CN113599507B - 葡萄糖触发的活性氧响应注射型复合水凝胶的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了葡萄糖触发的活性氧响应注射型复合水凝胶的制备方法。该制备方法包括：制备获得主链具有苯硼酸的透明质酸‑氨基苯硼酸衍生物HA‑g‑PBA和丙烯酸基修饰的葡萄糖氧化酶衍生物GOx‑AC；利用巯基苯硼酸的巯基与GOx‑AC的丙烯酸酯基进行迈克尔加成反应，制备获得带有苯硼酸葡萄糖氧化酶衍生物GOx‑g‑PBA；通过GOx‑g‑PBA的羟基与聚乙烯醇的羟基形成硼酸酯动态共价键，制备获得修饰有葡萄糖氧化酶的聚乙烯醇衍生物PVA‑g‑GOx；将HA‑g‑PBA与PVA‑g‑GOx按预设比例混合后通过形成硼酸酯动态共价键，制备获得葡萄糖触发的活性氧响应注射型复合水凝胶。该制备方法简单且应用前景良好，能通过葡萄糖和活性氧双重响应调控降解周期。
Description
技术领域
本发明涉及应用于生物医学领域的注射型水凝胶的制备方法，尤其是涉及葡萄糖触发的活性氧响应注射型复合水凝胶的制备方法。
背景技术
水凝胶是一种具有三维网络结构的高分子聚合物，其交联网络结构可以防止渗透，这些特性使其成为良好的药物载体，可应用于手术植入、局部针头注射和通过静脉注射的全身递送。但是目前研究和应用的大多数水凝胶都是通过物理交联作用，利用机体组织内部环境(温度、pH值和离子强度等)的改变来引发水凝胶网络的形成。温敏型海藻酸-g-聚(N-异丙基丙烯酰胺、接枝聚(N- 异丙基丙烯酰胺)和聚(甲基丙烯酸)到环状低聚糖β-环糊精上，合成了具有 pH响应和温度响应的水凝胶，可以在结肠中(pH＝7.4)同时释放甲硝唑和氧氟沙星和离子强度敏化型藻朊酸盐，高分子材料的合成为注射型水凝胶的研究和应用打下了良好的基础。然而，此类物理交联凝胶在人体组织内部的交联固化周期较长，并且交联作用较弱，大大限制了其临床的应用范围。
与物理交联凝胶相比，化学交联的凝胶展现出了其独特的优势，如交联速度快，稳定性、机械性能优良等。但是，大多数化学凝胶的交联过程需要额外加入引发剂，而引发剂往往具有较高的毒性或需要特定的引发条件，不适合在生物体内原位使用。而基于苯硼酸的水凝胶是通过硼酸和聚乙烯醇1，2-二醇形成硼酸酯共价键，其兼具物理交联和化学交联水凝胶的特性，且硼酸酯共价键具有敏感的葡萄糖和活性氧双响应特性。由于小分子糖会与水凝胶的二醇结构竞争，与硼酸间形成可逆硼酸酯键，所以水凝胶的硼酸酯键可以被病灶组织环境中存在的葡萄糖竞争而断键或被活性氧分子氧化而发生断键。
葡萄糖氧化酶是一种需氧脱氢酶，广泛存在于动植物体内，在氧气存在的条件下，可以专一催化氧化β-D-葡萄糖，生成葡萄糖酸和过氧化氢。然而与大多数蛋白质药物类似，天然GOx稳定性差、体内半衰期短和全身毒性等缺点，难以直接用于高糖环境疾病治疗。因此，基于苯硼酸和葡萄糖氧化酶共同建立的水凝胶材料将具有敏感的葡萄糖诱导的活性氧响应降解特性，这种水凝胶材料在一些具有高血糖浓度的病灶组织的局部缓释给药中将展现出广阔的临床应用前景。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种葡萄糖触发的活性氧响应注射型葡萄糖激发活性氧响应复合水凝胶的制备方法，该方法基于接有苯硼酸的透明质酸-氨基苯硼酸衍生物HA-g-PBA以及修饰有葡萄糖氧化酶的聚乙烯醇衍生物 PVA-g-GOx反应构建出一种新型注射型、可塑性强、粘附性强及生物降解时间可控的水凝胶材料。
特别地，本发明提供了葡萄糖触发的活性氧响应注射型复合水凝胶的制备方法，包括如下步骤：
制备获得主链具有苯硼酸的透明质酸-氨基苯硼酸衍生物HA-g-PBA和丙烯酸基修饰的葡萄糖氧化酶衍生物GOx-AC；
利用巯基苯硼酸的巯基与GOx-AC的丙烯酸酯基进行迈克尔加成反应，制备获得带有苯硼酸的葡萄糖氧化酶衍生物GOx-g-PBA；
通过GOx-g-PBA的羟基与聚乙烯醇的羟基形成硼酸酯动态共价键，制备获得修饰有葡萄糖氧化酶的聚乙烯醇衍生物PVA-g-GOx；
将HA-g-PBA与PVA-g-GOx按预设比例混合后通过形成硼酸酯动态共价键，制备获得葡萄糖触发的活性氧响应注射型复合水凝胶。
可选地，所述制备获得主链具有苯硼酸的透明质酸-氨基苯硼酸衍生物 HA-g-PBA和丙烯酸基修饰的葡萄糖氧化酶衍生物GOx-AC中，所述GOx-AC 的制备方法为：
将葡萄糖氧化酶溶解在第一缓冲溶液中以配置成所述葡萄糖氧化酶的质量百分比为0.5％-1.5％的第一溶液中；
将N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺溶于二甲基亚砜(DMSO)中，获得第二溶液，其中，所述N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺与所述葡萄糖氧化酶的摩尔比为15-25:1；
将所述第二溶液施加至所述第一溶液中，且在室温下进行搅拌，透析提纯后得到所述GOx-AC。
可选地，所述利用巯基苯硼酸的巯基与GOx-AC的丙烯酸酯基进行迈克尔加成反应，制备获得带有苯硼酸的葡萄糖氧化酶衍生物GOx-g-PBA，包括如下步骤：
将4-巯基苯硼酸溶于二甲基亚砜中，获得第三溶液，其中，所述4-巯基苯硼酸与所述葡萄糖氧化酶的摩尔比为15-25:1；
将所述第三溶液施加至所述GOx-AC中，并在30℃-37℃下进行搅拌，再透析提纯得到所述GOx-g-PBA。
