CN113637761A - 用于黑色素瘤诊断和治疗的miRNA标志物及其相关产品 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了用于黑色素瘤诊断和治疗的miRNA标志物及其相关产品，所述miRNA标志物为miR‑450a和miR‑675的组合，所述用于黑色素瘤诊断的产品包括芯片、试剂盒、制剂，所述芯片、试剂盒、制剂中包含特异性识别miR‑450a和miR‑675的探针或特异性结合miR‑450a和miR‑675的引物、探针或芯片，本发明经实验验证发现，所述miRNA标志物具有较好的诊断效能，且miR‑450a和miR‑675联合具有协同增效的作用，能够用于黑色素瘤的诊断和治疗中。

Description

用于黑色素瘤诊断和治疗的miRNA标志物及其相关产品
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体地，本发明涉及用于黑色素瘤诊断和治疗的miRNA标志物及其相关产品，更具体地，本发明所述的miRNA标志物包括miR-450a、miR-675。
背景技术
黑色素瘤，又称恶性黑色素瘤，是一种黑色素细胞发生突变形成的恶性肿瘤，黑色素瘤多发生于皮肤，是最具侵袭性的皮肤高度恶性肿瘤，死亡率占皮肤恶性肿瘤的第1位。恶性黑色素瘤在白种人群中发病率较高，为21.6/10万；非洲人群为1.0/10万；中国人群发病率略低于非洲人群。然而我国发病率近年来成倍增长，每年新发约2万病例。恶性黑色素瘤50%-80%的晚期患者发生肝转移，8%-46%的患者发生脑转移。
黑色素瘤恶性程度高，转移早且广泛，因此在临床治疗上颇为棘手，其传统的治疗方法包括早期手术切除、放疗及化疗。90%-95%的恶性黑色素瘤患者早期治疗选择手术切除。因其易转移的特点，目前治疗多以化学治疗为主，常用的化疗方案为CVD（顺铂+长春新碱+达卡巴嗪）和CDBT（顺铂+达卡巴嗪+卡莫司汀+他莫昔芬）；放疗仅用于手术切除不彻底或者不能手术者的姑息性治疗。然而上述疗法疗效不佳，且不良反应较多。
近年来，随着对黑色素瘤发生分子机制的探索不断深入，已有越来越多的研究表明miRNA与黑色素瘤的发生密切相关。miRNA是天然存在于体内的21-22 nt的非编码RNA分子，是一类通过转录后基因沉默对靶基因表达进行调节的RNA。据估计，生物体内约有1/3的基因受miRNA的调控。miRNA与RISC的复合体通过碱基配对可与靶基因mRNA 5’-UTR或者3’-UTR中的互补序列相结合，抑制蛋白质翻译，或引发mRNA降解，从而负调控靶基因的表达。
miRNA是调节基因表达的内源性非编码小分子RNA，在转录后水平对基因表达进行调控，参与细胞周期、凋亡、发育、分化和新陈代谢等生理过程。miRNA在细胞中的表达失调会导致包括黑色素瘤在内的多种癌症的发生，最新的研究表明一些miRNA在黑色素瘤患者的样本中异常表达，但是具体是哪些miRNA与黑色素瘤的发生发展相关并能够作为治疗黑色素瘤的药物靶点仍未达成共识。因此有必要筛选并验证与黑色素瘤发生发展相关的miRNA，从而为临床上早期辅助诊断和辅助治疗黑色素瘤提供一种有效的手段。
发明内容
本发明的目的在于提供用于黑色素瘤诊断和治疗的miRNA标志物及其相关产品，所述miRNA标志物包括miR-450a、miR-675，本发明将所述miRNA标志物应用于黑色素瘤的诊断和治疗中，经验证发现，所述miRNA标志物miR-450a和miR-675与黑色素瘤的发生发展密切相关，将所述miRNA标志物miR-450a和miR-675组合应用于黑色素瘤的诊断中的诊断效能较好，所述miRNA标志物miR-450a和miR-675与黑色素瘤细胞的凋亡密切相关，且miR-450a和miR-675联合具有协同治疗的效果。
本发明的上述目的通过以下技术方案得以实现：
第一方面，本发明提供了检测miRNA标志物miR-450a和miR-675的表达水平的试剂在制备诊断黑色素瘤的产品中的应用。
进一步，所述试剂包括测序技术、核酸杂交技术、核酸扩增技术检测miRNA生物标志物miR-450a和miR-675的表达水平的试剂。
进一步，所述试剂选自：
特异性识别所述miRNA标志物miR-450a和miR-675的探针；或
特异性扩增所述miRNA标志物miR-450a和miR-675的引物。
进一步，特异性扩增所述miRNA标志物miR-450a和miR-675的引物的序列分别如SEQ ID NO:4-SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6-SEQ ID NO:7所示。
