CN113577636B - 亲油疏水高活性负载微生物沥青多孔材料的制备与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供负载混合微生物多孔材料的制备方法，包括以下步骤：S1，亲水亲油沥青多孔材料的制备；S2，混合菌悬液的制备；S3，负载混合微生物多孔材料的制备。本发明还提供亲油疏水高活性负载微生物沥青多孔材料的制备方法，是将聚偏氟乙烯用N,N‑二甲基甲酰胺溶解，将负载混合微生物多孔材料浸泡其中得到的。本发明的负载混合微生物多孔材料和亲油疏水高活性负载微生物沥青多孔材料能够有效降解石油中的中长链烷烃，尤其是正十六烷。

Description

亲油疏水高活性负载微生物沥青多孔材料的制备与应用
技术领域
本发明属于环境材料应用技术领域，具体涉及亲油疏水高活性负载微生物沥青多孔材料的制备方法，本发明还涉及该多孔材料在降解正十六烷中的应用。
背景技术
称为“工业血液”的石油不仅是工业生产中重要的化石原料，也是许多化学工业产品如溶剂、化肥、杀虫剂和塑料等的原料。在石油开采、加工、运输及使用过程中，原油以及各种石油制品的泄漏和排放造成严重的石油污染。正十六烷烃是原油轻质油长链烷烃中的重要成分之一，它具有水溶性低、难挥发的特点，一旦进入环境就很难被消除，属于持久性污染物。因此，迫切需要通过高效、高性能、低成本且绿色环保的技术来解决这个问题。迄今为止，研究采用了物理法、化学法、生物法等多种方法来消除石油衍生污染。相比物理和化学处理方法，生物处理方法具有很大的优势，它能够通过生物降解方式处理含油成分，具有处理效果好、费用低、对环境影响小及应用范围广等优点,已得到大多数研究者的青睐。多项研究表明，游离微生物，降解时间长，受环境因素干扰较大，游离微生物会表现出单位体积内有效浓度低等特点。由此，面对单一应变使复杂成分的石油快速降解，可通过微生物固定技术，将多种微生物限定在一定的空间区域内，使微生物高度密集并保持生物活性功能，提高微生物降解效率。在微生物固定过程中载体材料扮演着重要的角色，沥青作为负载微生物多孔材料，具有良好的生物兼容性，价格低廉，为微生物提供丰富的碳源、化害为利，变废为宝等优点。目前，研究通常以包埋和吸附的方式固定微生物，由于微生物固定量较少，吸附方式结合力弱等缺点限制其推广应用。因此，开发探究新型具有高活性高性能的负载微生物多孔材料将成为今后研究的主要方向。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了亲油疏水高活性负载微生物沥青多孔材料的制备方法和其在降解正十六烷中的应用。本发明采用多次浓缩的固定方式，将混合菌剂进行负载在沥青多孔材料中。一方面，可以有效增加微生物数量，提高微生物与负载材料中的结合力，增强微生物的活性。另一方面可以利用微生物的协同效应，发挥微生物的高效能，促进微生物降解，达到高效降解的目的。
为了实现本发明的技术目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明提供负载混合微生物多孔材料的制备方法，包括以下步骤：
S1，亲水亲油沥青多孔材料的制备：将溶解在有机溶剂中的沥青与溶解在蒸馏水中的十二烷基磺酸钠混合均匀，加入饱和NaCl溶液，得到灰色均一的乳浊液，静置使得未反应的二氯甲烷挥发，之后将其放入含有丙酮的液氮后迅速放入冷冻干燥机中干燥，然后进行炭化，洗涤去除NaCl，得到亲水亲油沥青多孔材料；
S2，混合菌悬液的制备：将苏云金芽孢杆菌BT，铜绿假单胞菌A6，鲁菲不动杆菌A5，白色类诺卡氏菌F1，芽孢杆菌BS分别制成菌液，按照等体积比混合制成混合菌悬液；
S3，负载混合微生物多孔材料的制备：将步骤S1制备的亲水亲油沥青多孔材料PPM用聚乙烯醇粘连，之后放入步骤S2制备的混合菌悬液中吸附混合菌，然后用Ca2+进行交联，得到负载混合微生物多孔材料。
作为优选，步骤S1中，所述沥青与有机溶剂的用量比为1.0-1.1g：1.5-1.7mL；和/或
所述沥青、十二烷基磺酸钠、饱和氯化钠的用量比为1.0-1.1g：2.0-2.2g：1.9-2.0mL；和/或
