CN113640521A - 一种毛发中毒品定量测定试纸条、试剂盒及制备方法与应用 - Google Patents

一种毛发中毒品定量测定试纸条、试剂盒及制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种毛发中毒品定量测定试纸条、试剂盒及制备方法与应用，所述试纸条包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸和底板；所述结合垫喷涂了聚集诱导发光荧光纳米微球修饰的检测抗体和质控蛋白兔IgG；所述硝酸纤维素膜设置了检测线和质控线，分别包被毒品完全抗原和羊抗兔IgG；所述吸水纸用于吸收未反应的纳米微球、修饰抗体和待测液；所述样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸是按照以样本垫为起始位置的横向层析方向，依次相互交叠固定于底板上。试剂盒包括毛发裂解液和试纸条。本发明的试纸条及试剂盒通过结合便携的荧光读数仪，可提供一种高灵敏、准确的毛发痕量毒品现场分析技术，应用于法医毒物分析、安检以及毒驾筛查等。

Description

一种毛发中毒品定量测定试纸条、试剂盒及制备方法与应用
技术领域
本发明属于生物检测和公共安全领域，具体涉及一种毛发中毒品定量测定试纸条、试剂盒及制备方法与应用。
背景技术
毒品滥用不仅给吸毒者带来危害，更给盗抢骗等一系列违法犯罪活动埋下隐患。毒品作为一种成瘾性极强的药物，对人的中枢神经造成危害的同时，还会带来身体和精神上的依赖。长期滥用毒品不仅易导致精神性疾病，还会由此引发自伤自残、暴力伤害、“毒驾”等。通过对人体中代谢的毒品检测成为排查和控制吸毒人员的重要手段。
毒品检测通常取材自血液、唾液、尿液及毛发，毛发检测与血液、唾液、尿液检测相比，具有独特优势。毒品进入人体后代谢迅速，体液检测如血液、唾液和尿液仅能反映1-3天或更短时间内的吸毒状况；毛发中的毒品来自于药物沉积，不会或很少流失，能反映长时间的吸毒情况。毛发样品有检测时效长、吸食毒品信息全面、样本易保存和采取、可重复取样等特点，更甚者还可通过对毛发分段分析了解其近期吸毒史，因此，毛发中毒品检测在法医毒物分析、现场勘察及缉毒领域都有广泛应用。
毛发中毒品含量较少，因此对灵敏度和准确度要求较高。在我国，毛发中毒品分析主要采用实验室方法和荧光免疫层析技术。实验室方法主要为色谱法，色谱法具有极高灵敏度和准确度，但操作复杂、设备昂贵且耗时长等缺陷，使其无法满足相关可疑人员的大批量排查和跟踪，尤其是对于基层技术人员较难操作；荧光免疫层析技术是一种将荧光和快速免疫层析结合的技术，利用荧光物质取代原始的胶体金作为新的检测信号，具有灵敏度高、准确度好、操作简单、成本低、可定量等特点，更能满足现场进行的大批量毛发中药物检测需求。
目前，荧光免疫层析技术采用的标记荧光主要是时间分辨荧光微球和量子点微球等，时间分辨荧光微球有超过200nm的斯托克斯位移和长余辉，可避免背景信号干扰，但检测需要结合单模光纤和时间控制器件实现(Rapid and Sensitive Lateral FlowImmunoassay Method for Procalcitonin(PCT)Based on Time-ResolvedImmunochromatography.XY Shao，CR Wang，CM Xie，XG Wang，RL Liang，WW Xu，sensors，2017，17(3))；量子点鲜艳多彩，但其核壳结构的制备工艺复杂、造价较高且在长期存储中容易脱落(CdTe/CdS quantum dot-labeled fluorescent immunochromatography teststrips for rapid detection of Escherichia coli O157:H7.J Yu，J Su，J Zhang，XWei，A Guo，Rsc Advances，2017，7(29))。近年来，具有独特性质的聚集诱导发光材料崛起，聚集诱导发光材料与传统荧光分子所具有的荧光聚集猝灭(aggregation-causedquenching,ACQ)现象不同，其分子内的运动受限导致AIE分子存在从单分子态弱荧光到聚集态强荧光转换的现象，特别是在聚集、干燥或薄膜状态下其荧光效率出现显著增长的性质。
聚集诱导发光材料具有来源广泛、成本较低等特点，持久或多次激发的发光稳定性和抗光漂白性高，使用聚集诱导发光材料制备的纳米荧光微球和市场上常见的传统荧光微球相比，可以达到更好的光稳定性和更强的荧光信号效果。迄今为止，采用聚集诱导发光荧光纳米微球修饰抗原抗体，并用于高灵敏、准确的毛发中毒品含量测定技术，还未见相关文献专利报道。
