CN113637804A - 一种基于rt-pcr技术检测rb-n1基因型柑橘衰退病毒用试剂盒及其检测方法 - Google Patents
一种基于rt-pcr技术检测rb-n1基因型柑橘衰退病毒用试剂盒及其检测方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113637804A CN113637804A CN202111085900.7A CN202111085900A CN113637804A CN 113637804 A CN113637804 A CN 113637804A CN 202111085900 A CN202111085900 A CN 202111085900A CN 113637804 A CN113637804 A CN 113637804A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- pcr amplification
- genotype
- tristeza virus
- citrus tristeza
- kit
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Virology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供了一种基于RT‑PCR技术检测RB‑N1基因型柑橘衰退病毒用试剂盒及其检测方法,属于植物病理学技术领域。本发明针对前期研究中分离的RB‑N1基因型柑橘衰退病毒设计一对特异性强的引物对,并建立了一种基于RT‑PCR技术检测RB‑N1基因型柑橘衰退病毒的检测试剂盒。采用所述试剂盒检测RB‑N1基因型柑橘衰退病毒,具有操作简单快速、高效、检测结果重复性好、检测灵敏度高的特点,为更好的研究CTV分离株的RB‑N1基因型在全国的发生情况提供了一个强有力的技术支撑。
Description
技术领域
本发明属于植物病理学技术领域,具体涉及一种基于RT-PCR技术检测RB-N1基因型柑橘衰退病毒用试剂盒及其检测方法。
背景技术
柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus,CTV)引起的柑橘衰退病是一种极具经济重要性的病害,各柑橘产区均有发生,该病主要通过接穗和蚜虫进行扩散和传播,严重影响着柑橘的产量和品质,对全世界柑橘产业造成了严重的威胁。CTV属于长线形病毒属(Closterovirus),病毒粒子呈11×2,000nm的长线形,基因组约19,300个核苷酸组成的正义单链RNA(+ssRNA),是目前已知植物病毒基因组中最大的病毒。CTV存在多种基因型和复杂的株系分化现象,不同基因型的CTV分离株能引起包括茎陷点、酸橙作砧木的甜橙和葡萄柚植株快速死亡在内的多种症状。目前CTV被分为T3、VT、T30、T36、B165、RB、L1、M1、S1、HA165、T68、AT-1等10余种基因型,其中T30基因型CTV分离株为弱毒株系,T36基因型CTV分离株能引起柑橘植株的速衰症状,T3、VT、B165基因型CTV分离株主要引起苗黄症状,RB、HA基因型CTV分离株可能与茎陷点症状相关。为此,Hilf、Roy等人针对此现象设计了特异性引物并运用RT-PCR技术区分上述基因型CTV分离株,Yokomi等人根据CP基因设计的三种探针可区分T36、VT、T30基因型的CTV分离株。
申请人在前期研究中发现,CTV分离株中还存在一种新的基因型(RB-N1基因型),RB-N1基因型的CTV分离株序列与目前报道的引起柑橘植株茎陷点症状的CTV的RB基因型分离株的序列同源性高达86.5%,因此RB-N1基因型CTV分离株对拓展研究CTV分离物基因型类型和在各柑橘产区的分布情况以及与CTV分离物引起柑橘植株症状间的相关性有重要意义。到目前为止,还没有关于CTV分离株RB-N1基因型的相关报道。
发明内容
有鉴于此,本发明的目的在于提供一种基于RT-PCR技术检测RB-N1基因型柑橘衰退病毒用试剂盒及其检测方法,对RB-N1基因型柑橘衰退病毒具有快速、高效、特异性强和灵敏度高的检测特点。
本发明提供了一种检测RB-N1基因型柑橘衰退病毒的引物对,包括RB-N1F和RB-N1R2;
所述RB-N1F的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示;
所述RB-N1R2的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