所述十二烷基磺酸钠与蒸馏水的重量比为2.0-2.2g：8.0-8.8mL。
作为优选，步骤S1中，所述炭化是将温度以2-5℃的升温速率升温至160-180℃保温2-4h，优选以2℃/min升温速率升至温度180℃保温2h。
作为优选，步骤S3中，所述Ca2+的重量百分比浓度为0.98-1.22％；和/或
所述步骤S3重复1-5次。
本发明还提供一种负载混合微生物多孔材料，其是应用上述的方法制备得到的。
本发明还提供亲油疏水高活性负载微生物沥青多孔材料的制备方法，包括以下步骤：将聚偏氟乙烯用N,N-二甲基甲酰胺溶解，将上述的负载混合微生物多孔材料放入其中浸泡直至负载混合微生物多孔材料表面全部覆盖溶液，取出放入蒸馏水中，得到亲油疏水高活性负载微生物沥青多孔材料；
作为优选，所述聚偏氟乙烯与N,N-二甲基甲酰胺的用量比为1g:5mL。
本发明还提供一种亲油疏水高活性负载微生物沥青多孔材料，其是应用上述的方法制备得到的。
本发明还提供上述的负载混合微生物多孔材料，或，亲油疏水高活性负载微生物沥青多孔材料在降解石油烃中的应用；所述石油烃为长链正构烷烃，中长链烷烃，藿烷或甾烷；作为优选，所述中长链烷烃为C4-C16链烷烃，作为进一步优选，所述中长链烷烃为正十六烷。
本申请采用的是从含油污泥中分离纯化得到的几株高效降解石油菌，该菌不仅能降解正十六烷，还可以将高碳数的正构烷烃降解为中碳数和低碳数的烷烃，最后转化成水和二氧化碳。除此之外，该菌剂还可以降解正构烷烃、藿烷、甾烷，当把上述菌剂负载到沥青多孔材料中，理论上可以降解长链正构烷烃，中长链烷烃，藿烷，甾烷。
作为优选，所述降解时的温度为27～47℃，优选37℃；和/或
所述降解时的pH为2～10，优选pH为6；和/或
所述石油链烷烃的重量百分比浓度为1％-5％。
本发明以多次浓缩固定微生物、亲油疏水选择性改性为主要手段，介绍了负载混合微生物多孔材料和亲油疏水高活性负载微生物沥青多孔材料的合成方法。其次介绍了其生物活性方面的应用，研究其在石油烃模拟油正十六烷中的降解性能。本发明采用水包油(O/W)乳液法得到蜂窝结构的沥青多孔材料。该材料化害为利，变废为宝，具备机械性强、可循环使用、吸附量大、亲水亲油性能。同时将降解石油烃的五种菌剂等比例混合，通过多次浓缩法，使混合菌剂负载在沥青多孔材料中，加强微生物与沥青多孔材料的结合力，提高单位体积微生物的数量，增强单位体积微生物的生物活性。对负载微生物沥青多孔材料表面包覆一层疏水亲油薄膜，使其具有选择吸附性能，增强其与模拟油正十六烷的接触率，达到高效降解的目的。其次研究了在石油烃模拟油正十六烷中的降解性能。本发明通过粘连剂聚乙烯醇(PVA)和交联剂Ca2+多次浓缩菌剂和选择性吸附疏水改性对提高降解率起着关键性作用。通过对其修复研究，初步认为本发明中制备的这种亲油疏水高活性负载混合微生物沥青多孔材料具有较好的降解正构烷烃特性，在未来的石油污染修复具有一定的实际应用价值。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1为本发明的亲油疏水高活性负载微生物沥青多孔材料的制备及降解路线图。
图2为PPM的扫描电子显微镜图。
图3为MPP(@)的扫描电镜(SEM)图。
图4中，a为实施例2制备的负载混合微生物多孔材料，b为实施例3制备的亲油疏水高活性负载微生物沥青多孔材料。
图5中，图a-c分别为游离菌剂、PPM(@)和H-PPM(@)GC原图，图d为在37℃、120r/min、pH＝6、正十六烷浓度为3％的条件下，游离混合菌、PPM(@)和H-PPM(@)在不同降解时间下的降解率。
图6为在37℃、120r/min、pH＝6，降解时间为50h时，游离菌(suspendedcell)、PPM(@)和H-PPM(@)在不同正十六烷浓度的降解率。
图7(a)为在120r/min、pH＝6，降解时间为60h时，游离菌(suspended cell)、PPM(@)和H-PPM(@)在不同温度条件下的降解率。图7(b)为在37℃，120r/min，降解时间为60h时，游离菌(suspendedcell)、PPM(@)和H-PPM(@)在不同pH条件下的降解率。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均购自常规生化试剂公司。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
