CN113577281A

CN113577281A - 调控整合素β亚基的试剂和方法

Info

Publication number: CN113577281A
Application number: CN202010367306.6A
Authority: CN
Inventors: 陈剑峰; 张海龙; 郑雅娟
Original assignee: Center for Excellence in Molecular Cell Science of CAS
Current assignee: Center for Excellence in Molecular Cell Science of CAS
Priority date: 2020-04-30
Filing date: 2020-04-30
Publication date: 2021-11-02
Also published as: WO2021218594A1

Abstract

调控整合素β亚基的试剂和方法。本发明提供下调整合素αE的表达、降低免疫细胞跨血管迁移能力、抑制免疫细胞与上皮组织的黏附、抑制免疫细胞向肠道相关淋巴组织的归巢、抑制免疫细胞在肠道相关淋巴组织的驻留的方法及其用途，包括下调整合素β亚基的表达或活性。本发明还提供试剂在制备用于下调整合素αE的表达、降低免疫细胞跨血管迁移能力、抑制免疫细胞与上皮组织的黏附、抑制免疫细胞向肠道相关淋巴组织的归巢、抑制免疫细胞在肠道相关淋巴组织的驻留或抑制肠道炎症的药物中的用途。

Description

调控整合素β亚基的试剂和方法

技术领域

背景技术

肠道炎症性疾病(Inflammatory bowel disease,IBD)是一类由肠道菌群免疫失调引起的炎症性反应，主要包括溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)和克罗恩病(Crohn’s disease，CD)。IBD发病极为普遍，全世界范围内每年约有40亿人次，其中发展中国家的发病率和死亡率最高。肠道炎症常见并发症有中毒性肠扩张、肠梗阻、肠穿孔、消化道出血和结肠癌，该疾病严重危害人类生活质量和生命安全。

在IBD的发生和发展过程中，单核巨噬细胞、中性粒细胞和炎症性T细胞均在肠道黏膜层异常聚集。首先，肠道黏膜和上皮结构破坏会引起先天免疫细胞迅速反应，单核巨噬细胞最先归巢到炎症部位分泌炎症因子(TNF-α、IL-1β、IL-6和MCP-1)发挥促炎作用。随后，活化的先天免疫细胞将抗原呈递给适应性免疫细胞，激活炎症性T细胞(Th1和Th17)进一步诱导免疫细胞向炎症部位的迁移，发挥抑菌和黏膜上皮修复的功能。以上表明先天免疫和适应性免疫***在该疾病过程中都发挥重要作用。而过度活化的免疫细胞会加剧肠道免疫反应。

淋巴细胞从循环***迁移到特定组织部位是机体免疫与宿主防御的关键环节。而该过程依赖于整合素与其相关配体的结合，通过调节淋巴细胞滚动和稳定黏附两个关键步骤来完成。整合素α4β7负责淋巴细胞向肠道的定向迁移，既可以介导细胞在血管内皮表面滚动，也可以介导细胞的稳定黏附，同时负责跨膜信号的传递，整合素α4β7与其配体黏膜地址素1(Mucosal addressing cell adhesion molecule 1，MAdCAM-1)的相互作用在淋巴细胞的组织特异性迁移的过程中发挥重要作用。淋巴细胞在未收到任何刺激的条件下，细胞膜上的整合素α4β7处于低活性构象，表现出低配体亲和性，可以介导淋巴细胞在血管内皮表面进行滚动黏附。当细胞受到激活剂(趋化因子和细胞因子)的刺激后，细胞内部的相关信号通路被激活，细胞内部的调节蛋白通过一种称为inside-out signaling的信号引起整合素的一系列构像变化，即由低活性的折叠构像变为高活性的伸展构像，从而完成整合素的活化。活化后的整合素α4β7具有高配体亲和性，可介导淋巴细胞的稳定黏附。整合素β7亚基还可以与αE亚基形成异源二聚体。整合素αEβ7高表达在肠道黏膜中的白细胞上，包含上皮内淋巴细胞(Intraepithelial lymphocytes,IEL)、树突状细胞、肥大细胞和T调节细胞(Regulatory cells,Tregs)。整合素αEβ7通过与钙粘蛋白(E-cadherin)的相互作用介导淋巴细胞与肠道上皮细胞的黏附，使得淋巴细胞可以驻留在肠道内，而这种黏附主要依赖于整合素αE亚基内的α-I域的金属离子依赖的黏附位点(Metal ion-dependent adhesionsite,MIDAS)。有文献报道趋化因子能促进αEβ7⁺T淋巴细胞进入肠道上皮，并且增加与其配体E-cadherin的黏附。整合素αE敲除的小鼠显示肠道中显著减少IEL的细胞数，表明其在维持肠道淋巴细胞与上皮细胞相互作用中的重要功能。因此，整合素β7既可以调节淋巴细胞向肠道的归巢，同时调控淋巴细胞在肠道内的驻留，整合素β7功能的异常(包括α4β7和αEβ7两种整合素)与IBD和肠道肿瘤的发生、发展密切相关。

已有研究报道，整合素β7功能缺失可以抑制淋巴细胞向肠道部位的迁移，从而可以缓解T细胞诱导的肠炎的发病进程。基于此研究人员开发了整合素β7功能抑制性抗体用于临床治疗溃疡性结肠炎。Vedolizumab可以特异阻断整合素α4β7，该单克隆抗体已被批准用于治疗成人溃疡性结肠炎和克罗恩病，但临床数据表明高剂量抗体可使部分病人肠炎加剧。此外，另一项临床数据显示，可同时抑制α4β7和αEβ7的单克隆抗体etrolizumab，高剂量组反而没有低剂量组治疗效果好。有文献报道高剂量组会抑制抑炎性Treg细胞向肠道的迁移。完全抑制整合素β7功能(β7KO小鼠)会导致肠道Treg细胞的缺失，从而加剧先天性免疫介导的急性肠道炎症。以上报道表明过度抑制整合素β7功能在治疗IBD中具有较强的副作用。因此，基于整合素结构和功能开发新的特异药物用于治疗肠道炎症还有待进一步研究。

发明内容

发明人通过研究，发现整合素的活化可用于调节免疫细胞黏附及归巢、机体肠道免疫稳态以及肠道炎症发生发展。

本发明第一方面提供下调整合素β亚基的表达或活性在下调整合素αE的表达、降低免疫细胞跨血管迁移能力、抑制免疫细胞与上皮组织的黏附、抑制免疫细胞向肠道相关淋巴组织的归巢、抑制免疫细胞在肠道相关淋巴组织的驻留中的用途。在一个或多个实施方案中，所述用途是非治疗或诊断用途。

在一个或多个实施方案中，所述免疫细胞是淋巴细胞。

在一个或多个实施方案中，所述整合素β亚基是整合素β7亚基。

本发明还提供下调整合素αE的表达、降低免疫细胞跨血管迁移能力、抑制免疫细胞与上皮组织的黏附、抑制免疫细胞向肠道相关淋巴组织的归巢、抑制免疫细胞在肠道相关淋巴组织的驻留、抑制肠道炎症、减少肠道移植物抗宿主病、抑制肿瘤生成的方法，所述方法包括下调整合素β亚基的表达或活性的步骤。

在一个或多个实施方案中，所述免疫细胞是淋巴细胞。

在一个或多个实施方案中，所述方法包括降低或抑制整合素β亚基I结构域中芳香族氨基酸与SyMBS位点的金属阳离子之间的相互作用。

在一个或多个实施方案中，所述方法包括降低或抑制整合素β亚基中第185位的苯丙氨酸与SyMBS位点的金属阳离子之间的相互作用。

在一个或多个实施方案中，所述方法包括对β亚基第185位的苯丙氨酸进行缺失或替换突变。

在一个或多个实施方案中，所述方法包括将β亚基第185位的苯丙氨酸(Phe，F)突变为色氨酸(Trp，W)、组氨酸(His，H)和丙氨酸(Ala，A)

在一个或多个实施方案中，所述方法包括将整合素β亚基中第185位的苯丙氨酸Phe突变为丙氨酸Ala，从而导致整合素β亚基与SyMBS之间的阳离子π相互作用完全消失。

本发明还提供试剂在制备用于下调整合素αE的表达、降低免疫细胞跨血管迁移能力、抑制免疫细胞与上皮组织的黏附、抑制免疫细胞向肠道相关淋巴组织的归巢、抑制免疫细胞在肠道相关淋巴组织的驻留、抑制肠道炎症、减少肠道移植物抗宿主病、抑制肿瘤生成或改善肠道炎症性疾病治疗副作用的药物中的用途，或在制备用于治疗或预防受益于下调整合素αE的表达、降低免疫细胞跨血管迁移能力、抑制免疫细胞与上皮组织的黏附、抑制免疫细胞向肠道相关淋巴组织的归巢、抑制免疫细胞在肠道相关淋巴组织的驻留的肠道疾病的药物中的用途，所述试剂选自：

(1)活性降低的整合素或其β亚基，或编码它们的核酸序列，和任选的野生型整合素或其β亚基的基因敲除试剂，

(2)降低整合素β亚基活性的试剂，

(3)下调整合素β亚基表达的试剂。

在一个或多个实施方案中，所述肠道炎症性疾病治疗副作用是肠道Treg细胞减少。

在一个或多个实施方案中，所述肠道炎症是适应性免疫介导的慢性肠道炎症或先天性免疫介导的急性肠道炎症。

在一个或多个实施方案中，所述活性是高亲和性黏附活性。优选地，所述活性是整合素高亲和性状态所介导的稳定黏附活性。

在一个或多个实施方案中，肠道相关淋巴组织是派伊尔结(Peyer’s patch)、肠系黏膜***、小肠上皮内、小肠黏膜固有层和结肠。

在一个或多个实施方案中，(1)活性降低的整合素或其β亚基包括无活性或低活性野生型整合素或其β亚基，或活化功能降低或缺失的整合素或其β亚基的突变体。

在一个或多个实施方案中，所述整合素突变体包含导致整合素β亚基I结构域中芳香族氨基酸与SyMBS位点的金属阳离子之间的相互作用与野生型相比减弱或消失的突变。

在一个或多个实施方案中，所述整合素突变体包含导致整合素β亚基中第185位的苯丙氨酸与SyMBS位点的金属阳离子之间的相互作用与野生型相比减弱或消失的突变。

在一个或多个实施方案中，所述突变是整合素β亚基第185位F的突变或SyMBS位点的突变。

在一个或多个实施方案中，所述整合素突变体的β亚基第185位的苯丙氨酸(Phe，F)突变为色氨酸(Trp，W)、组氨酸(His，H)和丙氨酸(Ala，A)。

在一个或多个实施方案中，所述整合素突变体的β亚基第185位的苯丙氨酸突变为色氨酸。该突变导致芳香性体系与SyMBS之间的阳离子π相互作用完全消失。

在一个或多个实施方案中，所述整合素突变体的β亚基具有SEQ ID NO:1或2所示序列或与其具有80％序列相同性的突变体并且第185位突变为A、H或W。

在一个或多个实施方案中，所述整合素突变体具有SEQ ID NO:3或4所示序列并且第185位突变为A、H或W。

在一个或多个实施方案中，(2)中降低整合素β亚基活性是降低或抑制整合素β亚基芳香族氨基酸与SyMBS位点之间的阳离子相互作用；优选是降低或抑制整合素β亚基中第185位的与SyMBS位点的金属阳离子之间的相互作用。

在一个或多个实施方案中，降低整合素β亚基活性的试剂选自：

能稳定整合素胞内保守序列GEFKR和/或LLv-iHDR的调节因子，例如使GEFKR和LLv-iHDR形成疏水键和离子健的调节因子；

能使整合素α和β胞内段形成α螺旋结构的试剂，例如在α和β亚基胞内段引入富含酸性和碱性氨基酸的肽段的试剂；

结合整合素β亚基中第185位的F的试剂，例如叶酸、亚甲蓝、脲、二茂铁、氯化血红素、氢化可的松、7-羟基香豆素、羟喜树碱等；

含有高浓度钙离子的试剂，例如含3-10mmol/L、3.5-9mmol/L、4-8mmol/L、4.5-7mmol/L、5-6mmol/L、或5mmol/L的钙离子的试剂；

抑制胞内蛋白与整合素结合的试剂；所述胞内蛋白是Talin、Kindlin和Paxillin；所述试剂包括与α亚基和/或β亚基竞争性结合的蛋白和调节该蛋白的蛋白激酶；在一个或多个实施方案中，与β亚基竞争性结合的蛋白是DOK1、ICAP1和filamin；在一个或多个实施方案中，与α亚基竞争性结合的蛋白是SHARPIN和MDG1；在一个或多个实施方案中，蛋白激酶包括：ILK、Src和Cas；

抑制整合素与其配体结合的试剂，优选能竞争性结合配体的β亚基胞外片段或其编码序列；所述片段与整合素β亚基的胞外部分具有至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％的序列相同性；所述片段优选是整合素β亚基第46-386位的氨基酸序列(胞外与配体MAdCAM-1特异结合序列)。

在一个或多个实施方案中，降低整合素β亚基活性的试剂是整合素β亚基或SyMBS位点的基因敲入试剂，所述基因敲入使得整合素β亚基与SyMBS位点之间的阳离子相互作用降低或抑制。优选地，所述基因敲入使β7亚基的第185位氨基酸发生突变，例如突变为A、H或W，优选突变为A。优选地，所述基因敲入使SyMBS位点发生突变。更优选地，基因敲入试剂包含具有SEQ ID NO:7所示序列的核酸分子。

在一个或多个实施方案中，降低整合素β亚基活性的试剂是降低整合素β亚基活性的整合素或其β亚基的特异性抗体或编码其的核酸序列，或具有抑制整合素或其β亚基的活性的小分子化合物。