本发明提供了一种基于RT-PCR技术检测RB-N1基因型柑橘衰退病毒用试剂盒,包括所述引物对。
优选的,所述试剂盒还包括PCR扩增用试剂和/或反转录用试剂。
优选的,所述PCR扩增用试剂包括普通PCR扩增用试剂或荧光PCR扩增用试剂;
所述荧光PCR扩增用试剂包括2×SYBR Green qPCRMix;
所述普通PCR扩增用试剂包括10×PCR-buffer、dNTPs和r-Taq酶。
优选的,所述反转录用试剂包括以下试剂中的一种或几种:解链液、5×RT-buffer、dNTPs、RNA酶抑制剂和反转录酶RTase。
本发明提供了所述引物对或所述试剂盒在检测植物感染RB-N1基因型柑橘衰退病毒中的应用。
本发明提供了一种基于RT-PCR技术检测RB-N1基因型柑橘衰退病毒感染的方法,包括以下步骤:
1)提取待检测样品的RNA;
2)将步骤1)中RNA进行反转录,得到cDNA;
3)以步骤2)中所述cDNA为模板,利用所述引物对进行PCR扩增,得到PCR扩增产物;
4)将步骤3)中所述PCR扩增产物进行片段分析,得到待测样品是否感染RB-N1基因型柑橘衰退病毒的结果。
优选的,所述PCR扩增包括普通PCR扩增和荧光PCR扩增;
所述普通PCR扩增的反应程序为:95℃预变性3分钟;95℃变性20秒,55℃退火30秒,72℃延伸45秒,35个循环;
所述荧光PCR扩增的反应程序为:95℃预变性20s;95℃5s,55℃15s,72℃20s,40个循环。
优选的,根据PCR扩增的方法进行片段分析:当采用普通PCR扩增时,所得PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳,若得到的条带为524bp,表示待测样品感染RB-N1基因型柑橘衰退病毒反之则没有感染或待检测样品感染RB-N1基因型柑橘衰退病毒的浓度没有达到检测限。
优选的,当采用荧光PCR扩增时,所得PCR扩增产物进行实时荧光定量检测,所得溶解曲线在退火温度为55℃时为单一峰,说明待测样品感染RB-N1基因型柑橘衰退病毒,反之则没有感染或待检测样品感染RB-N1基因型柑橘衰退病毒的浓度没有达到检测限。
本发明提供的检测RB-N1基因型柑橘衰退病毒的引物对,包括RB-N1F和RB-N1R2;所述RB-N1F的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示;所述RB-N1R2的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。本发明针对柑橘衰退病毒新型基因型毒株,设计一对特异性检测引物对RB-N1F/RB-N1R2,所述引物对仅针对RB-N1基因型能实现扩增,而对柑橘衰退病毒的其他基因型毒株(T36、RB、T3)均不能实现扩增,表明,所述引物对具有较高的检测特异性。
本发明提供了一种基于RT-PCR技术检测RB-N1基因型柑橘衰退病毒用试剂盒,所述试剂盒具有操作简单快速、检测过程高效等特点。采用所述试剂盒检测时,采用不同浓度cDNA进行PCR扩增,扩增曲线显示cDNA稀释梯度至1.57×10-2ng/μL时依然可以检测目的片段,说明RB-N1引物对有较高的灵敏度。该方法组内重复检测的变异系数最大为2.21%,组间重复性检测的变异系数最大为1.91%,说明该方法具有良好的重复性。
附图说明
图1为本发明特异性引物对RB-N1F/RB-N1R2的最适退火温度筛选结果;
图2为本发明特异性引物对RB-N1F/RB-N1R2的特异性检测结果;
图3为本发明特异性引物对RB-N1F/RB-N1R2在退火温度为55℃的溶解曲线;其中蓝线代表Y10样品,红线代表Y5样品;
图4为本发明特异性引物对RB-N1F/RB-N1R2的扩增曲线;其中蓝线代表Y10样品,红线代表Y5样品;
图5为本发明特异性引物对RB-N1F/RB-N1R2检测RB-N1基因型柑橘衰退病毒的标准曲线。
具体实施方式
本发明提供了一种检测RB-N1基因型柑橘衰退病毒的引物对,包括RB-N1F和RB-N1R2;所述RB-N1F的核苷酸序列如SEQ ID NO:1(TCCTTTTACACCCGGTTTGAGACT)所示;所述RB-N1R2的核苷酸序列如SEQ ID NO:2(ACTCGTTTATAGGCGCGCTCT)所示。所述引物对的来源没有特殊限制,采用本领域所熟知的引物对的来源即可。在本发明实施例中,所述引物对委托金斯瑞生物科技公司合成。所述引物对针对RB-N1基因型柑橘衰退病毒扩增,所得目标片段为524bp的片段片段。所述引物对还优选在RB-N1F和RB-N1R2的序列的基础上将靠近5’端的序列替换1~7个碱基所形成的新的序列。