可选地，所述通过GOx-g-PBA的羟基与聚乙烯醇的羟基形成硼酸酯动态共价键，制备获得修饰有葡萄糖氧化酶的聚乙烯醇衍生物PVA-g-GOx，包括如下步骤：
将聚乙烯醇溶于第二缓冲液中以配置成所述聚乙烯醇的质量百分比为 3％-10％的第四溶液中；
将所述GOx-g-PBA施加至所述第四溶液中，并在室温下进行搅拌，透析提纯后得到所述PVA-g-GOx。
可选地，所述将HA-g-PBA与PVA-g-GOx按预设比例混合后通过形成硼酸酯动态共价键，制备获得葡萄糖触发的活性氧响应复合水凝胶，包括如下步骤：
将质量比为0.5-2:1的所述HA-g-PBA和所述PVA-g-GOx溶于第三缓冲液中，配置成第五溶液；
按照体积比为1:1的所述第五溶液通过双组份注射器进行混合注射，得到溶液在30℃-37℃下反应交联生成所述活性氧响应注射型复合水凝胶。
可选地，所述第一缓冲液、所述第二缓冲液和所述第三缓冲液均选择为磷酸溶液。
可选地，所述制备获得主链具有苯硼酸的透明质酸-氨基苯硼酸衍生物 HA-g-PBA和丙烯酸基修饰的葡萄糖氧化酶衍生物GOx-AC，包括如下步骤：
配置质量百分比为0.2％-2％的透明质酸水溶液和质量百分比为0.5％-1.5％的4-氨基苯硼酸的二甲基亚砜溶液；
将透明质酸水溶液、所述4-氨基苯硼酸的二甲基亚砜溶液和1-乙基-3-(3- 二甲氨基丙基)碳二酰亚胺盐酸盐进行混合，再将混合后的溶液的pH值调节至4.5-5，得到第六溶液；
向所述第六溶液中加入N-羟基琥珀酰亚胺，反应透析提纯后冻干保存，得到所述HA-g-PBA。
可选地，所述透明质酸水溶液、所述4-氨基苯硼酸的二甲基亚砜溶液、所述1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二酰亚胺盐酸盐和所述N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为1:0.3-0.5:0.5-1.5:0.5-1.5。
可选地，所述透明质酸的分子量为40-200KDA。
可选地，所述将所述第二溶液施加至所述第一溶液中，且在室温下进行搅拌，透析提纯后得到所述GOx-AC的步骤中，透析提纯使用截留分子量3500Da 的透析袋；
可选地，所述将所述GOx-g-PBA施加至所述第四溶液中，并在室温下进行搅拌，透析提纯后得到所述PVA-g-GOx的步骤中，透析提纯使用截留分子量200Da的透析袋；
可选地，向所述第六溶液中加入N-羟基琥珀酰亚胺，反应透析提纯后冻干保存，得到所述HA-g-PBA的步骤中，透析提纯使用截留分子量8-14KDa的透析袋。
根据本发明的方案，由于用于生成葡萄糖触发的活性氧响应注射型复合水凝胶的主体材料HA-g-PBA中的HA是一种广泛分布于人体各部位的黏性多糖，其具有优良的生物相容性和生物可降解性而被广泛地应用在化妆品、保健和医药领域，并且另一主体材料PVA-g-GOx中的聚乙烯醇是医药级聚乙烯醇，是一种极安全的高分子有机物，对人体无毒，无副作用，具有良好的生物相容性，尤其在医疗中如其水性凝胶在眼科、伤口敷料和人工关节方面具有广泛应用。因此，最终制备获得的葡萄糖触发的活性氧响应注射型复合水凝胶均具有上述优点。并且，该制备方法简单，应用前景良好，能通过葡萄糖和活性氧双重响应调控降解周期。
并且，通过GOx-g-PBA的羟基与聚乙烯醇的羟基形成的硼酸酯动态共价键，具有环境友好性和反应速度可控性，为活性氧响应注射型复合水凝胶在体内注射型生物医用水凝胶的应用中奠定了良好的基础。并且，与传统的物理缔合注射型凝胶相比，苯硼酸透明质酸钠衍生物/接有葡萄糖的聚乙烯醇衍生物的动态共价交联复合水凝胶具有优良的稳定性和机械性能。
根据下文结合附图对本发明具体实施例的详细描述，本领域技术人员将会更加明了本发明的上述以及其他目的、优点和特征。
附图说明
后文将参照附图以示例性而非限制性的方式详细描述本发明的一些具体实施例。附图中相同的附图标记标示了相同或类似的部件或部分。本领域技术人员应该理解，这些附图未必是按比例绘制的。附图中：
图1示出了根据本发明一个实施例的葡萄糖触发的活性氧响应注射型复合水凝胶的制备方法的示意性流程图；
图2示出了根据本发明一个实施例的主链具有苯硼酸的透明质酸-氨基苯硼酸衍生物HA-g-PBA的制备方法的示意性流程图；
图3示出了根据本发明一个实施例的丙烯酸基修饰的葡萄糖氧化酶衍生物 GOx-AC的制备方法的示意性流程图；
图4示出了根据本发明一个实施例的带有苯硼酸葡萄糖氧化酶衍生物 GOx-g-PBA的制备方法的示意性流程图；
图5示出了根据本发明一个实施例的修饰有葡萄糖氧化酶的聚乙烯醇衍生物PVA-g-GOx的制备方法的示意性流程图；
图6示出了根据本发明一个实施例的葡萄糖触发的活性氧响应复合水凝胶的制备方法的示意性流程图；
图7示出了根据本发明一个实施例的制备获得HA-g-PBA的反应机理图；
图8示出了根据本发明一个实施例的制备获得PVA-g-GOx的反应机理图；
图9示出了根据本发明一个实施例的通过HA-g-PBA和PVA-g-GOx制备形成葡萄糖触发的活性氧响应注射型复合水凝胶的示意性机理图；
图10示出了根据本发明实施例的活性氧响应注射型复合水凝胶降解的质量变化图；
图11示出了根据本发明实施例的活性氧响应注射型复合水凝胶降解过程中溶液pH值的变化曲线图；
图12示出了根据本发明实施例一的活性氧响应注射型复合水凝胶的力学性能表征图；
