在每种配置中,只有单个配体可以与任何特定受体结合,反之亦然),得到:
并且(3)中的总和从0扩展到min(NL,NR)。该配分函数不能写成紧密形式,用蛮力计算它在计算上效率不高。然而,正如Angioletti-Uberti等人(J Chem Phys,2013,138,21102-21106)所示,在任何可能结合情况下,因此包括径向情况下,配体-受体介导的能量(除非配体和受体的数量同时为1;参见Tito and Angioletti-Uberti,J Chem Phys,2016,144(16),161101),可以通过一组耦合方程近似到kBT精度的尾数位(fraction)内:
其中χ=exp(-ΔG)可以解释为单键强度(参见Angioletti-Uberti,Phys RevLett,2017,118(6):068001),ΔG值越低,χ就会增加。在(6)中,指数i指的是***中的任何配体或受体,并且总和扩展到i的所有结合伙伴j。因此,需要求解NL+NR耦合方程。在径向结合情况中,其中每个配体或受体具有相同数量的邻居(neighbour)(对于配体为NR,对于受体为NL),因此之前的方程简化为两个耦合方程:
它们同时求解得到
(以及针对pR的改变下标L、R的对称公式),其用于绘制图11中径向结合情况的曲线。
至于Frep,可以通过结合Halperin(Langmuir,1999,15(7),2525-2533)和Zhulina(Eur Phys JE:Soft Matter Biol Phys,2006,20(3),243-256and Macromolecules,2012,45(11),4429-4440)的先前结果来构建模型,以计算将对象***曲面上的聚合物刷中的排斥自由能。在这个模型中,可以得出:
FroP=A(z)NR (9)
其中VR是受体体积,σ是每条聚合物链的平均面积,δ=(z/h0)∈[0,1],为纳米颗粒与表面之间的距离除以接枝在平面上时的平均刷高度(h0=N(νa 2/3σ)1/3),N是聚合度,ν=a3,是大小为a的单体的体积,最后γ是相对于刷高度取决于纳米颗粒核心半径R的参数,对于h0/R>(√3–1),γ=3,否则γ=(1+h0/R)2。
B.拟合实验数据
图4中的理论曲线是通过使用上述方程(2)到(10)中的表达式拟合实验数据获得的,其中对每个位点的受体数量以及相互作用配体的数量取双泊松平均值,以考虑聚合物泡囊官能化的不均匀性。为了计算吸引力贡献,假设了径向结合情况。结合距离L近似为用于将配体接枝到纳米颗粒的系链的最可能的端到端距离,如果将其视为高斯链(Gaussianchain),则测试实验***的L=2RG=6nm(参见下文)。此外,R=Rnp+h,h=8nm,h是刷高度,是根据保护性PEO涂层的聚合度及其使用Zhulina模型(参见Eur Phys JE:Soft Matter BiolPhys,2006,20(3),243-256)的接枝密度估计的,并且Rnp=50nm,这是纳米颗粒的大小,如通过动态光散射和低温透射电镜实验确定的。
由这些数字还在(10)中得到δ=0.75和γ=(1+h0/R),用于通过(10)估计由受体引起的排斥贡献,其中Angiopep受体的VP=188nm3,如根据已知结构数据(参见Xiaohe Tianet al.,2019,SciAdv)估计的。这留下了三个拟合参数:表面上配体的参考接枝密度σL(因为只有不同聚合物泡囊之间配体数量的比率是已知的,而它们的绝对值并不已知;见下文);受体的平均接枝密度以及每个配体的排斥贡献,其类似于(9),适用于简单的表达式Frep=ANL,其中A包含描述细胞糖萼的未知参数的所有复合效应以及所有排除的配体和细胞表面之间的体积相互作用。给出这些公式,可以使用蒙特卡罗退火法(Monte Carloannealing)拟合实验数据以最小化数量,
其中wi可以作为每个实验数据θi,exp的m.s.r.d.的倒数,实验数据θi,exp是通过其在具有不同接枝密度的所有聚合物泡囊中的最大值进行归一化的实验测量吸附。该程序从有效温度1开始,每100MC扫描以0.95倍的系数缩放温度,直到温度达到10-7的值,此时***已经停止进展。整个过程产生的拟合参数为σL=1.88 10-3/nm2或与结合位点接触的聚合物泡囊区域(对于参考聚合物泡囊)内具有大约7个相互作用配体,ρR=4.3×10-5/nm2,或每个吸附位点平均有0.32个受体,排斥参数A=0.62kBT。