本发明的亲油疏水高活性负载微生物沥青多孔材料的制备及降解路线如图1所示。
图1为本发明的亲油疏水高活性负载微生物沥青多孔材料的制备及降解路线图。
本发明所使用的菌株：苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，BT)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，A6)鲁菲不动杆菌(Acinetobacter lwoffii，A5)，白色类诺卡氏菌Nocardioides luteus，F1)、芽孢杆菌(Aacillus，BS)。
其中，苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，BT)在文献“苏云金芽孢杆菌对PAHs的降解研究，雒晓芳等，生物技术通报”中已公开。
铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，A6)鲁菲不动杆菌(Acinetobacterlwoffii，A5)，白色类诺卡氏菌Nocardioides luteus，F1)在文献“Study onbiologicaldegradation and transform characteristics of different components inpetroleum hydrocarbon used by bacterial consortium，Lihua Chen，etc.，EnvironEarth Sci”中已公开。
芽孢杆菌(Aacillus，BS)在文献“Study of the Characteristics of TwoImmobilized Microbial Materials in Degradation and Evolution ofPetroleumHydrocarbon，Xiaofang Luo，etc.，”中已公开。
本申请人承诺自申请日起20年内向公众提供上述5株菌。
本发明的亲油疏水高活性负载微生物沥青多孔材料的制备方法步骤如下：
一、亲水亲油沥青多孔材料PPM的制备
称取1.0-1.1g沥青，加入含有1.5-1.65mL溶剂比如二氯甲烷的烧杯中，机械搅拌使其充分溶解，比如搅拌20min。同时称量2.0-2.2g的十二烷基磺酸钠，放入含有8.0-8.8mL的蒸馏水(蒸馏水为十二烷基磺酸钠的溶剂，该蒸馏水用量能够使其充分发泡)的烧杯中，搅拌使十二烷基磺酸钠充分发泡，比如搅拌15min。将上述两种溶液混合均匀，加入1.9-2.0mL饱和NaCl溶液，得到灰色均一的乳浊液，将乳浊液倒入直径为2.5cm的圆柱塑料模具中固定，在室温下静置以使未反应的二氯甲烷挥发，比如静置30min，最后将其放入含有体积百分比为50％丙酮的液氮(因为液氮温度较低，加入丙酮可将温度保持在-100℃左右)后迅速放入冷冻干燥机中，冷冻干燥机温度设置为-40～-50℃，干燥36h。为了加强其机械性能，需要进行炭化，炭化的方式是将温度以2-5℃的升温速率升温至160-180℃保温2-4h，当以2℃/min升温速率升至温度180℃保温2h的方式进行炭化时效果最佳，蒸馏水多次浸泡洗涤，除去材料中的NaCl，得到蜂窝状的亲水亲油沥青多孔材料，命名为PPM。将PPM在121℃下高压蒸汽灭菌30min，冷却至室温后备用。
沥青与二氯甲烷的用量比选择为1.0-1.1g：1.5-1.7mL。
二氯甲烷的作用是使石油沥青溶解，二氯甲烷过多会造成试剂的浪费，二氯甲烷过低，不易形成乳浊液。显然，此处也可以使用能溶解沥青的其他溶剂。
本发明制备沥青多孔材料采用软模板技术，十二烷基磺酸钠作为连续相，沥青为分散相，沥青与十二烷基磺酸钠的重量比为1.0-1.1：2.0-2.2，当十二烷基磺酸钠的量较少，形成的沥青孔结构较少，且分布不均匀。十二烷基磺酸钠的含量过多，制备出的沥青多孔材料过于疏松，机械强度较差，无法进行微生物菌剂的负载。