发明内容
为了克服现有技术存在的上述不足，本发明目的在于提供一种基于聚集诱导发光荧光纳米微球的毛发中毒品定量测定试纸条、试剂盒及制备方法与应用，旨在采用聚集诱导发光荧光纳米微球对抗原抗体进行修饰开发一种新型荧光免疫层析技术，相对于传统的荧光标记物，其光稳定性和荧光信号更强，提供一种高灵敏度、宽线性、准确的毛发中毒品检测技术。
本发明通过采用具有独特聚集诱导发光材料制备的聚集诱导发光荧光纳米微球标记结合垫上的质控蛋白兔IgG和毒品单克隆抗体，通过固定在硝酸纤维素膜上的毒品抗原和羊抗兔IgG完成捕捉，将样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸依次交叠搭接、粘贴在底板上，制备一种毛发中毒品定量检测试纸条，并和毛发裂解液等组成检测试剂盒。
本发明目的通过以下技术方案来实现：
一种毛发中毒品定量测定试纸条，所述试纸条包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸和底板；
所述结合垫喷涂了聚集诱导发光荧光纳米微球修饰的检测抗体和质控蛋白兔免疫球蛋白G(immunoglobulin G，IgG)；
所述硝酸纤维素膜设置了检测线和质控线，分别包被毒品完全抗原和羊抗兔IgG；
所述吸水纸用于吸收未反应的纳米微球、标记抗体和待测液；
所述样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸是按照以样本垫为起始位置的横向层析方向，依次相互交叠固定于底板上。
优选的，所述聚集诱导发光荧光纳米微球是由聚苯乙烯包裹、包埋聚集诱导发光分子的纳米微球，所述聚集诱导发光荧光纳米微球的表面由羧基修饰，粒径为100-500nm，激发波长为300-500nm，发射波长为400-650nm。
优选的，所述检测抗体为单克隆抗体；
优选的，所述毒品完全抗原为毒品分子和载体蛋白的偶联复合物，其中载体蛋白为牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)、钥孔血蓝蛋白(KLH)、人血清白蛋白(HSA)、兔血清白蛋白(RSA)中的一种或多种；
优选的，所述样本垫和结合垫选自玻璃纤维素膜或聚酯膜中的一种；
优选的，所述底板选自聚氯乙烯(Polyvinyl chloride，PVC)材料或其他硬质且不吸水的材料中的一种；
优选的，所述硝酸纤维素膜，从所述样品垫端至吸水纸一端，依次是检测线及质控线；所述检测线及质控线间隔距离是3-10mm。
上述的毛发中毒品定量测定试纸条的制备方法，包括以下步骤：
S1、抗体标记：采用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride，EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(N-Hydroxy succinimide，NHS)活化后的聚集诱导发光荧光微球，对检测抗体和质控蛋白兔IgG进行标记，加入BSA溶液进行封闭，离心复溶后得到聚集诱导发光荧光纳米微球修饰的检测抗体和兔IgG；
S2、结合垫制备：将纳米微球修饰的抗体和兔IgG喷涂于结合垫上，30-50℃烘干；
S3、包被膜制备：在硝酸纤维素膜的检测线T线位置包被毒品完全抗原，所述毒品完全抗原浓度为1.0-3.0mg/mL，在质控线C线位置包被羊抗兔IgG，所述羊抗兔IgG浓度为0.5-2.4mg/mL，30-50℃烘干；
S4、试纸条组装：在粘贴有硝酸纤维素膜的底板上依次搭接结合垫、样品垫和吸水纸组装成大板，用切条机切成3-5mm宽的试纸条。
一种毛发中毒品定量测定试剂盒，包括试纸条和毛发裂解液；所述试纸条为上述的毛发中毒品定量测定试纸条；所述毛发裂解液用于将毒品分子从毛发结构中释放，并使其分子结构处于稳定形态。
优选的，所述毛发裂解液的成分包括：缓冲液、表面活性剂、角蛋白水解酶、防腐剂以及氯化钠。表面活性剂用以洗涤毛发表面的油污，使角蛋白酶充分与毛发接触，提高毒品的溶解率。角蛋白水解酶用以分解毛发角蛋白和小分子，便于毒品分子与毛发角蛋白分开并溶解。缓冲溶液中和蛋白酶K分解毛发对环境成分的变化，提高角蛋白水解酶的生物活性，增加毒品分子的溶解率和结构的稳定性以及裂解液成分的稳定性。防腐剂的作用是有效控制试剂中微生物的生长。氯化钠用以维持溶液的离子平衡，减少蛋白质的非特异性结合。
进一步优选的，所述表面活性剂为TritonX-100、PEG4000、PVP-K30、EDTA二钠、Tween-20、S9、CTAB、S16中的一种或多种；