本发明所述的测序技术是指高通量测序技术，所述高通量测序技术又称下一代测序技术，是对传统测序技术的一次革命性的改变，高通量测序技术一次可对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，极大地提高了测序效率。这类大规模测序技术极大地提高了多个物种遗传信息的解读速度，为获取所有miRNA的序列信息，解密miRNA图谱提供了保证。同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能，所以又被称为深度测序（deep sequencing），高通量测序平台的代表是罗氏公司的454测序仪（RochGSFLX sequencer），Illumina公司的Solexa基因组分析仪（Illumina Genome Analyzer）和ABI的SOLiD测序仪（ABI SOLiD sequencer）。
本发明中所述的核酸杂交技术包括探针杂交技术、基因芯片技术，所述探针杂交技术是指将经标记的探针与miRNA样本进行杂交，进而进行信号检测，确定miRNA的表达水平。所述探针杂交方法包括northern杂交方法、miRNA表达谱芯片、核酶保护分析技术、RAKE法、原位杂交、基于微球的流式细胞术等技术；所述基因芯片技术是指通过微阵列（Microarray）技术将高密度DNA片段通过高速机器人或原位合成方式以一定的顺序或排列方式使其附着在如膜、玻璃片等固相表面，以同位素或荧光标记的DNA探针，借助碱基互补杂交原理，进行大量的基因表达及监测等方面研究的方法，其测序原理是杂交测序方法，即通过与一组已知序列的核酸探针杂交进行核酸序列测定的方法，在一块基片表面固定了序列已知的靶核苷酸的探针。当溶液中带有荧光标记的核酸序列与基因芯片上对应位置的核酸探针产生互补匹配时，通过确定荧光强度最强的探针位置，获得一组序列完全互补的探针序列。据此可重组出靶核酸的序列。
第二方面，本发明提供了一种诊断黑色素瘤的产品。
进一步，所述产品包含检测miRNA标志物miR-450a和miR-675的表达水平的试剂；
所述产品包括芯片、试剂盒、制剂；
所述芯片包括特异性识别miRNA标志物miR-450a和miR-675的探针；
所述试剂盒包括特异性结合miRNA标志物miR-450a和miR-675的引物、探针或芯片；
所述制剂包括特异性识别miRNA标志物miR-450a和miR-675的探针、特异性结合miRNA标志物miR-450a和miR-675的引物。
进一步，所述芯片的制备可采用本领域技术人员已知的生物芯片的常规制备方法，包括（但不限于）：采用修饰玻片或硅片的固相载体，探针的5’端含有氨基修饰的聚dT串，将寡核苷酸探针配制成溶液，然后采用点样仪将其点在修饰玻片或硅片上，排列成预定的序列或阵列，然后通过放置过夜来固定，就可得到本发明所述的miRNA芯片。
进一步，所述试剂盒还包括使用说明书或标签、阳性对照物、阴性对照物、缓冲剂、助剂或溶剂；所述说明书或标签详细记载了如何使用所述试剂盒进行样本的检测以及所述试剂盒用于检测黑色素瘤。
进一步，所述的试剂盒可包含适于实用（如针对不同的检测方法）的多种不同的试剂，并不限于目前本发明中所列举的试剂，只要是基于miR-450a和miR-675的检测来诊断黑色素瘤的试剂均包含在本发明的范围内。
第三方面，本发明提供了miRNA标志物miR-450a和miR-675在制备治疗黑色素瘤的药物组合物中的应用。
进一步，所述药物组合物包括降低miR-450a和miR-675表达水平的抑制剂；
所述降低miR-450a表达水平的抑制剂的序列如SEQ ID NO:1所示；
所述降低miR-675表达水平的抑制剂的序列如SEQ ID NO:2所示。
第四方面，本发明提供了一种治疗黑色素瘤的药物组合物。
进一步，所述药物组合物包括降低miR-450a和miR-675表达水平的抑制剂；
所述降低miR-450a表达水平的抑制剂的序列如SEQ ID NO:1所示；
所述降低miR-675表达水平的抑制剂的序列如SEQ ID NO:2所示。
进一步，所述药物组合物还可包括一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂、填充剂、结合剂及其它赋形剂，主要依赖于给药方式及所设计的剂量形式。
本领域技术人员已知的治疗惰性的无机或有机的载体包括（但不限于）：乳糖、玉米淀粉或其衍生物、滑石、植物油、蜡、脂肪、多羟基化合物例如聚乙二醇、水、蔗糖、乙醇、甘油，诸如此类，各种防腐剂、润滑剂、分散剂、矫味剂。保湿剐、抗氧化剂、甜味剂、着色剂、稳定剂、盐、缓冲液诸如此类也可加入其中，这些物质根据需要用于帮助配方的稳定性或有助于提高活性或它的生物有效性或在口服的情况下产生可接受的口感或气味，在这种组合物中可以使用的制剂可是其原始化合物本身的形式，或任选地使用其药物学可接受的盐的形式。如此配制的组合物根据需要可选择本领域技术人员已知的任何适当的方式把药物进行给药。使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明的药物施用于人，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