在一个或多个实施方案中，降低整合素β亚基活性的试剂是阳离子螯合剂，例如EDTA。

在一个或多个实施方案中，下调整合素β亚基表达的试剂是整合素β亚基的siRNA、shRNA或基因敲除载体。

本文还提供一种药物组合物，所述药物组合物含有本文任一实施方案中所述的试剂和任选的药学上可接受的载体或赋形剂。

本文还提供一种核酸分子，包含选自以下的序列：

(1)含有SEQ ID NO:7所示序列、LoxP位点的核酸序列；和

(2)(1)所述序列的互补序列。

在一个或多个实施方案中，所述核酸序列含有同源臂序列，其中3’同源臂包含SEQID NO:7。

在一个或多个实施方案中，所述核酸序列从5’到3’依次含有5’同源臂、LoxP位点、标记基因、LoxP位点和3’同源臂。

在一个或多个实施方案中，所述核酸序列从5’到3’依次含有5’同源臂、LoxP位点、frt、标记基因、frt、LoxP位点和3’同源臂。

在一个或多个实施方案中，所述同源臂与LoxP位点之间可具有任选的连接序列。

本文还提供一种载体，其含有本文第一方面所述的核酸序列。在一个或多个实施方案中，所述载体用于同源重组。

本文还提供一种经基因工程改造的宿主细胞，所述宿主细胞转入了本文第一方面所述的载体。在一个或多个实施方案中，所述宿主细胞在其基因组中含有本文第一方面所述的核酸序列。

在一个或多个实施方案中，所述宿主细胞为非人哺乳动物细胞。

在一个或多个实施方案中，所述宿主细胞为啮齿类动物的细胞。

在一个或多个实施方案中，所述宿主细胞为人的体细胞或已建立的胚胎干细胞。

在一个或多个实施方案中，所述宿主细胞非人哺乳动物的体细胞或胚胎干细胞。

本文还提供一种构建转基因小鼠的方法，所述方法包括：

(1)提供本文第一方面所述的载体，

(2)将所述载体转入小鼠胚胎干细胞中，筛选获得同源重组的胚胎干细胞克隆，

(3)将步骤(2)获得的胚胎干细胞注射到小鼠囊胚中，并将该囊胚转入假孕母鼠中，获得嵌合体小鼠，

(4)将步骤(3)获得的嵌合体小鼠与野生型小鼠(例如C57/B6)交配，获得带有Flox位点的整合素β亚基的F185发生突变的小鼠，

(5)将步骤(4)获得的带有Flox位点的整合素β亚基的F185发生突变的小鼠与表达(例如组成型表达)Cre酶的转基因小鼠杂交，得到第一代杂合小鼠，然后杂合小鼠交配，获得纯合的突变小鼠，即所述转基因小鼠，

任选的(6)将步骤(5)得到的小鼠与野生型小鼠(例如C57/B6)交配以纯化基因背景。

在一个或多个实施方案中，该构建方法还包括使步骤(6)获得的纯合的突变小鼠与该步骤获得的纯合的对照小鼠交配，从而扩大纯合的小鼠的种群。

在一个或多个实施方案中，该转基因小鼠的特征是整合素或其β亚基无活性或活性降低。

在一个或多个实施方案中，所述整合素是整合素α4β7和/或αEβ7。

本文还提供一种转基因小鼠，所述转基因小鼠的整合素或其β亚基无活性或活性降低。

本文还提供整合素或其β亚基的基因或蛋白作为靶点在筛选药物中的应用，或用作分子指标在临床上用于诊断肠道疾病的病程发展，所述药物用于治疗或预防肠道疾病或改善肠道炎症性疾病治疗副作用。

在一个或多个实施方案中，所述肠道疾病是受益于抑制淋巴细胞的稳定黏附、降低免疫细胞跨血管迁移能力、下调整合素αE的表达、抑制免疫细胞向肠道相关淋巴组织的归巢、抑制肠道炎症的疾病。优选地，所述疾病是肠道炎症。更优选地，所述肠道炎症是适应性免疫介导的慢性肠道炎症或先天性免疫介导的急性肠道炎症。

本文还提供检测整合素或其β亚基的基因或蛋白的试剂在制备用于诊断肠道疾病或判断肠道疾病的病程发展的试剂盒中的应用。

本文还提供一种检测试剂盒，所述检测试剂盒含有检测整合素或其β亚基的基因或蛋白的试剂。

附图说明

图1显示整合素Itgb7^F185A/F185A KI小鼠的构建策略及鉴定。(A)小鼠Itgb7基因组序列分析。(B)Itgb7^F185A/F185A KI小鼠质粒构建策略。(C)基因型鉴定，仅有380bp条带为KI纯合子；仅有360bp条带为WT小鼠；两条带都有为杂合子小鼠。(D)利用KOD高保真DNA聚合酶扩增带有F185A突变的小鼠基因组片段用于测序鉴定。结果显示编码185位氨基酸残基的密码子TTT(Phe)成功突变为GCG(Ala)且未引入其他突变。

图2显示整合素β7F185A突变导致淋巴细胞向肠道相关组织部位迁移能力减弱。(A)H&E染色显示与WT小鼠相比，KI和KO小鼠小肠结构基本完整，但绒毛较细，绒毛内淋巴细胞数目减少。(B)KI和KO小鼠结肠结构基本完整。(C，D)KI和KO小鼠小肠上派尔氏结(Peyer’s patch，PP)变小，并且PP中淋巴细胞数目减少。

图3显示整合素β7F185A突变抑制淋巴细胞的黏附与迁移。(A)FACS检测WT、β7杂合子(Itgb7^+/-，+/-)、β7基因敲低(Knock-down，KD)、KI和KO小鼠脾脏淋巴细胞表面整合素α4和β7的表达情况。虚线表示对照组，即不染α4和β7抗体。实线表示α4和β7的表达情况。(B)流动室技术(Flow chamber)检测WT、+/-、KD、KI和KO小鼠脾脏淋巴细胞与整合素配体MAdCAM-1的黏附情况。分为不加趋化因子和加趋化因子(CCL21或者CCL25)三个条件刺激细胞。细胞分别以应切力(Shear stress)1dyn/cm²或者2dyn/cm²的速度通过流动室。深灰色和空白柱子分别表示稳定黏附的细胞(Firmly adherent cells)和滚动黏附的细胞(Rollingcells)。(C，D)利用血清诱导的细胞穿孔迁移实验检测WT、+/-、KD、KI和KO小鼠脾脏淋巴细胞在配体MAdCAM-1(C)和ICAM-1(D)上的穿孔迁移能力。***P<0.001；ns表示没有显著性差异(not significant)。^AAAP<0.001(Student's t-test在A-D)。数据以平均值±标准差统计。星号表示黏附的总细胞数。

图4显示整合素β7F185A突变不影响αEβ7与E-cadherin的黏附。(A)FACS检测Jurkat T-αEβ7WT和Jurkat T-αEβ7F185A细胞表面整合素αE和β7的表达情况。虚线表示对照组，即不染αE和β7抗体。实线表示αE和β7的表达情况。方框中的数字代表平均荧光强度。(B)Flow chamber检测Jurkat T-αEβ7WT和Jurkat T-αEβ7F185A细胞与配体E-cadherin的黏附情况。分为加趋化因子(CCL21或者CCL25)和加入抑制结合的抗体M290三个条件来研究整合素β7突变受趋化因子调控的机制。细胞以应切力1dyn/cm²的速度通过流动室。***P<0.001；ns表示没有显著性差异(not significant)。数据以平均值±标准差统计。

图5显示整合素β7F185A突变导致αEβ7⁺淋巴细胞显著减少，并且下调整合素αE的表达。(A)FACS检测WT、+/-、KI和KO小鼠脾脏淋巴细胞中αE的表达情况。(B)FACS检测WT、+/-、KI和KO小鼠小肠和结肠中IEL、LPL的αE的表达情况。(A，B)方框中的数字代表αEβ7阳性细胞比例。上皮内淋巴细胞(Intraepithelial lymphocytes，IEL)；粘膜内淋巴细胞(Lamina propria lymphocytes，LPL)。

图6显示整合素β7活化功能缺失抑制脾脏淋巴细胞向肠道相关免疫组织的迁移。(A-C)KI(A)、KO(B)和+/-(C)小鼠脾脏淋巴细胞向受体小鼠不同淋巴组织的迁移比例。注射后18小时FACS检测KI、KO或+/-淋巴细胞与WT淋巴细胞在特定组织中的比例。外周血(Peripheral blood，PB)；外周***(Peripheral lymph node，PLN)；肠系黏膜***(Mesenteric lymph node，MLN)；派尔氏结(Peyer’s patch，PP)；小肠(Small intestine，SI)；结肠(Colon)；脾脏(Spleen，SP)；肝脏(Liver，LIV)和肺(Lung，LUN)。***P<0.001(Student's t-test)；ns表示没有显著性差异(not significant)。数据以平均值±标准差统计。

图7显示Itgb7^F185A/F185A KI小鼠CD4⁺CD45RB^highT细胞诱导肠炎的能力减弱。(A)Rag1^-/-受体小鼠分别给予尾静脉注射1×10⁵WT，KI或者KO的CD4⁺CD45RB^highT细胞，后续12周观察受体小鼠的体重变化。(B)尾静脉注射各组小鼠CD4⁺CD45RB^highT细胞后，Rag1^-/-受体小鼠肠炎发病评分统计。(C)尾静脉注射各组小鼠CD4⁺CD45RB^highT细胞后，Rag1^-/-受体小鼠结肠远端H&E染色结果。(D)免疫荧光检测Rag1^-/-受体小鼠结肠远端CD4⁺T细胞浸润。并且统计每张荧光图中CD4⁺T细胞的浸润数目。比例尺为100μm。**P<0.005，***P<0.001；ns表示没有显著性差异(not significant)。数据以平均值±标准差统计。

图8显示Itgb7^F185A/F185A KI小鼠没有增加对DSS诱导的急性肠道炎症的易感性。(A)小鼠加药处理五天，后续正常饮用水恢复十天，观察WT、KI和KO各组小鼠的体重变化。(B)DSS处理后各组小鼠死亡率统计。(C)DSS处理后各组小鼠肠炎发病评分统计。(D)实时荧光定量核酸扩增检测***(Real-time quantitative PCR detecting system，qPCR)检测小鼠肠道组织中促炎症因子IL-6、TNF-α和IL-1β的分泌。(E)DSS处理第十天各组小鼠结肠远端H&E染色结果。(F)小鼠肠道中Treg细胞在CD4⁺T细胞中的比例和Treg细胞的总数目统计。(G)免疫荧光检测并统计DSS处理第四天小鼠肠道上皮细胞ICAM-1表达和巨噬细胞浸润。

具体实施方式

应理解，在本发明范围中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成优选的技术方案。

SyMBS(the synergistic metal ion binding site)、MIDAS(metal ion-dependent adhesion site)和ADMIDAS(the adjacent to MIDAS)是整合素β亚基I结构域的三个金属离子结合位点。SyMBS主要通过协同MIDAS行使功能，是整合素的正调控位点，整合素的活化依赖于SyMBS与金属离子的结合。前期研究工作中对整合素α4β7的研究发现SyMBS通过与其附近的F185的苯环之间形成阳离子-π相互作用而行使其功能(Pan et al.,2010)。该阳离子-π相互作用将整合素β亚基金属离子结合位点与整合素的另外一个调控元件-SDL(specific metal ion binding site)联系起来(Pan et al.,2010)。阳离子-π相互作用的丧失严重影响了高亲和力α4β7介导的细胞稳定黏附，但是对低亲和力α4β7介导的细胞滚动黏附影响很小(Pan et al.,2010)。

本发明中，通过调控整合素β亚基活性，可以进一步调控整合素αE的表达、免疫细胞跨血管迁移能力、免疫细胞与上皮组织的黏附、免疫细胞向肠道相关淋巴组织的归巢、免疫细胞在肠道相关淋巴组织的驻留和/或肠道炎症。发现人通过构建整合素β7活化突变小鼠Itgb7^F185A/F185A(该突变抑制了整合素β7活化)，发现抑制整合素β7活化，即部分缺失整合素β7的功能可以降低免疫细胞跨血管的迁移能力、抑制免疫细胞向肠道相关淋巴组织的归巢、同时由于可以降低整合素αE的表达，从而可以抑制免疫细胞与上皮组织的黏附和在肠道相关淋巴组织的驻留。更重要的是，抑制整合素β7活化与完全抑制整合素β7功能相比不会导致的肠道Treg细胞缺失，避免了完全抑制整合素β7功能导致而引起的先天性免疫介导的肠道加剧的副作用(抑制整合素β7活化作为IBD治疗策略的优势)。因此，抑制整合素β7活化可以同时抑制适应性免疫介导的慢性肠炎，也可以减缓先天性免疫介导的急性肠炎，减少现有整合素β7抑制抗体在IBD治疗中的副作用，为临床治疗及新药开发提供新的思路。

因此，本文提供一种通过调控整合素β亚基活性来调控整合素αE的表达、免疫细胞跨血管迁移能力、免疫细胞与上皮组织的黏附、免疫细胞向肠道相关淋巴组织的归巢、免疫细胞在肠道相关淋巴组织的驻留、抑制适应性免疫介导的肠炎并且不增加先天免疫介导的肠炎的易感性的方法。本文中，“调控”包括上调和下调，上调包括促进、增加和/或增强，下调包括抑制、降低、减弱、破坏和/或减少。本文中，“肠道相关淋巴组织”包括但不限于派尔氏结(Peyer’s patch，PP)、肠系黏膜***、小肠上皮内、小肠黏膜固有层和结肠。本文中，“归巢”是指免疫细胞从血液经过毛细血管高内皮静脉定向迁移至淋巴器官，以及免疫细胞向炎症部位的渗出。本文中，“膜”是带孔小室，模拟体内淋巴细胞穿过血管的过程。