所述加入饱和氯化钠有两个作用，一方面，十二烷基磺酸钠与沥青溶液进行混合时，发生团聚现象，加入饱和氯化钠，可有效阻止团聚的发生。另一方面，当进行冷冻干燥时饱和氯化钠晶体析出，经过炭化后洗涤，氯化钠被剔除，留下孔结构。当饱和氯化钠含量过少时，团聚现象消除不明显，当饱和氯化钠含量过多时，导致成为了水溶液，形成不了乳浊液。
通过实验可知，每1.9-2.0mL饱和NaCl溶液可以使含2.0-2.2g十二烷基磺酸钠的溶液与含1.0-1.1g沥青的溶液形成均一的乳浊液。
由于十二烷基磺酸钠是表面活性剂，需要进行超低温冷冻，在冷冻干燥机的作用下，可以使样品中的水分以冰的存在方式下直接升华，使样品中产生较多的孔。然而不将其先放入液氮中而是直接将其进行冷冻干燥会造成样品损坏，且不成型。
经过优化实验结果表明，炭化时，以2℃/min升温速率升至温度180℃保温2h，沥青多孔材料可以保持形貌完整，且不发生坍塌。未经过炭化时，制备出的沥青多孔材料比较疏松，遇水溶解，当经过炭化后，材料可以浸泡在水溶液中，经试验，浸泡一个月，材料不会被溶解。
二、混合菌悬液的制备：将苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，BT)，铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，A6)，鲁菲不动杆菌(Acinetobacter lwoffii，A5)，白色类诺卡氏菌(Nocardioides luteus，F1)，芽孢杆菌(Aacillus，BS)5株菌按照相应文献中的方法进行三级扩大培养制成菌液，菌液浓度在1×1010～1×1012cfu·mL-1，按照等体积比混合制成混合菌悬液。利用稀释涂布平板法检测混合菌液菌落活性数，达到1×1010～1×1012cfu·mL-1后，4℃下储存待用。
三、将灭菌后的亲水亲油沥青多孔材料放入重量百分比3％聚乙烯醇(PVA)溶液中，浸泡20min从而将3％的PVA充分渗透到沥青多孔材料中，进行抽滤，去除多余PVA，并用蒸馏水冲洗其表面，防止外壁孔道堵塞。然后放入步骤(2)的混合菌悬液中浸泡至少20分钟，使得沥青多孔材料充分吸附菌悬液，得到负载菌悬液的沥青多孔材料。再将负载菌悬液的沥青多孔材料在37～40℃下干燥1h，此时混合菌剂已浓缩负载在PVA表面或包裹其中，最后放入含重量百分比为0.98-1.22％的Ca2+溶液中(4℃条件下)交联1h，抽滤多余未反应的含Ca2+溶液，干燥。
聚乙烯醇的作用是粘连剂，能够将混合菌剂充分吸附在沥青多孔材料中。
Ca2+的作用是交联剂，在溶液中，Ca2+的重量百分比为0.98-1.22％时交联效果较好。
本发明通过PVA将微生物牢固的负载在沥青多孔材料孔隙上，再用Ca2+交联PVA使牢固的粘连在沥青多孔材料上，从而增加微生物数量，提高降解率。
在本发明中，可以使用Ca(NO3)2、CaCl2等含Ca2+溶液作为交联剂使用。
四、重复步骤三多次，比如1-5次，得到负载混合微生物多孔材料，命名MPP(@)。
多次重复负载微生物可以加强微生物与沥青多孔材料的结合力，提高单位体积微生物的数量，增强单位体积微生物的生物活性。
五、称取5g的聚偏氟乙烯放入25mLN,N-二甲基甲酰胺的烧杯中充分溶解，将步骤五制备的负载混合微生物多孔材料放入上述溶液中浸泡直至负载混合微生物多孔材料表面全部覆盖溶液，取出放入蒸馏水中，其表面形成一种疏水亲油薄膜，得到亲油疏水高活性负载微生物沥青多孔材料，命名为H-PPM(@)。
其中，N,N-二甲基甲酰胺是聚偏氟乙烯的溶剂。
聚偏氟乙烯作为沥青多孔材料改性的关键，与N,N-二甲基甲酰胺的用量比为1g:5mL，因为负载微生物的沥青多孔材料只需要表面改性，表面只需形成一层薄薄的薄膜。浓度过高时，形成较厚薄膜，不利于正十六烷的传输。浓度过低时，无法形成膜结构，达不到改性的目的。
N,N-二甲基甲酰胺可以遇水溶解，形成一层疏水聚偏氟乙烯薄膜。由于形成疏水膜，不用再次干燥。
蒸馏水可以将未发生反应的N,N-二甲基甲酰胺溶解在水中，同时可以形成疏水亲油薄膜。
