CN113559059B

CN113559059B - 一种阳离子纳米混悬液及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN113559059B
Application number: CN202110825776.7A
Authority: CN
Inventors: 甘莉; 颜蓉; 王秋贺; 吴峥
Original assignee: Shanghai Institute of Technology
Current assignee: Shanghai Institute of Technology
Priority date: 2021-07-21
Filing date: 2021-07-21
Publication date: 2023-04-28
Anticipated expiration: 2041-07-21
Also published as: CN113559059A

Abstract

本发明涉及一种阳离子纳米混悬液及其制备方法和应用，其制备方法为：称取并配置阳离子表面活性剂、非离子表面活性剂、高分子聚合物的水溶液作为稳定剂水溶液；称取纯药物颗粒并通过有机溶剂溶解，在搅拌条件下，用注射器将其注入到S1中制备的稳定剂水溶液中，继续搅拌，然后旋转蒸发除去有机溶剂，得粗纳米混悬液；最后用调节pH至6‑8，得到阳离子纳米混悬液。与现有技术相比，本发明以纯药物颗粒为核心，以阳离子表面活性剂、非离子表面活性剂、高分子聚合物为稳定剂，形成的亚微米颗粒胶状分散体系，制备的阳离子纳米混悬液能增加眼部生物黏附性，延长眼表滞留时间，是一种更有效的眼部药物递送***。

Description

一种阳离子纳米混悬液及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及眼用纳米混悬液技术领域，尤其是涉及一种阳离子纳米混悬液及其制备方法和应用。

背景技术

由于眼睛独特的解剖学和生理学特性，眼部给药受到许多给药屏障和清除***的影响。如反射性眨眼、泪膜再生、泪液循环等使得通常情况下的眼局部给药生物利用度很低，一般不到5％。针对各种眼表及眼内疾病，如干眼症、青光眼、葡萄膜炎及黄斑变性等治疗，临床多采用甾体或非甾体抗炎药，而它们多数为难溶性药物。由于这些药物本身具有强亲脂性和水溶性较差的特点，

近年来，针对这类难溶性药物，涌现了若干脂质纳米载体制剂如纳米乳、脂质体、纳米胶束等。由于脂质载体本身的限制，包封率和载药量都有限，并且临床上存在广泛的刺激性等毒副作用。

因此亟需研究一种新型的眼部药物递送***，既能够增加药物在眼部的生物利用度，又能大大地降低眼部刺激性将具有重要的临床意义。

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种阳离子纳米混悬液及其制备方法和应用，用于药物在眼部的有效递送，该眼部药物递送***具有刺激性小、生物黏附性强的特点，能大大对提高药物在眼部生物利用度。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

首先，本技术方案有着缜密的构思，基于研发基础构建了明确的研发方向，本发明中采用纳米混悬液独特的组成形式，使其成为一种很有前途的眼部药物递送***。与纳米脂质载体制剂相比，眼用纳米混悬液具有以下的优势：

(1)减少眼部刺激性不需要依靠高浓度的表面活性剂来增加药物浓度，可以很好的解决纳米脂质载体制剂中大量的油相和表面活性剂会破坏角膜细胞的完整性，引起眼睛红肿、刺痛、灼伤及减低泪流率等刺激性问题，改善眼用制剂的安全性，减少刺激性。

(2)增加角膜粘附性，延长眼表滞留时间。

(3)促进角膜渗透，提高眼部生物利用度。纳米混悬液巨大的比表面积可显著增加药物在泪液中的饱和溶解度和溶出速度，能够使药物在较短的时间能更快更完全的释放出来，在角膜表面快速达到较高的药物浓度，形成一定的浓度梯度，提高药物角膜渗透，促进药物分子从泪液至眼组织的转运。