本文中，“定向”指免疫细胞特异性地向次级淋巴器官、炎症部位或肿瘤组织等部位的迁移，用以增强免疫监视、维持免疫稳态或促进免疫反应。本文中，“个体”、“对象”或“患者”指哺乳动物，尤其指人。

本文中，整合素或整联蛋白是一种跨膜的异质二聚体，它由两个非共价结合的跨膜亚基，即α和β亚基所组成。整合素的细胞外结构域可与细胞外配体例如基质蛋白结合，细胞内的结构则启动下游过程。整合素同配体的结合需要二价阳离子，如Ca²⁺、Mg²⁺等的参与。示例性整合素β亚基的序列如SEQ ID NO:1或2所示的整合素β7亚基。与整合素β亚基能形成异源二聚体的α亚基包括α4和αE。整合素α亚基的序列如SEQ ID NO:3或4所示的整合素α4亚基，和SEQ ID NO:5或6所示的整合素αE亚基。应理解的是，本文中，除非具体提及，否则整合素泛指各种来源的整合素。

本文也包括整合素的突变体。本文涉及的整合素突变体包括保留了野生型整合素的α亚基、仅在β亚基或SyMBS位点发生了突变的突变体。所述β亚基或SyMBS位点的突变可以是***、取代或缺失，只要突变能调控整合素β亚基与SyMBS位点之间的阳离子相互作用并且任选地不影响整合素与其配体的结合即可。在某些实施方案中，整合素突变体包括发生了导致无法介导β亚基与SyMBS位点之间的阳离子相互作用的突变的突变体。该突变可以是取代突变，尤其是β亚基第185位的F发生的取代突变，如突变为A。

β亚基与SyMBS之间相互作用的调控可通过调控β亚基和/或调控SyMBS来实现。例如，可通过降低整合素的活性来下调β亚基I结构域中芳香族氨基酸与SyMBS位点的金属阳离子之间的相互作用，从而下调整合素αE的表达、降低免疫细胞跨血管迁移能力、抑制免疫细胞与上皮组织的黏附、抑制免疫细胞向肠道相关淋巴组织的归巢、抑制免疫细胞在肠道相关淋巴组织的驻留或抑制肠道炎症。本发明并非旨在进行治疗或诊断。降低整合素的活性的方法包括但不限于使用(1)活性降低的整合素或其β亚基，或编码它们的核酸序列，和任选的野生型整合素或其β亚基的基因敲除试剂，(2)降低整合素β亚基活性的试剂。

本文所述活性降低的整合素或整合素β亚基是任何形式的高亲和性黏附活性降低或缺失的整合素或β亚基，包括无活性或低活性野生型整合素或β亚基，或活化功能降低或缺失的整合素或β亚基的突变体，例如包含整合素β亚基或SyMBS位点的突变的突变体。因此，可通过基因敲入载体(置换载体，打靶载体等)将表达突变的β亚基或SyMBS位点的编码序列整合到感兴趣细胞的基因组中，置换野生型的β亚基或SyMBS位点的编码序列，从而使得感兴趣的细胞表达突变的β亚基或SyMBS位点，二者的相互作用与未突变的蛋白相比降低(如低50％以上)，但保留了β亚基和整合素的其它生物学活性。示例性的突变型整合素包括但不限于β亚基或SyMBS位点发生突变、导致β亚基I结构域中芳香族氨基酸与SyMBS位点的金属阳离子之间的相互作用与野生型相比减弱或消失的突变体。示例性的突变包括但不限于β亚基第185位的F的突变。例如，可缺失第185位的氨基酸残基F，或可用其它氨基酸取代F，尤其是使用与F不属于相同一氨基酸类别的其它氨基酸残基取代。例如，降低β亚基与SyMBS位点之间的相互作用的突变可为：将185位的苯丙氨酸Phe(符号F)突变为色氨酸Trp(符号W)和组氨酸(符号H)。

本文中，氨基酸的类别可大致分为：(1)非极性氨基酸(疏水氨基酸)，包括丙氨酸(Ala)、缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、脯氨酸(Pro)、苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Trp)和蛋氨酸(Met)；(2)极性氨基酸(亲水氨基酸)，包括(a)极性不带电荷氨基酸，为甘氨酸(Gly)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、半胱氨酸(Cys)、酪氨酸(Tyr)、天冬酰胺(Asn)和谷氨酰胺(Gln)；(b)极性带正电荷的氨基酸(碱性氨基酸)，为赖氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)和组氨酸(His)；和(c)极性带负电荷的氨基酸(酸性氨基酸)，为天冬氨酸(Asp)和谷氨酸(Glu)。

本文所述降低整合素β亚基活性的试剂是能降低或抑制整合素β亚基I结构域中芳香族氨基酸与SyMBS位点的金属阳离子之间的相互作用的试剂。这样的试剂可以是整合素β亚基或SyMBS位点的基因敲入试剂，所述基因敲入使得整合素β亚基I结构域中芳香族氨基酸与SyMBS位点的金属阳离子之间的相互作用降低或抑制，例如通过使β亚基(例如第185位氨基酸)或使SyMBS位点发生突变。基因敲入试剂可以是如上所述的的基因敲入载体，其具有待敲入β亚基或SyMBS位点的核酸序列或其互补序列的核酸分子。示例性的用于基因敲入的核酸分子具有SEQ ID NO:7所示核酸序列。SEQ ID NO:7是示例性待敲入序列，P349下游同源片段碱基序列，其中野生型的“TTT”(苯丙氨酸)突变为“GCG”(丙氨酸)。所述核酸序列还可含有用于同源重组的同源臂序列以及同源臂与待敲入序列之间的连接序列。在某些实施方案中，同源臂、待敲入序列、LoxP位点和连接序列等元件如图1所示。本领域技术人员知晓这些元件或同源重组敲入所需的其他元件的序列或获取序列的方法，例如通过NCBI网站获取。

本文所述降低整合素β亚基活性的试剂还包括但不限于稳定整合素胞内保守序列GEFKR和LLv-iHDR的调节因子、使整合素α和β胞内段形成α螺旋结构的试剂、结合整合素β亚基中第185位的F的试剂、降低整合素β亚基活性的试剂是高浓度钙离子或含有高浓度钙离子的试剂(例如至少1mmol/L、2mmol/L、3mmol/L、4mmol/L、5mmol/L、6mmol/L、7mmol/L、8mmol/L、9mmol/L、10mmol/L)、抑制胞内蛋白与整合素结合的试剂、抑制整合素与其配体结合的试剂、基因敲入试剂、阳离子螯合剂、降低整合素β亚基活性的整合素或其β亚基的特异性抗体或编码其的核酸序列，或具有抑制整合素或其β亚基的活性的小分子化合物。所述抗体可以不显著影响整合素与其配体的相互作用。

本文中，肠道疾病是受益于下调整合素αE的表达、降低免疫细胞跨血管迁移能力、抑制免疫细胞与上皮组织的黏附、抑制免疫细胞向肠道相关淋巴组织的归巢、抑制免疫细胞在肠道相关淋巴组织的驻留的疾病，例如肠道炎症，所述肠道炎症是适应性免疫介导的慢性肠道炎症或先天性免疫介导的急性肠道炎症。通过降低整合素β亚基活性可抑制免疫细胞向肠道相关淋巴组织的迁移和归巢，从而抑制炎症。此外，由于整合素αE与β7亚基形成异源二聚体后，通过与上皮细胞的配体E-cadherin相互作用，介导细胞与上皮组织的特异黏附和驻留。基于发明人的发现，通过降低整合素β7亚基活性，导致β7亚基表达下降，继而下调整合素αE的表达，可以抑制免疫细胞在肠道相关淋巴组织的驻留，从而抑制炎症、减少肠道移植物抗宿主病(Gut graft-versus-host disease)、抑制肿瘤生成。这可能是由于多余的αE亚基不能形成有功能的形式，导致αE亚基不稳定，被胞内蛋白酶降解。

为了减弱或破坏细胞内整合素β亚基I结构域中芳香族氨基酸与SyMBS位点的金属阳离子之间的相互作用，可在细胞中转入基因敲除或敲低载体，以敲除或敲低细胞中整合素和/或β亚基的表达，和/或采用基因编辑技术如ZFN、TALEN或CRISPR/Cas9等敲除或敲低细胞整合素和/或β亚基的表达，和/或通过干扰RNA介导的基因沉默敲除或敲低整合素和/或β亚基的表达，和/或可在免疫细胞中转入基因***载体、以在敲除整合素和/或β亚基的编码序列的同时将β亚基I结构域中芳香族氨基酸与SyMBS位点的金属阳离子之间的相互作用减弱或消失，或将第185位氨基酸发生突变的β亚基的表达框整合到细胞的基因组中。适用于本发明的ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9技术为本领域所周知。各技术各自通过DNA识别域与核酸内切酶的共同作用实现靶基因的敲除。

本文中所述的调控方法可以是体外方法，也可以是体内方法。在某些实施方案中，本发明提供下调免疫细胞向肠道相关淋巴组织的迁移能力的方法。所述方法包括体外对免疫细胞实施以下一项或多项处理，以使该免疫细胞具有与其对应的野生型细胞(即从对象直接分离得到的免疫细胞)相比抑制或减弱的整合素β亚基I结构域中芳香族氨基酸与SyMBS位点的金属阳离子之间的相互作用：使免疫细胞表达其β亚基I结构域中芳香族氨基酸与SyMBS位点的金属阳离子之间的相互作用减弱或消失的整合素突变蛋白的试剂。可使用前文所述的表达载体、整合载体或ZFN、TALEN或CRISPR/Cas9等作为所述试剂来实现所述敲除、敲低或表达突变的整合素。在某些实施方案中，整合素突变蛋白为β亚基第185位发生突变的整合素蛋白。所述迁移能力减弱指与未经本文所述方法处理的免疫细胞相比，经本文所述方法处理的免疫细胞向肠道相关淋巴组织的迁移能力下降，例如下降至少10％，至少20％，至少30％或至少50％。如前所述，可采用本领域周知的测试肿瘤细胞迁移能力的方法来评价本申请免疫细胞的迁移能力。例如，可采用本文下文第1.2.6节描述的方法进行评价。

本文还提供一种工具细胞，该细胞具有能竞争性结合配体的β亚基胞外片段或其编码序列，可与体内的免疫细胞竞争性结合配体，抑制免疫细胞向肠道的迁移。或者所述工具细胞细胞具有可以表达特异识别活化型整合素的肽段，可以与活化型整合素结合，抑制其与配体的结合能竞争性结合配体的β亚基胞外片段片段与整合素β亚基的胞外部分具有至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％的序列相同性。在一个或多个实施方案中，所述片段是整合素β亚基第46-386位的氨基酸序列。在某些实施方案中，本文还提供一种药物组合物，所述药物组合物含有本文所述的工具细胞和任选的药学上可接受的载体或赋形剂。本文中，药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度对所述免疫细胞以及免疫细胞的接受者是无毒的，可包括本领域周知的免疫细胞治疗中常用于递送活的免疫细胞的各种类型的载体或赋形剂。药物组合物中免疫细胞以治疗有效量存在。可根据不同的免疫细胞种类、接受该免疫细胞的患者的年龄、性别、所患疾病的严重程度等确定本文所述免疫细胞的治疗有效量。可通过常规的给药方式给予本文所述的免疫细胞，例如，可采用常规的免疫细胞疗法来实现免疫细胞的回输。

在某些实施方案中，本文还提供一种治疗肠道炎症、减少肠道移植物抗宿主病或抑制肿瘤生成的方法，所述方法包括降低对象免疫细胞中整合素β亚基I结构域中芳香族氨基酸与SyMBS位点的金属阳离子之间的相互作用的步骤。在某些实施方案中，所述免疫细胞：含有整合素β亚基或SyMBS位点突变的表达载体，该突变可以抑制整合素β亚基I结构域中芳香族氨基酸与SyMBS位点的金属阳离子之间的相互作用。

本发明还包括本文所述的各种突变体的编码序列及其互补序列，以及含有所述编码序列或互补序列的核酸构建体。本文中，核酸构建体是可以被引入靶细胞或组织中的人工构建的核酸区段。该核酸构建体含有本文所述的编码序列或其互补序列，以及与这些序列操作性连接的一个或多个调控序列。调控序列可以是合适的启动子序列。启动子序列通常与待表达氨基酸序列的编码序列操作性连接。启动子可以是在所选择的宿主细胞中显示转录活性的任何核苷酸序列，包括突变的、截短的和杂合启动子，并且可以从编码与该宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。调控序列也可以是合适的转录终止子序列，由宿主细胞识别以终止转录的序列。终止子序列与编码该多肽的核苷酸序列的3发末端相连，在选择的宿主细胞中有功能的任何终止子都可用于本文。

在某些实施方案中，所述核酸构建体是载体。具体而言，可将本文所述的编码序列克隆入许多类型的载体，这些类型的载体包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。载体可以是表达载体，或者是克隆载体。

通常，合适的载体包含在至少一种有机体中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制酶位点和一个或多个可选择的标记。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体PL启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、毕赤酵母的甲醇氧化酶启动子和其它一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。标记基因可用于提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，包括但不限于真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。当本文所述的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中***增强子序列，则将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。

本领域一般技术人员清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。可采用本领域技术人员熟知的方法构建含本文所述的多核苷酸序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。

本文还包括包含本文所述多核苷酸序列或其核酸构建体的宿主细胞。宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；丝状真菌细胞、或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母、丝状真菌、植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS、293细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。