实施例1亲水亲油沥青多孔材料PPM的制备
称取1.0g沥青，加入含有1.5mL二氯甲烷的烧杯中，机械搅拌20min，使其充分溶解。同时称量2.0g的十二烷基磺酸钠，放入含有8.0mL的蒸馏水的烧杯中，搅拌15min使十二烷基磺酸钠充分发泡。将上述两者溶液混合均匀，加入2.0mL饱和NaCl溶液，得到灰色均一的乳浊液，将乳浊液倒入直径为2.5cm的圆柱塑料模具中固定，在室温下静置30min，最后将其放入含有50％丙酮液氮后迅速放入冷冻干燥机中，在-40℃下干燥36h。为了加强其机械性能，以2℃/min升温速率升至温度180℃保温2h进行炭化，蒸馏水多次浸泡洗涤，除去材料中的NaCl，得到蜂窝状的亲水亲油沥青多孔材料，命名为PPM。
制备得到的亲水亲油沥青多孔材料直径为2cm，高0.5cm，质量为1.0g。
图2为PPM的扫描电子显微镜图。其中，图a为PPM横截面的扫描电子显微镜图，图b为PPM纵截面的扫描电子显微镜图。
图2通过扫描电子显微镜(SEM)对沥青多孔材料的形貌表征，图a在放大1000倍条件下，剖面图像清晰地看到大致有序的大孔。如图b所示，放大1000倍条件下，沥青多孔材料横截面图，孔隙大致均匀，且紧密相连，呈多孔蜂窝结构，这样特殊的孔联结构，使得制备得到沥青多孔材料具有较低的扩散阻力、较低的密度、相对高的比表面积和丰富的潜在活性位点，为内部微生物的生长提供了良好生存环境。
对复合材料进行亲水性测试，结果为：能够吸收大量的水分和油分，说明沥青多孔材料亲水亲油，具体实验过程如下：
将1.0g的沥青多孔材料分别浸泡在水和油中，30min后称其质量为2.0g、1.5g，经过高速摄像机表明水滴在1205ms时可完全浸入，油滴在27ms时完全浸入。充分证明沥青多孔材料具有超亲水和超亲油的性能。
实施例2负载混合微生物多孔材料PPM(@)的制备
(1)亲水亲油沥青多孔材料PPM合成：同实施例1。
(2)混合菌悬液的制备：将苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，BT)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，A6)鲁菲不动杆菌(Acinetobacter lwoffii，A5)，白色类诺卡氏菌Nocardioides luteus，F1)，芽孢杆菌(Aacillus，BS)5株菌进行三级扩大培养制成菌液，菌液浓度分别为1×1010～1×1012cfu·mL-1，按照等体积比混合制成混合菌悬液。利用稀释涂布平板法检测混合菌液菌落活性数，达到1×1010～1×1012cfu·mL-1后，4℃下储存待用。
(3)将步骤(1)制备的亲水亲油沥青多孔材料PPM在121℃下高压蒸汽灭菌30min，冷却至室温后备用。
(4)将灭菌后的亲水改性沥青多孔材料放入重量百分比3％聚乙烯醇(PVA)溶液中，浸泡20min，进行抽滤，去除多余PVA，并用蒸馏水冲洗其表面，防止外壁孔道堵塞。放入步骤(2)的混合菌悬液中浸泡20min，得到负载菌悬液的沥青多孔材料。再将负载菌悬液的沥青多孔材料在38℃下干燥1h，此时混合菌剂已浓缩负载在PVA表面或包裹其中，最后放入重量百分比为5％Ca(NO3)2溶液中(4℃条件下)交联1h，抽滤多余未反应的Ca(NO3)2溶液，干燥。
(5)重复步骤(4)5次，得到负载混合微生物多孔材料，命名PPM(@)。
图3为PPM(@)的扫描电镜(SEM)图。其中，图a为浓缩1次的PPM(@)的扫描电镜图，图b为浓缩3次的PPM(@)的扫描电镜图，图c为浓缩5次的PPM(@)的扫描电镜图。
如图3所示，从图中可直观看出有杆状的、球状的颗粒，浓缩5次的微生物数量远大于单次浓缩。这是由于微生物成功被负载到沥青多孔材料中。负载混合菌剂次数越多，细菌堆积成块状越显著，主要因为负载在大孔材料上的混合菌剂，不受菌群化学信息交流达到生长阈值，而是自由生殖直到生长空间受限。由此得出，采用多次浓缩，逐次积累叠加，有助于增加负载微生物的数量。
沥青多孔材料中平均吸附菌悬液的量分别为：每1.0g沥青多孔材料在第1、2、3、4、5次分别吸附菌悬液：1.5g、1.0g、0.8g、0.7g、0.5g。