图13示出了根据本发明实施例一的活性氧响应注射型复合水凝胶的扫描电镜图；
图14示出了根据本发明实施例一的HA-g-PBA和HA的傅里叶红外光谱图。
图15示出了根据本发明实施例一的PVA-g-GOx和GOx-AC的傅里叶红外光谱图。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本申请的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本申请的其他优点与功效。显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。本申请还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本申请的精神下进行各种修饰或改变。需说明的是，在不冲突的情况下，以下实施例及实施例中的特征可以相互组合。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
图1示出了根据本发明一个实施例的葡萄糖触发的活性氧响应注射型复合水凝胶的制备方法的示意性流程图。如图1所示，该活性氧响应注射型复合水凝胶的制备方法包括：
步骤S100，制备获得主链具有苯硼酸的透明质酸-氨基苯硼酸衍生物HA-g-PBA和丙烯酸基修饰的葡萄糖氧化酶衍生物GOx-AC；
步骤S200，利用巯基苯硼酸的巯基与GOx-AC的丙烯酸酯基进行迈克尔加成反应，制备获得带有苯硼酸的葡萄糖氧化酶衍生物GOx-g-PBA；
步骤S300，通过GOx-g-PBA的羟基与聚乙烯醇的羟基形成硼酸酯动态共价键，制备获得修饰有葡萄糖氧化酶的聚乙烯醇衍生物PVA-g-GOx；
步骤S400，将HA-g-PBA与PVA-g-GOx按预设比例混合后通过形成硼酸酯动态共价键，制备获得葡萄糖触发的活性氧响应注射型复合水凝胶。
根据本发明的方案，由于用于生成葡萄糖触发的活性氧响应注射型复合水凝胶的主体材料HA-g-PBA中的HA是一种广泛分布于人体各部位的黏性多糖，其具有优良的生物相容性和生物可降解性而被广泛地应用在化妆品、保健和医药领域，并且另一主体材料PVA-g-GOx中的聚乙烯醇是医药级聚乙烯醇，是一种极安全的高分子有机物，对人体无毒，无副作用，具有良好的生物相容性，尤其在医疗中如其水性凝胶在眼科、伤口敷料和人工关节方面具有广泛应用。因此，最终制备获得的葡萄糖触发的活性氧响应注射型复合水凝胶均具有上述优点。并且，该制备方法简单，应用前景良好，能通过葡萄糖和活性氧双重响应调控降解周期。
并且，通过GOx-g-PBA的羟基与聚乙烯醇的羟基形成的硼酸酯动态共价键，具有环境友好性和反应速度可控性，为活性氧响应注射型复合水凝胶在体内注射型生物医用水凝胶的应用中奠定了良好的基础。并且，与传统的物理缔合注射型凝胶相比，苯硼酸透明质酸钠衍生物/接有葡萄糖的聚乙烯醇衍生物的动态共价交联复合水凝胶具有优良的稳定性和机械性能。
图2示出了根据本发明一个实施例的主链具有苯硼酸的透明质酸-氨基苯硼酸衍生物HA-g-PBA的制备方法的示意性流程图。如图2所示，该步骤S100 中制备获得主链具有苯硼酸的透明质酸-氨基苯硼酸衍生物HA-g-PBA的方法包括：
步骤S110，配置质量百分比为0.2％-2％的透明质酸水溶液和质量百分比为0.5％-1.5％的4-氨基苯硼酸的二甲基亚砜溶液；
步骤S120，将透明质酸水溶液、所述4-氨基苯硼酸的二甲基亚砜溶液和 1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二酰亚胺盐酸盐进行混合，再将混合后的溶液的pH值调节至4.5-5，得到第六溶液；
步骤S130，向所述第六溶液中加入N-羟基琥珀酰亚胺，反应透析提纯后冻干保存，得到HA-g-PBA。
该步骤S110中，该透明质酸的分子量为40-200KDA中任一值，例如可以为40KDA、100KDA或200KDA。该透明质酸水溶液的质量百分比配置成 0.2％-2％中任一值，例如为0.2％、0.5％、1％或2％。该透明质酸水溶液的质量百分比数值太小，则导致后序制备的产品无法成胶，数值太大则导致透明质酸自身成胶，从而影响反应。该步骤S120中，将混合后的溶液的pH值调节至 4.5-5，这是通过向溶液中加入氢氧化钠和盐酸来调整的pH值。该步骤S130中，透析提纯使用截留分子量8-14KDa的透析袋。
在该步骤S120和步骤S130中，透明质酸水溶液、4-氨基苯硼酸的二甲基亚砜溶液、1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二酰亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为1:0.3-0.5:0.5-1.5:0.5-1.5中任一值，例如可以为1:0.3:0.5:0.5、1:0.5： 1.5:1.5或1:0.4:1:1。该步骤S110至步骤S130中，是通过1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二酰亚胺盐酸盐引发4-氨基苯硼酸的氨基与N-羟基琥珀酰亚胺引发 HA的主链羧基进行缩合反应，得到的HA-g-PBA。
图3示出了根据本发明一个实施例的丙烯酸基修饰的葡萄糖氧化酶衍生物 GOx-AC的制备方法的示意性流程图。如图3所示，该步骤S100中制备获得 GOx-AC的制备方法包括：