第五方面，本发明提供了一种筛选用于预防和/或治疗黑色素瘤的候选药物的方法。
进一步，所述方法包括如下步骤：
(1) 将待测物质与含有或表达miR-450a和miR-675的体系接触；
(2) 检测所述体系中miR-450a和miR-675的表达水平；
(3) 选择可降低miR-450a和miR-675表达水平的物质为预防和/或治疗黑色素瘤的候选药物。
进一步，所述体系包括（但不限于）：细胞体系、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系。
进一步，所述待测物质包括（但不限于）：针对miR-450a和miR-675或其上游或下游基因设计的干扰分子、核酸抑制物、小分子化合物。
第六方面，本发明提供了miRNA标志物miR-450a和miR-675在筛选用于预防和/或治疗黑色素瘤的候选药物中的应用。
除非另有定义，本发明上下文中的所使用的所有的技术和科学术语具有本领域普通技术人员所理解的相同含义。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例，不是旨在于限制本发明，此外，对部分术语解释如下。
本文中使用的术语“表达水平”，是指特定的miRNA序列从其基因组基因座被转录的程度，即miRNA在一个或多个被分析血液中的浓度。在本发明的具体实施例中，所述特定的miRNA为miR-450a和miR-675。
本文中使用的术语“miRNA标志物”，是指具有特异性生物学特性、生物化学特征或者其他方面特性的分子指示物（miRNA），其可用于确定存在或不存在某种特定疾病或状况和/或某种特定疾病或状况的严重程度。在本发明的具体实施例中，所述某种特定疾病或状况指黑色素瘤。
本文中使用的术语“治疗”，是指涉及人类或动物（例如，被兽医所应用）的治疗，其中可达到某些预期的治疗效果，例如，抑制病症的发展（包括降低发展速度、使发展停止）、改善病症和治愈病症。还包括作为预防措施（例如预防）的治疗。对还没有发展为病症但有发展为该病症危险的患者的用途，也包括在术语“治疗”中。
本文中使用的术语“差异表达”，是指miRNA在靶样本中的表达水平与在对照样本中相比是改变的，所述对照样本可以是健康人的样本，其可以是上调（即在靶样本中miRNA浓度增加）或下调（即在靶样本中miRNA浓度降低或消失）。在本发明的具体实施例中，所述miRNA为miR-450a和miR-675。
本文中使用的术语“抑制剂”或“降低生物标志物表达水平的抑制剂”，是指miRNAinhibitor，miRNA inhibitor是化学修饰的专门针对细胞中特异的靶miRNA的抑制剂，特异地靶向和敲除单个的miRNA分子，可以削弱内源miRNA的基因沉默效应，提高蛋白表达量，进行功能缺失性（loss-of-function）研究，可以用来筛选miRNA靶位点，筛选调控某一基因表达的miRNA，筛选影响细胞发育过程的miRNA。miRNA inhibitor是化学修饰的RNA单链，能够与成熟miRNA序列竞争性结合，其易于获得，操作简便，实验周期短，可以很好地应用于miRNA功能分析研究，如细胞增殖、细胞凋亡、细胞分化、细胞迁移、干细胞生长等方面功能研究。miRNA inhibitor只需用转染试剂包裹即可转染进入细胞，无需构建载体的繁琐操作，无需病毒防护方面的担忧，用转染对照即可观察其转染效率。
本发明公开的miRNA标志物miR-450a和miR-675的序列均可在miRBase数据库（http://microrna.sanger.ac.uk/）中进行查询，其中，miR-450a的序列如SEQ ID NO:10所示，miR-675的序列如SEQ ID NO:11所示；
miR-450a的序列：
AAACGAUACUAAACUGUUUUUGCGAUGUGUUCCUAAUAUGCACUAUAAAUAUAUUGGGAACAUUUUGCAUGUAUAGUUUUGUAUCAAUAUA（SEQ ID NO:10）
miR-675的序列：
CCCAGGGUCUGGUGCGGAGAGGGCCCACAGUGGACUUGGUGACGCUGUAUGCCCUCACCGCUCAGCCCCUGGG（SEQ ID NO:11）
进一步，本发明所述的miR-450a、miR-675选自：miR-450a、miR-675初始miRNA，miR-450a、miR-675前体miRNA，miR-450a、miR-675成熟miRNA。本领域技术人员应当知道，本发明实施例中的miR-450a、miR-675包括组成型核酸分子的功能等同物，即变体，其显示完整miR-450a、miR-675核酸分子相同的功能，尽管它们通过核苷酸残基的缺失、置换或者***而突变。本领域人员熟知，为了保证miRNA的稳定性，可以在miRNA的一端或者两端增加保护性碱基，如TT，也可对miRNA碱基进行修饰，但是不影响miRNA的功能。因此，本领域技术人员熟知，在不影响miR-450a、miR-675功能的条件下，对miR-450a、miR-675进行碱基修饰或者在两端增加碱基获得的序列同样包含在本发明的保护范围之内。