实施例3亲油疏水高活性负载微生物沥青多孔材料H-PPM(@)的制备
(1)负载混合微生物多孔材料的制备：同实施例2。
(2)称取5g的聚偏氟乙烯放入25mLN,N-二甲基甲酰胺的烧杯中充分溶解，将步骤(1)制备的负载混合微生物多孔材料放入上述溶液中浸泡，取出放入蒸馏水中，其表面形成一种疏水亲油薄膜，得到亲油疏水高活性负载微生物沥青多孔材料，命名为H-PPM(@)。
图4中，a为实施例2制备的负载混合微生物多孔材料，b为实施例3制备的亲油疏水高活性负载微生物沥青多孔材料。
如图4中a所示，水滴完全浸入实施例2制备的负载混合微生物多孔材料的表面，如图4中b所示，水滴在实施例3制备的亲油疏水高活性负载微生物沥青多孔材料的接触角显示为100.1°，大于90°，表明：实施例3制备的亲油疏水高活性负载微生物沥青多孔材料具有疏水性。这种疏水亲油膜具有选择吸附性能，正十六烷烃能够被迅速吸附到沥青多孔材料中，加快微生物降解速率。
实施例4亲水亲油沥青多孔材料PPM的制备
称取1.1g沥青，加入含有1.65mL二氯甲烷的烧杯中，机械搅拌20min，使其充分溶解。同时称量2.2g的十二烷基磺酸钠，放入含有8.8mL的蒸馏水的烧杯中，搅拌18min使十二烷基磺酸钠充分发泡。将上述两者溶液混合均匀，加入1.9mL饱和NaCl溶液，得到灰色均一的乳浊液，将乳浊液倒入直径为2.5cm的圆柱塑料模具中固定，在室温下静置30min，最后将其放入含有50％丙酮液氮后迅速放入冷冻干燥机中，在-50℃下干燥36h。为了加强其机械性能，以2℃/min升温速率升至温度180℃保温2h进行炭化，蒸馏水多次浸泡洗涤，除去材料中的NaCl，得到蜂窝状的亲水亲油沥青多孔材料，命名为PPM。
实施例5负载混合微生物多孔材料PPM(@)的制备
(1)亲水亲油沥青多孔材料PPM合成：同实施例1。
(2)混合菌悬液的制备：将苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，BT)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，A6)鲁菲不动杆菌(Acinetobacter lwoffii，A5)，白色类诺卡氏菌Nocardioides luteus，F1)，芽孢杆菌(Aacillus，BS)5株菌进行三级扩大培养制成菌液，菌液浓度分别为1×1010～1×1012cfu·mL-1，按照等体积比混合制成混合菌悬液。利用稀释涂布平板法检测混合菌液菌落活性数，达到1×1010～1×1012cfu·mL-1后，4℃下储存待用。
(3)将步骤(1)制备的亲水亲油沥青多孔材料PPM在121℃下高压蒸汽灭菌30min，冷却至室温后备用。
(4)将灭菌后的亲水改性沥青多孔材料放入重量百分比3％聚乙烯醇(PVA)溶液中，浸泡20min，进行抽滤，去除多余PVA，并用蒸馏水冲洗其表面，防止外壁孔道堵塞。放入步骤(2)的混合菌悬液中浸泡25min，得到负载菌悬液的沥青多孔材料。再将负载菌悬液的沥青多孔材料在40℃下干燥1h，此时混合菌剂已浓缩负载在PVA表面或包裹其中，最后放入重量百分比为4％Ca(NO3)2溶液中(4℃条件下)交联1h，抽滤多余未反应的Ca(NO3)2溶液，干燥。
(5)重复步骤(4)5次，得到负载混合微生物多孔材料，命名PPM(@)。
实施例6亲油疏水高活性负载微生物沥青多孔材料H-PPM(@)的制备
(1)负载混合微生物多孔材料的制备：同实施例2。
(2)称取5g的聚偏氟乙烯放入25mLN,N-二甲基甲酰胺的烧杯中充分溶解，将步骤(1)制备的负载混合微生物多孔材料放入上述溶液中浸泡，取出放入蒸馏水中，其表面形成一种疏水亲油薄膜，得到亲油疏水高活性负载微生物沥青多孔材料，命名为H-PPM(@)。
实施例7本发明的亲油疏水高活性负载微生物沥青多孔材料在模拟含油废水的修复