步骤S101，将葡萄糖氧化酶溶解在第一缓冲溶液中以配置成所述葡萄糖氧化酶的质量百分比为0.5％-1.5％的第一溶液中；
步骤S102，将N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺溶于二甲基亚砜中，获得第二溶液，其中，所述N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺与所述葡萄糖氧化酶的摩尔比为 15-25:1；
步骤S103，将第二溶液施加至所述第一溶液中，且在室温下进行搅拌，透析提纯后得到GOx-AC。
该步骤S103中，搅拌的时间为大于等于4h，且小于等于8h，在透析提纯时使用截留分子量3500Da的透析袋。
该步骤S101中，该第一溶液中葡萄糖氧化酶的质量百分比过大则会影响与N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺的反应，无法生成预想产品。
图4示出了根据本发明一个实施例的带有苯硼酸葡萄糖氧化酶衍生物 GOx-g-PBA的制备方法的示意性流程图。如图4所示，该步骤S200包括：
步骤S210，将4-巯基苯硼酸溶于二甲基亚砜中，获得第三溶液，其中，所述4-巯基苯硼酸与所述葡萄糖氧化酶的摩尔比为15-25:1；
步骤S220，将第三溶液施加至GOx-AC中，并在30℃-37℃下进行搅拌，再透析提纯得到GOx-g-PBA。
该步骤S220中，搅拌的时间大于等于2h，且小于等于6h。
图5示出了根据本发明一个实施例的修饰有葡萄糖氧化酶的聚乙烯醇衍生物PVA-g-GOx的制备方法的示意性流程图。如图5所示，该步骤S300中制备得到修饰有葡萄糖氧化酶的聚乙烯醇衍生物PVA-g-GOx的方法包括：
步骤S310，将聚乙烯醇溶于第二缓冲液中以配置成聚乙烯醇的质量百分比为3％-10％的第四溶液中；
步骤S320，将GOx-g-PBA施加至所述第四溶液中，并在室温下进行搅拌，透析提纯后得到PVA-g-GOx。
该步骤S320中搅拌时间为大于等于12h，且小于等于24h，在透析提纯时使用截留分子量200Da的透析袋。
图6示出了根据本发明一个实施例的葡萄糖触发的活性氧响应复合水凝胶的制备方法的示意性流程图。如图6所示，该步骤S400中葡萄糖触发的活性氧响应复合水凝胶的制备方法包括：
步骤S410，将质量比为0.5-2:1的HA-g-PBA和PVA-g-GOx溶于第三缓冲液中，配置成第五溶液；
步骤S420，按照体积比为1:1的第五溶液通过双组份注射器进行混合注射，得到溶液在30℃-37℃下反应交联生成活性氧响应注射型复合水凝胶。
图7示出了根据本发明一个实施例的制备获得HA-g-PBA的反应机理图。图8示出了根据本发明一个实施例的制备获得PVA-g-GOx的反应机理图。图9 示出了根据本发明一个实施例的通过HA-g-PBA和PVA-g-GOx制备形成葡萄糖触发的活性氧响应注射型复合水凝胶的示意性机理图。由图7至图9可以看出各个产物的化学结构式。
图10示出了根据本发明实施例的活性氧响应注射型复合水凝胶降解的质量变化图。图10中，1表示HA-g-PBA和PVA-g-GOx质量比为18:10，2表示 HA-g-PBA/PVA-g-GOx质量比为15:8，3表示HA-g-PBA/PVA-g-GOx质量比为18:8，4表示HA-g-PBA/PVA-g-GOx质量比为15:10。由图10可知，12小时水凝胶降解几乎完成，24小时完全降解。
图11示出了根据本发明实施例的活性氧响应注射型复合水凝胶降解过程中溶液pH值的变化曲线图。图11中，1表示HA-g-PBA和PVA-g-GOx质量比为18:10，2表示HA-g-PBA和PVA-g-GOx质量比为15:8，3表示HA-g-PBA 和PVA-g-GOx质量比为18:8，4表示HA-g-PBA和PVA-g-GOx质量比为15:10。由图11可知PVA成功桥接葡萄糖氧化酶，且质量比为18：10的水凝胶葡萄糖响应最为明显。
图12示出了根据本发明实施例一的活性氧响应注射型复合水凝胶的力学性能表征图，其中，E’表示储能模量，E”表示损耗模量。图12中，HA-g-PBA 和PVA-g-GOx质量比为18：10。由图12可知，由上述方法制备获得的活性氧响应注射型复合水凝胶的力学性能良好。
以下以具体实施例来详细说明：
实施例1：
一种葡萄糖触发的活性氧响应注射型复合水凝胶的制备方法，包括如下步骤：
1)透明质酸-氨基苯硼酸衍生物(HA-g-PBA)的制备
将2g HA(分子量40KDa)溶于800mL的超纯水中，然后加入690mg 4- 氨基苯硼酸溶于100mL DMSO溶液，再加入1530mg 1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二酰亚胺盐酸盐，并通过盐酸调整溶液pH到4.5-5.0，再加入920mg N- 羟基琥珀酰亚胺，反应6小时；产物HA-g-PBA溶液经过透析提纯(使用截留分子量8-10KDa透析袋)后冻干保存。
2)修饰有葡萄糖氧化酶的聚乙烯醇衍生物的制备