本发明具有如下有益效果：
(1) 本发明首次发现miRNA标志物miR-450a和miR-675联合对于黑色素瘤具有较高的诊断效能，在黑色素瘤中呈现显著性的差异表达，能够应用于黑色素瘤的诊断中；
(2) 本发明首次发现miRNA标志物miR-450a和miR-675联合对于黑色素瘤的治疗具有协同增效的作用，可将抑制miRNA标志物miR-450a和miR-675表达的试剂同时应用于黑色素瘤的治疗中，具有很好的临床应用前景。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1显示miR-450a、miR-675在对照组和黑色素瘤组之间差异表达的结果图，其中，A图：miR-450a，B图：miR-675；
图2显示miR-450a、miR-675对黑色素瘤的诊断效能验证的ROC曲线结果图，其中，A图：miR-450a，B图：miR-675；
图3显示miR-450a+miR-675联合对黑色素瘤的诊断效能验证的ROC曲线结果图；
图4显示miR-450a、miR-675的相对表达量的结果图，其中，A图：miR-450a，B图：miR-675；
图5显示miR-450a inhibitor、miR-675 inhibitor、miR-450a inhibitor+miR-675 inhibitor联合对黑色素瘤细胞凋亡率的影响的结果图，其中，A图：空白对照组，B图：阴性对照组，C图：miR-450a inhibitor组，D图：miR-675 inhibitor组，E图：miR-450ainhibitor+miR-675 inhibitor组。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解为：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。
实施例1 筛选黑色素瘤中差异表达的基因
1、数据来源和处理
在基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus，GEO）中搜索公共基因表达数据和完整的临床注释，从GEO数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）下载黑色素瘤（Melanoma）基因表达数据集GSE20994，所述数据集中包括健康对照者和黑色素瘤患者的血液样本数据，所述数据集的样本量为Case：Normal=35：22，并利用注释文件对其注释，多个探针对应同一个基因的取平均值作为其表达量，然后获得基因表达矩阵文件。
2、差异表达分析
使用R软件中的“limma”包对上述数据进行差异表达分析，其中，差异表达基因的筛选标准均为：|log2FC|>0.5，adj.P value<0.05。
3、实验结果
实验结果显示，筛选得到的差异表达的基因共有397个，其中，上调的差异表达基因有190个，下调的差异表达基因有207个，其中，本发明涉及的生物标志物miR-450a、miR-675在黑色素瘤患者的血液样本中的表达均显著上调，结果见表1和图1A、图1B。
表1 miR-450a、miR-675的差异表达结果
Figure DEST_PATH_IMAGE001
实施例2 miR-450a、miR-675诊断效能的验证
1、实验方法
使用R包“pROC”执行接收器工作特性（ROC）分析，绘制ROC曲线，分别对实施例1中筛选得到的差异表达基因miR-450a、miR-675、miR-450a+miR-675作为检测变量的AUC值、敏感性和特异性进行分析，判断上述指标miR-450a、miR-675、miR-450a+miR-675对黑色素瘤的诊断效能，在判断单个miRNA的诊断效能时，直接使用miRNA的表达量进行分析。首先调用pROC包，然后读入目的miRNA构建的表达量矩阵，运行绘制ROC曲线的命令，其中命令采用for循环，同时涉及添加AUC、Thres（阈值）、Smooth（拟合曲线）的命令。在判断miRNA联合的诊断效能时，首先是使用glmnet对miRNA进行Logistics回归分析，利用建立的Logistic回归模型，使用predict函数观察某个预测变量在各个水平对结果概率的影响，计算预测概率，绘制预测结果的ROC曲线，对miR-450a、miR-675、miR-450a+miR-675的诊断效能进行分析。
2、实验结果
结果见表2和图2A、图2B、图3，从结果中可以看出miR-450a、miR-675两者联合应用于黑色素瘤的诊断中具有较高的准确性、敏感性以及特异性，AUC值为0.860，显著优于单个基因miR-450a、miR-675的诊断效能，表明了miR-450a、miR-675两者联合具有更好的诊断效能。
