CN113637804A - 一种基于rt-pcr技术检测rb-n1基因型柑橘衰退病毒用试剂盒及其检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种基于RT‑PCR技术检测RB‑N1基因型柑橘衰退病毒用试剂盒及其检测方法，属于植物病理学技术领域。本发明针对前期研究中分离的RB‑N1基因型柑橘衰退病毒设计一对特异性强的引物对，并建立了一种基于RT‑PCR技术检测RB‑N1基因型柑橘衰退病毒的检测试剂盒。采用所述试剂盒检测RB‑N1基因型柑橘衰退病毒，具有操作简单快速、高效、检测结果重复性好、检测灵敏度高的特点，为更好的研究CTV分离株的RB‑N1基因型在全国的发生情况提供了一个强有力的技术支撑。

Description

一种基于RT-PCR技术检测RB-N1基因型柑橘衰退病毒用试剂 盒及其检测方法

技术领域

本发明属于植物病理学技术领域，具体涉及一种基于RT-PCR技术检测RB-N1基因型柑橘衰退病毒用试剂盒及其检测方法。

背景技术

柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus，CTV)引起的柑橘衰退病是一种极具经济重要性的病害，各柑橘产区均有发生，该病主要通过接穗和蚜虫进行扩散和传播，严重影响着柑橘的产量和品质，对全世界柑橘产业造成了严重的威胁。CTV属于长线形病毒属(Closterovirus)，病毒粒子呈11×2,000nm的长线形，基因组约19,300个核苷酸组成的正义单链RNA(+ssRNA)，是目前已知植物病毒基因组中最大的病毒。CTV存在多种基因型和复杂的株系分化现象，不同基因型的CTV分离株能引起包括茎陷点、酸橙作砧木的甜橙和葡萄柚植株快速死亡在内的多种症状。目前CTV被分为T3、VT、T30、T36、B165、RB、L1、M1、S1、HA165、T68、AT-1等10余种基因型，其中T30基因型CTV分离株为弱毒株系，T36基因型CTV分离株能引起柑橘植株的速衰症状，T3、VT、B165基因型CTV分离株主要引起苗黄症状，RB、HA基因型CTV分离株可能与茎陷点症状相关。为此，Hilf、Roy等人针对此现象设计了特异性引物并运用RT-PCR技术区分上述基因型CTV分离株，Yokomi等人根据CP基因设计的三种探针可区分T36、VT、T30基因型的CTV分离株。

申请人在前期研究中发现，CTV分离株中还存在一种新的基因型(RB-N1基因型)，RB-N1基因型的CTV分离株序列与目前报道的引起柑橘植株茎陷点症状的CTV的RB基因型分离株的序列同源性高达86.5％，因此RB-N1基因型CTV分离株对拓展研究CTV分离物基因型类型和在各柑橘产区的分布情况以及与CTV分离物引起柑橘植株症状间的相关性有重要意义。到目前为止，还没有关于CTV分离株RB-N1基因型的相关报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于RT-PCR技术检测RB-N1基因型柑橘衰退病毒用试剂盒及其检测方法，对RB-N1基因型柑橘衰退病毒具有快速、高效、特异性强和灵敏度高的检测特点。

本发明提供了一种检测RB-N1基因型柑橘衰退病毒的引物对，包括RB-N1F和RB-N1R2；

所述RB-N1F的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；

所述RB-N1R2的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明提供了一种基于RT-PCR技术检测RB-N1基因型柑橘衰退病毒用试剂盒，包括所述引物对。