进一步优选的，所述角蛋白水解酶为蛋白水解酶K、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶中的一种或多种；
进一步优选的，所述缓冲液为PB、Tris-HCl中的一种；
进一步优选的，所述防腐剂为Proclin-300；
进一步优选的，所述氯化钠的作用是维持溶液的离子平衡；
进一步优选的，所述毛发裂解液中角蛋白水解酶的总浓度为3-20μg/mL，氯化钠的质量浓度为50-250mM，防腐剂的质量浓度为0.05-3％，所述表面活性剂的总质量浓度为0.05-3％。
进一步优选的，所述毛发裂解液中的缓冲液浓度为10-200mM；所述毛发裂解液的pH为6-8。
进一步优选的，所述PB缓冲液的pH为6-8，Tris-HCl缓冲液的pH为7-9。
上述的毛发中毒品定量测定试纸条在定量测定毛发中毒品中的应用，包括以下步骤：
(1)将毛发和毛发裂解液以1：50-200的质量比进行混合，通过物理粉碎，混匀并孵育，使毛发中毒品分子释放，提取其上清液作为待测样本；
(2)开启干式免疫荧光分析仪，将ID卡***，导入标准曲线；
(3)将所述试纸条装入检测卡中，将待测样本滴加在检测卡的加样孔中，再将检测卡***干式免疫荧光分析仪中，等待10-15min，进行测试；
(4)得到检测结果。
优选的，步骤(1)-(4)的检测时间为15-20min；所述检测结果的检测限＜1ng/mL，线性范围为2-1000ng/mL，其线性系数r≥0.9900，重复性的变异系数≤15％，准确度的相对偏差在±15％范围内。
与现有技术相比，本发明具有如下效果及优点：
本发明通过将聚集诱导发光荧光纳米微球应用于毛发中毒品定量分析技术，开发出一种快速、灵敏、准确的毛发中毒品定量试剂盒，并和便携的荧光读数仪配合使用，提供一种高灵敏度、准确、线性范围宽的毛发中痕量毒品现场分析技术，可应用于法医毒物分析、毒检及相关行业或社区大规模可疑人群排查等。
附图说明
图1为本发明的一种毛发中毒品定量快速定量试纸条的示意图，其中，1是底板，2是样品垫，3是结合垫，4是硝酸纤维素膜，5是吸水纸，6是检测线，7是质控线。
图2为检测卡的结构示意图。其中8是检测窗，9是样品加样孔，10是项目信息区。
图3为试纸条样品结果判定示意图。
图4为试纸条测试结果示意图。
图5为本发明试纸条用于毛发中毒品类检测的流程图。
图6为实施例9的检测结果一致性分析图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和特点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例；基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明通过以下技术方案实施
一种毛发中毒品定量测定试纸条，如图1所示，包括底板1、样品垫2、结合垫3、硝酸纤维素膜4和吸水纸5；
底板1作为试纸条各结构的支撑；
结合垫3上喷涂有聚集诱导发光荧光纳米微球标记的毒品检测抗体和羊抗兔IgG；
硝酸纤维素膜4上设置有检测线6和质控线7，分别包被有毒品完全抗原和羊抗兔IgG；
吸水纸5用于将过量的反应液充分吸收，防止液体回流，干扰检测结果；
依次将硝酸纤维素膜荧光标记物结合垫、样品垫、吸水纸搭接粘贴于底板上，试纸条以进样孔8的一端作为侧向层析起始位置。
实施例中，所述聚集诱导发光荧光纳米微球是聚苯乙烯包裹的、包埋了聚集诱导发光材料分子的纳米微球。
所述聚集诱导发光荧光纳米微球是由经高密度羧基修饰，用于蛋白、抗体和核酸的共价偶联，所述微球的粒径为100-500nm，激发波长为300-500nm，发射波长为500-650nm。
实施例中，所述毒品完全抗原为毒品半抗原和载体蛋白的偶联复合物，载体蛋白优选为牛血清蛋白或者酪蛋白；毒品为***或***。
实施例中，所述的毒品检测抗体为鼠源高特异性单克隆抗体，质控蛋白选自兔多克隆抗体和羊抗兔或鸡抗兔。
实施例中，所述结合垫3，选自玻璃纤维素膜或聚酯膜；
所述底板1为PVC基底或其他类似的硬质且不具有吸水性的材料基底；
所述硝酸纤维素膜4上，按照层析方向，依次是检测线6及质控线7。
所述检测线和质控线的间隔、以及相邻的所述检测线的间隔为3.0-5.0mm。
本发明实施例提供一种如上述毛发中毒品荧光检测试纸条的制备方法，所述制备步骤如下：
1)聚集诱导发光荧光微球标记物制备