表2 miR-450a、miR-675、miR-450a+miR-675的诊断效能结果
Figure 988613DEST_PATH_IMAGE002
实施例3 miR-450a、miR-675的表达与黑色素瘤细胞的凋亡的关系研究
1、实验材料
实验中涉及到的主要实验器材和实验试剂及耗材见表3和表4。
表3 实验中涉及的主要器材
Figure DEST_PATH_IMAGE003
表4 实验中涉及的主要试剂
Figure 233650DEST_PATH_IMAGE004
2、细胞来源
黑色素瘤细胞A375购自于中国科学院上海细胞生物研究所，引进后在本实验室长期培养。A375培养基为以DMEM+10% FBS+1% P/S solution，37℃、5% CO2、95%空气、饱和湿度的条件下进行培养。
3、细胞培养
(1) A375黑色素瘤细胞复苏
细胞复苏法使用的是水浴锅内快速融化的方法。实验之前进行防护，穿戴好手套及防护面具，从液氮中取出一支A375黑色素瘤细胞冻存管，注意观察标签名称、冻存日期等信息，确定是需要的细胞，然后快速放入已经备好的37℃的水浴锅中，整个过程一定要快速，最好在1 min时间内把冻存液完全融化，此时注意无菌操作防止感染，特别注意瓶盖处防护，完成融化后使用吸管把冻存的细胞转移到离心管中，加入PBS缓冲溶液均匀吹打，保证完全融入PBS缓冲溶液中，然后把离心管放入离心机中，调整转速1000 rpm/min，时间维持5 min左右，取出上清，保留离心管底层的物质，加入适量DMEM完全培养基重新悬浮，按照1:2种植于T25培养瓶中，每个培养瓶中加入DMEMF完全培养基5 mL，于镜下可见悬浮的圆形的细胞，代表已经把细胞转移成功，然后放入含有5% CO2、37℃恒温的细胞孵育箱中进行培养；
(2) A375黑色素瘤细胞换液
A375黑色素瘤细胞开始贴壁的时间一般是大约4-6 h左右，一般一天的时间就可以完全贴壁，贴壁后的细胞呈多边形，可以根据观察培养液的颜色及镜下观察情况进行换液，注意DMEM完全培养基要在37℃恒温水浴锅中提前预热，可以用巴氏管吸取上面的陈旧培养液，尽可能不要接触培养皿的下部，防止底层细胞造成划痕，细胞生长不均匀。然后沿着侧壁慢慢加入37℃水浴预热的PBS缓冲溶液进行清洗，去除一些坏死的细胞，可以用37℃水浴预热的PBS冲洗三次，最后在培养皿中加入37℃水浴预热的5 mL DMEM完全培养基，放入5% CO2、37℃恒温孵育箱培养。整个过程注意无菌操作，巴氏管接触外界后要及时丢弃，过程干净利索，不宜过长时间；
(3) A375黑色素瘤细胞传代
约2-3天，A375黑色素瘤细胞就可以达到80%-100%的细胞融合，此时进行细胞传代。实验之前要进行个人防护，在提前消毒30 min的超净工作台中，使用巴氏管，吸弃陈旧的培养液，使用37℃水浴预热的PBS冲洗三次，加入1 mL浓度为0.25%胰蛋白酶，放入37℃恒温孵育箱中，计时1 min左右，为明确细胞是否完全被消化，可以在倒置显微镜下观察，如果见圆形的细胞大部分悬浮，就可停止胰蛋白酶消化，加入1-2 mL的37℃水浴预热的5-10 mLDMEM/F-12完全培养基，同时及时吹打细胞，使细胞完全悬浮溶液中，然后转移到离心管中，配平离心机，调整转速1000 rpm/min，离心时间5 min左右，按照1:3-1:5的比例进行传代，培养皿放入5-10 mL DMEM/F-12完全培养基，放入37℃、5% CO2的细胞恒温孵育箱中进行培养。
4、细胞转染
(1) 取处于对数生长期的A375细胞，生长状态良好的细胞，用培养基将细胞密度调整到1×105/mL，接入6孔板，每孔2 mL细胞悬液，每组各两孔，37℃培养过夜；
(2) 转染前2小时，换成无血清培养基；
(3) 转染步骤，对于每个转染样品，均按如下所述的方法进行准备：
1) 转染前一天将细胞计数，取1 mL加入6孔板中，使得孔板的细胞密度不低于2×105个；
2) 对于每孔细胞，用250 μL的无血清培养基稀释10 μL的100 nM的inhibitor，室温孵育5 min；
3) 对于每孔细胞，用250 μL的无血清培养基稀释5 μL Lipo2000，室温孵育5min；
4) 将步骤2)和步骤3)中的液体混合，室温孵育20 min；
5) 将预先分好的贴壁细胞换成无血清培养基，加入上述复合物，在37℃，5% CO2中培养6小时，再换成加血清的生长培养基，继续在37℃，5% CO2中培养48小时。收集细胞样本，PBS洗两次，弃去液体，进行后续RNA的提取；
将实验设置为3个组：空白对照组（A375黑色素瘤细胞）、阴性对照组（inhibitor-NC）和实验组（inhibitor组）。
其中，针miR-450a的inhibitor的序列信息如下：