取50mg葡萄糖氧化酶溶解在5mL缓冲溶液(PBS,pH＝7.4-8.0，150mM) 中，另取10μL N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺10％(w/v)DMSO溶液，滴加到葡萄糖氧化酶溶液中，室温搅拌4小时，产物GOx-AC在4℃下透析提纯(截留分子量3500透析袋)；再取20μL 4-巯基苯硼酸1％(w/v)DMSO溶液，滴加到上步提纯后的溶液中，37℃搅拌2小时，产物(GOx-g-MPBA)在4℃下透析提纯(截留分子量3500透析袋)；取10mL聚乙烯醇10％(w/v)缓冲溶液(PBS,pH＝7.4-8.0，150mM)，稀释2倍，再将透析提纯后溶液滴加到聚乙烯醇溶液中，室温搅拌12小时，透析提纯(截留分子量200KDa透析袋)后，冻干得到产物PVA-g-GOx。
3)水凝胶的制备
将步骤1)中所制HA-g-PBA 18mg溶解于100μL 150mM的缓冲液，其中缓冲液选择为磷酸缓冲盐溶液(PBS)，并且，该PBS缓冲液的pH值为7.4-8；步骤2)中所制PVA-g-GOx 10mg溶解于100μL 150mM PBS缓冲液中，并且，该PBS缓冲液的pH值为7.4-8；待两相完全溶解后等体积混合得到水凝胶前体溶液，再将水凝胶前体溶液在37℃烘箱交联固化40-60min形成葡萄糖触发的活性氧响应注射型复合水凝胶。
图13示出了根据本发明实施例一的活性氧响应注射型复合水凝胶的扫描电镜图。如图13所示，水凝胶断面SEM呈现出清晰孔道，呈三维网络状结构，说明结构很好，是良好的药物载体。
图14示出了根据本发明实施例一的HA-g-PBA和HA的傅里叶红外光谱图。如图14所示，图中1500-1600cm-1附近出现苯环峰可以看出HA主链成功缩合氨基苯硼酸。图15示出了根据本发明实施例一的PVA-g-GOx和GOx-AC 的傅里叶红外光谱图。如图15所示，图中同样在1500-1600cm-1附近出现苯环峰，同时在3200-3650cm-1处的O-H峰增强表明接有巯基苯硼酸的葡萄糖氧化酶成功与聚乙烯醇形成硼酸酯动态共价键。
实施例2：
一种葡萄糖触发的活性氧响应注射型复合水凝胶的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
1)透明质酸-氨基苯硼酸衍生物(HA-g-PBA)的制备
将2g HA(分子量20KDa)溶于800mL的超纯水中，然后加入1380mg 4- 氨基苯硼酸溶于100mL DMSO溶液，再加入3060mg 1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二酰亚胺盐酸盐，并通过盐酸调整溶液pH到4.5-5.0，再加入1920mg N-羟基琥珀酰亚胺，反应6小时；产物HA-APBA溶液经过透析提纯(截留分子量8-10KDa透析袋)后冻干保存。
2)修饰有葡萄糖氧化酶的聚乙烯醇衍生物的制备
取50mg葡萄糖氧化酶溶解在5mL缓冲溶液(PBS,pH＝7.4-8.0，150mM) 中，另取10μL N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺10％(w/v)DMSO溶液，滴加到葡萄糖氧化酶溶液中，室温搅拌4小时，产物GOx-AC在4℃下透析提纯(截留分子量3500透析袋)；再取20μL 4-巯基苯硼酸1％(w/v)DMSO溶液，滴加到上步提纯后的溶液中，37℃搅拌2小时，产物(GOx-g-MPBA)在4℃下透析提纯(截留分子量3500透析袋)；取10mL聚乙烯醇10％(w/v)缓冲溶液(PBS,pH＝7.4-8.0，150mM)，稀释3倍，再将透析提纯后溶液滴加到聚乙烯醇溶液中，室温搅拌12小时，透析提纯(截留分子量200KDa透析袋)后，冻干得到产物PVA-g-GOx。
3)水凝胶的制备
将实施例2步骤1)中所制HA-g-PBA 18mg溶解于100μL缓冲液(PBS, pH＝7.4-8.0,150mM)；步骤2)中所制PVA-g-GOx 10mg溶解于100μL缓冲液(PBS,pH＝7.4-8.0,150mM)；待两相完全溶解后等体积混合得到水凝胶前体溶液，再将水凝胶前体溶液在37℃烘箱交联固化40-60min形成葡萄糖触发的活性氧响应复合水凝胶。
实施例3
一种葡萄糖触发的活性氧响应注射型复合水凝胶的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
1)透明质酸-氨基苯硼酸衍生物(HA-g-PBA)的制备
将2g HA(分子量80KDa)溶于800mL的超纯水中，然后加入345mg 4- 氨基苯硼酸溶于100mL DMSO溶液，再加入760mg 1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二酰亚胺盐酸盐，并通过盐酸调整溶液pH到4.5-5.0，再加入480mg N- 羟基琥珀酰亚胺，反应6小时；产物HA-g-PBA溶液经过透析提纯(截留分子量8-10KDa透析袋)后冻干保存，得到HA-g-PBA。
2)修饰有葡萄糖氧化酶的聚乙烯醇衍生物的制备
取50mg葡萄糖氧化酶溶解在5mL缓冲溶液(PBS,pH＝7.4-8.0，150mM) 中，另取20μL N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺10％(w/v)DMSO溶液，滴加到葡萄糖氧化酶溶液中，室温搅拌4小时，产物GOx-AC在4℃下透析提纯(截留分子量3500透析袋)；再取60μL 4-巯基苯硼酸1％(w/v)DMSO溶液，滴加到上步提纯后的溶液中，37℃搅拌2小时，产物(GOx-g-MPBA)在4℃下透析提纯(截留分子量3500透析袋)；取10mL聚乙烯醇10％(w/v)缓冲溶液(PBS,pH＝7.4-8.0，150mM)，稀释3倍，再将透析提纯后溶液滴加到聚乙烯醇溶液中，室温搅拌12小时，透析提纯(截留分子量200KDa透析袋)后冻干得到产物PVA-g-GOx。