优选的，所述试剂盒还包括PCR扩增用试剂和/或反转录用试剂。

优选的，所述PCR扩增用试剂包括普通PCR扩增用试剂或荧光PCR扩增用试剂；

所述荧光PCR扩增用试剂包括2×SYBR Green qPCRMix；

所述普通PCR扩增用试剂包括10×PCR-buffer、dNTPs和r-Taq酶。

优选的，所述反转录用试剂包括以下试剂中的一种或几种：解链液、5×RT-buffer、dNTPs、RNA酶抑制剂和反转录酶RTase。

本发明提供了所述引物对或所述试剂盒在检测植物感染RB-N1基因型柑橘衰退病毒中的应用。

本发明提供了一种基于RT-PCR技术检测RB-N1基因型柑橘衰退病毒感染的方法，包括以下步骤：

1)提取待检测样品的RNA；

2)将步骤1)中RNA进行反转录，得到cDNA；

3)以步骤2)中所述cDNA为模板，利用所述引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；

4)将步骤3)中所述PCR扩增产物进行片段分析，得到待测样品是否感染RB-N1基因型柑橘衰退病毒的结果。

优选的，所述PCR扩增包括普通PCR扩增和荧光PCR扩增；

所述普通PCR扩增的反应程序为：95℃预变性3分钟；95℃变性20秒，55℃退火30秒，72℃延伸45秒，35个循环；

所述荧光PCR扩增的反应程序为：95℃预变性20s；95℃5s，55℃15s，72℃20s，40个循环。

优选的，根据PCR扩增的方法进行片段分析：当采用普通PCR扩增时，所得PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，若得到的条带为524bp，表示待测样品感染RB-N1基因型柑橘衰退病毒反之则没有感染或待检测样品感染RB-N1基因型柑橘衰退病毒的浓度没有达到检测限。

优选的，当采用荧光PCR扩增时，所得PCR扩增产物进行实时荧光定量检测，所得溶解曲线在退火温度为55℃时为单一峰，说明待测样品感染RB-N1基因型柑橘衰退病毒，反之则没有感染或待检测样品感染RB-N1基因型柑橘衰退病毒的浓度没有达到检测限。

本发明提供的检测RB-N1基因型柑橘衰退病毒的引物对，包括RB-N1F和RB-N1R2；所述RB-N1F的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述RB-N1R2的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。本发明针对柑橘衰退病毒新型基因型毒株，设计一对特异性检测引物对RB-N1F/RB-N1R2，所述引物对仅针对RB-N1基因型能实现扩增，而对柑橘衰退病毒的其他基因型毒株(T36、RB、T3)均不能实现扩增，表明，所述引物对具有较高的检测特异性。

本发明提供了一种基于RT-PCR技术检测RB-N1基因型柑橘衰退病毒用试剂盒，所述试剂盒具有操作简单快速、检测过程高效等特点。采用所述试剂盒检测时，采用不同浓度cDNA进行PCR扩增，扩增曲线显示cDNA稀释梯度至1.57×10^-2ng/μL时依然可以检测目的片段，说明RB-N1引物对有较高的灵敏度。该方法组内重复检测的变异系数最大为2.21％，组间重复性检测的变异系数最大为1.91％，说明该方法具有良好的重复性。

附图说明

图1为本发明特异性引物对RB-N1F/RB-N1R2的最适退火温度筛选结果；

图2为本发明特异性引物对RB-N1F/RB-N1R2的特异性检测结果；

图3为本发明特异性引物对RB-N1F/RB-N1R2在退火温度为55℃的溶解曲线；其中蓝线代表Y10样品，红线代表Y5样品；

图4为本发明特异性引物对RB-N1F/RB-N1R2的扩增曲线；其中蓝线代表Y10样品，红线代表Y5样品；

图5为本发明特异性引物对RB-N1F/RB-N1R2检测RB-N1基因型柑橘衰退病毒的标准曲线。

具体实施方式

本发明提供了一种检测RB-N1基因型柑橘衰退病毒的引物对，包括RB-N1F和RB-N1R2；所述RB-N1F的核苷酸序列如SEQ ID NO:1(TCCTTTTACACCCGGTTTGAGACT)所示；所述RB-N1R2的核苷酸序列如SEQ ID NO:2(ACTCGTTTATAGGCGCGCTCT)所示。所述引物对的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的引物对的来源即可。在本发明实施例中，所述引物对委托金斯瑞生物科技公司合成。所述引物对针对RB-N1基因型柑橘衰退病毒扩增，所得目标片段为524bp的片段片段。所述引物对还优选在RB-N1F和RB-N1R2的序列的基础上将靠近5’端的序列替换1～7个碱基所形成的新的序列。