5’-AUAUUAGGAACACAUCGCAAAA-3’（SEQ ID NO:1）
针对miR-675的inhibitor的序列信息如下：
5’-CACUGUGGGCCCUCUCCGCACCA-3’（SEQ ID NO:2）
inhibitor-NC的序列信息如下：
5’-CAGUACUUUUGUGUAGUACAAA-3’（SEQ ID NO:3）
5、QPCR检测细胞中miR-450a、miR-675的表达水平
(1) 样本总RNA的提取（Trizol法）
1) 取适量待测样本加入液氮后研磨粉碎；
2) 用1 mL Trizol将研磨样本转移到1.5 mL EP管中；
3) 向1.5 mL EP管中加入500 μL酚氯，仿振荡混匀后，静止5分钟；
4) 4℃ 12000 rpm离心10分钟，小心吸取上清于一新的1.5 mL EP管中；
5) 向分离出的上清中加入700 μL异丙醇，充分混匀；
6) 4℃ 12000 rpm离心10分钟，小心弃上清；
7) 用75%乙醇洗涤沉淀一次，室温晾干；
8) 50 μL DEPC水溶解RNA沉淀；
9) 琼脂糖凝胶电泳检测。
(2) 总RNA质量检测
1) 使用核酸浓度测定仪测定RNA浓度和纯度，测量前先用溶解RNA用的DEPC水调零，操作方法如下：抬起样品臂，把样品加到检测基座上；放下样本臂，使用电脑上的软件开始吸光值检测。在上下两个光纤之间会自动拉出一个样品柱，然后进行检测；当检测完成后，抬起样品臂，并用干净的无尘纸把上下基座上的样品擦拭干净；
2) 浓度测定：260 nm处读值为1表示40 ng RNA/µL。样品RNA浓度计算公式为：A260 X 40 ng/µL；
3) 纯度检测：RNA溶液的A260/A280的比值是一种RNA纯度检测方法，比值范围1.8到2.1。
(3) 逆转录合成cDNA
逆转录使用invitrogen的逆转录试剂盒superscript III；
反应体系1的建立见表5，混匀，离心，65℃，5分钟，结束后置于冰上；
表5 反应体系1的组成
Figure DEST_PATH_IMAGE005
反应体系2的建立见表6；
表6 反应体系2的组成
Figure 341283DEST_PATH_IMAGE006
混匀，离心，置于42℃，水浴60分钟；取出后置于85℃，反应10分钟，灭活逆转录酶，反应结束后将产物置于-20℃待用。
(4) 实时荧光定量检测
首先设计QPCR的扩增引物，具体引物序列如下：
miR-450a：
正向引物为5’-TTTTGCGATGTGTTCCTAAT-3’（SEQ ID NO:4）；
反向引物为5’-CTCAACTGGTGTCGTG-3’（SEQ ID NO:5）；
miR-675：
正向引物为5’-TGGTGCGGAGAGGGCCCAC-3’（SEQ ID NO:6）；
反向引物为5’-CTCAACTGGTGTCGTG-3’（SEQ ID NO:7）；
U6内参引物：
正向引物为5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’（SEQ ID NO:8）；
反向引物为5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’（SEQ ID NO:9）；
Real time PCR反应体系建立见表7；
表7 Real time PCR反应体系
Figure DEST_PATH_IMAGE007
体系混匀后，瞬离，置于荧光定量PCR仪上，按照表8所述的条件反应；
表8 Realtime PCR反应条件
Figure 329968DEST_PATH_IMAGE008
对各组样本的相对定量结果进行分析，其中，miR-450a、miR-675相对表达量的计算公式如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE009
6、细胞凋亡实验
本实施例中采用流式细胞术检测miR-450a、miR-675、miR-450a+miR-675的表达对A375黑色素瘤细胞凋亡的影响，首先收集未经转染、转染miR-450a inhibitor、转染miR-675 inhibitor、同时转染miR-450a inhibitor和miR-675 inhibitor的A375黑色素瘤细胞，对细胞进行洗涤后用乙醇进行固定，并进行细胞的重悬和细胞过滤，并采用PI染液进行染色，之后采用流式细胞仪进行检测；
其中，在细胞凋亡检测中，流式细胞术检测结果图中的不同象限代表不同的意义，Q1-1 (AnnexinV-FITC)-/PI+代表坏死细胞，Q1-2 (AnnexinV+FITC)+/PI+代表中晚期凋亡的细胞，Q1-4 (AnnexinV-FITC)+/PI-代表早期凋亡的细胞，Q1-3 (AnnexinV-FITC)-/PI-代表正常的活细胞，各象限的百分数分别代表对应细胞所占的比例，细胞总凋亡率=中晚期凋亡率+早期凋亡率。