取100mg粒径为100-500nm羧基修饰的纳米微球(其固含量为1％)15000rpm离心10min，1mL偶联缓冲液重悬。按1:10-1:50的摩尔比加入EDC和NHS，涡旋震荡后室温孵育20-30min，15000rpm离心10min。加入偶联缓冲液重悬微球，加入30-150μg检测抗体或羊抗兔IgG，混匀后室温反应2-4h，12000rpm离心10min去除上清，加入1mL封闭缓冲液(含0.2-1％的BSA和0.4-2％的甘氨酸的水溶液)，混匀后室温反应1-2h，用封闭缓冲液离心洗涤3次后，用pH＝7.4的20mMPBS(含0.2-1％的BSA和0.1-5％的海藻糖)重悬沉淀，将制备的微球修饰抗体溶液于2-8℃备用；
2)结合垫制备
将结合垫用pH＝7.4的20-50mM Tris-HCl(含0.1-5％的海藻糖、0.2-1％的BSA、0.02-1％的Tween-20)浸泡2h，37℃烘干16-24h备用。将纳米微球修饰的检测抗体和羊抗兔IgG按照稀释浓度进行稀释，检测抗体稀释浓度为5-20％，羊抗兔IgG的稀释浓度为3-10％。混匀后用划膜喷金仪进行喷膜，参数为3-7μL/cm，完成后置于湿度≤35％，温度为37℃的烘箱中干燥16-24h，干燥后密封室温(10-30℃)储存备用；
3)包被膜制备
用pH＝7.4的20mM PBS包被缓冲液(含0.2-1％的BSA，0.5-5％的海藻糖)将毒品半抗原-载体蛋白和兔IgG分别稀释后进行划线，检测线为毒品半抗原-载体蛋白，划线浓度为0.5～2.0mg/mL，划线用量为0.5-1.0μL/cm；质控线为兔IgG，划线浓度为0.5～1.0mg/mL，划线用量为0.5-1.0μL/cm。完成后将包被膜置于湿度≤35％，温度为37℃的烘箱中干燥16-24h，干燥后密封室温(10-30℃)储存备用；
4)试纸条组装
如图1所示，将干燥好的包被膜、结合垫、样品垫和吸水纸搭接粘贴于底板的相应位置上，并压紧。组装完成后用切条机切成4mm宽的免疫层析试纸条，将试纸条按样品垫对准加样孔方向装入如图2所示的检测卡中，加样孔8对应样品垫，检测窗9则对应硝酸纤维素膜上的检测线和质控线区域。将检测卡装入干燥剂的铝箔袋中并封口，置于室温(10-30℃)环境下保存备用。
一种毛发中毒品荧光检测试纸条测试方法如下：
(1)将毛发通过物理破碎，和毛发裂解液以1：100的质量比进行混合，充分混匀并孵育，使毛发中毒品分子充分释放，提取其上清液作为待测样本；
(2)开启干式免疫荧光分析仪，将ID卡***，导入标准曲线；
(3)将60-120μL待测样本滴加在检测卡的加样孔中，将检测卡***干式免疫荧光分析仪中，等待5-15min，进行测试；
(4)荧光分析仪读取检测窗内检测线和质控线的荧光强度，并通过内置的标准曲线计算出样品中***的浓度，并判断阴阳性，如图3所示。
实施例所用的毛发裂解液成分为20-50mMPB缓冲液或Tris、60-80nM蛋白水解酶K、60-80mM的NaCl和0.5-3％的Proclin300、0.5-3％的TritonX-100，缓冲体系pH为7-8。
实施例1
毛发中***快速定量测定试剂条的制备
(1)聚集诱导发光荧光纳米微球标记抗体的制备
取100mg的粒径为100nm的羧基修饰的纳米微球(其固含量为1％)，15000rpm离心10min，1mL偶联缓冲液重悬。按1:10的摩尔比加入EDC和NHS，涡旋震荡后室温孵育20-30min，15000rpm离心10min。加入偶联缓冲液重悬微球，加入30μg***抗体或羊抗兔IgG，混匀后室温反应2h，12000rpm离心10min去除上清，加入1mL封闭缓冲液(含0.2％的BSA和0.4％的甘氨酸的水溶液)，混匀后室温反应1h，用封闭缓冲液离心洗涤3次后，用pH＝7.4的20mM PBS(含0.2％的BSA和0.1％的海藻糖)重悬沉淀，将制备的微球修饰抗体溶液于2-8℃备用；
(2)结合垫制备
将结合垫用pH＝7.4的20mM Tris-HCl(含0.1％的海藻糖、0.2％的BSA、0.02％的Tween-20)浸泡2h，37℃烘干16h备用。将微球修饰的***抗体和羊抗兔IgG按照稀释浓度进行稀释，***抗体稀释浓度为5％，羊抗兔IgG稀释浓度为3％。混匀后用划膜喷金仪进行喷膜，参数为4μL/cm，完成后置于湿度≤35％，温度为37℃的烘箱中干燥16h，干燥后密封室温(10-30℃)储存备用；(3)包被膜制备
用pH＝7.4的20mM PBS包被缓冲液(含0.2％的BSA，0.5％的海藻糖)将***半抗原-BSA复合物和兔IgG分别稀释后进行划线，检测线为***半抗原-BSA复合物，划线浓度为0.5mg/mL，划线用量为0.5μL/cm；质控线为兔IgG，划线浓度为0.5mg/mL，划线用量为0.5μL/cm。完成后将包被膜置于湿度≤35％，温度为37℃的烘箱中干燥16h，干燥后密封室温(10-30℃)储存备用；