作为本技术方案中构思的核心：眼表粘液层由黏蛋白和泪液组成，粘蛋白带负电性能与带正电荷的药物离子结合，从而增加阳离子给药***在眼表的滞留。

本申请的第一个目的是保护一种阳离子纳米混悬液的制备方法，包括以下步骤：

S1：称取并配置阳离子表面活性剂、非离子表面活性剂、高分子聚合物的水溶液作为稳定剂水溶液；

S2：称取纯药物颗粒并通过有机溶剂溶解，在搅拌条件下，用注射器将其注入到S1中制备的稳定剂水溶液中，继续搅拌，然后旋转蒸发除去有机溶剂，得粗纳米混悬液；

S3：最后用调节pH至6-8，得到阳离子纳米混悬液。

进一步地，S3中制备的纳米混悬液是以纯药物颗粒为核心，以阳离子表面活性剂、非离子表面活性剂、高分子聚合物为稳定剂，形成的亚微米颗粒胶状分散体系，制备的阳离子纳米混悬液能增加眼部生物黏附性，延长眼表滞留时间，是一种更有效的眼部药物递送***。

进一步地，S3中制备的纳米混悬液平均粒径小于1μm，Zeta电位为-15～+90mV。

进一步地，所述纯药物颗粒为环孢素A。

进一步地，所述阳离子表面活性剂的加入量为阳离子纳米混悬液的0.0001wt％～0.01wt％；

所述非离子表面活性剂的用量为阳离子纳米混悬液的0.01wt％～4wt％；

所述高分子聚合物的用量为阳离子纳米混悬液的0.01wt％～4wt％。

所述纯药物颗粒的用量为量按照实际的需求进行调整即可。

进一步地，所述阳离子表面活性剂为西他氯铵(CKC)、苯扎氯氨(BKC)、苯扎溴铵(BDB)、十六烷基三甲基氯化铵(1631)、十八烷基三甲基氯化铵(1831)、壳聚糖中的一种或多种的组合。

进一步地，所述非离子表面活性剂为泊洛沙姆407(P407)、泊洛沙姆188(P188)、TPGS(CAS号9002-96-4)、吐温80、PEG400中的一种或多种的组合。

进一步地，所述高分子聚合物为聚乙烯醇(PVA)、聚维酮(PVP)、HPMC-羟丙甲纤维素(HPMC)、透明质酸(HA)中的一种或多种。

本申请的第二个目的是保护一种由上述所述方法制备的阳离子纳米混悬液。

本申请的第三个目的是保护一种上述述阳离子纳米混悬液在眼部药物中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下技术优势：

(1)本发明中制备的阳离子纳米混悬液，辅料用量少，刺激性小，阳离子表面活性剂的加入使药物粒子带正电荷，能与眼表带负电荷的粘蛋白结合，提高生物黏附性高，延长在眼表的滞留时间，体内生物利用度高。

(2)本发明中制备的阳离子纳米混悬液在角膜中药物含量能达到有效的药物治疗浓度(10～20μg/g)，是一种有效的眼用环孢素纳米递送***。

(3)本发明中制备的阳离子纳米混悬液比粘液渗透粒子和普通的纳米混悬液，在眼部的生物利用度更高。

附图说明

图1：阳离子纳米混悬液的透射电镜图。

图2：阳离子纳米混悬液X-射线粉末衍射图。

图3：阳离子环孢素纳米混悬液与不同浓度粘蛋白作用后电位变化结果。

图4：环孢素纳米混悬液与粘蛋白结合率随时间变化的实验结果。

图5：环孢素纳米混悬液局部给药后环孢素在角膜中的浓度。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。

本发明采用反溶剂沉淀法制备纳米混悬液。将药物溶在有机溶剂中，然后在磁力搅拌的条件下将其快速的注入到含有稳定剂的等渗水溶液中。

本发明提供一种正电荷的阳离子纳米混悬液，其中阳离子纳米混悬液是以非离子表面活性剂包括泊洛沙姆407、泊洛沙姆188、TPGS、吐温80、PEG400和阳离子表面活性剂包括西他氯铵(CKC)、苯扎氯氨(BKC)、苯扎溴铵(BDB)、十六烷基三甲基氯化铵(1631)、十八烷基三甲基氯化铵(1831)、壳聚糖为稳定剂，其中非离子表面活性剂作为立体稳定作用，而阳离子表面活性剂吸附在粒子表面使粒子带正电荷形成静电排斥作用，立体稳定和静电排斥作用共同维持粒子的稳定性。