一、在50mL锥形瓶中加入30mL去离子水和0.175mL正十六烷(相对于菌剂的固定量，正十六烷的重量百分比浓度为3％)，得到模拟含油废水，分别将4.5g实施例2步骤(2)制备的混合菌悬液、4.5g实施例2制备的负载混合微生物多孔材料PPM(@)、4.5g实施例3制备的亲油疏水高活性负载微生物沥青多孔材料H-PPM(@)投入其中，在37℃、120r/min、pH＝6的条件下降解10h、20h、30h、40h、50h、60h、70h、80h。分别通过GC(Clarus GC-TotalChrom，美国珀金埃尔默仪器(上海)有限公司)对其进行定量分析，通过标准曲线计算其降解率。GC的测量条件为：柱温为180℃；维持2min，进样器和FID检测器温度均为220℃。氮气，氢气和空气的固定流速分别为20、45和450mL/min。
图5中，图a-c分别为混合菌悬液(在该图中，为“游离菌”)、PPM(@)和H-PPM(@)的GC原图，图d为在37℃、120r/min、pH＝6、正十六烷重量百分比浓度为3％的条件下，游离混合菌、PPM(@)和H-PPM(@)在不同降解时间下的降解率。
如图5中(a-c)所示，游离混合菌、PPM(@)和H-PPM(@)的GC原图上观察到随着降解时间的增加，峰面积逐渐减少，从而可以判断出正十六烷的残留量逐渐减少，37℃条件下，80h后降解率分别到达到64.1％、89.3％、96.75％。如图5中(d)所示，37℃条件下，70h时，H-PPM(@)降解达到平衡，此时游离混合菌，PPM(@)，亲油疏水高活性负载微生物沥青多孔材料H-PPM(@)降解率分别为58.35％、84.53％、96.89％，相比较可知，游离混合菌的降解率小于负载微生物沥青多孔材料以及小于疏水改性负载微生物沥青多孔材料，主要因为游离微生物受环境因素干扰较大，单位体积内有效浓度低，而负载混合微生物多孔材料具有储存微生物丰富的孔道结构，可以为微生物的增殖提供更多的生长空间，直到载体上的自由空间完全被充满，可得到密集程度高的微生物，同时采用多次浓缩的负载微生物的方式，弥补了传统吸附法结合力弱的不足，通过PVA将微生物牢固的负载在材料孔隙上，再用Ca2+交联PVA使牢固的粘连在沥青多孔材料上，从而增加微生物数量，提高速率降解率。其次将负载微生物沥青多孔材料表面疏水改性，将其表面形成一层疏水亲油薄膜，这种薄膜选择性的将正十六烷吸附到负载微生物的H-PPM@复合材料中，增加微生物与十六烷接触面积，促进疏水性正十六烷在H-PPM@中的传递速率，从而提高微生物利用度，加快了微生物对正十六烷的降解。
二、固定其他条件，在不同正十六烷浓度下进行降解，降解结果见图6。
图6为在37℃、120r/min、pH＝6，降解时间为50h时，游离菌(suspended cell)、PPM(@)和H-PPM(@)在不同正十六烷浓度的降解率。
如图6所示，从图中可以明显观察到H-PPM@、PPM@和游离菌降解正十六烷具有同步性，随着正十六烷浓度的增加，其降解率都在逐渐下降，且呈持续下降的趋势，但是下降幅度不明显，降解率在数值上相差不大，说明重量百分比浓度在1％-5％的模拟油(相对于菌剂的含量)中H-PPM@、PPM@和游离菌对正十六烷的降解效果影响不大。
三、固定其他条件，在不同温度和pH值下进行降解，降解结果见图7。
图7(a)为在120r/min、pH＝6，降解时间为60h时，游离菌(suspended cell)、PPM(@)和H-PPM(@)在不同温度条件下的降解率。图7(b)为在37℃，120r/min，降解时间为60h时，游离菌(suspended cell)、PPM(@)和H-PPM(@)在不同pH条件下的降解率。
如图7(a)所示，研究了在不同的温度条件下，H-PPM(@)、PPM(@)和游离菌对正十六烷的降解性能，研究结果表明，在120r/min，pH＝6条件下，随着温度的升高，H-PPM(@)、PPM(@)和游离菌降解率先增大后减小的趋势，在温度为37℃下，H-PPM(@)、PPM(@)和游离菌对3％的正十六烷降解率达到最大，在较低温度下游离菌对正十六烷的降解率高于较高温度。H-PPM(@)、PPM(@)对正十六烷的降解率高温大于低温，远远高于游离菌剂，且在27～47℃降解率仍然分别保持在60％以上。