(4)试纸条组装
将干燥好的包被膜、结合垫、样品垫和吸水纸粘贴于底板的相应位置上，并压紧。组装完成后用切条机切成4mm宽的试纸条，把试纸条按样品垫对准加样孔方向固定在装入检测卡中。将检测卡装入干燥剂的铝箔袋中并封口，置于室温(10～30℃)环境下保存备用。
实施例2
毛发中***快速定量测定试剂条的制备
(1)聚集诱导发光荧光纳米微球标记抗体的制备
取100mg粒径为400nm羧基修饰的纳米微球(其固含量为1％)15000rpm离心10min，1mL偶联缓冲液重悬。按1:50的摩尔比加入EDC和NHS，涡旋震荡后室温孵育30min，15000rpm离心10min。加入偶联缓冲液重悬微球，加入150μg***抗体或羊抗兔IgG，混匀后室温反应4h，12000rpm离心10min去除上清，加入1mL封闭缓冲液(含0.2％的BSA和0.4％的甘氨酸的水溶液)，混匀后室温反应2h，用封闭缓冲液离心洗涤3次后，用pH＝7.4的20mMPBS(含1％的BSA和5％的海藻糖)重悬沉淀，将制备的微球修饰抗体溶液于2-8℃备用；
(2)结合垫制备
将结合垫用pH＝7.4的50mM Tris-HCl(含5％的海藻糖、1％的BSA、1％的Tween-20)浸泡2h，37℃烘干24h备用。将微球修饰的***抗体和羊抗兔IgG按照稀释浓度进行稀释，***抗体稀释浓度为20％，羊抗兔IgG稀释浓度为10％。混匀后用划膜喷金仪进行喷膜，参数为4μL/cm，完成后置于湿度≤35％，温度为37℃的烘箱中干燥24h，干燥后密封室温(10-30℃)储存备用；
(3)包被膜制备
用pH＝7.4的20mM PBS包被缓冲液(含1％的BSA，5％的海藻糖)将***半抗原-BSA复合物和兔IgG分别稀释后进行划线，检测线为***半抗原-BSA复合物，划线浓度为2.0mg/mL，划线用量为1.0μL/cm；质控线为兔IgG，划线浓度为1.0mg/mL，划线用量为1.0μL/cm。完成后将包被膜置于湿度≤35％，温度为37℃的烘箱中干燥24h，干燥后密封室温(10-30℃)储存备用；
(4)试纸条组装
同实施例1中的步骤(4)。
实施例3
毛发中***快速定量测定试剂条的制备
(1)聚集诱导发光荧光纳米微球标记抗体的制备
取100mg粒径为200nm羧基修饰的纳米微球(其固含量为1％)15000rpm离心10min，1mL偶联缓冲液重悬。按1:20的摩尔比加入EDC和NHS，涡旋震荡后室温孵育30min，15000rpm离心10min。加入偶联缓冲液重悬微球，加入60μg***抗体或羊抗兔IgG，混匀后室温反应2h，12000rpm离心10min去除上清，加入1mL封闭缓冲液(含0.2％的BSA和0.4％的甘氨酸的水溶液)，混匀后室温反应1h，用封闭缓冲液离心洗涤3次后，用pH＝7.4的20mM PBS(含0.5％的BSA和2％的海藻糖)重悬沉淀，将制备的微球修饰抗体溶液于2-8℃备用；
(2)结合垫制备
将结合垫用pH＝7.4的20mM Tris-HCl(含2％的海藻糖、0.5％的BSA、0.05％的Tween-20)浸泡2h，37℃烘干24h备用。将微球修饰的***抗体和羊抗兔IgG按照稀释浓度进行稀释，***抗体稀释浓度为10％，羊抗兔IgG稀释浓度为5％。混匀后用划膜喷金仪进行喷膜，参数为4μL/cm，完成后置于湿度≤35％，温度为37℃的烘箱中干燥24h，干燥后密封室温(10-30℃)储存备用；
(3)包被膜制备
用pH7.4，0.02M PBS包被缓冲液(含0.5％的BSA，2％的海藻糖)将***半抗原-BSA复合物和兔IgG分别稀释后进行划线，检测线为***半抗原-BSA复合物，划线浓度为2.0mg/mL，划线用量为1.0μL/cm；质控线为兔IgG，划线浓度为1.0mg/mL，划线用量为1.0μL/cm。完成后将包被膜置于湿度≤35％，温度为37℃的烘箱中干燥24h，干燥后密封室温(10-30℃)储存备用；
(4)试纸条组装
同实施例1中的步骤(4)。
实施例4
毛发中***快速定量测定试剂条的制备
(1)聚集诱导发光荧光纳米微球标记抗体的制备
取100mg粒径为100nm羧基修饰的纳米微球(其固含量为1％)15000rpm离心10min，1mL偶联缓冲液重悬。按1:10的摩尔比加入EDC和NHS，涡旋震荡后室温孵育20-30min，15000rpm离心10min。加入偶联缓冲液重悬微球，加入30μg***抗体或羊抗兔IgG，混匀后室温反应2h，12000rpm离心10min去除上清，加入1mL封闭缓冲液(含0.1％的BSA和0.4％的甘氨酸的水溶液)，混匀后室温反应1h，用封闭缓冲液离心洗涤3次后，用pH＝7.4的20mMPBS(含0.2％的BSA和0.1％的海藻糖)重悬沉淀，将制备的微球修饰抗体溶液于2-8℃备用；