可采用常规的方法将本文的载体导入宿主细胞中，这些方法包括显微注射法、基因枪法、电穿孔法、病毒介导的转化法、电子轰击法、磷酸钙沉淀法等。

本发明还包括检测整合素或其β亚基的基因或蛋白的表达或活性的试剂在制备用于诊断肠道疾病或判断肠道疾病的病程发展的试剂盒中的应用，所述肠道疾病是受益于抑制淋巴细胞的稳定黏附、降低免疫细胞跨血管迁移能力、下调整合素αE的表达、抑制免疫细胞向肠道相关淋巴组织的归巢的疾病。所述试剂例如能特异识别活化型整合素的抗体。本领域知晓检测整合素活性的方法，例如X射线晶体衍射分析、核磁共振、荧光共振能量转移(FRET)、可溶性配体结合实验(soluble ligand binding assay)、细胞黏附实验、细胞铺展实验和细胞迁移实验等。

本发明构建了含有F185A点突变、包含SEQ ID NO:7的同源重组载体PL-124，将该质粒转染129小鼠的ES细胞并筛选阳性ES细胞，然后将阳性ES细胞注射进入129小鼠囊胚中，得到嵌合体小鼠。通过嵌合体小鼠交配得到含有F185A点突变的KI小鼠，再与EIIa-Cre工具鼠交配切除LoxP序列，得到阳离子-π相互作用缺失的β7基因敲入(KI)小鼠。

本发明通过参考以下实验实施例进一步详细地进行描述。这些实施例仅出于说明性的目的提供，并不意欲为限制性的，除非另有规定。因此，本发明决不应被解释为限于以下实施例，而是应被解释为包括由于本文提供的教导变得显而易见的任何和全部的变化。实施例中所用的方法和试剂，除非另有说明，否则为本领域常规的方法和试剂。

实施例

一.实验材料和方法

1.1实验材料

1.1.1常用缓冲液配方

TBS：20mM Tris-HCl(pH 7.4)，150mM NaCl，1mM CaCl₂，1mM MgCl₂；

细胞裂解缓冲液：TBS，1％Triton X-100，0.05％Tween 20，Complete ProteaseInhibitor Cocktail Tablets，PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Cocktail Tablets；

2×SDS蛋白质加样缓冲液：100mM Tris-HCl(pH6.8)，4％SDS，0.2％溴酚蓝，20％甘油，10％β-Me；

Tris-甘氨酸蛋白质电泳缓冲液：25mM Tris，250mM甘氨酸，0.1％SDS；

蛋白质转膜缓冲液：3g Tris，14.4g甘氨酸，200ml甲醇，Milli-Q H₂O定容至1L；

TBS：20mM Tris-HCl(pH 7.4)，150mM NaCl，1mM CaCl₂，1mM MgCl₂；

TBST缓冲液：8.8g NaCl，6g Tris，0.5ml Tween-20，pH 7.5，Milli-Q H₂O定容至1L；

PBS：8g NaCl，0.2g KCl，3.63g Na₂HPO₄·3H₂O，0.24g KH₂PO₄，Milli-Q H₂O定容至1L，pH 7.4，过滤除菌；

2×HBS：8.0g NaCl，0.37g KCl，201mg Na₂HPO₄.7H₂O，1.0g葡萄糖，5.0g HEPES，Milli-Q H₂O定容至500ml，pH 7.05，过滤除菌，4℃存储；

LB培养液：10g蛋白胨，10g NaCl，5g酵母提取物；

流动室实验所用缓冲液：

Ca²⁺&Mg²⁺-free HBSS：137mM NaCl，5.4mM KCl，0.4mM KH₂PO₄，0.3mM Na₂HPO₄，4.2mM NaHCO₃，5.6mM葡萄糖，pH 7.4；

包被缓冲液：PBS，10mM NaHCO₃，pH9.0；

封闭缓冲液：包被缓冲液加2％BSA；

清洗缓冲液：0.2g BSA，40ml HBSS，400μl EDTA(0.5M，pH 8.0)；

Buffer A：0.225g BSA，45ml HBSS；

Fc-Tag融合蛋白纯化所用缓冲液：

Protein A结合缓冲液：0.1M Tris-HCl，pH 8.0；

Protein A洗脱缓冲液：0.1M甘氨酸，pH 3.0；

Protein A中和缓冲液：1M Tris-HCl，pH 8.0。

红细胞裂解液：

pH 7.25(过滤并高压灭菌后使用，存储在4℃)0.15M NH4Cl，1mM NaHCO3，0.1mMEDTA。

肠道免疫细胞分离液：

Pre-digestion buffer:1mM EDTA,2mM HEPES,5％FBS,1mM DTT；

Digestion buffer:0.5mg/ml Collogenase D,0.5mg/ml DNase,3mg/ml DispaseII,10mM HEPES,5％FBS；

Percoll分离液:40％和70％Percoll分离液。

1.1.2基本化学试剂

1.1.3抗体

1.1.4酶类

名称	购自
		KOD plus Neo	TOYOBO
限制性内切酶	New England Biolabs
		T4连接酶	Fermentas
M-MLV reverse transcriptase	Promega

1.1.5试剂盒及其他

名称	购自
		ECL substrate	Pierce
DNA小量回收试剂盒	天根
		BCA蛋白定量试剂盒	碧云天
PhosStop Phosphatase Inhibitor Cocktail Tablets	Roche
		Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets	Roche
CellTrace Violet Cell Proliferation kit	Thermo Fisher Scientific
		CellTrace Yellow Cell proliferation kit	Thermo Fisher Scientific
Human/mouse chemokines CCL21	R&D Systems
		Human/mouse chemokines CCL25	R&D Ststems
Treg cell staining kit	eBioscience
		DAPI	Sigma
SYBR Premix ExTaq kit	TaKaRa
		Mouse MAdCAM-1/Fc	实验室纯化
Mouse ICAM-1/Fc	实验室纯化
		Human MadCAM-1/Fc	实验室纯化
Mouse E-cadherin/Fc	实验室纯化
		色层定性分析滤纸	新华
硝酸纤维素膜	Whatman
		0.22/0.45μm醋酸纤维灭菌滤膜	Pall
Protein A/G-sepharose	Amersham Pharmacia
		胰岛素针	BD

1.1.6主要仪器

1.1.7细胞系

名称	培养液
		293T	DMEM/10％FBS/PSG
Jurkat T	1640/10％FBS/PSG
		Hybridoma cells producing FIB504antibody	1640/10％FBS/PSG/NaPyr
Hybridoma cells producing M290antibody	1640/10％FBS/PSG/NaPyr

1.1实验方法

1.2.1整合素β7F85A KI小鼠的构建

(1)Itgb7 F185A KI质粒构建策略

PL-124质粒含有两段同向Loxp序列，中间含有neo抗性基因，是基因工程KI以及knock-out(KO)常用载体。该载体含有多个酶切位点，利于***所需要的外源基因。通过在Loxp两侧分别***了上下游同源序列，同源重组将Loxp和neo序列整合进入小鼠基因组。最后在小鼠水平通过Cre重组酶切掉Loxp和neo基因，仅残留一个Loxp序列。

上游同源序列构建：从C57/B6品系小鼠基因组DNA特异扩增出2970bp的P348上游同源片段利用SacII和NotI酶切位点将P348序列整合到PL124质粒载体中作为上游同源序列。

下游同源序列构建：1)从C57/B6品系小鼠基因组DNA特异扩增出长度分别为360bp和1600bp的P349、P350下游同源片段；2)利用ClaI和SacII酶切位点将P349序列整合到PMD-T19载体中，同时引入F185A点突变；3)利用SacII、SalI酶切位点将P350序列整合到另一个PMD-T19载体中；4)将P349序列整合到PMD-T19-P350载体中构建PMD-T19-P349-P350质粒；5)利用ClaI和SalI酶切将P349-P350整合到PL124载体的Loxp下游，作为下游同源序列。上下游同源序列经测序确定正确后即完成了Itgb7 F185A KI质粒的构建。

(2)Itgb7 KI ES细胞建系策略

将构建好的F185A KI质粒PL124-248-(349-350)用Sal I酶切线性化后电转129品系小鼠ES细胞。质粒进入ES细胞后经过同源重组将上下游同源位点之间野生型序列替换为突变序列。通过neomycin抗性基因筛选KI阳性ES细胞。将筛选到的抗性ES细胞抽提基因组DNA进行测序，筛选带有F185A突变的ES克隆。

(3)Itgb7 KI小鼠建系策略

通过显微注射将阳性ES细胞注射到小鼠囊胚中，再将囊胚植入假孕母鼠子宫内。阳性ES细胞与囊胚同时发育出含有KI基因序列组织的嵌合体小鼠。如果KI阳性ES细胞嵌合进入小鼠生殖***，那么该嵌合体的生殖细胞中就有可能含有F185A点突变。129品系小鼠的黄色毛色为显性基因，因此将嵌合体与C57/B6小鼠交配得到F1代幼鼠中有灰色和黑色两种可能。灰色幼鼠有可能含有129品系ES细胞的遗传基因。选取F1黄色幼鼠剪尾抽提基因组DNA做基因型鉴定，即有可能获得含有KI序列的杂合子。

得到F1代杂合子后需要进一步与全身性表达Cre酶的小鼠交配，切掉Loxp和位于其两者之间的neo等其他序列，以减少外源***序列对基因组的影响。然后可以按照孟德尔遗产定律进行小鼠传代培养，鉴定纯合子或者杂合子用于后续实验。

根据孟德尔遗传定律，F1代杂合子雄鼠和雌鼠交配得到F2代中有1/4的纯合子，即两条等位基因均为含有F185A点突变的KI片段；1/2的杂合子，即一条等位基因均为KI片段另一条为WT基因；1/4的WT，即两条等位基因均为WT基因。

另一方面因为ES细胞源于129品系小鼠，F1代小鼠既含有129的遗传背景又含有C57/B6的遗传背景，较难控制遗传质量。所以还需要进一步与C57/B6品系小鼠连续杂交5-6代保证小鼠基因型背景较纯。

1.2.2质粒构建

I、PCR扩增目的片段

在50μl反应体系中，加入1μl 5ng/μl模板DNA，34μl ddH₂O，5μl 10×KOD buffer，5μl 2mM dNTP，2μl 25mM Mg²⁺，3μl 5μM primer A，3μl 5μM primer B，1μl KOD。PCR反应条件如下：先94℃变性10min；进入94℃30sec，60℃30sec，68℃3min 10sec的循环27次，最后68℃延伸10min。取5μl PCR产物用1％agarose胶分离，鉴定其条带大小。

II、质粒和PCR产物的酶切电泳分离回收

在10-20μl反应体系中加入相应的酶切反应缓冲液、载体DNA或PCR产物、限制性内切酶，混合物于37℃作用2-4h，加DNA加样缓冲液，进行1％琼脂糖凝胶电泳分离。鉴定出正确的PCR条带后用天根胶回收试剂盒对PCR产物进行回收，最终溶于30μl去离子水中。

III、***片段与载体的连接

在10μl反应体系中加入连接缓冲液、T4连接酶、回收所得***片段以及适量的载体，16℃反应过夜。

IV、质粒转化E.coli DH5α感受态细胞

(1)将从-80℃冰箱中取出的100μl感受态细胞置冰上至其融化；

(2)加入制备好的转化产物；

(3)轻柔混匀，置冰上30min；

(4)42℃热激45s；

(5)冰上放置2min；

(6)加入900μl液体LB培养基；

(7)轻柔混匀，置37℃水浴30min。

待复苏完成后，将EP管置于离心机中，5000rpm离心5min，使菌体在管底富集。在超净台中，吸出多余的上清液，留取约100μl左右，轻轻吹打菌体，使之悬浮。将悬浮液全部吸出，涂在LB(Amp⁺)平板上。玻璃珠涂匀菌液后，弃去玻璃珠。将平板倒置于37℃生化培养箱中，过夜培养12h。

V、质粒DNA的小量制备

转移约5ml过夜生长的菌于1.5ml EP管，10000rpm离心1min，去上清，利用残留壁上的少量溶液在振荡器上混悬细菌。加入200μl Sol I振荡混匀，再加入200μl Sol II，轻轻倒置两下后加入200μl Sol III，倒置混匀后12000rpm离心5min。将上清转移至一新管中，并加入300μl异丙醇，混匀室温15min，12000rpm离心15min。弃上清，沉淀用70％乙醇洗涤，晾干后溶于50μl Milli-Q H₂O。

1.2.3细胞培养与转染

HEK(人胚肾)293T细胞使用加入10％胎牛血清(Gibco)、50U/ml盘尼西林和50μg/ml链霉素的DMEM培养。培养箱保持在37℃，二氧化碳浓度5％。

I、细胞复苏和培养(以293T细胞为例)

(1)将293T细胞从液氮罐中取出，37℃水浴融化；

(2)取4ml新鲜DMEM培养液于15ml无菌管中，取1ml培养液缓慢加入细胞冻存管中，轻轻吹打混匀，转入15ml无菌管中，1200rmp离心3min。弃上清；

(3)用1ml新鲜DMEM培养液，轻轻重悬细胞，移至10cm细胞培养皿中，补加细胞培养液至10ml；

(4)置于37℃、5％CO₂、饱和湿度的培养箱中培养。

II、细胞传代(以293T细胞为例)