如图7(b)所示，随着pH值的增加，H-PPM(@)、PPM(@)和游离菌的降解率呈先增大后减小的趋势，在pH＝6时降解率达到最大，H-PPM(@)、PPM(@)对正十六烷的降解率在碱性条件下高于酸性条件，且在pH在2～10时降解率仍然分别保持在54％以上。综上所述，本发明的负载混合微生物多孔材料PPM(@)和亲油疏水高活性负载微生物沥青多孔材料H-PPM(@)为微生物提供庇护所，使微生物在恶劣的环境中保持其较强的生物降解能力。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (12)

1.负载混合微生物多孔材料的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1，亲水亲油沥青多孔材料的制备：将溶解在有机溶剂中的沥青与溶解在蒸馏水中的十二烷基磺酸钠混合均匀，加入饱和NaCl溶液，得到灰色均一的乳浊液，静置使得未反应的二氯甲烷挥发，之后将其放入含有丙酮的液氮后迅速放入冷冻干燥机中干燥，然后进行炭化，洗涤去除NaCl，得到亲水亲油沥青多孔材料；
S2，混合菌悬液的制备：将苏云金芽孢杆菌BT，铜绿假单胞菌A6，鲁菲不动杆菌A5，白色类诺卡氏菌F1，芽孢杆菌BS分别制成菌液，按照等体积比混合制成混合菌悬液；
S3，负载混合微生物多孔材料的制备：将步骤S1制备的亲水亲油沥青多孔材料PPM用聚乙烯醇粘连，之后放入步骤S2制备的混合菌悬液中吸附混合菌，然后用Ca2+进行交联，得到负载混合微生物多孔材料；
其中，步骤S1中，所述沥青与有机溶剂的用量比为1.0-1.1g：1.5-1.7mL；和/或
所述沥青、十二烷基磺酸钠、饱和氯化钠的用量比为1.0-1.1g：2.0-2.2g：1.9-2.0mL；和/或
所述十二烷基磺酸钠与蒸馏水的重量比为2.0-2.2g：8.0-8.8mL；
所述炭化是将温度以2-5℃的升温速率升温至160-180℃保温2-4h；
步骤S3中，所述Ca2+的重量百分比浓度为0.98-1.22％。
2.根据权利要求1所述的负载混合微生物多孔材料的制备方法，其特征在于：步骤S1中，所述炭化是将温度以2℃/min升温速率升至温度180℃保温2h。
3.根据权利要求1或2所述的负载混合微生物多孔材料的制备方法，其特征在于：所述步骤S3重复1-5次。
4.一种负载混合微生物多孔材料，其是应用权利要求1-3任一项所述的方法制备得到的。
5.亲油疏水高活性负载微生物沥青多孔材料的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：将聚偏氟乙烯用N,N-二甲基甲酰胺溶解，将权利要求4所述的负载混合微生物多孔材料放入其中浸泡直至负载混合微生物多孔材料表面全部覆盖溶液，取出放入蒸馏水中，得到亲油疏水高活性负载微生物沥青多孔材料。
6.根据权利要求5所述的亲油疏水高活性负载微生物沥青多孔材料的制备方法，其特征在于：所述聚偏氟乙烯与N,N-二甲基甲酰胺的用量比为1g:5mL。
7.一种亲油疏水高活性负载微生物沥青多孔材料，其是应用权利要求5或6所述的方法制备得到的。
8.权利要求4所述的负载混合微生物多孔材料，或，权利要求7所述的亲油疏水高活性负载微生物沥青多孔材料在降解石油烃中的应用；所述石油烃为长链正构烷烃，中长链烷烃，藿烷或甾烷。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述中长链烷烃为C4-C16链烷烃。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述中长链烷烃为正十六烷。
11.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述降解时的温度为27～47℃；和/或
所述降解时的pH为2～10；和/或
所述石油链烷烃的重量百分比浓度为1％-5％。
12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于：所述降解时的温度为37℃；和/或
所述降解时的pH为6。
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