7、实验结果
转染的结果显示，以空白对照组miR-450a的表达水平作为参比设为1，相比于空白对照组miR-450a的表达量（相对表达量为1）与转染inhibitor-NC的阴性对照组（NC组）miR-450a的表达量，转染miR-450a inhibitor的实验组的miR-450a的表达量显著下调，且差异具有统计学意义（P＜0.05），而空白对照组和阴性对照组之间无显著差异（见图4A）；
转染的结果显示，以空白对照组miR-675的表达水平作为参比设为1，相比于空白对照组miR-675的表达量（相对表达量为1）与转染inhibitor-NC的阴性对照组（NC组）miR-675的表达量，转染miR-675 inhibitor的实验组的miR-675的表达量显著下调，且差异具有统计学意义（P＜0.05），而空白对照组和阴性对照组之间无显著差异（见图4B）；
细胞凋亡实验的结果显示，转染miR-450a inhibitor的实验组的细胞的总凋亡率（10.27%）显著高于空白对照组（3.10%）和阴性对照组（3.06%）（见表9和图5A、图5B、图5C），表明miR-450a能够影响黑色素瘤细胞的凋亡能力，抑制miR-450a的表达可促进黑色素瘤细胞的凋亡；
细胞凋亡实验的结果显示，转染miR-675 inhibitor的实验组的细胞的总凋亡率（10.35%）显著高于空白对照组（3.10%）和阴性对照组（3.06%）（见表9和图5A、图5B、图5D），表明miR-675能够影响黑色素瘤细胞的凋亡能力，抑制miR-675的表达可促进黑色素瘤细胞的凋亡；
细胞凋亡实验的结果显示，共同转染miR-450a inhibitor和miR-675 inhibitor的实验组的细胞的总凋亡率（25.88%）显著高于单独转染miR-450a inhibitor的实验组（10.27%）和单独转染miR-675 inhibitor的实验组（10.35%）（见表9和图5C、图5D、图5E）；
此外，对各组的细胞抑制率进行计算，计算得到的结果见表10，利用金氏公式表达式q=EA+B/(EA+EB-EA×EB)判断二者联合使用后的效果是否优于单独使用的效果，其中，EA+B为miR-450a inhibitor+miR-675 inhibitor对黑色素瘤细胞的抑制率，EA为miR-450ainhibitor对黑色素瘤细胞的抑制率，EB为miR-675 inhibitor对黑色素瘤细胞的抑制率；若q=0.85-1.15之间为单纯叠加，1.15＜q＜20为协同，q＞20为显著协同，q＜0.85为拮抗，即q＞1.15时即可判定miR-450a inhibitor和miR-675 inhibitor两者对黑色素瘤细胞的凋亡促进作用为协同效果，而非单纯叠加；
根据表10计算得到的细胞抑制率的结果，利用金氏公式计算增效q值，评价miR-450a inhibitor和miR-675 inhibitor两者联用的效应是否强于单独的效应，代入计算得到的细胞抑制率的结果可知，q=EA+B/(EA+EB-EA×EB)=0.2278/(0.0717+0.0725-0.0717×0.0725)=1.639，即q=1.639，q＞1.15，表明了miR-450a inhibitor和miR-675 inhibitor两者对黑色素瘤细胞的凋亡促进作用为协同效果，进一步证明了miR-450a inhibitor和miR-675 inhibitor两者联合为协同治疗，而非单纯的叠加效果。
表9 细胞凋亡实验的结果统计
Figure 472236DEST_PATH_IMAGE010
表10 各组的细胞抑制率的计算结果
Figure DEST_PATH_IMAGE011
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
序列表
<110> 北京百奥思科生物医学技术有限公司
<120> 用于黑色素瘤诊断和治疗的miRNA标志物及其相关产品
<141> 2021-10-11
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
auauuaggaa cacaucgcaa aa 22
<210> 2
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cacugugggc ccucuccgca cca 23
<210> 3
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
caguacuuuu guguaguaca aa 22
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ttttgcgatg tgttcctaat 20
<210> 5
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ctcaactggt gtcgtg 16