本发明提供了一种基于RT-PCR技术检测RB-N1基因型柑橘衰退病毒用试剂盒,包括所述引物对。
在本发明中,所述试剂盒优选还包括PCR扩增用试剂和/或反转录用试剂。所述PCR扩增用试剂优选包括普通PCR扩增用试剂或荧光PCR扩增用试剂。所述荧光PCR扩增用试剂优选包括2×SYBR Green qPCRMix。所述普通PCR扩增用试剂优选包括10×PCR-buffer、dNTPs和r-Taq酶。所述反转录用试剂优选包括以下试剂中的一种或几种:解链液、5×RT-buffer、dNTPs、RNA酶抑制剂和反转录酶RTase。本发明对所述试剂的来源不做具体限定,采用本领域所熟知的试剂种类即可。
鉴于所述引物对能够特异性扩增RB-N1基因型柑橘衰退病毒,本发明提供了所述引物对或所述试剂盒在检测植物感染RB-N1基因型柑橘衰退病毒中的应用。
本发明提供了一种基于RT-PCR技术检测RB-N1基因型柑橘衰退病毒感染的方法,包括以下步骤:
1)提取待检测样品的RNA;
2)将步骤1)中RNA进行反转录,得到cDNA;
3)以步骤2)中所述cDNA为模板,利用所述引物对进行PCR扩增,得到PCR扩增产物;
4)将步骤3)中所述PCR扩增产物进行片段分析,得到待测样品是否感染RB-N1基因型柑橘衰退病毒的结果。
本发明提取待检测样品的RNA。
本发明对提取RNA的方法没有特殊限制,采用本领域所熟知的提取RNA的方法即可,例如,采用试剂盒法或TRIzol法提取。
RNA提取结束后,本发明将RNA进行反转录,得到cDNA。
本发明对所述反转录的方法没有特殊限制,采用本领域所熟知的反转录方法即可。
得到cDNA后,本发明以所述cDNA为模板,利用所述引物对进行PCR扩增,得到PCR扩增产物。
在本发明中,所述PCR扩增优选包括普通PCR扩增和荧光PCR扩增。所述普通PCR扩增的反应程序为:95℃预变性3分钟;95℃变性20秒,55℃退火30秒,72℃延伸45秒,35个循环。所述普通PCR扩增的反应体系为25μL,其中无RNase超纯水16.1μL,10×PCR-buffer4.5μL,浓度为2.5mM/L的dNTPs 2μL,浓度为10μmol/L的引物RB-N1F和RB-N1R2各0.5μL,r-Taq酶0.4μL。所述荧光PCR扩增的反应程序为:95℃预变性20s;95℃5s,55℃15s,72℃20s,40个循环。所述荧光PCR扩增的反应体系为10μL,其中2×SYBR Green qPCR Mix(TAKARA,日本)5μL、10μmol/L正反向引物RB-N1F和RB-N1R2各0.5μL,cDNA模板1μL和ddH2O 3μL。
得到PCR扩增产物后,本发明将所述PCR扩增产物进行片段分析,得到待测样品是否感染RB-N1基因型柑橘衰退病毒的结果。
在本发明中,根据PCR扩增的方法进行片段分析:当采用普通PCR扩增时,所得PCR扩增产物优选进行琼脂糖凝胶电泳,若得到的条带为524bp,表示待测样品感染RB-N1基因型柑橘衰退病毒反之则没有感染或待检测样品感染RB-N1基因型柑橘衰退病毒的浓度没有达到检测限。当采用荧光PCR扩增时,所得PCR扩增产物优选进行实时荧光定量检测。在实时荧光定量检测时熔解曲线分析条件优选如下:65℃~95℃,每升高0.5℃检测1次荧光信号。所得溶解曲线在退火温度为55℃时为单一峰,说明待测样品感染RB-N1基因型柑橘衰退病毒,反之则没有感染或待检测样品感染RB-N1基因型柑橘衰退病毒的浓度没有达到检测限。通过计算组内组间的变异系数以及标准曲线的相关系数可知,本发明提供的检测方法具有较好的组内、组间重复性,同时具有较理想的引物重复性。阳性标准品梯度浓度检测结果表明,cDNA稀释梯度为10-4时依然可以检测目的片段,说明RB-N1引物对有较高的灵敏度。
下面结合实施例对本发明提供的一种基于RT-PCR技术检测RB-N1基因型柑橘衰退病毒用试剂盒及其检测方法进行详细的说明,但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
待测柑橘植株的总RNA的提取方法,按照如下步骤操作:
1)取0.1g柑橘叶片,液氮充分研磨后加入预先放置1ml Trizol溶液(Invitrogen,美国)的1.5ml的离心管中,剧烈振荡混匀后室温放置10分钟,将离心管在12900rpm,4℃下离心10分钟。