本发明提供了一种基于RT-PCR技术检测RB-N1基因型柑橘衰退病毒用试剂盒，包括所述引物对。

在本发明中，所述试剂盒优选还包括PCR扩增用试剂和/或反转录用试剂。所述PCR扩增用试剂优选包括普通PCR扩增用试剂或荧光PCR扩增用试剂。所述荧光PCR扩增用试剂优选包括2×SYBR Green qPCRMix。所述普通PCR扩增用试剂优选包括10×PCR-buffer、dNTPs和r-Taq酶。所述反转录用试剂优选包括以下试剂中的一种或几种：解链液、5×RT-buffer、dNTPs、RNA酶抑制剂和反转录酶RTase。本发明对所述试剂的来源不做具体限定，采用本领域所熟知的试剂种类即可。

鉴于所述引物对能够特异性扩增RB-N1基因型柑橘衰退病毒，本发明提供了所述引物对或所述试剂盒在检测植物感染RB-N1基因型柑橘衰退病毒中的应用。

本发明提供了一种基于RT-PCR技术检测RB-N1基因型柑橘衰退病毒感染的方法，包括以下步骤：

1)提取待检测样品的RNA；

2)将步骤1)中RNA进行反转录，得到cDNA；

3)以步骤2)中所述cDNA为模板，利用所述引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；

4)将步骤3)中所述PCR扩增产物进行片段分析，得到待测样品是否感染RB-N1基因型柑橘衰退病毒的结果。

本发明提取待检测样品的RNA。

本发明对提取RNA的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的提取RNA的方法即可，例如，采用试剂盒法或TRIzol法提取。

RNA提取结束后，本发明将RNA进行反转录，得到cDNA。

本发明对所述反转录的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的反转录方法即可。

得到cDNA后，本发明以所述cDNA为模板，利用所述引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

在本发明中，所述PCR扩增优选包括普通PCR扩增和荧光PCR扩增。所述普通PCR扩增的反应程序为：95℃预变性3分钟；95℃变性20秒，55℃退火30秒，72℃延伸45秒，35个循环。所述普通PCR扩增的反应体系为25μL，其中无RNase超纯水16.1μL，10×PCR-buffer4.5μL，浓度为2.5mM/L的dNTPs 2μL，浓度为10μmol/L的引物RB-N1F和RB-N1R2各0.5μL，r-Taq酶0.4μL。所述荧光PCR扩增的反应程序为：95℃预变性20s；95℃5s，55℃15s，72℃20s，40个循环。所述荧光PCR扩增的反应体系为10μL，其中2×SYBR Green qPCR Mix(TAKARA，日本)5μL、10μmol/L正反向引物RB-N1F和RB-N1R2各0.5μL，cDNA模板1μL和ddH₂O 3μL。

得到PCR扩增产物后，本发明将所述PCR扩增产物进行片段分析，得到待测样品是否感染RB-N1基因型柑橘衰退病毒的结果。

在本发明中，根据PCR扩增的方法进行片段分析：当采用普通PCR扩增时，所得PCR扩增产物优选进行琼脂糖凝胶电泳，若得到的条带为524bp，表示待测样品感染RB-N1基因型柑橘衰退病毒反之则没有感染或待检测样品感染RB-N1基因型柑橘衰退病毒的浓度没有达到检测限。当采用荧光PCR扩增时，所得PCR扩增产物优选进行实时荧光定量检测。在实时荧光定量检测时熔解曲线分析条件优选如下：65℃～95℃，每升高0.5℃检测1次荧光信号。所得溶解曲线在退火温度为55℃时为单一峰，说明待测样品感染RB-N1基因型柑橘衰退病毒，反之则没有感染或待检测样品感染RB-N1基因型柑橘衰退病毒的浓度没有达到检测限。通过计算组内组间的变异系数以及标准曲线的相关系数可知，本发明提供的检测方法具有较好的组内、组间重复性，同时具有较理想的引物重复性。阳性标准品梯度浓度检测结果表明，cDNA稀释梯度为10^-4时依然可以检测目的片段，说明RB-N1引物对有较高的灵敏度。

下面结合实施例对本发明提供的一种基于RT-PCR技术检测RB-N1基因型柑橘衰退病毒用试剂盒及其检测方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

待测柑橘植株的总RNA的提取方法，按照如下步骤操作：

1)取0.1g柑橘叶片，液氮充分研磨后加入预先放置1ml Trizol溶液(Invitrogen，美国)的1.5ml的离心管中，剧烈振荡混匀后室温放置10分钟，将离心管在12900rpm，4℃下离心10分钟。