3)水凝胶的制备
将实施例3步骤1)中所制HA-g-PBA 18mg溶解于100μL缓冲液(PBS, pH＝7.4-8.0,150mM)；步骤2)中所制PVA-g-GOx 10mg溶解于100μL缓冲液(PBS,pH＝7.4-8.0,150mM)；待两相完全溶解后等体积混合得到水凝胶前体溶液，再将水凝胶前体溶液在37℃烘箱交联固化40-60min形成葡萄糖触发的活性氧响应复合水凝胶。
实施例4
一种葡萄糖触发的活性氧响应注射型复合水凝胶的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
1)透明质酸-氨基苯硼酸衍生物(HA-g-PBA)的制备
将2g HA(分子量40KDa)溶于800mL的超纯水中，然后加入690mg 4- 氨基苯硼酸溶于100mL DMSO溶液，再加入920mg 1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二酰亚胺盐酸盐，并通过盐酸调整溶液pH到4.5-5.0，再加入1530mg N- 羟基琥珀酰亚胺，反应6小时；产物HA-APBA溶液经过透析提纯(截留分子量8-10KDa透析袋)后，冻干保存。
2)修饰有葡萄糖氧化酶的聚乙烯醇衍生物的制备
取50mg葡萄糖氧化酶溶解在5mL缓冲溶液(PBS,pH＝7.4-8.0，150mM) 中，另取20μL N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺10％(w/v)DMSO溶液，滴加到葡萄糖氧化酶溶液中，室温搅拌4小时，产物GOx-AC在4℃下透析提纯(截留分子量3500透析袋)；再取40μL 4-巯基苯硼酸1％(w/v)DMSO溶液，滴加到上步提纯后的溶液中，37℃搅拌2小时，产物(GOx-g-MPBA)在4℃下透析提纯(截留分子量3500透析袋)；取15mL聚乙烯醇10％(w/v)缓冲溶液(PBS,pH＝7.4-8.0，150mM)，稀释3倍，再将透析提纯后溶液滴加到聚乙烯醇溶液中，室温搅拌12小时，透析提纯(截留分子量200KDa透析袋)后，冻干得到产物PVA-g-GOx。
3)水凝胶的制备
将实施例4步骤1)中所制HA-g-PBA 18mg溶解于100μL缓冲液(PBS, pH＝7.4-8.0,150mM)；步骤2)中所制PVA-g-GOx 10mg溶解于100μL缓冲液(PBS,pH＝7.4-8.0,150mM)；待两相完全溶解后等体积混合得到水凝胶前体溶液，再将水凝胶前体溶液在37℃烘箱交联固化40-60min形成葡萄糖触发的活性氧响应复合水凝胶。
实施例5
一种葡萄糖触发的活性氧响应注射型复合水凝胶的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
1)透明质酸-氨基苯硼酸衍生物(HA-g-PBA)的制备
将2g HA(分子量40KDa)溶于800mL的超纯水中，然后加入690mg 4- 氨基苯硼酸溶于100mL DMSO溶液，再加入920mg 1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二酰亚胺盐酸盐，并通过盐酸调整溶液pH到4.5-5.0，再加入1320mg N-羟基琥珀酰亚胺，反应6小时；产物HA-APBA溶液经过透析提纯(截留分子量8-10KDa透析袋)后冻干保存。
2)修饰有葡萄糖氧化酶的聚乙烯醇衍生物的制备
取50mg葡萄糖氧化酶溶解在5mL缓冲溶液(PBS,pH＝7.4-8.0，150mM) 中，另取10μL N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺10％(w/v)DMSO溶液，滴加到葡萄糖氧化酶溶液中，室温搅拌4小时，产物GOx-AC在4℃下透析提纯(截留分子量3500透析袋)；再取40μL 4-巯基苯硼酸1％(w/v)DMSO溶液，滴加到上步提纯后的溶液中，37℃搅拌2小时，产物(GOx-g-MPBA)在4℃下透析提纯(截留分子量3500透析袋)；取5mL聚乙烯醇10％(w/v)缓冲溶液 (PBS,pH＝7.4-8.0，150mM)，稀释3倍，再将透析提纯后溶液滴加到聚乙烯醇溶液中，室温搅拌12小时，透析提纯(截留分子量200KDa透析袋)后冻干得到产物PVA-g-GOx。
3)水凝胶的制备
将实施例5步骤1)中所制HA-g-PBA 18mg溶解于100μL缓冲液(PBS, pH＝7.4-8.0,150mM)；步骤2)中所制PVA-g-GOx 10mg溶解于100μL缓冲液(PBS,pH＝7.4-8.0,150mM)；待两相完全溶解后等体积混合得到水凝胶前体溶液，再将水凝胶前体溶液在37℃烘箱交联固化40-60min形成葡萄糖触发的活性氧响应复合水凝胶。
实施例6
一种葡萄糖触发的活性氧响应注射型复合水凝胶的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
1)透明质酸-氨基苯硼酸衍生物(HA-g-PBA)的制备