2)取上清液1ml置于新的1.5ml的离心管中,加入200μL氯仿,震荡混匀,4℃放置10分钟后12900rpm,4℃下离心5分钟。
3)取步骤2离心后的上清液(只取最上一层)置于新的1.5ml的离心管中,加入等体积的异丙醇,轻轻颠倒混匀后放置-20℃沉降2小时以上。
4)将步骤3中离心管在12000rpm,4℃离心10分钟,弃上清液后加入1ml75%乙醇颠倒混匀,在8000rpm,4℃下离心3min,弃上清液;再离心15s用枪头吸弃上清液,重复2次。
5)将步骤4中含有RNA沉淀的离心管置于通风橱中室温干燥2~3min,加入30μLDEPC水溶解RNA。
实施例2
建立RT-PCR检测体系,按照如下步骤操作:
1)以实施例1所提取的RNA为模板,利用RB-N1基因型的特异性引物RB-N1R2进行反转录反应,得到反转录产物cDNA。
2)反转录反应进行前需要解链反应:1μLRNA反应模板和2μL无RNase超纯水在65℃解链10分钟后加入反转录体系混合液进行反转录反应。反应体系为5.5μL,其中,解链液3μL、5×RT-buffer 1μL、浓度为2.5mM/L的dNTPs 0.5μL、浓度为10μmol/L的引物RB-N1R20.25μL、浓度为30U/L的RNA酶抑制剂RNasin 0.125μL、浓度为100U/μL的反转录酶RTase 0.125μL;反应程序为:30℃反应10分钟,42℃反转录40分钟,70℃加热5分钟。
3)以步骤1)得到的反转录产物cDNA为模板,用引物RB-N1F和RB-N1R2进行RT-PCR反应,反应体系为25μL,其中无RNase超纯水16.1μL、10×PCR-buffer 4.5μL、浓度为2.5mM/L的dNTPs 2μL、浓度为10μmol/L的引物RB-N1F和RB-N1R2各0.5μL、r-Taq酶0.4μL、反转录产物cDNA模板1μL;PCR扩增程序为:95℃预变性3分钟,95℃变性20秒,55℃(或者55.6℃、56.4℃和57℃)退火30秒,72℃延伸45秒,35个循环。所述引物RB-N1F和RB-N1R2序列如下:RB-N1F:TCCTTTTACACCCGGTTTGAGACT(SEQ ID NO:1),RB-N1R2:ACTCGTTTATAGGCGCGCTCT(SEQID NO:2)。得到PCR扩增目的片段。
如图1所示,退火温度为55℃时仅见单一且大小与目的条带相符的条带。
4)采用上述步骤1)和2)同时对柑橘衰退病毒T36、RB、T3基因型用引物RB-N1F和RB-N1R2进行RT-PCR检测。
如图2所示,只有RB-N1基因型出现扩增,T36、RB、T3均未出现扩增。说明该引物对的特异性好。
实施例3
RB-N1引物对的溶解曲线和扩增曲线的建立,按照如下步骤操作:
1)以实例1得到的反转录cDNA模板,按10倍梯度稀释共5个梯度(100~10-5)作为cDNA模板,每个梯度浓度设置3个重复,作为组间重复;且每个重复检测3次,作为组内重复。PCR扩增的反应体系10μL,其中2×SYBR Green qPCR Mix(TAKARA,日本)5μL、10μmol/L正反向引物RB-N1F和RB-N1R2各0.5μL,cDNA模板1μL和ddH2O 3μL;荧光定量PCR扩增条件:95℃预变性20s,95℃5s,55℃15s,72℃20s,40个循环。
2)步骤1)的PCR程序结束后仪器自动进行实时荧光定量检测,得到熔解曲线和扩增曲线。熔解曲线分析:65℃~95℃,每升高0.5℃检测1次荧光信号。
得到退火温度为55℃的融解曲线,如图3所示,在退火温度为55℃时仅见单一峰。
从扩增曲线分析可知:cDNA模板浓度梯度从左到右依次是1.57×102ng/μL~1.57×10-2ng/μL,每个梯度浓度设置3个重复,作为组间重复;且每个重复检测3次,作为组内重复。
用下列公式计算Ct平均值、标准差(SD)和变异系数(CV)。
组内Ct平均值=组内Ct值之和/3 公式I;
组间Ct平均值=组内Ct平均值之和/2 公式II;
变异系数(CV)=标准差(SD)/Ct平均值 公式IV。
结果如表1所示,扩增曲线及统计学分析结果表明,各梯度组内重复检测的变异系数最大为2.21%,表明该方法具有较好的组内重复性。而进行的组间重复性试验结果显示,各梯度的变异系数最大为1.96%,表明该方法具有较好的组间重复性。
表1不同稀释梯度cDNA重复检测结果分析表
表2实验样品信息
样品编号 | CTV基因型 | cDNA原始浓度 | cDNA稀释浓度 |