实施例1-9

处方组成:参见表1

(1)精密称取处方量的稳定剂于烧杯中，加纯化水超声使其完全溶解。

(2)精密称取处方量的环孢素A于小烧杯中加适量有机溶剂溶解，在磁力搅拌速度为100～900rpm的条件下，用注射器将其注入到上述含稳定剂的水溶液中，继续搅拌，然后旋转蒸发2-3h除去有机溶剂,得粗纳米混悬液。

(3)最后用调节pH至6-8，得到最终环孢素A纳米混悬液。

表1

实施例1-9中使用了9种不同的稳定剂，HA、PVP、PVA和HPMC属于高分子化合物，分子量较大；P88、P407、TPGS、吐温80属于非离子表面活性剂；SDS属于离子型表面活性剂。其形成的纳米混悬液的粒径大小顺序为：SDS＜P188＜P407＜TPGS＜吐温80＜PVA＜HPMC，其中HA和PVP无法形成均一状态的纳米混悬液，而是出现白色絮状沉淀。

在25℃条件下放置2天后，实施例4和实施例5分别以PVA、P407为稳定剂形成的纳米混悬液粒径基本没变化，其它的粒径变化非常明显，说明PVA、P407作为稳定剂效果较好。

实施例10-23

纳米混悬液的制备：

类似实施例4和5，区别在于使用不同浓度的高分子聚合物和离子表面活性剂制备纳米混悬液。

表2

比较各实施例可知，粒径均随稳定剂用量的增加而明显减少，随着稳定剂用量的增加，粒径减少的速率下降。

实施例10-16与实施例17-23相比，PVA减小的程度明显比P407大，主要是因为P407属与两亲性表面活性剂，其亲水链比PVA的亲水链短，而PVA属于高分子聚合物，分子量较大，具有较长的亲水链，立体作用力更强。

从25℃条件下放置14天粒径大小和粒径分布的变化数据显示，实施例14和实施例21粒径基本不增加，稳定性好。

实施例24-29。

处方组成：参见表3。

一种纳米混悬液的制备方法：

类似实施例14和21，区别在于使用了高分子聚合、非离子表面活性剂及阳离子表面活性剂作为复合稳定剂组合制备了纳米混悬液。

表3

比较实施例24-26可知，PVA和TPGS组合后制备的纳米混悬液表现出很好的稳定性，说明PVA和TPGS这两者稳定剂兼容效果好，原因可能是TPGS为具有亲脂头部和亲水尾部的两亲性表面活性剂，亲脂链与脂溶性药物粒子具有较强的亲和力，促进TPGS在纳米混悬液表面的吸附，而其亲水链相对较短并不影响PVA的进一步吸附使得药物粒子表面稳定覆盖更完全，表现出良好的稳定性。

比较实施例27-19可知，TPGS和P407组合后制备的纳米混悬液稳定性较差，说明TPGS和P407兼容性差，主要因为TPGS和P407均属于两亲性的表面活性剂，两者均具有亲脂链，在脂溶性药物粒子表面的吸附具有竞争性，使得药物粒子表面稳定剂吸附不完全，不能形成较厚的水化层空间立体屏障效应弱，因此形成的纳米混悬液不够稳定。

实施例25和实施例27与其他实施例相比，加入CKC后制备的纳米混悬液稳定性很好，主要是由于CKC的加入使得纳米粒子表面具有较高的正电荷，形成较强的静电斥力，进一步增强了纳米混悬液的稳定性。