(1)细胞长满培养皿后，弃掉旧培养液；

(2)加入3ml 1×PBS，轻轻冲洗一遍以除去残留培养液，之后弃掉1×PBS；

(3)加入1ml胰酶，静置10s，用手轻轻拍打，使细胞从培养皿上解离下来；

(4)加入3ml DMEM完全培养液，终止消化，并吹打成单克隆；

(5)将细胞转入15ml离心管中，1200rmp离心3min；

(6)弃去上清，取10ml培养液吹打混匀。若1：10传代，取1ml加到含有9ml培养液的培养皿中；若1：3传代，则取3ml加入；

(7)置于37℃、5％CO₂、饱和湿度的培养箱中培养。

III、磷酸钙法瞬时转染293T细胞

(1)转染前一天分细胞，使细胞在转染前达到60-70％的密度；

(2)转染前1h，换成含有25μM氯喹的培养液；

(3)在15ml的离心管中，加入10μg DNA，用MilliQ-H₂O定容到1095μL，再加入155μL2M CaCl₂。然后，逐滴加入1250μL的2×HBS，边加边轻柔混匀。再将该混合物直接逐滴加入细胞中。注意加入2×HBS后，要在1-2min内完成。并要确保将液滴均匀地洒在整个平皿表面；

(4)培养7-11h，将会看到非常细小、灰尘状的颗粒。之后，漂洗一次，换成不含氯喹的培养基；

(5)转染48-72h后收集细胞，进行后续实验。

IV、慢病毒侵染T细胞

磷酸钙转染法转染293T细胞进行慢病毒包装，转染质粒的比例为(以10cm dish为例)：pCDH载体20μg、psPAX2 15μg以及pMD2.G 6μg。转染72h后，用10ml注射器收集含慢病毒上清液的培养液，0.45μm的过滤器过滤上清，超速离心浓缩后感染目的细胞。超速离心条件为20000rpm，2h，4℃。离心后去沉淀用100-200μl无血清培养液重新溶解。侵染时，分别用细胞培养液：慢病毒培养液比例为1:1重悬细胞，同时加入终浓度为8μg/ml的聚凝胺(polybrene)到细胞上清中，充分混匀，37℃培养，24h后更换新鲜病毒培养液液，继续感染。72h后流式细胞术检测。

1.2.4流氏细胞术(FACS)检测整合素的表达情况

(1)取5×10⁵个细胞于1.5ml Ep管中，3000rpm，4℃离心3min，用PBS洗一遍；

(2)a.细胞沉淀直接溶于300μl PBS中，置于4℃(Mock)；b.细胞沉淀溶于50μl PBS中，加5μg/ml抗体，轻轻混匀，置于4℃，静止30min。加1ml PBS，混匀，4℃3000rmp离心3min，弃上清，重复一次，将细胞悬浮在300μl PBS中；

(3)将细胞悬浮液转移到细胞收集管中，利用流式细胞仪Calibur或者LSRII(BD)进行分析。

1.2.5流动室***检测整合素与其配体介导的细胞黏附能力

I、细胞处理

(1)取T免疫细胞于15ml离心管中，1200rpm，3min；

(2)用5ml的洗涤缓冲液(HBSS，5mM EDTA，2％BSA，pH 8.0)，1200rpm，3min，洗两次；

(3)5ml的缓冲液A(HBSS，2％BSA，pH 8.0)，1200rpm，3min，重复一次；

(4)将细胞溶于1ml缓冲液A中并计数，调整最终细胞浓度为1×10⁷个/ml。

II、流动室细胞黏附实验

原理：

为了研究整合素介导的细胞黏附功能，我们在体外建立了流动室***，可以研究整合素β7和β2分别与其配体MAdCAM-1、E-cadherin或者ICAM-1的相互作用。细胞从入口管进入，流经流动室，然后从另一根管流出。一个可以编程的泵接在这根管上，可以控制液体的流速。整合素的配体被包被在这个塑料培养皿上。首先我们用EDTA鳌合溶液中的金属离子，然后在悬浮有细胞的悬液中加入相应的金属离子，将细胞吸入流动室，壁面剪应力为1dyn/cm²或者2dyn/cm²。实验过程以录像的形式记录下来，用于后期的数据分析。

步骤：

(1)包被配体：取一洁净的塑料平皿，在皿底中央点一直径约5mm的圆圈，滴20μl 5μg/ml的MAdCAM-1、E-cadherin或者ICAM-1，置于湿盒中，37℃孵育1h；

(2)封闭杂蛋白：取出平皿，在标记的地方，用包被缓冲液洗三次(要保持配体表面一直有液体覆盖)，于圆圈中加20μl封闭缓冲液，37℃孵育1h；

(3)用HBSS洗两次，然后装上流动室***，在上面铺一层HBSS，用真空泵抽气，谨防漏气；

(4)于450μl缓冲液A加入50μl处理好的细胞，加入二价阳离子2μl，混匀，置于流动室***中检测，同时开启泵程序和视频记录程序，记录细胞的运动状态，以备分析。

1.2.6细胞迁移实验

在穿孔小室(Transwell chambers，小鼠原代细胞用孔径5μm，Jurakt T细胞用孔径8μm，Millipore)两侧分别包被有10μg/ml MAdCAM-1或者ICAM-1蛋白，4℃过夜，用封闭缓冲液37℃封闭1h。细胞重悬于不加血清的RPMI 1640培养液中，细胞计数至1×10⁶个/ml，取200μl细胞加入Well上层。Well下层加入600μl含有10％FBS的RPMI 1640培养液，保证Well内外液面水平，37℃静置孵育6h。孵育后用3.7％多聚甲醛固定细胞，并用棉签将Well上层细胞蘸走，迁移到孔下层的细胞用DAPI染色进行计数，从而相对定量细胞的跨膜迁移能力。

1.2.7 DSS诱导急性结肠炎

在饮用水中加入2.0％(wt/vol)DSS，分子质量为36-50KD，共5天(day 0-5)，然后换成正常饮用水天(day 6-14)，诱导急性结肠炎。每天对小鼠的体重、腹泻和血便进行评估。

疾病活动指数(Disease activity index)和组织损伤评分如下；按粪便一致性综合评分(0分，正常；1分，粪便潮湿/粘性；2分，软；3分，腹泻)，大便是否有血(0分，无血；1分，大便或***周围有血；2分，大出血)，小鼠外观评估(0分，正常；1分，毛发起皱或步态改变；2分，昏睡或垂死)。

结肠炎的严重程度通过染色切片进行评估，使用基于隐窝损伤和溃疡的既定标准，隐窝损伤评分如下：0分，隐窝完好；1分，结构三分之一破坏；2分，结构三分之二破坏；3分，隐窝全破坏；4分，上皮表面因侵蚀而改变；5分，融合性的侵蚀。溃疡评分如下：0分，无溃疡；1分，1-2个溃疡灶；2分，2-4个溃疡灶；3分，溃疡汇合或广泛。结肠组织进行组织学和定量PCR分析。

1.2.8 T细胞转移性结肠炎

分选仪分选小鼠脾脏中CD4⁺CD45RB^high

T细胞，1×10⁵个WT，KI或者KO小鼠的CD4⁺CD45RB^high

T细胞通过尾静脉注射到Rag1^-/-受体小鼠中。每周称量小鼠体重，记录小鼠状态和便血情况。12周后安乐死后，结肠组织学和定量PCR分析。

1.2.9实时定量PCR

细胞总RNA用TRIzol(Invitrogen)抽提，以oligo dT为引物，反转录为cDNA(Reverse Transcriptase M-MLV,RNase H-,TaKaRa)。使用SYBR green方法进行实时定量PCR(Applied Biosystems,Foster City,CA,USA)。GAPDH的含量作为内参。反应程序如下：94℃持续4min运行1循环,然后45cycles of 94℃持续30秒、58℃持续30秒和72℃持续40秒运行45循环。

1.2.10肠道免疫细胞分离

上皮内免疫细胞(Intraepithelial lymphocyte,IEL)分离步骤：

(1)小鼠安乐死后，取出肠道，并清除脂肪组织和Peyer’s结；

(2)用PBS冲洗肠道至上清干净，将肠道纵向切开，切成5mm大小片段；

(3)Pre-digestion buffer震荡消化肠道组织2次，每次20分钟，37℃；

(4)两次消化后，将上清汇总，1000g，离心10分钟后，弃上清；

(5)PBS清洗两次，每次10分钟，1000g；

(6)用8ml 40％Percoll分离液重悬细胞，将细胞悬浮液置于5ml 80％Percoll分离液上，650g，20℃，离心20分钟；

(7)离心后收集40％和80％交界处的细胞，即IEL。

黏膜固有层免疫细胞(Lamina propria lymphocyte,LPL)分离步骤：

(1)上述分离IEL后剩余的肠道组织，用digestion buffer震荡消化1h，37℃；

(2)消化后，1000g，离心10分钟后，弃上清；

(3)PBS清洗两次，每次10分钟，1000g；

(4)用8ml 40％Percoll分离液重悬细胞，将细胞悬浮液置于5ml 80％Percoll分离液上，650g，20℃，离心20分钟；

(5)离心后收集40％和80％交界处的细胞，即LPL。

1.2.11石蜡切片，H&E染色

组织选取：

(1)取***上方0.5cm处，结肠(远端)至盲肠之间肠道组织；

(2)PBS(ice cold)冲洗内部和外部；

(3)切取远端结肠，在4％PFA中固定4h。(4℃摇床、15ml离心管中)；

(4)4℃，15ml Tube，PBS洗3.5min；

(5)75％乙醇过夜。

脱水固定：

(1)75％乙醇20min；

(2)95％乙醇20min，(期间80℃化蜡)；

(3)100％乙醇20min；

(4)50％乙醇+50％二甲苯。2min，加入后摇匀；

(5)二甲苯，1min；

(6)苯蜡(50％+50％)，65℃，15min；

(7)蜡I，1.5h；

(8)蜡II，1.5h，期间打开包埋机。

包埋，切片：

(1)蜡II与样品同时拿到包埋机处，将模具同时放入左侧蜡盘中。取模具，冲蜡，加入样品。放入冰上，冷却包埋，镊子扶正，盖上盖子。冰上冷却4℃，10min；

(2)预先将石蜡块放入-20℃约10min；

(3)调整切片机，使切片平行切下，3～5μm厚度；

(4)连续切片，每3片一张载玻片，记下顺序；

(5)展片，37℃；

(6)捞片，注意勿产生气泡(PLL包被载玻片)；

(7)烤片，37℃，过夜。

H&E染色：

二甲苯I，5min；二甲苯II，5min；100％乙醇，5min；100％乙醇，5min；95％乙醇，5min；75％乙醇，5min；dd H₂O，5min；苏木精，45s；dd H2O清洗2～3min；分化试剂1～3s；ddH2O流水冲洗30min，(勿正对片子，流速不能太快)；伊红A，1min；伊红B，25s；95％乙醇，5min；100％乙醇，5min；100％乙醇，5min；二甲苯I，5min；二甲苯II，5min；中性树胶固定，通风橱过夜风干。

1.2.12冰冻切片，免疫荧光染色

组织选取：

(1)取***上方0.5cm处，结肠(远端)至回盲部；

(2)PBS(ice cold)冲洗内部和外部；

(3)切取结肠组织，在4％PFA中固定4h。(4℃摇床、15ml离心管中)；

(4)4℃，15ml Tube，PBS wash 3.5minutes；

(5)30％蔗糖脱水4h；

(6)OCT包埋；

冰冻切片：8μm(-80℃冻存)

免疫荧光染色：

(1)冰切8μm厚度样品于-80℃冰箱冻存；

(2)-20℃冰箱中预冷丙酮，固定冰切样品15min；

(3)室温挥发丙酮，组化笔画圈；

(4)PBS wash 3.5min；

(5)10％goat serum+1％BSA in PBS(Blocking buffer)blocking for 1h,RT；

(6)一抗in blocking buffer，stainingfor 2h in RT or 4℃overnight；

(7)PBS wash 3.5min；

(8)二抗in blocking buffer，stainingfor 2h in RT；

(9)PBS wash 3.5min；

(10)DAPI in PBS，stainingfor 15min RT；

(11)PBS wash 3.5min；

(12)荧光封片剂封片；

1.2.13体内竞争性归巢实验

2×10⁷个杂合子、KI或者KO的脾脏免疫细胞用Yellow染料标记后与相同数量的用Violet染料标记的WT的脾脏免疫细胞混合，分别通过尾静脉注射到WT小鼠中，注射18小时后，小鼠安乐死，取脾脏、外周血、外周***、肠系黏膜***、Peyer’s结、小肠、结肠、骨髓、肝脏或者肺的免疫细胞，流氏检测不同组织器官中Yellow和Violet两种标记的免疫细胞比例，归巢指数计算为[Yellow⁺]_tissue/[Violet⁺]_tissue.

1.2.14 WT脾脏免疫细胞的β7整合素的敲低

质粒构建：β7shRNA引物(CCCGTCTTCTAGTGTTCACTT)构建于pCHD载体上

慢病毒包装及侵染免疫细胞：磷酸钙转染法转染293T细胞进行慢病毒包装，转染质粒的比例为(以10cm dish为例)：pCDH载体20μg、psPAX2 15μg以及pMD2.G6μg。转染72h后，用10ml注射器收集含慢病毒上清液的培养液，0.45μm的过滤器过滤上清，超速离心浓缩后感染目的细胞。超速离心条件为20000rpm，2h，4℃。离心后去沉淀用100-200μl无血清培养液重新溶解。侵染时，分别用细胞培养液：慢病毒培养液比例为1:1重悬细胞，同时加入终浓度为8μg/ml的聚凝胺(polybrene)到细胞上清中，充分混匀，37℃培养，24h后更换新鲜病毒培养液液，继续感染。72h后流式细胞术检测。

1.2.15蛋白表达及纯化

293T细胞表达纯化鼠E-cadherin蛋白

(1)磷酸钙法转染293T细胞；

(2)培养至培养液变黄，收取培养液(大约转染后3-4天)；

(3)等体积Protein A纯化Binding buffer稀释培养液，稀释时，边加Bindingbuffer边搅拌，pH8.0；

(4)4℃，15000rpm离心30分钟；

(5)取上清，然后倒入Protein A柱子；

(6)Protein A纯化Binding buffer洗柱子15个柱体积；

(7)Protein A纯化Elution buffer洗脱7个柱体积，收集管中预先按照1:10比例加入Protein A纯化Neutralization buffer；

(8)收集洗脱液，浓缩，同时换buffer为TBS，-80℃保存。

二、实验结果

2.1整合素Itgb7^F185A/F185A KI小鼠的构建及鉴定

运用基因工程手段构建Knock-in小鼠：小鼠整合素β7基因位于第12号染色体长臂上，14个外显子剪切拼接并翻译成编码807个氨基酸残基序列的整合素β7亚基，第185位的苯丙氨酸Phe位于第四号外显子中部(图1，A)。首先构建含有两对上下游同源序列、F185A点突变及抗药基因neo的质粒载体PL-124，然后将该质粒转染129小鼠的ES细胞，通过同源重组替换野生型序列，将F185A点突变***整合素β7基因组中，加药筛选阳性ES细胞(图1，B)。最后将阳性ES细胞注射进入129小鼠囊胚中，如果含有F185A点突变的ES细胞整合进入生殖***，即可得到嵌合体小鼠。嵌合体小鼠交配后代有一定概率可以得到含有F185A点突变的KI小鼠，再与EIIa-Cre工具鼠交配切除LoxP序列。得到的KI小鼠需要与C57BL/6J野生型小鼠连续交配5代以上以纯化基因背景。

根据孟德尔遗传定律，F1代杂合子雄鼠和雌鼠交配得到F2代中有1/4的纯合子，即两条等位基因均为含有F185A点突变的KI片段；1/2的杂合子，即一条等位基因均为KI片段另一条为WT基因；1/4的WT，即两条等位基因均为WT基因。剪取鼠尾抽提基因组DNA作为模板进行PCR扩增反应。设计WT引物可扩增出360bp基因序列，KI引物可扩增出380bp基因片段。综上，基因型鉴定仅能扩增出380bp基因片段为KI纯合子小鼠；仅能扩增出360bp基因片段为WT小鼠；两条片段均能扩增出来的即为杂合子小鼠(图1，C)。

为确保同源重组替换后的基因片段序列中仅包含F185A点突变而未引入其他突变，利用高保真KOD酶扩增基因组中相关片段进行测序鉴定。琼脂糖凝胶电泳结果表明PCR条带大小正确(图1，C)。基因测序结果显示KI小鼠基因中引入了F185A点突变并且未引入其他突变(图1，D)。

2.2整合素β7F185A突变导致免疫细胞向肠道归巢能力减弱

免疫细胞向小肠绒毛的迁移和归巢是肠道粘膜免疫中的关键步骤，在维持免疫稳态，调节炎症反应过程中发挥重要功能。H&E染色结果显示WT、KI和KO小鼠的小肠和结肠结构基本一致(图2，A，B)。但是，KI小鼠Peyer’s patch比WT小鼠Peyer’s patch小，但比KO小鼠Peyer’s patch大(图2，C，D)。表1显示流氏细胞术(FACS)技术检测WT、KI和KO小鼠各淋巴组织中T细胞(CD3⁺)和B细胞(CD19⁺)的数目。外周血(Peripheral blood，PB)；外周***(Peripheral lymph node，PLN)；肠系黏膜***(Mesenteric lymph node，MLN)；骨髓(Bone marrow，BM)；上皮内淋巴细胞(Intraepithelial lymphocytes，IEL)；粘膜内淋巴细胞(Lamina propria lymphocytes，LPL)；脾脏(Spleen)；派尔氏结(Peyer’s patch,PP)，小肠(Small intestine，SI)；结肠(Colon)和胸腺(Thymus)。^AP<0.01；^AAP<0.005(Student'st-test)。^B表示去除盲肠。ND表示检测不到(Not detected)。数据以平均值±标准差统计。

结果显示，整合素α4β7活化功能缺失抑制T细胞和B细胞向肠道相关免疫组织包括Peyer’s patch、小肠上皮内、小肠黏膜固有层和结肠的归巢，但不影响免疫细胞向脾脏、胸腺、骨髓和外周***的归巢(表1)，与其他肠道相关免疫组织不同，肠系黏膜***并不受整合素α4β7表达和F185A突变的影响。同时，整合素β7F185A突变并没有显著影响T、B细胞在各个淋巴器官中的相对比例(表1)。以上数据表明，免疫细胞向肠道和Peyer’s patch迁移归巢依赖于整合素α4β7的功能：当整合素α4β7的功能缺失时，肠道和派尔氏结(Peyer’spatch)中免疫细胞数目显著减少；同时，F185A突变影响了整合素α4β7的正常功能，部分免疫细胞向小肠和派尔氏结(Peyer’s patch)的迁移归巢受到抑制。

表1、淋巴细胞分布

2.3整合素β7F185A突变抑制免疫细胞与MAdCAM-1的黏附以及迁移

WT小鼠相比，我们发现KI小鼠脾脏免疫细胞膜上整合素β7表达减少约50％，KO小鼠几乎不表达β7(图3，A、表2)。同时整合素α4的表达也相应减少(图3，A、表2)。杂合子Itgb7^+/-(+/-)小鼠由于只有一个单拷贝整合素β7基因，因此其表达量也有约33％的下调(图3，A、表2)。为避免KI小鼠整合素表达量下降影响其生物学功能，除了用杂合子小鼠作为对照组外，我们还体外将WT小鼠的免疫细胞上整合素β7的表达水平敲低(KD)到与KI小鼠的一致(图3，A、表2)，作为后面实验的重要对照组。

表2

整合素β7中苯丙氨酸(F185)和SyMBS位点的金属阳离子之间存在阳离子-π相互作用来调节整合素的活化功能。为验证点突变对免疫细胞膜表面整合素配体亲和力的影响，我们分离了原代脾脏免疫细胞，运用流动室技术(Flow Chamber)***检测整合素α4β7与其配体MAdCAM-1的相互作用。在不加趋化因子刺激的条件下，整合素以低亲和力构象与配体黏附结合。此时，同样数目WT、+/-、KD和KI小鼠脾免疫细胞与配体结合，KO小鼠免疫细胞没有整合素α4β7表达，不能与配体结合(图3，B)。在加入趋化因子如CCL25和CCL21刺激后，WT小鼠脾免疫细胞膜表面整合素α4β7被活化后以高亲和力构象结合配体。此时，更多的WT小鼠脾免疫细胞与其配体稳定黏附，而KI脾免疫细胞不能被细胞因子活化，其与配体的黏附结合并没有增强(图3，B)，虽然+/-和KD的整合素β7表达水平也下降，但是仍然能被趋化因子活化，而增加与配体的稳定黏附(图3，B)。数据显示，F185A KI点突变后整合素α4β7的活化功能被抑制。

另外，血清诱导的细胞穿孔迁移实验显示，WT脾脏免疫细胞穿过包被有其配体MAdCAM-1的小孔进入底部小室的数量多于KI免疫细胞，与+/-和KD免疫细胞数目无显著性差异，KO免疫细胞穿膜运动能力最弱(图3，C)。而各组小鼠脾免疫细胞穿过包被有配体ICAM-1的小孔进入底部小室的数量基本一致(图3，D)。数据表明整合素α4β7的活化功能缺失严重抑制了整合素α4β7介导的免疫细胞穿膜迁移能力。

2.4整合素β7活化功能缺失导致αEβ7⁺免疫细胞减少和αE表达下调

除了整合素α4β7，β7亚基还可以与整合素αE形成异源二聚体。整合素αEβ7主要与肠道上皮的E-cadherin结合，维持免疫细胞在肠道中的驻留。我们首先在永生化人T免疫细胞系Jurkat T细胞系上过表达小鼠的整合素αEβ7以及突变的αEβ7F185A，并且同时过表达趋化因子CCL25的受体CCR9(Jurkat T细胞上本身有趋化因子CCL21的受体CCR7的表达)。FACS检测Jurkat T-αEβ7WT和Jurkat T-αEβ7F185A上αE和β7表达水平相同(图4，A)，在相似的表达水平下进一步检测与配体E-cadherin的黏附情况。Flow chamber结果显示，JurkatT-αEβ7WT和Jurkat T-αEβ7F185A两种细胞在趋化因子CCL21和CCL25的刺激前后，与E-cadherin的黏附行为是相似的，用blocking抗体M290可以特异抑制这一结合(图4，B)。而未过表达αEβ7的Jurkat T细胞不能与E-cadherin结合。这一结果表明，β7-F185A突变不会抑制趋化因子激活后的αEβ7与E-cadherin的黏附，因为这一黏附主要依赖于αE整合素，只要αE表达正常，就可以与E-cadherin黏附，并且趋化因子可以增加这一黏附。但是，我们在KI小鼠的脾脏细胞中，发现αEβ7⁺的免疫细胞比例显著降低(图5A)，同时小肠和结肠中IEL和LPL中αEβ7⁺的免疫细胞也显著减少(图5，B)，进一步分析，发现αEβ7⁺的免疫细胞的αE表达显著下调(表3，表格中的数字代表αEβ7⁺淋巴细胞上的αE的平均荧光强度(Mean fluorescence，MFI))，这一结果表明整合素β7活化功能缺失导致免疫细胞上整合素αE表达显著下降，从而导致肠道中αEβ7⁺免疫细胞减少。

表3

2.5整合素β7活化功能缺失抑制免疫细胞向肠道相关免疫组织的归巢

整合素α4β7介导低亲和性和高亲和性黏附在免疫细胞与其配体MAdCAM-1的结合中至关重要。整合素α4β7功能缺失后免疫细胞不能黏附结合MAdCAM-1，因此KO小鼠肠道免疫***中免疫细胞显著减少。为研究整合素α4β7活化介导的高亲和性黏附功能缺失对免疫细胞在体内归巢的影响，我们建立了体内免疫细胞竞争性归巢实验***：利用不同的荧光染料标记WT、KI、+/-和KO小鼠脾免疫细胞，将等量标记好的免疫细胞通过尾静脉注射进入CD45.1受体小鼠体内；荧光标记细胞随血液循环归巢进入不同淋巴器官，18小时后处死小鼠；分离各个器官中免疫细胞，FACS检测荧光标记阳性细胞的相对比例，以此分析WT、KI、+/-和KO小鼠免疫细胞向不同组织器官的竞争性迁移及归巢能力。

实验数据显示：在CD45.1受体小鼠外周血(PBL)中，WT和KI荧光标记阳性免疫细胞数目相当，表明注射起始细胞量相同；WT和KI荧光标记阳性免疫细胞向CD45.1受体小鼠脾脏(SP)、外周***(PLN)、骨髓(BM)、肝脏(LIV)和肺部(LUN)的迁移归巢量一致；与WT免疫细胞相比，KI免疫细胞向CD45.1受体小鼠肠系膜***(MLN)、Peyer’s patch(PP)、小肠(SI)和结肠(Colon)中迁移能力明显减弱(图6，A)；表明整合素α4β7活化介导的高亲和性黏附功能缺失抑制免疫细胞向肠道相关淋巴组织中的归巢。

KO免疫细胞与KI免疫细胞结果相似。与WT免疫细胞相比，KO免疫细胞向CD45.1受体小鼠肠道相关淋巴组织的归巢能力也明显减弱(图6，B)，表明整合素α4β7的表达和活化功能在免疫细胞向肠道相关淋巴组织的归巢中均发挥重要作用。而杂合子(+/-)小鼠的免疫细胞由于整合素活化功能正常，不影响其向肠道相关淋巴组织的归巢(图6，C)。以上结果表明整合素α4β7在免疫细胞向肠道相关免疫组织的归巢中发挥重要作用，整合素α4β7活化介导的高亲和性黏附功能缺失抑制免疫细胞向肠道相关免疫组织的归巢。

2.6整合素β7F185A小鼠CD4⁺CD45RB^high T细胞诱导慢性肠炎的能力减弱

整合素α4β7介导的免疫细胞归巢在肠炎发病中发挥重要作用。进一步我们运用T细胞诱导的肠炎模型检测了KI T细胞诱导Rag1^-/-受体小鼠肠炎发病的能力。首先通过FACS分选得到CD4⁺CD45RB^high T细胞，将其通过尾静脉注射到Rag1^-/-受体小鼠中。后续十二周体重观察显示WT CD4⁺CD45RB^high T细胞诱导Rag1^-/-受体小鼠体重显著下降，而KI和KO CD4⁺CD45RB^highT细胞则不能诱导Rag1^-/-受体小鼠体重下降(图7，A)。与KI和KO CD4⁺CD45RB^high T细胞相比，WT CD4⁺CD45RB^high T细胞诱导的肠道炎症指数明显升高(图7，B)。H&E染色表明Rag1^-/-受体小鼠接受尾静脉注射WT CD4⁺CD45RB^high T细胞后，其结肠皱襞结构破坏严重，免疫细胞浸润程度加重。而KI CD4⁺CD45^RBhigh T细胞注射到Rag1^-/-受体小鼠尾静脉以后，Rag1^-/-小鼠肠道结构基本保持正常，相关炎症性反应程度较弱(图7，C)。

在CD4⁺CD45RB^high T细胞诱导Rag1^-/-受体小鼠肠道炎症发病过程中，CD4⁺T细胞向受体小鼠肠道组织归巢在肠道炎症发生发展中发挥重要功能。通过CD4免疫荧光染色Rag1^-/-受体小鼠肠道组织切片，并且根据荧光染色定量CD4⁺T细胞，我们发现在尾静脉注射WT CD4⁺CD45RB^highT细胞后，Rag1^-/-受体小鼠结肠组织中有大量CD4 T细胞迁移浸润。而尾静脉注射KI或者KO CD4⁺CD45RB^highT细胞后，Rag1^-/-受体小鼠结肠组织中并没有CD4 T细胞的异常迁移浸润(图7，D)。以上结果表明与WT CD4⁺CD45RB^highT细胞不同，KI和KO CD4⁺CD45RB^high T细胞并不能诱导Rag1^-/-受体小鼠肠道炎症的发生和发展。KI炎症性T细胞向肠道组织的迁移受抑制，其不会造成肠道免疫稳态的失衡。结果表明整合素α4β7活化功能缺失抑制适应性免疫介导的慢性肠道炎症的发生发展。

2.7整合素β7 F185A小鼠对DSS诱导的急性肠炎更加耐受

为研究整合素α4β7活化在先天免疫介导的肠道炎症中的功能和作用机制，我们选取了DSS诱导的肠炎模型。2％的DSS(分子量36,000-50,000)加入小鼠饮用水中处理五天，后续十天加入正常饮用水。数据表明，KO小鼠体重下降更明显，而WT和KI小鼠体重仅有轻微下降(图8，A)。同时有80％的KO小鼠会因为肠炎引起的严重脱水而死亡，WT和KI小鼠则不会死亡(图8，B)。与KI小鼠相比，KO小鼠肠道炎症指数明显升高(图8，C)，结肠组织中促炎症因子IL-6，TNF-α和IL-1β显著升高，表明炎症性反映增强(图8，D)。H&E染色表明KO小鼠结肠皱襞结构破坏严重，免疫细胞浸润程度加重，而KI小鼠肠道结构基本保持正常(图8，E)。综合以上数据，KO小鼠对DSS诱导的急性肠炎更敏感，而KI小鼠和WT小鼠一致，对DSS诱导的急性肠炎更加耐受。

在以前的研究工作中，我们发现肠道中Treg细胞的减少会导致肠道上皮细胞ICAM-1表达上调，进一步介导先天免疫巨噬细胞浸润并在DSS诱导的结肠炎中发挥重要功能。我们发现虽然KI小鼠中Treg细胞有部分减少，但仍然保留足够的Treg细胞抑制先天免疫的异常活化(图8，F)。通过ICAM-1和F4/80免疫荧光染色DSS处理第四天的小鼠结肠组织，我们发现在DSS处理的KO小鼠中ICAM-1在肠道上皮细胞中的表达显著上调，伴随有大量巨噬细胞的浸润(图8，G)；而DSS处理的WT和KI小鼠则没有巨噬细胞的浸润和相关炎症因子表达的上调。以上结果表明KO小鼠对DSS诱导的急性肠炎更敏感，而该炎症的发生和发展主要依赖于肠道上皮细胞ICAM-1的高表达介导的巨噬细胞的迁移浸润以及巨噬细胞促炎症因子的分泌。与KO小鼠不同的是，WT和KI小鼠对DSS诱导的急性肠炎更加耐受，表明整合素α4β7活化功能缺失不会造成先天免疫介导的急性肠道炎症的加剧。

综上所述，我们发现整合素β7活化功能缺失不仅可以抑制免疫细胞向肠道相关免疫器官的迁移，并且减少了免疫细胞在肠道内的驻留，同时抑制了α4β7和αEβ7两种整合素的功能。进而抑制T细胞异常浸润介导的自发性肠道炎症的发生和发展；同时，与完全抑制整合素β7的生物学功能不同，抑制其活化功能可以使肠道中保留足够的Treg细胞，从而抑制适应性免疫介导的结肠炎，同时不会增加DSS诱导的先天性急性肠道炎症的易感性。基于此，开发特异性抑制整合素β7活化功能的药物将会成为治疗肠道炎症的新方向，该项研究为肠道炎症性疾病的治疗及药物筛选提供了理论基础和指导。

序列表

<110> 中国科学院分子细胞科学卓越创新中心

<120> 调控整合素β亚基的试剂和方法

<130> 201097

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 798

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

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580 585 590

Thr Glu Glu Phe Pro Pro Leu Gln Pro Ile Leu Gln Gln Lys Lys Glu

595 600 605

Lys Asp Val Ile Arg Lys Met Ile Asn Phe Ala Arg Phe Cys Ala Tyr

610 615 620

Glu Asn Cys Ser Ala Asp Leu Gln Val Ser Ala Lys Val Gly Phe Leu

625 630 635 640

Lys Pro Tyr Glu Asn Lys Thr Tyr Leu Ala Val Gly Ser Met Lys Thr

645 650 655

Ile Met Leu Asn Val Ser Leu Phe Asn Ala Gly Asp Asp Ala Tyr Glu

660 665 670

Thr Thr Leu Asn Val Gln Leu Pro Thr Gly Leu Tyr Phe Ile Lys Ile

675 680 685

Leu Asp Leu Glu Glu Lys Gln Ile Asn Cys Glu Val Thr Glu Ser Ser

690 695 700

Gly Ile Val Lys Leu Ala Cys Ser Leu Gly Tyr Ile Tyr Val Asp Arg

705 710 715 720

Leu Ser Arg Ile Asp Ile Ser Phe Leu Leu Asp Val Ser Ser Leu Ser

725 730 735

Arg Ala His Glu Asp Leu Ser Ile Ser Val His Ala Ser Cys Glu Asn

740 745 750

Glu Gly Glu Leu Asp Gln Val Arg Asp Asn Arg Val Thr Leu Thr Ile

755 760 765

Pro Leu Arg Tyr Glu Val Met Leu Thr Val His Gly Leu Val Asn Pro

770 775 780

Thr Ser Phe Val Tyr Gly Ser Ser Glu Glu Asn Glu Pro Glu Thr Cys

785 790 795 800

Met Ala Glu Lys Leu Asn Leu Thr Phe His Val Ile Asn Thr Gly Ile

805 810 815

Ser Met Ala Pro Asn Val Ser Val Lys Ile Met Val Pro Asn Ser Phe

820 825 830

Leu Pro Gln Asp Asp Lys Leu Phe Asn Val Leu Asp Val Gln Thr Thr

835 840 845

Thr Gly Gln Cys His Phe Lys His Tyr Gly Arg Glu Cys Thr Phe Ala

850 855 860

Gln Gln Lys Gly Ile Ala Gly Thr Leu Thr Asp Ile Val Lys Phe Leu

865 870 875 880

Ser Lys Thr Asp Lys Arg Leu Leu Tyr Cys Met Lys Ala Asp Gln His

885 890 895

Cys Leu Asp Phe Leu Cys Asn Phe Gly Lys Met Glu Ser Gly Lys Glu

900 905 910

Ala Ser Val His Ile Gln Leu Glu Gly Arg Pro Ser Ile Leu Glu Met

915 920 925

Asp Glu Thr Ser Ser Leu Lys Phe Glu Ile Lys Ala Thr Ala Phe Pro

930 935 940

Glu Pro His Pro Lys Val Ile Glu Leu Asn Lys Asp Glu Asn Val Ala

945 950 955 960

His Val Phe Leu Glu Gly Leu His His Gln Arg Pro Lys Arg His Phe

965 970 975

Thr Ile Ile Ile Ile Thr Ile Ser Leu Leu Leu Gly Leu Ile Val Leu

980 985 990

Leu Leu Ile Ser Cys Val Met Trp Lys Ala Gly Phe Phe Lys Arg Gln

995 1000 1005

Tyr Lys Ser Ile Leu Gln Glu Glu Asn Arg Arg Asp Ser Trp Ser Tyr

1010 1015 1020

Val Asn Ser Lys Ser Asn Asp Asp

1025 1030

<210> 5

<211> 1179

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 5

Met Trp Leu Phe His Thr Leu Leu Cys Ile Ala Ser Leu Ala Leu Leu

1 5 10 15

Ala Ala Phe Asn Val Asp Val Ala Arg Pro Trp Leu Thr Pro Lys Gly

20 25 30

Gly Ala Pro Phe Val Leu Ser Ser Leu Leu His Gln Asp Pro Ser Thr

35 40 45

Asn Gln Thr Trp Leu Leu Val Thr Ser Pro Arg Thr Lys Arg Thr Pro

50 55 60

Gly Pro Leu His Arg Cys Ser Leu Val Gln Asp Glu Ile Leu Cys His

65 70 75 80

Pro Val Glu His Val Pro Ile Pro Lys Gly Arg His Arg Gly Val Thr

85 90 95

Val Val Arg Ser His His Gly Val Leu Ile Cys Ile Gln Val Leu Val

100 105 110

Arg Arg Pro His Ser Leu Ser Ser Glu Leu Thr Gly Thr Cys Ser Leu

115 120 125

Leu Gly Pro Asp Leu Arg Pro Gln Ala Gln Ala Asn Phe Phe Asp Leu

130 135 140

Glu Asn Leu Leu Asp Pro Asp Ala Arg Val Asp Thr Gly Asp Cys Tyr

145 150 155 160

Ser Asn Lys Glu Gly Gly Gly Glu Asp Asp Val Asn Thr Ala Arg Gln

165 170 175

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180 185 190

Asp Glu Glu Glu Glu Glu Ala Gly Thr Glu Ile Ala Ile Ile Leu Asp

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210 215 220

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225 230 235 240

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245 250 255

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260 265 270

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275 280 285

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355 360 365

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385 390 395 400

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450 455 460

Val Ala Val Leu His Lys Thr Cys Ser Leu Ser Tyr Ile Ala Gly Ala

465 470 475 480

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Tyr Phe Gly Ser Glu Leu Cys Pro Val Asp Ile Asp Met Asp Gly Ser

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530 535 540

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Ser Leu Ala Arg Ile Leu Ser Gly His Pro Gly Phe Thr Asn Ala Arg

565 570 575

Phe Gly Phe Ala Met Ala Ala Met Gly Asp Leu Ser Gln Asp Lys Leu

580 585 590

Thr Asp Val Ala Ile Gly Ala Pro Leu Glu Gly Phe Gly Ala Asp Asp

595 600 605

Gly Ala Ser Phe Gly Ser Val Tyr Ile Tyr Asn Gly His Trp Asp Gly

610 615 620

Leu Ser Ala Ser Pro Ser Gln Arg Ile Arg Ala Ser Thr Val Ala Pro

625 630 635 640

Gly Leu Gln Tyr Phe Gly Met Ser Met Ala Gly Gly Phe Asp Ile Ser

645 650 655

Gly Asp Gly Leu Ala Asp Ile Thr Val Gly Thr Leu Gly Gln Ala Val

660 665 670

Val Phe Arg Ser Arg Pro Val Val Arg Leu Lys Val Ser Met Ala Phe

675 680 685

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705 710 715 720

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725 730 735

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740 745 750

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755 760 765

Pro Thr Glu Gly Glu Leu Cys Glu Glu Asp Cys Phe Ser Asn Ala Ser

770 775 780

Val Lys Val Ser Tyr Gln Leu Gln Thr Pro Glu Gly Gln Thr Asp His

785 790 795 800

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805 810 815

Leu Pro Tyr Glu Lys Ala Cys Lys Asn Lys Leu Phe Cys Val Ala Glu

820 825 830

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835 840 845

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885 890 895

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900 905 910

Val Leu Lys Arg Ser Ser Ala His Val Ser Val Val Trp Gln Leu Glu

915 920 925

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930 935 940

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965 970 975

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980 985 990

Val His Gly Glu Asn Leu Phe Gly Ala Glu Tyr Gln Leu Gln Ile Cys

995 1000 1005

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1010 1015 1020

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1025 1030 1035 1040

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1075 1080 1085

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1090 1095 1100

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Lys Tyr His Ser Leu Pro Ile Ile Ile Lys Gly Ser Val Gly Gly Leu