Y5 | RB-N1 | 1.57×10<sup>2</sup>ng/μL(a) | a×10<sup>0</sup>~a×10<sup>-4</sup> |
Y10 | RB-N1 | 2.3×10<sup>2</sup>ng/μL(b) | b×10<sup>0</sup>~b×10<sup>-4</sup> |
从标准曲线可知:如图5该曲线的相关系数R2为0.9948,同样说明该引物的重复性较好。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 赣南师范大学
<120> 一种基于RT-PCR技术检测RB-N1基因型柑橘衰退病毒用试剂盒及其检测方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tccttttaca cccggtttga gact 24
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
actcgtttat aggcgcgctc t 21
Claims (10)
1.一种检测RB-N1基因型柑橘衰退病毒的引物对,其特征在于,包括RB-N1F和RB-N1R2;
所述RB-N1F的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示;
所述RB-N1R2的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
2.一种基于RT-PCR技术检测RB-N1基因型柑橘衰退病毒用试剂盒,其特征在于,包括权利要求1所述引物对。
3.根据权利要求2所述试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括PCR扩增用试剂和/或反转录用试剂。
4.根据权利要求3所述试剂盒,其特征在于,所述PCR扩增用试剂包括普通PCR扩增用试剂或荧光PCR扩增用试剂;
所述荧光PCR扩增用试剂包括2×SYBRGreenqPCRMix;
所述普通PCR扩增用试剂包括10×PCR-buffer、dNTPs和r-Taq酶。
5.根据权利要求3所述试剂盒,其特征在于,所述反转录用试剂包括以下试剂中的一种或几种:解链液、5×RT-buffer、dNTPs、RNA酶抑制剂和反转录酶RTase。
6.权利要求1所述引物对或权利要求2~5任意一项所述试剂盒在检测柑橘植株感染RB-N1基因型柑橘衰退病毒中的应用。
7.一种基于RT-PCR技术检测RB-N1基因型柑橘衰退病毒的方法,其特征在于,包括以下步骤:
1)提取待检测样品的RNA;
2)将步骤1)中RNA进行反转录,得到cDNA;
3)以步骤2)中所述cDNA为模板,利用权利要求1所述引物对进行PCR扩增,得到PCR扩增产物;
4)将步骤3)中所述PCR扩增产物进行片段分析,得到待测样品是否感染RB-N1基因型柑橘衰退病毒的结果。
8.根据权利要求7所述方法,其特征在于,所述PCR扩增包括普通PCR扩增和荧光PCR扩增;
所述普通PCR扩增的反应程序为:95℃预变性3分钟;95℃变性20秒,55℃退火30秒,72℃延伸45秒,35个循环;
所述荧光PCR扩增的反应程序为:95℃预变性20s;95℃5s,55℃15s,72℃20s,40个循环。
9.根据权利要求8所述方法,其特征在于,根据PCR扩增的方法进行片段分析:当采用普通PCR扩增时,所得PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳,若得到的条带为524bp,表示待测样品感染RB-N1基因型柑橘衰退病毒反之则没有感染或待检测样品感染RB-N1基因型柑橘衰退病毒的浓度没有达到检测限。
10.根据权利要求8所述方法,其特征在于,当采用荧光PCR扩增时,所得PCR扩增产物进行实时荧光定量检测,所得溶解曲线在退火温度为55℃时为单一峰,说明待测样品感染RB-N1基因型柑橘衰退病毒,反之则没有感染或待检测样品感染RB-N1基因型柑橘衰退病毒的浓度没有达到检测限。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202111085900.7A CN113637804B (zh) | 2021-09-16 | 2021-09-16 | 一种基于rt-pcr技术检测rb-n1基因型柑橘衰退病毒用试剂盒及其检测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202111085900.7A CN113637804B (zh) | 2021-09-16 | 2021-09-16 | 一种基于rt-pcr技术检测rb-n1基因型柑橘衰退病毒用试剂盒及其检测方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN113637804A true CN113637804A (zh) | 2021-11-12 |