2)取上清液1ml置于新的1.5ml的离心管中，加入200μL氯仿，震荡混匀，4℃放置10分钟后12900rpm，4℃下离心5分钟。

3)取步骤2离心后的上清液(只取最上一层)置于新的1.5ml的离心管中，加入等体积的异丙醇，轻轻颠倒混匀后放置-20℃沉降2小时以上。

4)将步骤3中离心管在12000rpm，4℃离心10分钟，弃上清液后加入1ml75％乙醇颠倒混匀，在8000rpm，4℃下离心3min，弃上清液；再离心15s用枪头吸弃上清液，重复2次。

5)将步骤4中含有RNA沉淀的离心管置于通风橱中室温干燥2～3min，加入30μLDEPC水溶解RNA。

实施例2

建立RT-PCR检测体系，按照如下步骤操作：

1)以实施例1所提取的RNA为模板，利用RB-N1基因型的特异性引物RB-N1R2进行反转录反应，得到反转录产物cDNA。

2)反转录反应进行前需要解链反应：1μLRNA反应模板和2μL无RNase超纯水在65℃解链10分钟后加入反转录体系混合液进行反转录反应。反应体系为5.5μL，其中，解链液3μL、5×RT-buffer 1μL、浓度为2.5mM/L的dNTPs 0.5μL、浓度为10μmol/L的引物RB-N1R20.25μL、浓度为30U/L的RNA酶抑制剂RNasin 0.125μL、浓度为100U/μL的反转录酶RTase 0.125μL；反应程序为：30℃反应10分钟，42℃反转录40分钟，70℃加热5分钟。

3)以步骤1)得到的反转录产物cDNA为模板，用引物RB-N1F和RB-N1R2进行RT-PCR反应，反应体系为25μL，其中无RNase超纯水16.1μL、10×PCR-buffer 4.5μL、浓度为2.5mM/L的dNTPs 2μL、浓度为10μmol/L的引物RB-N1F和RB-N1R2各0.5μL、r-Taq酶0.4μL、反转录产物cDNA模板1μL；PCR扩增程序为：95℃预变性3分钟，95℃变性20秒，55℃(或者55.6℃、56.4℃和57℃)退火30秒，72℃延伸45秒，35个循环。所述引物RB-N1F和RB-N1R2序列如下：RB-N1F：TCCTTTTACACCCGGTTTGAGACT(SEQ ID NO:1)，RB-N1R2：ACTCGTTTATAGGCGCGCTCT(SEQID NO:2)。得到PCR扩增目的片段。

如图1所示，退火温度为55℃时仅见单一且大小与目的条带相符的条带。

4)采用上述步骤1)和2)同时对柑橘衰退病毒T36、RB、T3基因型用引物RB-N1F和RB-N1R2进行RT-PCR检测。

如图2所示，只有RB-N1基因型出现扩增，T36、RB、T3均未出现扩增。说明该引物对的特异性好。

实施例3

RB-N1引物对的溶解曲线和扩增曲线的建立，按照如下步骤操作：

1)以实例1得到的反转录cDNA模板，按10倍梯度稀释共5个梯度(10⁰～10^-5)作为cDNA模板，每个梯度浓度设置3个重复，作为组间重复；且每个重复检测3次，作为组内重复。PCR扩增的反应体系10μL，其中2×SYBR Green qPCR Mix(TAKARA，日本)5μL、10μmol/L正反向引物RB-N1F和RB-N1R2各0.5μL，cDNA模板1μL和ddH₂O 3μL；荧光定量PCR扩增条件：95℃预变性20s，95℃5s，55℃15s，72℃20s，40个循环。

2)步骤1)的PCR程序结束后仪器自动进行实时荧光定量检测，得到熔解曲线和扩增曲线。熔解曲线分析：65℃～95℃，每升高0.5℃检测1次荧光信号。

得到退火温度为55℃的融解曲线，如图3所示，在退火温度为55℃时仅见单一峰。

从扩增曲线分析可知：cDNA模板浓度梯度从左到右依次是1.57×10²ng/μL～1.57×10^-2ng/μL，每个梯度浓度设置3个重复，作为组间重复；且每个重复检测3次，作为组内重复。