实施例30-40

处方组成：参见表4。

一种纳米混悬液的制备方法：

类似实施例25和27，区别在于使用了不同种类的阳离子表面活性剂制备纳米混悬液。

表4

实施例41-50

处方组成：参见表5。

一种纳米混悬液的制备方法：

类似实施例32和35，区别在于使用了不同浓度的阳离子表面活性剂制备纳米混悬液。

表5

比较各实施例可知，纳米混悬液的Zeta电位随着阳离子表面活性剂用量的增加而增大。比较实施例40-45和实施例46-50可知，使用相同浓度的阳离子表面活性剂时，以表面活性剂为主要稳定剂制备的纳米混悬液的Zeta电位比以高分子聚合为稳定剂制备的纳米混悬液Zeta电位高。

应用实施例

应用本发明实施例21、实施例25、实施例26、实施例27纳米混悬液对其体外理化性质进行表征，并对其体外黏附性、粘液穿透性和眼部组织分布进行评价。

在水中稀释后，使用马尔文粒度仪对不同纳米混悬液进行粒径，PDI和电位的测定。见表6。

表6

4种不同CsA纳米悬浮液的理化特性，实施例25和实施例26的平均粒径分别为(181.9nm)和(197.5nm)明显大于实施例27(115.7nm)和实施例21(117.9nm)。这是由于实施例25和实施例26中使用的主要稳定剂PVA是一种高分子聚合物，实施例27和实施例21中使用的主要稳定剂是P407是一种表面活性剂。P407属与两亲性表面活性剂，其亲水链比PVA的亲水链短，而PVA属于高分子聚合物，分子量较大，具有较长的亲水链，在药物晶体表面形成更大的水化层，因此，形成的纳米粒子粒径更大。

一、阳离子环孢素纳米混悬液与不同浓度粘蛋白作用后电位变化

试验步骤如下：

(1)称取100mg粘蛋白于研钵中，先加少量去离子水研磨1h后加去离子水稀释得到1mg/mL粘蛋白溶液，然后用磁力搅拌器在300rpm搅拌速度下搅拌过夜使其完全水化之后在4℃下储备，然后再稀释到不同浓度制备成0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.3mg/ml、0.4mg/ml、0.5mg/ml、0.75mg/ml、1mg/ml粘蛋白溶液。

(2)以1:10比例将样品加入到上述不同浓度的粘蛋白溶液中(1mL样品溶液+10mL粘蛋白溶液)，在混匀机上混匀30s后静置15min，比较混合前后zeta电位变化。

实验结果如图3所示。随着粘蛋白浓度的增加，Zeta电位逐渐降低，然后接近于零，进一步增加粘蛋白浓度时，最终导致药物纳米粒子的电荷由正变为负。这可能是因为带负电荷的粘蛋白吸附在带正电荷的CsA纳米粒子体表面，从而降低了表面电荷。此外，我们还发现当粘蛋白浓度分别为0.3mg/ml和1mg/ml时，最终实施例15和实施例13的Zeta电位都逆转到-15mV左右。上述结果表明，实施例3(+31mV)与粘蛋白之间的静电作用力比实施例13(+11mV)更强，这主要是由于实施例15所带的正电荷比实施例13大，Zeta绝对值越大则表现出更强的静电作用力。

二、纳米混悬液与粘蛋白的结合率

试验步骤如下：

(1)称取100mg粘蛋白于研钵中，先加少量纯水研磨1h后加水稀释得到1mg/ml粘蛋白溶液，然后用磁力搅拌器在300rpm搅拌速度下搅拌过夜使其完全水化之后在4℃下储备。

(2)以1:10比例将样品加入到上述粘蛋白溶液中(1mg/ml)，在混匀机上混匀30s后分别静置5min、10min、30min、60min，后离心(16000rpm，10min)，取上清液并用去离子水稀释10倍，用紫外分光光度计在粘蛋白最大吸收波长处测量其吸光度，得游离的粘蛋白浓度，从而计算出样品与粘蛋白的结合率。结合率越大说明其黏附性越强。