C.聚合物泡囊的制备
PEO-b-PDPA和N3-PEO-b-PDPA共聚物如先前报道(参见Blanazs et al.,AdvFunctional Mat,2009,19(18),2906-2914和Gaitzsch et al.,Polymer Chem,2016,7(17),3046-3055)的通过原子转移自由基聚合方法进行合成。对于荧光标记(Cy5-PEG113-PDPA100)和配体结合物(Angiopep2-PEG68-PDPA90),首先将一个当量的N3-PEO-b-PDPA通过pH转换程序在PBS中进行组装(如Contini et al.,IScience,2018,7,132-144所述的)。然后在搅拌下通过超声处理和惰性气流对自组装聚合物的溶液进行脱气。脱气溶液与1.2当量的相应的配体混合。对于肽缀合(AP-炔烃),将肽溶解在脱气的PBS(pH 7.4)中,而将不溶于水的配体(例如Cy5-炔烃)添加到脱气的二甲亚砜(Dimethylsulfoxide,DMSO)中,最终DMSO:PBS的比例为10:1。然后添加抗坏血酸钠(5当量)并将混合物进一步脱气至少30分钟。最后,在惰性气氛下加入1当量的CuSO4,并使反应在40℃避光反应72小时。用DMSO对标记的聚合物进行透析,然后用水进行纯化(肽纯化的MWCO为至少为5KDa,染料纯化的MWCO至少为3.5KD)。冻干后回收标记的聚合物。为了制备配体量增加的聚合物泡囊,将共聚物PEG113-PDPA80与Angiopep2-PEG68-PDPA90(0mol%至10mol%)和Cy5-PEG113-PDPA100(10mol%)混合,并将混合物溶解在四氢呋喃:二甲亚砜(90:10)中,使最终聚合物总浓度为20mg/mL。使用自动注射泵将2.3mL的pH为7.4的PBS(水相)以2L/分钟泵入有机溶液中。水相的添加在40℃下连续搅拌下进行。注射后,手动添加额外体积的PBS(pH 7.4)(3.7mL)。为了去除剩余的有机溶剂,将聚合物泡囊溶液转移到纤维素半透膜(3.5kDa截断)中,并在室温下在PBS(pH7.4)中透析超过24小时。样品以1000r.c.f.离心10分钟,在4℃下超声处理20分钟,然后通过填充有Sepharose 4B的尺寸排阻色谱(Size exclusion chromatography,SEC)柱进行纯化。所有样品均在4℃下储存并避光直至进一步使用。聚合物泡囊的平均尺寸和形态通过动态光散射(DLS)和透射电子显微镜(TEM)进行表征。使用配备有He-Ne 4mW 633nm激光器的Malvern Zetasizer进行DLS测量,在一次性聚苯乙烯比色皿中用PBS(pH 7.4)稀释聚合物泡囊溶液。对于TEM分析,聚合物泡囊在辉光放电的碳涂覆的铜网上沉积1分钟,然后用0.5%(w/v)的PTA溶液染色2秒。
D.吸附概率的测量
FaDu细胞(ATCC HTB-43)以20000个细胞/孔的密度接种在8孔室玻片(iBidi)上,并在37℃,5%CO2下在补充有10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的MEME(伊格尔最低必需培养基M5650-Sigma)中维持。24小时后,去除培养基,用杜氏磷酸盐缓冲盐水(Dulbecco’sPhosphate-Buffered Saline,DPBS)洗涤细胞3次,并在室温下用3.7%(DPBS中的v/v)的多聚甲醛固定10分钟。将固定细胞在37℃下与Cy5标记的和Angiopep2装饰的聚合物泡囊(0.15mg/mL)在PBS(pH 7.4)中孵育1小时。1小时后,去除聚合物泡囊溶液,用DPBS洗涤细胞3次,并在室温下用CellMask Green(在DPBS中1:1000)处理5分钟。将细胞留在实时成像溶液(Live Imaging Solution)中,并在配备有63倍油镜的Leica SP8共聚焦激光扫描显微镜上分析聚合物泡囊在细胞膜上的吸附情况。聚合物泡囊使用633nm的激发波长在650nm至700nm范围内测量Cy5标记的聚合物泡囊的总发射荧光,并使用z轴层切的30张图像收集所述总发射荧光。对于使用ImageJ软件研究和处理的每个Angiopep2百分比,在50个细胞上获取图像数据。所有实验以一式三份进行。
序列表
<110> UCL商业有限公司
<120> 多配体官能化的聚合物泡囊
<130> N415065WO
<150> GB1900185.8
<151> 2019-01-07
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Angiopep-2
<400> 1
Thr Phe Phe Tyr Gly Gly Ser Arg Gly Lys Arg Asn Asn Phe Lys Thr
1 5 10 15
Glu Glu Tyr
<210> 2
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFR ligand
<400> 2
Tyr His Trp Tyr Gly Tyr Thr Pro Gln Asn Val Ile
1 5 10
Claims (24)
1.一种用于与细胞表面结合的纳米颗粒或微米颗粒,其中所述纳米颗粒或微米颗粒是包含在其外表面上的至少第一配体类型和在其外表面上的至少第二配体类型的聚合物泡囊、脂质体、合成体或胶束,其中所述第一配体类型能够与所述细胞表面上的第一受体类型结合,并且所述第二配体类型能够与所述细胞表面上的第二受体类型结合,并且其中所述纳米颗粒或微米颗粒包含所述第一配体类型的2个至1000个配体和所述第二配体类型的2个至1000个配体,并且其中所述纳米颗粒或微米颗粒包含在其外表面上的聚合物刷。
2.根据权利要求1所述的纳米颗粒或微米颗粒,其中,所述纳米颗粒或微米颗粒包含所述第一配体类型的5个至1000个配体。
3.根据权利要求1或2所述的纳米颗粒或微米颗粒,其中,所述纳米颗粒或微米颗粒包含所述第一配体类型的10个至500个配体。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的纳米颗粒或微米颗粒,其中,所述纳米颗粒或微米颗粒包含所述第一配体类型的20个至200个配体。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的纳米颗粒或微米颗粒,其中,所述纳米颗粒或微米颗粒包含所述第二配体类型的5个至1000个配体。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的纳米颗粒或微米颗粒,其中,所述纳米颗粒或微米颗粒包含所述第二配体类型的10个至500个配体。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的纳米颗粒或微米颗粒,其中,所述纳米颗粒或微米颗粒包含所述第二配体类型的20个至200个配体。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的纳米颗粒或微米颗粒,还包含包封在所述纳米颗粒或微米颗粒内的药物。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的纳米颗粒或微米颗粒,其中,所述纳米颗粒或微米颗粒是聚合物泡囊。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的纳米颗粒或微米颗粒,其中,所述纳米颗粒或微米颗粒的外表面上的第i种配体类型(li)的配体数量根据下式定义:
其中:
a是所述纳米颗粒或微米颗粒的活性,计算为a=[P]VPNA,其中[P]是所述纳米颗粒或微米颗粒在本体溶液中的摩尔浓度,NA是阿伏伽德罗常数,VP是所述纳米颗粒或微米颗粒的几何体积;
kB是玻尔兹曼常数;
T是绝对温度;
EB(i)是第i种配体-受体对结合的总能量,由以下的总和得出:(a)配体/受体结合亲和力kBTlnKD(i),其中,KD(i)是第i种受体/配体偶合的解离常数;和(b)所述纳米颗粒或微米颗粒与所述细胞表面之间的空间干扰Es;以及
ri是所述细胞表面上的i型受体的密度;
并且进一步地,其中i是1和/或2。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的纳米颗粒或微米颗粒,其中,所述纳米颗粒或微米颗粒包含在其外表面上的2种至7种配体类型,优选3种至5种配体类型,最优选4种配体类型,其中每种配体类型能够与所述细胞表面上的互补受体类型结合。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的纳米颗粒或微米颗粒,其中,所述纳米颗粒或微米颗粒包含在其外表面上的能够与所述细胞表面上的受体类型结合的配体类型,所述受体类型选自低密度脂蛋白受体相关蛋白1(LRP-1)、B类清道夫受体成员1(SCARB1)、转铁蛋白受体(TFRC)、叶酸受体1(FOLR1)和表皮生长因子受体(EGFR)。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的纳米颗粒或微米颗粒,其中,所述纳米颗粒或微米颗粒包含在其外表面上的第一配体类型,所述第一配体类型选自Angiopep肽、聚(2-(甲基丙烯酰氧基)乙基磷酰胆碱)、叶酸、转铁蛋白、转铁蛋白模拟肽和YHWYGYTPQNVI肽。
14.根据权利要求13所述的纳米颗粒或微米颗粒,其中,所述纳米颗粒或微米颗粒包含在其外表面上的第二配体类型,所述第二配体类型选自Angiopep肽、聚(2-(甲基丙烯酰氧基)乙基磷酰胆碱)、叶酸、转铁蛋白、转铁蛋白模拟肽和YHWYGYTPQNVI肽,条件是所述第二配体类型与所述第一配体类型不同。
15.根据权利要求6至14中任一项所述的纳米颗粒或微米颗粒,其中,所述药物选自神经保护剂、免疫调节药物、NSAID、皮质类固醇、DMARD、免疫抑制剂、TNF-α抑制剂和抗癌药。
16.根据权利要求1至12中任一项所述的纳米颗粒或微米颗粒,其中,所述聚合物刷包含聚(乙二醇)(PEG)、聚(乙烯基吡咯烷酮)(PVP)、聚(2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱)(PMPC)、聚(甘油)、聚(硫代甜菜碱)、聚(羧基甜菜碱)、聚(氨基酸)、聚肌氨酸、聚(2-恶唑啉)、聚(N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺)、聚二醇、肝素、葡聚糖、聚(乙二醇)-聚(2-(二异丙基氨基)乙基甲基丙烯酸酯)和/或聚(低聚(乙二醇)甲基醚甲基丙烯酸酯)(POEGMA)。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的纳米颗粒或微米颗粒,其中,所述纳米颗粒或微米颗粒其外表面上包含聚合物刷和各配体类型,所述聚合物刷包含聚(乙二醇)-聚(2-(二异丙基氨基)乙基甲基丙烯酸酯)。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的纳米颗粒或微米颗粒,其中,所述纳米颗粒或微米颗粒的所述外表面上的各配体与聚(乙二醇)分子共价结合。
19.一种药物组合物,包含:多个根据权利要求1至18中任一项所述的纳米颗粒或微米颗粒;和一种或多种药学上可接受的赋形剂或稀释剂。
20.用于治疗疾病的根据权利要求1至18中任一项所述的纳米颗粒或微米颗粒或根据权利要求19所述的药物组合物。
21.根据权利要求20所述用途的纳米颗粒或微米颗粒、或药物组合物,其中,所述疾病是癌症。
22.一种治疗人类患者的癌症的方法,其中所述方法包括向有需要的患者施用根据权利要求1至18中任一项所述的纳米颗粒或微米颗粒、或根据权利要求19所述的药物组合物。
23.根据权利要求1至18中任一项所述的纳米颗粒或微米颗粒、或根据权利要求19所述的药物组合物在制备用于治疗患者的癌症的药物中的用途。
24.一种疫苗,包含权利要求1至18中任一项所述的纳米颗粒或微米颗粒和抗原。
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Legal Events
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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