(2)结合垫制备
将结合垫用pH＝7.4的20mM Tris-HCl(含0.1％的海藻糖、0.2％的BSA、0.02％的Tween-20)浸泡2h，37℃烘干16h备用。将微球修饰的***抗体和羊抗兔IgG按照稀释浓度进行稀释，***抗体稀释浓度为5％，羊抗兔IgG稀释浓度为3％。混匀后用划膜喷金仪进行喷膜，参数为4μL/cm，完成后置于湿度≤35％，温度为37℃的烘箱中干燥16h，干燥后密封室温(10-30℃)储存备用；
(3)包被膜制备
用pH＝7.4的20mM PBS包被缓冲液(含0.2％的BSA，0.5％的海藻糖)将***半抗原-BSA复合物和兔IgG分别稀释后进行划线，检测线为***半抗原-BSA复合物，划线浓度为0.5mg/mL，划线用量为0.5μL/cm；质控线为兔IgG，划线浓度为0.5mg/mL，划线用量为0.5μL/cm。完成后将包被膜置于湿度≤35％，温度为37℃的烘箱中干燥16h，干燥后密封室温(10-30℃)储存备用；
(4)试纸条组装
同实施例1中的步骤(4)。
实施例5
毛发中***快速定量测定试剂条的制备
(1)聚集诱导发光荧光纳米微球标记抗体的制备
取100mg粒径为400nm的羧基修饰的纳米微球(其固含量为1％)15000rpm离心10min，1mL偶联缓冲液重悬。按1:50的摩尔比加入EDC和NHS，涡旋震荡后室温孵育30min，15000rpm离心10min。加入偶联缓冲液重悬微球，加入150μg***抗体或羊抗兔IgG，混匀后室温反应4h，12000rpm离心10min去除上清，加入1mL封闭缓冲液(含0.2％的BSA和0.3％的甘氨酸的水溶液)，混匀后室温反应2h，用封闭缓冲液离心洗涤3次后，用pH＝7.4的20mMPBS(含1％的BSA和5％的海藻糖)重悬沉淀，将制备的微球标记抗体溶液于2-8℃备用；
(2)结合垫制备
将结合垫用pH＝7.4的50mM Tris-HCl(含5％的海藻糖、1％的BSA、1％的Tween-20)浸泡2h，37℃烘干24h备用。将微球修饰的***抗体和羊抗兔IgG按照稀释浓度进行稀释，***抗体稀释浓度为20％，羊抗兔IgG稀释浓度为10％。混匀后用划膜喷金仪进行喷膜，参数为4μL/cm，完成后置于湿度≤35％，温度为37℃的烘箱中干燥24h，干燥后密封室温(10-30℃)储存备用；
(3)包被膜制备
用pH＝7.4的20mM PBS包被缓冲液(含1％的BSA，5％的海藻糖)将***半抗原-BSA复合物和兔IgG分别稀释后进行划线，检测线为***半抗原-BSA复合物，划线浓度为2.0mg/mL，划线用量为1.0μL/cm；质控线为兔IgG，划线浓度为1.0mg/mL，划线用量为1.0μL/cm。完成后将包被膜置于湿度≤35％，温度为37℃的烘箱中干燥24h，干燥后密封室温(10-30℃)储存备用；
(4)试纸条组装
同实施例1中的步骤(4)。
实施例6
毛发中***快速定量测定试剂条的制备
(1)聚集诱导发光荧光纳米微球标记抗体的制备
取100mg粒径为200nm羧基修饰的纳米微球(其固含量为1％)15000rpm离心10min，1mL偶联缓冲液重悬。按1:20的摩尔比加入EDC和NHS，涡旋震荡后室温孵育30min，15000rpm离心10min。加入偶联缓冲液重悬微球，加入120μg***抗体或60μg羊抗兔IgG，混匀后室温反应2h，12000rpm离心10min去除上清，加入1mL封闭缓冲液(含0.2％的BSA和0.4％的甘氨酸的水溶液)，混匀后室温反应1h，用封闭缓冲液离心洗涤3次后，用pH＝7.4的20mM PBS(含0.5％的BSA和2％的海藻糖)重悬沉淀，将制备的微球修饰抗体溶液于2-8℃备用；
(2)结合垫制备
将结合垫用pH＝7.4的20mM Tris-HCl(含2％的海藻糖、0.5％的BSA、0.05％的Tween-20)浸泡2h，37℃烘干24h备用。将微球修饰的***抗体和羊抗兔IgG按照稀释浓度进行稀释，***抗体稀释浓度为10％，羊抗兔IgG稀释浓度为5％。混匀后用划膜喷金仪进行喷膜，参数为4μL/cm，完成后置于湿度≤35％，温度为37℃的烘箱中干燥24h，干燥后密封室温(10-30℃)储存备用；
(3)包被膜制备