1125 1130 1135

Leu Val Leu Ile Val Ile Leu Val Ile Leu Phe Lys Cys Gly Phe Phe

1140 1145 1150

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1155 1160 1165

Leu Lys Ser Glu Asn Leu Leu Glu Glu Glu Asn

1170 1175

<210> 6

<211> 1167

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 6

Met Lys Trp Leu Phe His Thr Leu Leu Cys Met Ala Ser Leu Lys Pro

1 5 10 15

Gln Gly Ala Phe Asn Leu Asp Val Asp Trp Ala Trp Val Thr Ala Leu

20 25 30

Gln Pro Gly Ala Pro Ala Val Leu Ser Ser Leu Leu His Gln Asp Pro

35 40 45

Ser Asn Asn Gln Thr Cys Leu Leu Val Ala Arg Arg Ser Ser Asn Arg

50 55 60

Asn Thr Ala Ala Leu Tyr Arg Cys Ala Ile Ser Ile Ser Pro Asp Glu

65 70 75 80

Ile Ala Cys Gln Pro Val Glu His Ile Cys Met Pro Lys Gly Arg Tyr

85 90 95

Gln Gly Val Thr Leu Val Gly Asn His Asn Gly Val Leu Val Cys Ile

100 105 110

Gln Val Gln Ala Arg Lys Phe Arg Ser Leu Asn Ser Glu Leu Thr Gly

115 120 125

Ala Cys Ser Leu Leu Thr Pro Asn Leu Asp Leu Gln Ala Gln Ala Tyr

130 135 140

Phe Ser Asp Leu Glu Gly Phe Leu Asp Pro Gly Ala His Val Asp Ser

145 150 155 160

Gly Asp Tyr Cys Arg Ser Lys Gly Gly Ser Thr Gly Glu Glu Lys Lys

165 170 175

Ser Ala Arg Arg Arg Arg Thr Val Glu Glu Glu Asp Glu Glu Glu Asp

180 185 190

Gly Thr Glu Ile Ala Ile Val Leu Asp Gly Ser Gly Ser Ile Glu Pro

195 200 205

Ser Asp Phe Gln Lys Ala Lys Asn Phe Ile Ser Thr Met Met Arg Asn

210 215 220

Phe Tyr Glu Lys Cys Phe Glu Cys Asn Phe Ala Leu Val Gln Tyr Gly

225 230 235 240

Ala Val Ile Gln Thr Glu Phe Asp Leu Gln Glu Ser Arg Asp Ile Asn

245 250 255

Ala Ser Leu Ala Lys Val Gln Ser Ile Val Gln Val Lys Glu Val Thr

260 265 270

Lys Thr Ala Ser Ala Met Gln His Val Leu Asp Asn Ile Phe Ile Pro

275 280 285

Ser Arg Gly Ser Arg Lys Lys Ala Leu Lys Val Met Val Val Leu Thr

290 295 300

Asp Gly Asp Ile Phe Gly Asp Pro Leu Asn Leu Thr Thr Val Ile Asn

305 310 315 320

Ser Pro Lys Met Gln Gly Val Val Arg Phe Ala Ile Gly Val Gly Asp

325 330 335

Ala Phe Lys Asn Asn Asn Thr Tyr Arg Glu Leu Lys Leu Ile Ala Ser

340 345 350

Asp Pro Lys Glu Ala His Thr Phe Lys Val Thr Asn Tyr Ser Ala Leu

355 360 365

Asp Gly Leu Leu Ser Lys Leu Gln Gln His Ile Val His Met Glu Gly

370 375 380

Thr Val Gly Asp Ala Leu Gln Tyr Gln Leu Ala Gln Thr Gly Phe Ser

385 390 395 400

Ala Gln Ile Leu Asp Lys Gly Gln Val Leu Leu Gly Thr Val Gly Ala

405 410 415

Phe Asn Trp Ser Gly Gly Ala Leu Leu Tyr Ser Thr Gln Asn Gly Arg

420 425 430

Gly Cys Phe Leu Asn Gln Thr Ala Lys Glu Asp Ser Arg Thr Val Gln

435 440 445

Tyr Ser Tyr Leu Gly Tyr Ser Leu Ala Val Leu His Lys Ala His Gly

450 455 460

Val Ser Tyr Val Ala Gly Ala Pro Arg His Lys Leu Arg Gly Ala Val

465 470 475 480

Phe Glu Leu Arg Lys Glu Asp Arg Glu Glu Asp Ala Phe Val Arg Arg

485 490 495

Ile Glu Gly Glu Gln Met Gly Ser Tyr Phe Gly Ser Val Leu Cys Pro

500 505 510

Val Asp Ile Asp Met Asp Gly Thr Thr Asp Phe Leu Leu Val Ala Ala

515 520 525

Pro Phe Tyr His Ile Arg Gly Glu Glu Gly Arg Val Tyr Val Tyr Gln

530 535 540

Val Pro Glu Gln Asp Ala Ser Phe Ser Leu Ala His Thr Leu Ser Gly

545 550 555 560

His Pro Gly Leu Thr Asn Ser Arg Phe Gly Phe Ala Met Ala Ala Val

565 570 575

Gly Asp Ile Asn Gln Asp Lys Phe Thr Asp Val Ala Ile Gly Ala Pro

580 585 590

Leu Glu Gly Phe Gly Ala Gly Asp Gly Ala Ser Tyr Gly Ser Val Tyr

595 600 605

Ile Tyr Asn Gly His Ser Gly Gly Leu Tyr Asp Ser Pro Ser Gln Gln

610 615 620

Ile Arg Ala Ser Ser Val Ala Ser Gly Leu His Tyr Phe Gly Met Ser

625 630 635 640

Val Ser Gly Gly Leu Asp Phe Asn Gly Asp Gly Leu Ala Asp Ile Thr

645 650 655

Val Gly Ser Arg Asp Ser Ala Val Val Leu Arg Ser Arg Pro Val Val

660 665 670

Asp Leu Thr Val Ser Met Thr Phe Thr Pro Asp Ala Leu Pro Met Val

675 680 685

Phe Ile Gly Lys Met Asp Val Lys Leu Cys Phe Glu Val Asp Ser Ser

690 695 700

Gly Val Ala Ser Glu Pro Gly Leu Arg Glu Met Phe Leu Asn Phe Thr

705 710 715 720

Val Asp Val Asp Val Thr Lys Gln Arg Gln Arg Leu Gln Cys Glu Asp

725 730 735

Ser Ser Gly Cys Gln Ser Cys Leu Arg Lys Trp Asn Gly Gly Ser Phe

740 745 750

Leu Cys Glu His Phe Trp Leu Ile Ser Thr Glu Glu Leu Cys Glu Glu

755 760 765

Asp Cys Phe Ser Asn Ile Thr Ile Lys Val Thr Tyr Glu Phe Gln Thr

770 775 780

Ser Gly Gly Arg Arg Asp Tyr Pro Asn Pro Thr Leu Asp His Tyr Lys

785 790 795 800

Glu Pro Ser Ala Ile Phe Gln Leu Pro Tyr Glu Lys Asp Cys Lys Asn

805 810 815

Lys Val Phe Cys Ile Ala Glu Ile Gln Leu Thr Thr Asn Ile Ser Gln

820 825 830

Gln Glu Leu Val Val Gly Val Thr Lys Glu Val Thr Met Asn Ile Ser

835 840 845

Leu Thr Asn Ser Gly Glu Asp Ser Tyr Met Thr Asn Met Ala Leu Asn

850 855 860

Tyr Pro Arg Asn Leu Gln Phe Lys Lys Ile Gln Lys Pro Val Ser Pro

865 870 875 880

Asp Val Gln Cys Asp Asp Pro Lys Pro Val Ala Ser Val Leu Val Met

885 890 895

Asn Cys Lys Ile Gly His Pro Ile Leu Lys Arg Ser Ser Val Asn Val

900 905 910

Ser Val Thr Trp Gln Leu Glu Glu Ser Val Phe Pro Asn Arg Thr Ala

915 920 925

Asp Ile Thr Val Thr Ile Ser Asn Ser Asn Glu Lys Ser Leu Ala Arg

930 935 940

Glu Thr Arg Ser Leu Gln Phe Arg His Ala Phe Ile Ala Val Leu Ser

945 950 955 960

Arg Pro Ser Val Met Tyr Met Asn Thr Ser Gln Ser Pro Ser Asp His

965 970 975

Lys Glu Phe Phe Phe Asn Val His Gly Glu Asn Leu Phe Gly Ala Val

980 985 990

Phe Gln Leu Gln Ile Cys Val Pro Ile Lys Leu Gln Asp Phe Gln Ile

995 1000 1005

Val Arg Val Lys Asn Leu Thr Lys Thr Gln Asp His Thr Glu Cys Thr

1010 1015 1020

Gln Ser Gln Glu Pro Ala Cys Gly Ser Asp Pro Val Gln His Val Lys

1025 1030 1035 1040

Glu Trp His Ser Val Val Cys Ala Ile Thr Ser Asn Lys Glu Asn Val

1045 1050 1055

Thr Val Ala Ala Glu Ile Ser Val Gly His Thr Lys Gln Leu Leu Arg

1060 1065 1070

Asp Val Ser Glu Leu Pro Ile Leu Gly Glu Ile Ser Phe Asn Lys Ser

1075 1080 1085

Leu Tyr Glu Gly Leu Asn Ala Glu Asn His Arg Thr Lys Ile Thr Val

1090 1095 1100

Ile Phe Leu Lys Glu Glu Glu Thr Arg Ser Leu Pro Leu Ile Ile Gly

1105 1110 1115 1120

Ser Ser Ile Gly Gly Leu Leu Val Leu Val Val Ile Ile Ala Ile Leu

1125 1130 1135

Phe Lys Cys Gly Phe Phe Lys Arg Lys Tyr Gln Gln Leu Asn Leu Glu

1140 1145 1150

Ser Thr Arg Arg Ala Gln Leu Lys Ala Asp Ser Leu Leu Gln Asp

1155 1160 1165

<210> 7

<211> 360

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

catctaggtg tatcatctga gtatttagca gggactctta aatcctgtcg atgccttgtg 60

atctttggca cagctcccat cgctttctgc tttcaggttt tggctccttc gtggacaaaa 120

cggtgctgcc cgcggtaagc accgtgccct ccaagcttca ccacccatgc cccagccgac 180

tggagcgttg tcagccaccc ttcagctttc accacgtgct gtccctcacc ggggacgctc 240

aagccttcga gagagaggtg ggacgccaga atgtctctgg caacctggac tcacccgaag 300

gcggctttga tgccattttg caggctgccc tctgccaggt gagatagggt taggatctga 360

Claims

1.一种体外下调整合素αE的表达、降低免疫细胞跨血管迁移能力、抑制免疫细胞与上皮组织的黏附、抑制免疫细胞向肠道相关淋巴组织的归巢、抑制免疫细胞在肠道相关淋巴组织的驻留的非治疗或诊断方法，包括下调整合素β亚基的表达或活性。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括降低或抑制整合素β亚基I结构域中芳香族氨基酸与SyMBS位点的金属阳离子之间的相互作用，

优选地，所述方法包括降低或抑制整合素β亚基中第185位的苯丙氨酸与SyMBS位点的金属阳离子之间的相互作用，

更优选地，所述方法包括对β亚基第185位的苯丙氨酸进行突变。

3.试剂在制备用于下调整合素αE的表达、降低免疫细胞跨血管迁移能力、抑制免疫细胞与上皮组织的黏附、抑制免疫细胞向肠道相关淋巴组织的归巢、抑制免疫细胞在肠道相关淋巴组织的驻留、抑制肠道炎症、减少肠道移植物抗宿主病、抑制肿瘤生成或改善肠道炎症性疾病治疗副作用的药物中的用途，或在制备用于治疗或预防受益于下调整合素αE的表达、降低免疫细胞跨血管迁移能力、抑制免疫细胞与上皮组织的黏附、抑制免疫细胞向肠道相关淋巴组织的归巢、抑制免疫细胞在肠道相关淋巴组织的驻留的肠道疾病的药物中的用途，所述试剂选自：

(1)活性降低的整合素或其β亚基，或编码它们的核酸序列，和任选的野生型整合素或其β亚基的基因敲除试剂，优选地，活性降低的整合素或其β亚基包括无活性或低活性野生型整合素或其β亚基，或活化功能降低或缺失的整合素或其β亚基的突变体，更优选地，所述整合素或其β亚基的突变体包含导致整合素β亚基I结构域中芳香族氨基酸与SyMBS位点的金属阳离子之间的相互作用与野生型相比减弱或消失的突变，

(2)降低整合素β亚基活性的试剂，

(3)下调整合素β亚基表达的试剂，

优选地，所述肠道炎症是适应性免疫介导的慢性肠道炎症或先天性免疫介导的急性肠道炎症，

优选地，所述整合素β亚基是整合素β7亚基。

4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，降低整合素β亚基活性是降低或抑制整合素β亚基芳香族氨基酸与SyMBS位点之间的阳离子相互作用，优选地，降低整合素β亚基活性的试剂选自以下的一种或多种：

稳定整合素胞内保守序列GEFKR和/或LLv-iHDR的调节因子，

能使整合素α和β胞内段形成α螺旋结构的试剂，

结合整合素β亚基I结构域中芳香族氨基酸的试剂，

含有浓度至少1mmol/L的钙离子，

抑制胞内蛋白与整合素结合的试剂，优选所述试剂包括：与所述胞内蛋白竞争性结合的蛋白，和调节与所述胞内蛋白竞争性结合的蛋白的蛋白激酶，

抑制整合素与其配体结合的试剂，优选能竞争性结合配体的β亚基胞外片段或其编码序列，所述片段与整合素β亚基的胞外部分具有至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％的序列相同性，

整合素β亚基或SyMBS位点的基因敲入试剂，所述基因敲入使得整合素β亚基与SyMBS位点之间的阳离子相互作用降低或抑制，

降低整合素β亚基活性的整合素或其β亚基的特异性抗体或编码其的核酸序列，或抑制整合素或其β亚基的活性的小分子化合物，

阳离子螯合剂，优选EDTA。

5.一种核酸分子，包含选自以下的序列：

(1)含有SEQ ID NO:7所示序列和LoxP位点的核酸序列；和

(2)(1)所述序列的互补序列。

6.一种载体，其含有权利要求5所述的核酸序列。

7.一种经基因工程改造的宿主细胞，所述宿主细胞转入了权利要求5所述的载体。

8.一种构建转基因小鼠的方法，所述方法包括：

(1)提供权利要求6所述的载体，

9.整合素或其β亚基的基因或蛋白作为靶点在筛选药物中的应用，或用作分子指标在临床上用于诊断肠道疾病的病程发展，所述药物用于治疗或预防肠道疾病或改善肠道炎症性疾病治疗副作用，

优选地，所述肠道疾病是受益于抑制淋巴细胞的稳定黏附、降低免疫细胞跨血管迁移能力、下调整合素αE的表达、抑制免疫细胞向肠道相关淋巴组织的归巢的疾病，优选地，所述疾病是肠道炎症。

10.检测整合素或其β亚基的基因或蛋白的试剂在制备用于诊断肠道疾病或判断肠道疾病的病程发展的试剂盒中的应用，

优选地，所述肠道疾病是受益于抑制淋巴细胞的稳定黏附、降低免疫细胞跨血管迁移能力、下调整合素αE的表达、抑制免疫细胞向肠道相关淋巴组织的归巢、抑制肠道炎症的疾病，

更优选地，所述疾病是肠道炎症。