用下列公式计算Ct平均值、标准差(SD)和变异系数(CV)。

组内Ct平均值＝组内Ct值之和/3 公式I；

组间Ct平均值＝组内Ct平均值之和/2 公式II；

变异系数(CV)＝标准差(SD)/Ct平均值 公式IV。

结果如表1所示，扩增曲线及统计学分析结果表明，各梯度组内重复检测的变异系数最大为2.21％，表明该方法具有较好的组内重复性。而进行的组间重复性试验结果显示，各梯度的变异系数最大为1.96％，表明该方法具有较好的组间重复性。

表1不同稀释梯度cDNA重复检测结果分析表

表2实验样品信息

样品编号	CTV基因型	cDNA原始浓度	cDNA稀释浓度
				Y5	RB-N1	1.57×10<sup>2</sup>ng/μL(a)	a×10<sup>0</sup>～a×10<sup>-4</sup>
Y10	RB-N1	2.3×10<sup>2</sup>ng/μL(b)	b×10<sup>0</sup>～b×10<sup>-4</sup>

从标准曲线可知：如图5该曲线的相关系数R²为0.9948，同样说明该引物的重复性较好。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 赣南师范大学

<120> 一种基于RT-PCR技术检测RB-N1基因型柑橘衰退病毒用试剂盒及其检测方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tccttttaca cccggtttga gact 24

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

actcgtttat aggcgcgctc t 21

Claims (10)

1.一种检测RB-N1基因型柑橘衰退病毒的引物对，其特征在于，包括RB-N1F和RB-N1R2；

所述RB-N1F的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；

所述RB-N1R2的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

2.一种基于RT-PCR技术检测RB-N1基因型柑橘衰退病毒用试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述引物对。

3.根据权利要求2所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PCR扩增用试剂和/或反转录用试剂。

4.根据权利要求3所述试剂盒，其特征在于，所述PCR扩增用试剂包括普通PCR扩增用试剂或荧光PCR扩增用试剂；

所述荧光PCR扩增用试剂包括2×SYBRGreenqPCRMix；

所述普通PCR扩增用试剂包括10×PCR-buffer、dNTPs和r-Taq酶。

5.根据权利要求3所述试剂盒，其特征在于，所述反转录用试剂包括以下试剂中的一种或几种：解链液、5×RT-buffer、dNTPs、RNA酶抑制剂和反转录酶RTase。

6.权利要求1所述引物对或权利要求2～5任意一项所述试剂盒在检测柑橘植株感染RB-N1基因型柑橘衰退病毒中的应用。

7.一种基于RT-PCR技术检测RB-N1基因型柑橘衰退病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)提取待检测样品的RNA；

2)将步骤1)中RNA进行反转录，得到cDNA；

3)以步骤2)中所述cDNA为模板，利用权利要求1所述引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；

4)将步骤3)中所述PCR扩增产物进行片段分析，得到待测样品是否感染RB-N1基因型柑橘衰退病毒的结果。

8.根据权利要求7所述方法，其特征在于，所述PCR扩增包括普通PCR扩增和荧光PCR扩增；

所述普通PCR扩增的反应程序为：95℃预变性3分钟；95℃变性20秒，55℃退火30秒，72℃延伸45秒，35个循环；

所述荧光PCR扩增的反应程序为：95℃预变性20s；95℃5s，55℃15s，72℃20s，40个循环。

9.根据权利要求8所述方法，其特征在于，根据PCR扩增的方法进行片段分析：当采用普通PCR扩增时，所得PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，若得到的条带为524bp，表示待测样品感染RB-N1基因型柑橘衰退病毒反之则没有感染或待检测样品感染RB-N1基因型柑橘衰退病毒的浓度没有达到检测限。

10.根据权利要求8所述方法，其特征在于，当采用荧光PCR扩增时，所得PCR扩增产物进行实时荧光定量检测，所得溶解曲线在退火温度为55℃时为单一峰，说明待测样品感染RB-N1基因型柑橘衰退病毒，反之则没有感染或待检测样品感染RB-N1基因型柑橘衰退病毒的浓度没有达到检测限。

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