用pH＝7.4的20mM PBS包被缓冲液(含0.5％的BSA，2％的海藻糖)将***半抗原-BSA复合物和兔IgG分别稀释后进行划线，检测线为***半抗原-BSA复合物，划线浓度为2.0mg/mL，划线用量为1.0μL/cm；质控线为兔IgG，划线浓度为1.0mg/mL，划线用量为1.0μL/cm。完成后将包被膜置于湿度≤35％，温度为37℃的烘箱中干燥24h，干燥后密封室温(10-30℃)储存备用；
(4)试纸条组装
同实施例1中的步骤(4)。
实施例7
***标准曲线的绘制
如图5，采集一定量的阴性毛发进行处理，进行加标样本的标准曲线制备：(1)取定值为1ug/mL的***标准品，使用毛发裂解液(20mM的PB缓冲液、5ug/mL的蛋白水解酶K、85mM的NaCl、0.05％的Proclin300、0.05％的TritonX-100，pH＝7.4)稀释成浓度分别为500ng/mL、200ng/mL、100ng/mL、20ng/mL、5ng/mL、1ng/mL的标准浓度溶液；
(2)取约10mg的毛发(发根端长度约3cm)，用剪刀剪成约1-2mm小段，加入500uL(1)中配置的标准浓度溶液，取等量毛发裂解液进行处理作为阴性样本，将以上混合物充分混匀、充分物理粉碎并裂解5min，静置，提取其上清液作为待测样本；
(2)开启干式免疫荧光分析仪；
(3)取85μL待测样本滴加在实施例4检测卡的加样孔中，将检测卡***干式免疫荧光分析仪中，等待10min，点击快速测试；
(4)对浓度和信号值绘制标准曲线，导入ID卡。
实施例8
***标准曲线的绘制
如图5，采集一定量的阴性毛发进行处理，进行加标样本的标准曲线制备：
(1)取定值为1ug/mL的***标准品，使用毛发裂解液(20mM的Tris缓冲液、5ug/mL的蛋白水解酶K、100mM的NaCl、0.05％的Proclin300、0.05％TritonX-100，pH＝8.0)稀释成浓度分别为500ng/mL、200ng/mL、100ng/mL、20ng/mL、5ng/mL、1ng/mL的标准浓度溶液；
(2)取约10mg的毛发(发根端长度约3cm)，用剪刀剪成约1-2mm小段，加入500uL(1)中配置的标准浓度溶液，取等量毛发裂解液进行处理作为阴性样本，将以上混合物充分混匀、充分物理粉碎并裂解5min，静置，提取其上清液作为待测样本；
(2)开启干式免疫荧光分析仪；
(3)取85μL待测样本滴加在实施例4(或其他实施例的)检测卡的加样孔中，将检测卡***干式免疫荧光分析仪中，等待10min，点击快速测试；
(4)对浓度和信号值绘制标准曲线，导入ID卡。
实施例9
***快速定量测定试剂盒的测试
如图5所示，实现毛发中***含量的快速测定，其步骤如下：
(1)取约10mg的毛发(发根端长度约3cm)，用剪刀剪成约1～2mm小段，加入500uL毛发裂解液(20mM的Tris缓冲液、10ug/mL的蛋白水解酶K、150mM的NaCl、0.05％的Proclin300、0.05％的TritonX-100，pH＝8.0)中，充分混匀并裂解5min，静置，提取其上清液作为待测样本；
(2)开启干式免疫荧光分析仪，***如实施例8中绘制的相关检测项目的ID卡，导入标准曲线；
(3)取85μL待测样本滴加在实施例4检测卡的加样孔中，将检测卡***干式免疫荧光分析仪中，等待10min，点击快速测试；
(4)显示测试结果。
20例阳性毛发样本的金标分析方法色谱法和试纸条测试结果如下：
Figure BDA0003134434660000171
图6为上述检测结果的一致性分析图。
结果表明，将试纸条测试结果和色谱法进行对比，在0-5ng/mL的低值区，结果相对偏差≦25％，在5-20ng/mL的中值区，相对偏差≦15％，在20-100ng/mL的高值区，相对偏差≦10％。综合评价两种方法的检测结果一致性较好，说明本发明提供的一种毛发中毒品定量测定方法误差小，效率高，结果准确。
实施例10
***快速定量测定试剂盒的测试
使用实施例1制备的检测卡和实施例7中绘制的标准曲线，其他同实施例9的步骤(1)、(2)、(3)、(4)。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种毛发中毒品定量测定试纸条，其特征在于，所述试纸条包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸和底板；
所述结合垫喷涂了聚集诱导发光荧光纳米微球修饰的检测抗体和质控蛋白兔免疫球蛋白G；
所述硝酸纤维素膜设置了检测线和质控线，分别包被毒品完全抗原和羊抗兔IgG；
所述吸水纸用于吸收未反应的纳米微球、修饰抗体和待测液；
所述样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸是按照以样本垫为起始位置的横向层析方向，依次相互交叠固定于底板上。
2.根据权利要求1所述的一种毛发中毒品定量测定试纸条，其特征在于，所述聚集诱导发光荧光纳米微球是由聚苯乙烯包裹、包埋具有聚集诱导发光材料分子的纳米微球，所述聚集诱导发光荧光纳米微球的表面由羧基修饰，粒径为100-500nm，激发波长为300-500nm，发射波长为400-650nm。
3.根据权利要求1所述的一种毛发中毒品定量测定试纸条，其特征在于，
所述检测抗体为单克隆抗体；
所述毒品完全抗原为毒品分子和载体蛋白的偶联复合物，其中载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清蛋白、钥孔血蓝蛋白、人血清白蛋白、兔血清白蛋白中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的一种毛发中毒品定量测定试纸条，其特征在于，
所述结合垫选自玻璃纤维素膜或聚酯膜；
所述底板选自聚氯乙烯材料或其他硬质且不吸水的材料；
所述硝酸纤维素膜，从所述样品垫端至吸水纸一端，依次是检测线及质控线；所述检测线及质控线间隔距离是3-10mm。
5.权利要求1-4任一项所述的毛发中毒品定量测定试纸条的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、抗体标记：采用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺活化后的聚集诱导发光荧光纳米微球，对检测抗体和质控蛋白兔IgG进行标记，加入BSA溶液进行封闭，离心复溶后得到聚集诱导发光荧光纳米微球修饰的检测抗体和兔IgG；
S2、结合垫制备：将纳米微球修饰的检测抗体和兔IgG喷涂于结合垫上，30-50℃烘干；
S3、包被膜制备：在硝酸纤维素膜的检测线T线位置包被毒品完全抗原，所述毒品完全抗原浓度为1.0-3.0mg/mL，在质控线C线位置包被羊抗兔IgG，所述羊抗兔IgG浓度为0.5-2.4mg/mL，30-50℃烘干；
S4、试纸条组装：在粘贴有硝酸纤维素膜的底板上依次搭接结合垫、样品垫和吸水纸组装成大板，用切条机切成3-5mm宽的试纸条。
6.一种毛发中毒品定量测定试剂盒，其特征在于，包括试纸条和毛发裂解液；所述试纸条为权利要求1-4任一项所述的毛发中毒品定量测定试纸条；所述毛发裂解液用于将毒品分子从毛发结构中释放，并使其分子结构处于稳定形态。
7.根据权利要求6所述的毛发中毒品定量测定试剂盒，其特征在于，所述毛发裂解液的成分包括：缓冲液、表面活性剂、角蛋白水解酶、防腐剂以及氯化钠。
8.根据权利要求7所述的毛发中毒品定量测定试剂盒，其特征在于：
所述表面活性剂为TritonX-100、PEG4000、PVP-K30、EDTA二钠、Tween-20、S9、CTAB、S16中的一种或多种；
所述缓冲液为PB、Tris-HCl中的一种；
所述角蛋白水解酶为蛋白水解酶K、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶中的一种或多种；
所述防腐剂为Proclin-300；
所述氯化钠的作用是维持溶液的离子平衡；
所述毛发裂解液中角蛋白水解酶的总浓度为3-20μg/mL，氯化钠的质量浓度为50-250mM，防腐剂的质量浓度为0.05-3％，所述表面活性剂的总质量浓度为0.05-3％；所述毛发裂解液中的缓冲液浓度为10-200mM；所述毛发裂解液的pH为6-8。
9.权利要求1-4任一项所述的毛发中毒品定量测定试纸条在定量测定毛发中毒品中的应用，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将毛发和毛发裂解液以1：50-200的质量比进行混合，通过物理粉碎，混匀并孵育，使毛发中毒品分子释放，提取其上清液作为待测样本；
(2)开启干式免疫荧光分析仪，将ID卡***，导入标准曲线；
(3)将所述试纸条装入检测卡中，将待测样本滴加在检测卡的加样孔中，再将检测卡***干式免疫荧光分析仪中，等待10-15min，进行测试；
(4)得到检测结果。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，步骤(1)-(4)的检测时间为15-20min；所述检测结果的检测限＜1ng/mL，线性范围为2-1000ng/mL，其线性系数r≥0.9900，重复性的变异系数≤15％，准确度的相对偏差在±15％范围内。
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