结果如图4所示。实施例25和实施例26与粘蛋白溶液孵育60min后才吸附完全达到平衡，而实施例27和实施例21只需孵育10min后就可达到平衡。这可能是因为实施例25和实施例26中使用的稳定剂为高分子聚合物PVA，具有很长的亲水链与粘蛋白之间除了静电相互作用之外，还可能存在氢键或物理缠绕的过程。物理缠绕的过程没有静电相互作用那么快，导致实施例25和实施例26需要更长的时间才能达到平衡。在前20min内，实施例25与粘蛋白结合率低于实施例27，但60min后，最终实施例25(61％)与粘蛋白结合率要高于实施例27(50.2％)，也是因为相同的原因。

从图中可看出实施例25(61％)和实施例27(50.2％)与粘蛋白的结合率明显高于实施例26(29.9％)和实施例21(10.2％)。这可能是因为实施例25和实施例27带正电荷，与带负电荷的粘蛋白之间的相互作用更强。上述结果表明，通过静电相互作用和物理缠绕都可以促进药物纳米粒子与粘蛋白的结合效率，但是静电相互作用的速率比物理藏绕的过程快，静电相互作用在短短几分钟内就可以完成，而且粘蛋白的结合率可达50％以上。可见，正负电荷的静电相互作是影响纳米晶与带负电荷粘蛋白的结合率的主要因素，其次是由PVA亲水链的藏绕。

三、纳米混悬液体外粘液穿透性实验

试验步骤如下：

利用Transwell小室模拟体内眼粘液层结构，对CsA纳米混悬液在粘液中的穿透性进行研究，Transwell小室渗透装置主要由一个供体室和受体室组成，在供体室底部涂有一层特殊的聚碳酸酯半透膜其孔径为0.4μm，它能允许药物粒子自由穿过进入接收室，但粘液不能渗透通过。将100μL浓度为1mg/ml粘蛋白溶液加入到上述的12孔Transwell小室(0.4μm)半透膜上，在接受室中加入1.5mL的人工泪液，上室分别加入500μL相同浓度的四种环孢素纳米混悬液溶液，为了模拟体内动态环境，将恒温摇床的温度设置为35±0.1℃，摇床转速设置为100rpm，将上述Transwell小室渗透装置在此条件下将进行培养3h，用移液枪在下面的接受室中取200μL样品溶液，用HPLC进样测量其药物浓度。

实验结果见表5。实施例25(1.01×10-6cm.s^-1)和实施例27(0.43×10-6cm.s^-1)的Papp值明显低于实施例26(3.44×10^-6cm.s^-1)和实施例21(4.94×10-6cm.s^-1)。这一结果表明，由于实施例25和实施例27都带正电荷，与粘蛋白之间发生了强烈的静电相互作用，从而表现出与粘蛋白有更高的亲和力，被粘液中粘蛋白捕获，因此表观渗透系数低。另外，虽然实施例26和实施例21都带负电荷，但实施例21(4.94×10-6cm.s^-1)的Papp值明显高于实施例26(3.44×10-6cm.s^-1)。这是因为实施例21中使用的稳定剂为表面活性剂P407，P407分子结构中具有2条亲水的PEG链，PEG亲水链覆盖在CsA表面能形成一种具有粘液穿透性的涂层，实施例21形成的是一种具有粘液穿透性的粒子(MPP)，能逃避粘蛋白的捕获，因此其表观渗透系数较高。这些研究结果表明，MPP技术可能有助于药物粒子克服眼粘液屏障,实现较高的药物浓度到达角膜表面。

表7

四、眼组织分布试验

试验步骤如下：

(1)组织样品制备。将各组体重相当的健康的雄性新西兰白兔固定在实验操作台上，向每只兔眼结膜囊内滴入50μL环孢素纳米混悬液，(每天给药4次，每次间隔2小时，一共连续给药5天)，每次给药后轻轻地使其眼睑闭合1分钟，防止药物溢出流失。分别于最后一次给药后1h并向耳缘静脉注射20mL空气，通过栓塞处死，迅速摘取眼球置于表面皿中，然后迅速解剖眼球，完整地取出角膜，置于不同组织研磨器中研碎，制备角膜组织匀浆液。

(2)样品前处理。兔角膜样品的处理：分别加500μL生理盐水进行组织匀浆。然后在35±0.1℃和100rpm的条件下，在摇床上放置1h,使其药物充分的从角膜组织中溶出。然后用移液枪取上述匀浆好的角膜组织匀浆液400μL置于5ml离心管中,再向离心管中加入100μL浓度为1μg/ml的环孢素D(CsD)内标物溶液，并加入2mL的***溶液进行萃取，将此混合溶液混匀后，在离心机上离心1min(3000r/min)，将上层有机相转移至另一离心管中，在水浴温度为40℃条件下，在通风厨中用氮气将有机溶液吹干，再向离心管中加入500μL甲醇-水溶液(70％甲醇)，使其将残渣充分溶解，混匀后，再加入500μL正庚烷萃取溶液中的脂溶性杂质，混旋30s，再离心1min(3000r/min)后，取下层溶液进样,用LC-MS测定其药物浓度。

实验结果如表7和图5所示。组织分布实验结果显示，无论是具有较高黏附性的带正电荷的阳离子纳米混悬液实施例27(13641.10ng/g)和实施例25(11912.58ng/g)还是具有较强粘液穿透性的实施例21(11436.073ng/g)，在角膜中药物含量均能达到有效的药物治疗浓度(10～20μg/g)。而粘液穿透性和黏附性都不强的实施例26(8471.47ng/g)在角膜中药物含量明显比其它三组要低。说明对药物粒子表面进行修饰，使其具有粘液穿透性或黏附性都能有效增加药物在眼局部给药的生物利用度。另外，带更高正电荷实施例27在角膜中药物浓度比实施例21更高，说明了通过由静电作用增加粘液黏附性比增加粘液穿透性克服粘液屏障对药物在眼部生物利用的影响更大。

表8

综上所述，具有粘液穿透性和粘液黏附性的环孢素纳米混悬液都能提高药物在角膜生物利用度，而阳离子纳米混悬液生物利用度更高，是一种更有效的的眼部药物递送***。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种阳离子纳米混悬液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S3：最后用调节pH至6-8，得到阳离子纳米混悬液；

S3中制备的纳米混悬液是以纯药物颗粒为核心，以阳离子表面活性剂、非离子表面活性剂、高分子聚合物为稳定剂，形成的亚微米颗粒胶状分散体系；

S3中制备的纳米混悬液平均粒径小于1μm，Zeta电位为-15 ~ +90mV;

所述阳离子表面活性剂的加入量为阳离子纳米混悬液的0.0001wt% ~ 0.01 wt %；

所述非离子表面活性剂的用量为阳离子纳米混悬液的0.01 wt % ~ 4 wt %；

所述高分子聚合物的用量为阳离子纳米混悬液的0.01 wt %~4 wt %；

所述纯药物颗粒为环孢素A；

所述阳离子表面活性剂为西他氯铵（CKC）、苯扎氯氨（BKC）、苯扎溴铵(BDB)、十六烷基三甲基氯化铵（1631）、十八烷基三甲基氯化铵（1831）、壳聚糖中的一种或多种的组合；

所述非离子表面活性剂为泊洛沙姆407、泊洛沙姆188、TPGS、吐温80、PEG400中的一种或多种的组合；

所述高分子聚合物为聚乙烯醇（PVA）、聚维酮（PVP）、HPMC-羟丙甲纤维素（HPMC）、透明质酸（HA）中的一种或多种。

2.一种由权利要求1中所方法制备的阳离子纳米混悬液。