CN113637804B CN113637804B (zh) | 2023-10-20 |
Family
ID=78425900
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202111085900.7A Active CN113637804B (zh) | 2021-09-16 | 2021-09-16 | 一种基于rt-pcr技术检测rb-n1基因型柑橘衰退病毒用试剂盒及其检测方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN113637804B (zh) |
Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102296128A (zh) * | 2011-10-08 | 2011-12-28 | 中国农业科学院柑桔研究所 | 柑桔衰退病毒的rt-lamp快速检测方法 |
CN102586481A (zh) * | 2012-02-27 | 2012-07-18 | 中国农业科学院柑桔研究所 | 同时检测柑桔4种重要病原的一步法多重pcr检测方法 |
CN102899315A (zh) * | 2011-07-29 | 2013-01-30 | 江汉大学 | 一种隐性混合池测序基因克隆方法 |
CN103937909A (zh) * | 2014-04-11 | 2014-07-23 | 中国农业科学院柑桔研究所 | 一种检测柑橘衰退病毒t3基因型的实时荧光定量rt-pcr方法 |
CN108531502A (zh) * | 2018-04-23 | 2018-09-14 | 西南大学 | 柑桔衰退病毒侵染性克隆的构建及接种方法 |
WO2019071051A1 (en) * | 2017-10-04 | 2019-04-11 | The Broad Institute, Inc. | DIAGNOSTICS BASED ON A CRISPR EFFECTOR SYSTEM |
-
2021
- 2021-09-16 CN CN202111085900.7A patent/CN113637804B/zh active Active
Patent Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102899315A (zh) * | 2011-07-29 | 2013-01-30 | 江汉大学 | 一种隐性混合池测序基因克隆方法 |
CN102296128A (zh) * | 2011-10-08 | 2011-12-28 | 中国农业科学院柑桔研究所 | 柑桔衰退病毒的rt-lamp快速检测方法 |
CN102586481A (zh) * | 2012-02-27 | 2012-07-18 | 中国农业科学院柑桔研究所 | 同时检测柑桔4种重要病原的一步法多重pcr检测方法 |
CN103937909A (zh) * | 2014-04-11 | 2014-07-23 | 中国农业科学院柑桔研究所 | 一种检测柑橘衰退病毒t3基因型的实时荧光定量rt-pcr方法 |
WO2019071051A1 (en) * | 2017-10-04 | 2019-04-11 | The Broad Institute, Inc. | DIAGNOSTICS BASED ON A CRISPR EFFECTOR SYSTEM |
CN108531502A (zh) * | 2018-04-23 | 2018-09-14 | 西南大学 | 柑桔衰退病毒侵染性克隆的构建及接种方法 |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
SHUANGHUA LI等: "Complete genome sequences of a novel genotype of citrus tristeza virus infecting Chinese wild mandarin (Citrus daoxianensis S.W. He) in China", RESEARCH SQUARE, pages 1 - 8 * |