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tggtgcggag agggcccac 19
<210> 7
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ctcaactggt gtcgtg 16
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gcttcggcag cacatatact aaaat 25
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cgcttcacga atttgcgtgt cat 23
<210> 10
<211> 91
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
aaacgauacu aaacuguuuu ugcgaugugu uccuaauaug cacuauaaau auauugggaa 60
cauuuugcau guauaguuuu guaucaauau a 91
<210> 11
<211> 73
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
cccagggucu ggugcggaga gggcccacag uggacuuggu gacgcuguau gcccucaccg 60
cucagccccu ggg 73

Claims (10)

1.检测miRNA标志物miR-450a和miR-675的表达水平的试剂在制备诊断黑色素瘤的产品中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂包括测序技术、核酸杂交技术、核酸扩增技术检测miRNA标志物miR-450a和miR-675的表达水平的试剂。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述试剂选自：
特异性识别所述miRNA标志物miR-450a和miR-675的探针；或
特异性扩增所述miRNA标志物miR-450a和miR-675的引物。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，特异性扩增所述miRNA标志物miR-450a和miR-675的引物的序列分别如SEQ ID NO:4-SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6-SEQ ID NO:7所示。
5.一种诊断黑色素瘤的产品，其特征在于，所述产品包含检测miRNA标志物miR-450a和miR-675的表达水平的试剂；
所述产品包括芯片、试剂盒、制剂；
所述芯片包括特异性识别miRNA标志物miR-450a和miR-675的探针；
所述试剂盒包括特异性结合miRNA标志物miR-450a和miR-675的引物、探针或芯片；
所述制剂包括特异性识别miRNA标志物miR-450a和miR-675的探针、特异性结合miRNA标志物miR-450a和miR-675的引物。
6.miRNA标志物miR-450a和miR-675在制备治疗黑色素瘤的药物组合物中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述药物组合物包括降低miR-450a和miR-675表达水平的抑制剂；
所述降低miR-450a表达水平的抑制剂的序列如SEQ ID NO:1所示；
所述降低miR-675表达水平的抑制剂的序列如SEQ ID NO:2所示。
8.一种治疗黑色素瘤的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括降低miR-450a和miR-675表达水平的抑制剂；
所述降低miR-450a表达水平的抑制剂的序列如SEQ ID NO:1所示；
所述降低miR-675表达水平的抑制剂的序列如SEQ ID NO:2所示。
9.一种筛选用于预防和/或治疗黑色素瘤的候选药物的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1) 将待测物质与含有或表达miR-450a和miR-675的体系接触；
(2) 检测所述体系中miR-450a和miR-675的表达水平；
(3) 选择可降低miR-450a和miR-675表达水平的物质为预防和/或治疗黑色素瘤的候选药物。
10.miRNA标志物miR-450a和miR-675在筛选用于预防和/或治疗黑色素瘤的候选药物中的应用。
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