将2g HA(分子量40KDa)溶于800mL的超纯水中，然后加入690mg 4- 氨基苯硼酸溶于100mL DMSO溶液，再加入1530mg 1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二酰亚胺盐酸盐，并通过盐酸调整溶液pH到4.5-5.0，再加入920mg N- 羟基琥珀酰亚胺，反应6小时；产物HA-g-PBA溶液经过透析提纯(截留分子量8-10KDa透析袋)后冻干保存。
2)修饰有葡萄糖氧化酶的聚乙烯醇衍生物的制备
取50mg葡萄糖氧化酶溶解在5mL缓冲溶液(PBS,pH＝7.4-8.0，150mM) 中，另取10μL N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺10％(w/v)DMSO溶液，滴加到葡萄糖氧化酶溶液中，室温搅拌4小时，产物GOx-AC在4℃下透析提纯(截留分子量3500透析袋)；再取20μL 4-巯基苯硼酸1％(w/v)DMSO溶液，滴加到上步提纯后的溶液中，37℃搅拌2小时，产物(GOx-g-MPBA)在4℃下透析提纯(截留分子量3500透析袋)；取10mL聚乙烯醇10％(w/v)缓冲溶液(PBS,pH＝7.4-8.0，150mM)，稀释3倍，再将透析提纯后溶液滴加到聚乙烯醇溶液中，室温搅拌12小时，透析提纯(截留分子量200KDa透析袋)后，冻干得到产物PVA-g-GOx。
3)水凝胶的制备
将实施例6步骤1)中所制HA-g-PBA 15mg溶解于100μL缓冲液(PBS, pH＝7.4-8.0,150mM)；步骤2)中所制PVA-g-GOx 8mg溶解于100μL缓冲液 (PBS,pH＝7.4-8.0,150mM)；待两相完全溶解后等体积混合得到水凝胶前体溶液，再将水凝胶前体溶液在37℃烘箱交联固化40-60min形成葡萄糖触发的活性氧响应复合水凝胶。
实施例7
一种葡萄糖触发的活性氧响应注射型复合水凝胶的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
1)透明质酸-氨基苯硼酸衍生物(HA-g-PBA)的制备
将2g HA(分子量40KDa)溶于800mL的超纯水中，然后加入690mg 4- 氨基苯硼酸溶于100mL DMSO溶液，再加入1530mg 1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二酰亚胺盐酸盐，并通过盐酸调整溶液pH到4.5-5.0，再加入920mg N- 羟基琥珀酰亚胺，反应6小时；产物HA-g-PBA溶液经过透析提纯(截留分子量8-10KDa透析袋)后冻干保存。
2)修饰有葡萄糖氧化酶的聚乙烯醇衍生物的制备
取50mg葡萄糖氧化酶溶解在5mL缓冲溶液(PBS,pH＝7.4-8.0，150mM) 中，另取10μL N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺10％(w/v)DMSO溶液，滴加到葡萄糖氧化酶溶液中，室温搅拌4小时，产物GOx-AC在4℃下透析提纯(截留分子量3500透析袋)；再取20μL 4-巯基苯硼酸1％(w/v)DMSO溶液，滴加到上步提纯后的溶液中，37℃搅拌2小时，产物(GOx-g-MPBA)在4℃下透析提纯(截留分子量3500透析袋)；取10mL聚乙烯醇10％(w/v)缓冲溶液(PBS,pH＝7.4-8.0，150mM)，稀释2倍，再将透析提纯后溶液滴加到聚乙烯醇溶液中，室温搅拌12小时，透析提纯(截留分子量200KDa透析袋)后，冻干得到产物PVA-g-GOx。
3)水凝胶的制备
将实施例7步骤1)中所制HA-g-PBA 18mg溶解于100μL缓冲液(PBS, pH＝7.4-8.0,150mM)；步骤2)中所制PVA-g-GOx 8mg溶解于100μL缓冲液 (PBS,pH＝7.4-8.0,150mM)；待两相完全溶解后等体积混合得到水凝胶前体溶液，再将水凝胶前体溶液在37℃烘箱交联固化40-60min形成葡萄糖触发的活性氧响应复合水凝胶。
实施例8
一种葡萄糖触发的活性氧响应注射型复合水凝胶的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
1)透明质酸-氨基苯硼酸衍生物(HA-g-PBA)的制备
将2g HA(分子量40KDa)溶于800mL的超纯水中，然后加入690mg 4- 氨基苯硼酸溶于100mL DMSO溶液，再加入1530mg 1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二酰亚胺盐酸盐，并通过盐酸调整溶液pH到4.5-5.0，再加入920mg N- 羟基琥珀酰亚胺，反应6小时；产物HA-g-PBA溶液经过透析提纯(截留分子量8-10KDa透析袋)后冻干保存。
2)修饰有葡萄糖氧化酶的聚乙烯醇衍生物的制备
取50mg葡萄糖氧化酶溶解在5mL缓冲溶液(PBS,pH＝7.4-8.0，150mM) 中，另取10μL N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺10％(w/v)DMSO溶液，滴加到葡萄糖氧化酶溶液中，室温搅拌4小时，产物GOx-AC在4℃下透析提纯(截留分子量3500透析袋)；再取20μL 4-巯基苯硼酸1％(w/v)DMSO溶液，滴加到上步提纯后的溶液中，37℃搅拌2小时，产物(GOx-g-MPBA)在4℃下透析提纯(截留分子量3500透析袋)；取10mL聚乙烯醇10％(w/v)缓冲溶液(PBS,pH＝7.4-8.0，150mM)，稀释2倍，再将透析提纯后溶液滴加到聚乙烯醇溶液中，室温搅拌12小时，透析提纯(截留分子量200KDa透析袋)后，冻干得到产物PVA-g-GOx。
3)水凝胶的制备
将实施例8步骤1)中所制HA-g-PBA 15mg溶解于100μL缓冲液(PBS, pH＝7.4-8.0,150mM)；步骤2)中所制PVA-g-GOx 10mg溶解于100μL缓冲液(PBS,pH＝7.4-8.0,150mM)；待两相完全溶解后等体积混合得到水凝胶前体溶液，再将水凝胶前体溶液在37℃烘箱交联固化40-60min形成葡萄糖触发的活性氧响应复合水凝胶。
实施例9
注射型生物可降解水凝胶材料的应用：将实施例1制得的注射型生物可降解水凝胶材料与药物、蛋白、细胞、无机颗粒等混合均匀，再将混合溶液倒入容器、模型或注射植入到动物或人体组织、器官、身体空腔内，使溶液在37℃交联固化。
至此，本领域技术人员应认识到，虽然本文已详尽示出和描述了本发明的多个示例性实施例，但是，在不脱离本发明精神和范围的情况下，仍可根据本发明公开的内容直接确定或推导出符合本发明常用理的许多其他变型或修改。因此，本发明的范围应被理解和认定为覆盖了所有这些其他变型或修改。
Claims (1)
1. 葡萄糖触发的活性氧响应注射型复合水凝胶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1）透明质酸-氨基苯硼酸衍生物HA-g-PBA的制备
将分子量40Kda的2g HA溶于800mL的超纯水中，然后加入690mg 4-氨基苯硼酸溶于100mL DMSO溶液，再加入1530mg 1-乙基-3-（3-二甲氨基丙基）碳二酰亚胺盐酸盐，并通过盐酸调整溶液pH到4.5-5.0，再加入920mg N-羟基琥珀酰亚胺，反应6小时；产物HA-g-PBA溶液使用截留分子量8-10KDa透析袋，经过透析提纯后冻干保存；
步骤2）修饰有葡萄糖氧化酶的聚乙烯醇衍生物的制备
取50mg葡萄糖氧化酶溶解在5mL，pH=7.4-8.0，150mMPBS缓冲溶液中，另取10μL N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺10%（w/v）DMSO溶液，滴加到葡萄糖氧化酶溶液中，室温搅拌4小时，产物GOx-AC在4℃下使用截留分子量3500透析袋透析提纯；再取20μL 4-巯基苯硼酸1%（w/v）DMSO溶液，滴加到上步提纯后的溶液中，37℃搅拌2小时，产物GOx-g-MPBA在4℃下使用截留分子量3500透析袋透析提纯；取10mL采用pH=7.4-8.0，150mMPBS溶解的聚乙烯醇10%（w/v）缓冲溶液，稀释2倍，再将透析提纯后溶液滴加到聚乙烯醇溶液中，室温搅拌12小时，使用截留分子量200KDa透析袋透析提纯后，冻干得到产物PVA-g-GOx；
3）水凝胶的制备
将步骤1）中所制HA-g-PBA 18mg溶解于100μL 150mM的缓冲液，其中缓冲液选择为磷酸缓冲盐溶液PBS，并且，该PBS缓冲液的pH值为7.4-8；步骤2）中所制PVA-g-GOx 10mg溶解于100μL 150mM PBS缓冲液中，并且，该PBS缓冲液的pH值为7.4-8；待两相完全溶解后等体积混合得到水凝胶前体溶液，再将水凝胶前体溶液在37℃烘箱交联固化40-60 min形成葡萄糖触发的活性氧响应注射型复合水凝胶。
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| CN202110916825.8A CN113599507B (zh) | 2021-08-11 | 葡萄糖触发的活性氧响应注射型复合水凝胶的制备方法 |
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Citations (2)
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|---|---|---|---|---|
| CN110256669A (zh) * | 2019-06-10 | 2019-09-20 | 温州医科大学 | 巯基/硼酸基修饰聚合物、葡萄糖敏感水凝胶组合物、葡萄糖敏感载药水凝胶及其制备方法 |
| CN110498936A (zh) * | 2019-07-15 | 2019-11-26 | 北京化工大学 | 一种透明质酸钠/海藻酸钠注射型复合水凝胶的制备方法 |
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| CN110256669A (zh) * | 2019-06-10 | 2019-09-20 | 温州医科大学 | 巯基/硼酸基修饰聚合物、葡萄糖敏感水凝胶组合物、葡萄糖敏感载药水凝胶及其制备方法 |
| CN110498936A (zh) * | 2019-07-15 | 2019-11-26 | 北京化工大学 | 一种透明质酸钠/海藻酸钠注射型复合水凝胶的制备方法 |
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