邹勤;周彦;李中安;周常勇;***;苏华楠;: "应用real-time RT-PCR监测柑橘衰退病毒强、弱毒株的时序变化", 园艺学报, no. 11, pages 2193 - 2198 * |
陶珍珍;易龙;卢占军;李坊贞;赖晓桦;钟八莲;陈慈相;: "赣南脐橙主产区柑橘衰退病发病率调查研究", 中国农学通报, no. 16, pages 297 - 300 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN113637804B (zh) | 2023-10-20 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN110863058B (zh) | 用于鉴定马铃薯腐烂茎线虫的rpa引物及其应用 | |
Ruiz-Ruiz et al. | Discrimination between mild and severe Citrus tristeza virus isolates with a rapid and highly specific real-time reverse transcription-polymerase chain reaction method using TaqMan LNA probes | |
CN112011650B (zh) | 中华蜜蜂囊状幼虫病毒rt-rpa检测引物和探针及试剂盒 | |
CN115044710B (zh) | 一种检测穿山甲β冠状病毒的引物组、试剂盒和应用 | |
CN111206106B (zh) | 一种用于检测甘薯腐烂茎线虫的rpa引物、试剂盒及检测方法 | |
Hadidi et al. | Polymerase chain reaction | |
CN111304365A (zh) | 新型小鹅痛风病毒的一步法环介导等温检测试剂及其应用 | |
CN109161611B (zh) | 一种基于三重荧光pcr法联合检测版纳病毒、卡地皮诺病毒及辽宁病毒的引物探针组及试剂盒 | |
CN111518949B (zh) | 四重rt-pcr特异性扩增引物组及其同步检测4种火龙果病毒的方法 | |
CN101153341B (zh) | 诺如病毒gⅱ型检测用引物、检测方法、检测试剂盒 | |
CN113637804B (zh) | 一种基于rt-pcr技术检测rb-n1基因型柑橘衰退病毒用试剂盒及其检测方法 | |
CN116287475A (zh) | 芸薹黄化病毒rt-lamp-crispr等温检测的核酸序列组合、试剂盒及应用 | |
CN114231664B (zh) | 一种赤点斑石斑鱼神经坏死病毒rgnnv检测试剂盒及检测方法 | |
CN116064905A (zh) | 用于检测大丽轮枝菌的引物组合、试剂盒及应用 | |
CN112430675A (zh) | 利用snp标记kz288474.1_322717鉴别蜂群抗囊状幼虫病性状的方法 | |
CN112266979A (zh) | 基于西瓜花叶病毒保守区域的rpa检测引物、检测方法及其应用 | |
CN111534634A (zh) | 一种ⅱ型犬腺病毒的可视化等温扩增检测试剂及其应用 | |
CN110894551A (zh) | 草鱼出血病i型病毒(gcrv-i)的raa恒温荧光检测方法及试剂 | |
CN113322353B (zh) | 一种检测甘薯羽状斑驳病毒和甘薯褪绿矮化病毒的rpa试剂盒 | |
CN115927752A (zh) | 同时检测5种ctv基因型的多重rt-pcr引物组、试剂盒与应用 | |
CN115976275A (zh) | 同时检测4种ctv基因型的多重rt-pcr引物组、试剂盒与应用 | |
JP5656210B2 (ja) | マイクロサテライトマーカーを用いるラッカセイ品種識別法 | |
KR102266871B1 (ko) | 이중 랜덤 프라이머를 이용한 식물 바이러스의 동정방법 | |
CN117187437A (zh) | 一种用于检测柑橘相关弹状病毒的引物及其应用 | |
KR100615615B1 (ko) | 감자m바이러스 진단용 특이 프라이머 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |