CN113518923A - 用于脂质化蛋白质结构的制备的方法 - Google Patents

用于脂质化蛋白质结构的制备的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN113518923A
CN113518923A CN202080020874.7A CN202080020874A CN113518923A CN 113518923 A CN113518923 A CN 113518923A CN 202080020874 A CN202080020874 A CN 202080020874A CN 113518923 A CN113518923 A CN 113518923A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cells
antibody
cell
linker
hydrophilic spacer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202080020874.7A
Other languages
English (en)
Inventor
S·沃尔
S·斯席勒
S·盖斯勒
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Merck Patent GmbH
Original Assignee
Merck Patent GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Merck Patent GmbH filed Critical Merck Patent GmbH
Publication of CN113518923A publication Critical patent/CN113518923A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/5432—Liposomes or microcapsules
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6891—Pre-targeting systems involving an antibody for targeting specific cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/65—Peptidic linkers, binders or spacers, e.g. peptidic enzyme-labile linkers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals

Abstract

本发明涉及使用酶促偶联制备缀合物的方法，所述缀合物包含生物分子、酶标记、亲水间隔基、接头和亲脂部分。包含酶标记（例如五甘氨酸部分）、亲水间隔基、接头和亲脂部分（例如脂质）的组分与生物分子在水性介质中酶促偶联，且接着纯化。优选存在用于由转肽基酶例如分选酶A酶促缀合的C‑末端基序（LPXTG）。计划用于将生物分子连接至例如脂质体、外来体或用于表面修饰。要连接的组分的实例：DMA‑PEG‑G5。

Description

用于脂质化蛋白质结构的制备的方法
本发明涉及用于肽和蛋白质-脂质缀合物的制备的方法，所述肽和蛋白质-脂质缀合物表现出与疏水表面和膜的强相互作用，同时可溶于纯水性分散体。通过这种方法获得的缀合物可用于疏水聚合物表面、药物递送***和细胞的表面人工改造。
本发明涉及使用酶促偶联制备缀合物的方法，所述缀合物包含生物分子、酶标记、亲水间隔基、接头和亲脂部分。与生物分子缀合的亲脂部分用于将生物分子锚定在疏水聚合物表面、基于脂质的药物递送***（DDS，例如脂质体）的表面或整个活细胞上[1]。
生物分子在药物递送***上的锚定具有实现靶向的到细胞的药物递送的目的，这意味着载体包囊的药物通过配体-靶相互作用被对准所期望的细胞类型。使用这种相互作用，可以改善药物的药物代谢动力学和药物动力学性质。这可能尤其包括向癌细胞递送有毒化合物。
生物分子在细胞上的锚定与包括过继细胞转移的疗法尤其有关。在这里，来自患者或另一个个体的细胞如干细胞或免疫细胞被先体外后体内培养和修饰，且然后返回患者。典型的治疗应用包括癌症免疫治疗、自身免疫病、再生医学和组织工程。如果所涉及的细胞表面以超生理（supraphysiological）方式进行修饰，例如在通过锚定细胞因子的免疫疗法期间[2]、在通过锚定配体从而导致增加的间充质干细胞趋化性的再生疗法期间[3,4]或在通过将抗原和酶锚定在细胞上治疗自身免疫性病期间[5, 6]，则这些治疗领域可能获益。
基因工程可用于细胞膜工程，从而提供后来的子细胞的基因可遗传性或同时实现细胞外和细胞内修饰的可能性。然而，基因工程具有几个缺点。这些包括病毒载体的使用，其可能导致免疫原性反应、过度激活（由于组成型表达[7]）或从头肿瘤发生[8, 9]。基因工程强烈依赖于转导或转染效率，其很难预测。因此，修饰的细胞的治疗功效可能显示不一致的治疗功效。同样，并非所有细胞类型修饰都是可能的，例如缓慢***的细胞[1]。最后，基因工程导致永久和不可逆的固有修饰，其可能不是每个治疗病例中都期望的[1]。
非遗传方法是细胞表面基因工程的重要备择方法，且可分为基于结构与细胞膜共价缀合或疏水***的修饰。共价缀合利用细胞表面上存在的反应性结构来附着所期望的结构[1]。这些化学方法的主要缺点是所得到的异质缀合产物，这是因为过多的可能的反应位点如羧酸、半胱氨酸、赖氨酸或碳水化合物结构与生物活性黏合剂和细胞表面的连接有关。因此，还采用了位点特异性点击化学（click chemistry）[10, 11]以将蛋白质缀合到细胞表面。这些位点特异性化学反应需要在细胞表面上（遗传）引入合适的辅助分子，或者可能需要潜在有毒的催化剂，或者可能仍导致产生几种副产物[10]。
疏水***是回避直接修饰细胞表面上现有结构的一种选择[1]。它包括作为分离的反应的生物活性黏合剂的脂质化，以及后来脂质化的结构到膜双层中的基于亲和性的自发***。由于脂质体药物递送***也建立在双层结构上，所以它们的膜也可以用脂质化的生物分子进行修饰。这个过程通常被称为“后***（post-insertion）”[12]。
通过疏水***将化合物锚定到细胞膜中被描述为无毒性的。同样，***的分子可以参与细胞膜的动态运动[1]。与共价附着相比，疏水***避免了细胞修饰程度对反应功效的依赖性。同样，像细胞膜迁移率的降低或细胞表面上存在的功能结构的改变那样的生理改变得到缓和[1]。疏水***在几份报道中被用于使用聚乙二醇[13, 14]、聚糖[15]、寡核苷酸[6]和肽或蛋白质[4, 16-19]实现细胞膜修饰。上面列举的关于蛋白质脂质化和细胞***的报道表明细胞膜工程的有希望的方法和结果。然而，几个主要缺点阻碍了正确使用，例如用于人中细胞治疗过程中的细胞膜重塑。Martin等人报道了具有甾醇样脂质锚的肽的脂质化[17]。所述步骤是在固相上进行的，且需要苛刻的反应条件，包括广泛使用羧酸保护基，这是因为所述反应是基于PyBOP（六氟磷酸苯并***-1-基-氧化三吡咯烷鏻）/HOBT（羟基苯并***）活化步骤的。同样，需要像二甲基甲酰胺那样的有机溶剂。因此，所述方法相当不适用于具有几个反应位点并且其中不可能对氨基酸侧链进行选择性保护的大蛋白质。此外，对于大蛋白质使用这种脂质化程序可以预期种类繁多的副产品。
为了改善再生方式的心肌梗死的治疗，Won等人将重组CXC趋化因子受体4（CXCR4）与具有两条疏水饱和肉豆蔻基链的聚乙二醇化（PEGylated）脂质缀合，并通过疏水***修饰间充质干细胞（MSC）的表面[4]。这改善了如此修饰的MSCs在体外测定中的迁移，因此潜在增加MSCs归巢到心肌缺血部位[1]。由于CXCR4具有八个半胱氨酸，其便于与所用的马来酰亚胺修饰的脂质反应，所以在脂质修饰后可以预期脂质化的CXCR4的各种各样的结构异构体或多种缀合的种类[4]。这些可能具有不同的生物活性或可能导致***的结构与细胞双层的不同相互作用。这可能接着导致受体结合区域的不同空间可接近性，并最终潜在地导致相应配体的降低的结合。在另一项研究中，相同的团队将二肉豆蔻基化的（di-myristylated）聚乙二醇化脂质与类似于销售的产品Kadcyla®的抗体药物缀合物缀合[20]。脂质由作为疏水锚的二肉豆蔻基基序和未描述的长度的聚乙二醇间隔基组成，其末端羧酸基团通过碳二亚胺-NHS化学活化。所述结构优先偶联至蛋白质中赖氨酸侧链的伯胺，其中88个中的最多到70个被描述为在Kadcyla®的抗体中是反应性的[10]。不可避免的异质性导致来自治疗、安全和还有监管/分析观点的多种关切。
这种异质性可以借助合适的位点选择性缀合策略来减轻。用于生物分子脂质化的分选酶介导的转肽作用是适用于上述问题的有希望的方法，这是因为所述反应具有显著的多功能性，在温和的反应条件下缀合是可行的，并且由于确定的氨基酸标记之间的缀合而具有固有的位点特异性。分选酶的酶家族属于转肽基酶，最初作为***中的持家酶被发现，在那里它们介导蛋白质锚定在肽聚糖层上[21]。衍生自金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的分选酶A变体识别靶蛋白质中的C-末端LPxTG-基序（亮氨酸-脯氨酸-任何氨基酸-苏氨酸-甘氨酸），并在酶的催化中心与苏氨酸和半胱氨酸形成硫代酰基中间体[21]。
反应式1：分选酶A介导的转肽作用的一般方案
Figure DEST_PATH_IMAGE001
朝向甘氨酸的酰胺键被裂解，且接着通过转肽作用反应用进入的例如低聚甘氨酸[21]或其他伯胺[22, 23]的亲核N-末端置换。
Antos 等人进行了将这种基于分选酶A的缀合策略贯彻到基于疏水***的细胞膜工程中的尝试[16]。Antos等人使用转肽基酶分选酶A以将范围从10一直到22个碳的三甘氨酸修饰的烷基链以及三甘氨酸修饰的胆固醇和金刚烷衍生物附着到LPETG-修饰的eGFP（增强型绿色荧光蛋白，一种模型蛋白）。他们显示了对于长度等于或长于14个碳原子的烷基链以及对于用作脂质锚的胆固醇，脂质化的eGFP与细胞的有效缔合。然而，未发现金刚烷脂质化的eGFP与细胞双层的缔合。尽管有这些有希望的结果，但Antos等人显示的研究具有几个缺点。首先，只有单个脂质链附着到蛋白质，尽管以前的报道指出需要两条脂质链用于蛋白质结构在膜中的的可靠和稳定的锚定[24, 25]。最有可能的是，Antos等人通过使用单脂质链修饰回避了溶解度问题-这是蛋白质脂质化过程中的主要挑战。长链锚的这些溶解度问题通过在eGFP用C22烷基链-最有希望的用于细胞相互作用的锚-脂质化过程中使用去污正十二烷基麦芽糖苷（maltoside）得到进一步缓和。在蛋白质脂质化过程中使用去污剂是不利的，这是因为去污剂和脂质结构两者具有相似的极性，这可能会妨碍正确的纯化，例如。通过层析。类似地，由于获得的产品的疏水性，从脂质化的产品排除去污剂可能导致稳定性问题。最后，去污剂可能是有毒的，从而妨碍了脂质化的产品在细胞上的使用，例如，在人中自体疗法期间，或去污剂可能通过变性影响脂质化的蛋白质的完整性。由于用胆固醇或C22烷基链锚脂质化的eGFP在5小时后在不同细胞系中显示出明显的内化，所以这些脂质锚是否充当合适的工具以稳定地重塑细胞膜的外侧也是有疑问的。同样，由于没有使用脂质锚和蛋白质之间的间隔基，所以固定化在细胞表面上的潜在黏合剂是否可以对其靶结构可接近可能是有疑问的[26]。Antos等人显示的方法的另一个缺点是基于亲和力的纯化方法。由于eGFP和分选酶A两者都带有His6-标记，并且在与脂质反应期间所述His6-标记从eGFP裂解，所以使用含有1 M NaCl和40 mM咪唑的Ni-NTA树脂以结合并接着去除所有His6-标记的蛋白质。所述策略忽略了还必须去除反应整体（bulk）中存在的其他化合物，特别是非缀合的脂质。因此，Antos等人提出的方法是不适合在例如体内研究或细胞疗法期间使用脂质化的产品的公开的形式。
Nagamune等人组合了三甘氨酸脂质（其包含疏水部分和三甘氨酸单位之间的聚乙二醇间隔基）向细胞中的疏水***与后来的分选酶A介导的LPETG修饰的蛋白的缀合[19,27]。所述方法可因此被认为是用于细胞膜工程的疏水***和共价缀合策略的组合。作者报道了eGFP可以成功地缀合到癌细胞系的三甘氨酸修饰的膜。此外，免疫球蛋白的Fc片段的缀合导致通过与树突细胞共温育的增加的癌细胞吞噬。虽然疏水***和共价缀合的组合策略是温和的方法，但几个重要的缺点妨碍了它的正确使用，例如在体内治疗期间。首先，已知分选酶A将LPETG-修饰的蛋白质非选择性地与存在于细胞膜表面[28]或在细胞周围基质/流体中的N-末端甘氨酸缀合。因此，分选酶A的主要优点-高度确定的反应产物的产生-丧失了，这是因为可以假定模型蛋白eGFP或Fc片段与细胞表面蛋白的多种缀合物。此外，没有显示细胞洗涤后分选酶A的残余物的确定。因为分选酶A是可以吸附到像细胞膜那样的大表面的蛋白质，所以从细胞整体的彻底排除可能是非常具有挑战性的任务。细胞暴露于分选酶A可能导致非特异性吸附[29]，且因此甚至在纯化后细胞表面上相当多的残余物。这些可能会导致逆反应，从而意味着缀合的结构从细胞的裂解，或者更显著地，在施用细胞后严重的免疫反应。
药物递送***也用类似于用于细胞膜工程的疏水***方法的方法进行修改。所述所谓的后***方法描述了从纯微团或从由脂质化的配体和聚乙二醇化脂质组成的混合微团***脂质化的配体[12, 30-32]。一般用作药物递送***上的靶向配体[33]的蛋白质结构的衍生化主要通过非特异性化学反应发生[31]。直到现在，没有公开用于使用后***的免疫脂质体制剂的位点选择性策略，尽管已经揭示了用于将配体“原位”缀合（或“后衍生化（post-derivatization））到脂质体表面上的几种位点选择性缀合策略[31]。尽管这些技术提供了比起以前使用的非选择性缀合方法来明显的改进，但它们仍然具有像需要各种催化剂、所用接头和/或反应产物的未知毒性或显著量的副产物那样的缺点[10]。酶促技术可能改善所述问题，并且几份报道描述了模型蛋白[34-36]或靶向配体[29, 37, 38]到脂质体表面上的成功缀合。然而，与酶的原地缀合具有挑战性，这是因为酶可能难以从反应整体去除，从而由于药物递送***的免疫原性和还有稳定性（由于逆反应）潜在影响安全性[29]。
本领域已知的用于蛋白质结构的脂质化以及后来的药物递送***或细胞膜的衍生化的上述方法具有几个缺点和/或导致具有关于同质性或纯度的不充分性质的化学或细胞产品。本发明的目的是提供用于生产合适的蛋白质-脂质缀合物的方法，其克服了这种缺点，从而意味着它应该产生不含来源于反应过程的残余物的位点选择性脂质化的产物，在不需要添加剂如去污剂的情况下可溶的产物，且当存在于复杂表面如细胞膜上时，它应提供未改变的生物功能和活性。
因此，本发明的一个目的涉及用于制备缀合物的方法，其中所述缀合物包含生物分子、酶标记、亲水间隔基、接头和亲脂部分，这种方法包括在水性介质中酶促偶联包含酶标记、亲水间隔基、接头和亲脂部分的组分与生物分子和缀合物的纯化。有利地，可以在不使用任何去污剂的情况下运行这种方法。
本发明的进一步的目的是将这些分子***疏水环境中，例如疏水聚合物表面、基于脂质的药物递送***或活细胞的膜。
如本文所用的，术语“包含酶标记、亲水间隔基、接头和亲脂部分的组分”也称为“组分A”。
根据优选的实施方案，构成要与生物分子偶联的组分A的酶标记、亲水间隔基、接头和亲脂部分以如它们所被提及的顺序互连（即酶标记-亲水间隔基-接头-亲脂部分）。
如本文所用的，“一个（a）”或“一种（an）”应意指一个或多个。如本文所用的，当和单词“包括”一起使用时，单词“一个”或“一种”意指一个或不止一个。如本文所用的，“另一个”意指至少第二个或更多。此外，除非上下文另有要求，否则单数术语包括复数并且复数术语包括单数。
如本文所用的，术语“生物分子”指通常具有大于约300的分子量的天然或合成分子，且优选为多糖或寡糖、寡肽或多肽、蛋白质、肽、多核苷酸或寡核苷酸以及其糖基化脂质衍生物。最一般地，生物分子是免疫治疗剂、抗体或其片段、包括融合蛋白的任何这些抗体或片段的功能衍生物。
如本文所用的，术语“酶标记”指可被酶识别并且将连接至这种标记的分子鉴定为由这种酶催化的反应的底物的部分。当与酶反应时，酶标记可以部分或全部去除。在本发明中，酶标记位于包含这种酶标记、亲水间隔基、接头和亲脂部分的组分的末端，并且与亲水间隔基直接连接。酶促标记允许这种组分通过酶促反应与生物分子偶联。组分与生物分子偶联后，酶标记的部分的全部或部分保留在由这种偶联产生的缀合物中。
如本文所用的，术语“亲水间隔基”指存在于缀合物或组分A的具体元件之间的部分，其是亲水的，且从而为这种缀合物或组分A提供一些亲水性。在本发明中，亲水间隔基存在于酶标记和接头之间。本发明中使用的亲水间隔基不受任何限制，只要其增加组分或缀合物的水溶性。
如本文所用的，术语“接头”指包含通过化学键将第一分子共价附着至第二分子的共价键或原子链的化学部分。在本发明中，使用接头将亲水间隔基与亲脂部分连接。
如本文所用的，术语“亲脂部分”指可溶于脂肪、油、脂质和亲脂非极性溶剂例如己烷或甲苯中或与它们可混溶的任何疏水基团。
如本文所用的，术语“纯化”指减少外来元件的量的方法步骤，所述外来元件例如不是缀合物并且在进行酶促反应后可能存在于介质中的副反应产物（例如在缀合期间不可避免地出现的酶底物的片段、酶本身或反应所需的辅因子或未反应的底物）。纯化可以包括本领域已知的不同方法，例如层析方法，并且可以包括一个或多个步骤，例如层析步骤。
缀合物中存在的生物分子是多肽。因此，本发明涉及一种方法，其中生物分子是多肽。
如本文所用的术语“多肽”指一个与另一个一般通过相邻氨基酸的α-氨基和羧基之间通过酰胺键的肽键连接的氨基酸（一般为L-氨基酸）的多聚体，其中氨基酸残基的数目可以从约5个一直到至约一百万个。优选地，多肽具有约10至约2000个氨基酸残基，且甚至更优选约20至约500个氨基酸残基。因此，如本文所用的，多肽包括本领域经常称为寡肽（5-10个氨基酸残基）、多肽（11 -100个氨基酸残基）和蛋白质（大于100个氨基酸残基）的那些。
可以作为生物分子存在的适当多肽包括抗原，细胞黏着蛋白包括整联蛋白和钙黏着蛋白，肽激素，尤其是生长因子，细胞因子，尤其是白细胞介素，与任何这些分子相关的受体，酶和天然或人工抗体及其片段。因此，本发明进一步涉及方法，其中与“组分A”缀合的生物分子是抗原、细胞黏着蛋白如整联蛋白或钙黏着蛋白，肽激素，如生长因子，细胞因子如白细胞介素，与任何这些分子相关的受体，酶或天然或人工抗体或其片段。
如本文所用的，术语“抗原”指可结合抗体的实体或其片段。抗原可以在生物体，特别是动物，更特别是哺乳动物包括人中诱导免疫应答。术语“抗原”包括称为抗原决定簇或表位的区域，其指抗原的一部分（其被接触或在支持负责抗原性或抗原决定簇的抗原中的接触残基中起重要作用）。
如本文所用的，术语“细胞黏着蛋白”指在结构内具有细胞外区域作为细胞识别位点并且与细胞至细胞的相互作用的介导有关的细胞黏着蛋白大家族。术语“细胞黏着蛋白”包括来自天然来源或来自重组细胞培养物的蛋白质和黏着蛋白天然序列的生物活性等价物，包括合成产生的小分子实体及其药学上可接受的衍生物和盐。
如本文所用的，术语“整联蛋白”指细胞黏着蛋白，其允许细胞结合细胞外基质并响应细胞外基质且与多种细胞功能有关，例如伤口愈合、细胞分化、肿瘤细胞归巢和凋亡。功能性整联蛋白由称为α和β的两个跨膜糖蛋白亚基组成，它们是非共价结合的。与β亚基一样，α亚基都彼此共有一些同源性。受体总是含有一条α链和一条β链。例子包括α6β1、α3β1、α7β1、LFA-1等。如本文所用，术语“整联蛋白”。
如本文所用的，术语“钙黏着蛋白”指作为蛋白质的钙黏着蛋白超家族成员的细胞黏着蛋白。钙黏着蛋白超家族包括例如经典钙黏着蛋白亚家族，其具体实例包括E-钙黏着蛋白、N-钙黏着蛋白和P-钙黏着蛋白，以及桥粒蛋白亚家族，其具体实例包括桥粒芯蛋白1、2和3，和桥粒胶蛋白3。钙黏着蛋白的天然来源可在脊椎动物中发现，包括人、农场动物、运动动物、灵长类动物、啮齿类动物和宠物，例如鸡、猪、羊、马、牛、兔、小鼠和大鼠。
如本文所用的，术语“肽激素”指具有内分泌功能的蛋白质，例如胰岛素、胰岛素原、甲状旁腺激素、松弛素、松弛素原（prorelaxin）、胰岛素、胰高血糖素、降钙素；糖蛋白激素，如促卵泡激素（FSH）、促甲状腺激素（TSH）和促黄体素（LH）。
如本文所用的，术语生长因子指能够刺激细胞生长的蛋白质或多肽。它们包括但不限于表皮生长因子（EGF），人生长激素（HGF），神经生长因子如NGFβ，N-甲硫氨酰人生长激素，牛生长激素，肝生长因子，血小板生长因子；转化生长因子（TGFs），如TGFα和 TGFβ；成纤维细胞生长因子肝配蛋白（Eph），***（EPO），神经胶质细胞刺激因子（GSF）；集落刺激因子（CSF）包括巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）和粒细胞集落刺激因子（G-CSF）；干细胞生长因子（SCGF）（也称为青灰因子）；基质细胞衍生因子（SDF），其有效片段及其组合；和血管内皮生长因子（VEGF）。其他生长因子可包括肝细胞生长因子（HGF）、血管生成素（Angiopoietin）-1、血管生成素-2、b-FGF和FLT-3配体，及其有效片段。
如本文所用的，术语“细胞因子”指由一个细胞群体释放的作为细胞间介质作用于另一细胞的蛋白质。这种细胞因子的例子是淋巴因子和单核因子。包括在细胞因子中的是白细胞介素；催乳素；胎盘催乳素；小鼠***相关肽；抑制素；激活素；血小板生成素（TPO）；干扰素，如IFNα、IFNβ和IFNγ；和TNFα或TNFβ。
如本文所用的，术语“白细胞介素”指由免疫细胞分泌的调节一系列免疫***功能的多种细胞因子中的任一种。本领域技术人员将理解一种或多种白细胞介素的存在或水平，包括，但不限于，IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24。
术语“抗体”或“免疫球蛋白”在本文中以最广泛的含义使用，且具体包括完整的单克隆抗体、多克隆抗体、由至少两种完整抗体形成的多特异性抗体（例如双特异性抗体）和抗体片段，只要它们表现出所期望的生物活性。所述术语通常包括由连接在一起的两种或更多种具有不同结合特异性的抗体或其片段组成的异种抗体。
取决于其恒定区的氨基酸序列，完整的抗体可以被分配入不同的“抗体（免疫球蛋白）类别”。存在五个主要类别的完整抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，且这些中的几种可以进一步分为“亚类”（同种型），例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。对应于不同类别抗体的重链恒定结构域分别被称为α、δ、ε、γ和μ。用作生物分子的抗体的优选主要类别是IgG，更详细地是IgG1和IgG2。
抗体通常是具有约150,000的分子量的糖蛋白，由两条相同的轻（L）链和两条相同的重（H）链组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链连接，而不同免疫球蛋白同种型的重链中二硫键的数目不同。每条重链和轻链还具有规则间隔的链内二硫键。每条重链在一端都有可变结构域（VH）继之以许多恒定结构域。每条轻链具有在一端的可变结构域（VL）和在另一端的恒定结构域。轻链的恒定结构域与重链的第一个恒定结构域对准，且轻链可变结构域与重链的可变结构域对准。特定氨基酸残基被认为在轻链和重链可变结构域之间形成界面。基于其恒定结构域的氨基酸序列，来自任何脊椎动物物种的抗体的“轻链”可以被分配为称为kappa（κ）和 lambda（λ）的两种明显不同的类型之一。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选包含其抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv和Fc片段、双抗体、线性抗体、单链抗体分子；和由一个或多个抗体片段形成的多特异性抗体。“完整”抗体是包含抗原结合可变区以及轻链恒定结构域（CL）和重链恒定结构域CH1、CH2和CH3的抗体。优选地，完整抗体具有一种或多种效应子功能。
如本文所用，术语“人工”指由人设计或制备且不是天然存在的组合物和***。例如，人工多肽（例如，抗体或抗体片段）是包含非天然序列的多肽（例如，与天然存在的蛋白质或其片段没有100%同一性的多肽）。
如本文所用的，与上述“人工”的定义一致，术语“人工抗体”指具有与天然抗体中发现的那些不同的氨基酸序列或化学组成的抗体。人工抗体不是野生型（即，最丰富的）或其突变形式的天然存在的蛋白质的子序列（subsequence）。如本文所用的，“人工抗体”可以通过任何合适的方法（例如，重组表达、化学合成、酶促合成、从整个动物纯化等）产生或合成。
根据本发明的优选实施方案，用作生物分子的抗体是单克隆抗体或其片段，例如单链可变片段（scFv），可变片段（Fv），或抗原结合片段（Fab、Fab’或F(ab’)2）、骆驼科动物（camelid）或软骨鱼来源的仅重链抗体或其片段，例如VHH或vNAR，或其中人工多肽是DARPin、adnectine、anticalin或affibody。
如本文所用的术语“单克隆抗体”指从基本上同质的抗体群体获得的抗体，即，除了可能以少量存在的天然发生的突变之外，构成群体的个体抗体是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，针对单个抗原位点。此外，与包括针对不同决定簇（表位）的不同抗体的多克隆抗体制剂形成对照的是，每种单克隆抗体都针对抗原的单一决定簇。除了它们的特异性之外，单克隆抗体是有利的，这是因为它们可以在不受其他抗体污染的情况下合成。制备单克隆抗体的方法包括Kohler和Milstein（1975, Nature 256, 495）和在“MonoclonalAntibody Technology, The Production and Characterization of Rodent and HumanHybridomas” (1985, Burdon等人，编，Laboratory Techniques in Biochemistry andMolecular Biology，第13卷，Elsevier Science Publishers, Amsterdam）中描述的杂交瘤方法，或者可以通过众所周知的重组DNA方法来制备（参见，例如，US 4,816,567）。还可以使用例如Clackson等人，Nature、352:624-628 (1991)和Marks等人，J. Mol. Biol., 222:58, 1-597（1991）中描述的技术从噬菌体抗体文库分离单克隆抗体。
抗体的木瓜蛋白酶消化产生称为“Fab”片段的两个相同的抗原结合片段，每个片段包含单个抗原结合部位和CL和CH1区，以及残余的“Fc”片段，其名称反映了其易于结晶的能力。
抗体的“Fc”区通常包含IgG1或IgG2抗体主要类别的CH2、CH3和铰链区。铰链区是一组约15个氨基酸残基，其将 CH1区与CH2-CH3区结合。
胃蛋白酶处理产生“F(ab’)2”片段，所述片段具有两个抗原结合部位，并且仍然能够交联抗原。用合适的还原剂如三(2-羧乙基)膦（TCEP）、β-巯基-乙胺或二硫苏糖醇进一步处理提供Fab’片段。“Fv”是含有完整抗原识别和抗原结合部位的最小限度抗体片段。所述区域由紧密非共价缔合的一条重链和一条轻链可变结构域的二聚体组成。正是在所述构型中，每个可变结构域的三个高变区（CDRs）相互作用以在VH-VL二聚体表面限定抗原结合部位。总起来说，六个高变区赋予抗体抗原结合特异性。然而，甚至单个可变结构域（或仅包含三个特异于抗原的高变区的Fv的一半）也具有识别和结合抗原的能力，尽管以比整个结合部位低的亲和力。Fab片段还含有轻链的恒定结构域和重链的第一个恒定结构域（CH1）。“Fab’”片段与Fab片段的不同之处在于在重链CH1结构域的羧基末端添加了几个残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。F(ab’)2抗体片段最初是作为Fab’片段对产生的，它们之间有铰链半胱氨酸。
“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH 和VL 结构域，其中这些结构域存在于单个多肽链中。优选地，scFv多肽在VH和VL结构域之间进一步包含多肽接头，其使得scFv能够形成用于抗原结合的所期望的结构。单链Fv抗体是已知的，例如从Plückthun（ThePharmacology of Monoclonal Antibodies, 第113卷, Rosenburg和Moore编, Springer-Verlag, New York, 第269-315页（1994）），WO93/16185；US 5,571,894；US 5,587,458；Huston等人(1988, Proc.Natl. Acad. Sci. 85, 5879)或Skerra和Plueckthun（1988,Science 240, 1038）。
如本文所用的术语“仅重链抗体”或“HCAb”指功能性抗体，其包含重链，但缺乏通常在抗体中发现的轻链。已知骆驼科动物（例如骆驼、美洲驼或羊驼）或软骨鱼（例如鲨鱼、桠鱼或鳐鱼）产生HCAbs。骆驼科动物和软骨鱼抗体包含重链，但缺乏条轻链。骆驼科动物或软骨鱼来源的HCAbs分别称为“骆驼科动物来源的仅重链抗体”和“软骨鱼来源的仅重链抗体”。
如本文所用的术语“VHH”指骆驼科动物抗体重链的可变区。因此，来自这种骆驼科动物抗体的VHH区代表了这些物种中特异性地结合感兴趣的抗原所需的最小限度结构元件。已经发现骆驼科动物VHH结构域以高亲和力结合抗原（Desmyter等人(2001), J. Biol.Chem. 276:26285-90）并在溶液中具有高稳定性（Ewert等人(2002), Biochemistry 41:3628-36）。
如本文所用的术语“vNAR”指单可变新抗原受体（NAR）结构域抗体片段。vNAR片段是衍生自重链抗体的单结构域抗体片段，例如鲨鱼免疫球蛋白新抗原受体抗体（IgNARs）。
术语“设计的锚蛋白重复序列蛋白”或“DARPin”指通过基因工程制备的对靶蛋白具有高特异性和高结合亲和力的人工多肽。DARPin起源于天然锚蛋白蛋白质，且具有其中至少2个或至少3个锚蛋白重复序列基序，例如3、4或5个锚蛋白重复序列基序重复的结构。例如，包含3、4或5个锚蛋白重复序列基序的DARPins可分别具有约10 kDa、约14 kDa和约18kDa的分子量。DARPin包括执行结构功能的核心部分和核心之外的与靶结合的靶结合部分。核心部分包括保守的氨基酸序列，且靶结合部分包括取决于靶的不同氨基酸序列。
如本文所用的术语“adnectine”指monobody，其是人工抗体，其使用纤连蛋白III型结构域（FN3）构建。
如本文所用的术语“anticalin”涉及衍生自特异性结合GPD1并抑制GPD1活性的脂笼蛋白的人工抗体。anticalin具有由通过环成对连接的八个反平行β-链和附着的α-螺旋形成并且与天然存在的脂笼蛋白共享的桶状结构。
如本文所用的术语“affibody”指由一条多肽链组成的重组蛋白质，其包含负责与抗原例如像HER2那样的具体肿瘤标志的选择性相互作用的结构域（例如C. Steffen, M.Wikman, V. Tolmachev, G.P. Adams, F.Y. Nilsson, S. Ståhl, J. Carlsson: Invitro characterization of a bivalent anti-HER-2 affibody with potential forradionuclide-based diagnostics, CancerBiother. Radiopharm., 20 (2005), 第239-248页），其可以与另一种多肽结合，从而确保与抗原结合的更好性质、更高的稳定性和额外的功能，例如与另一种物质或固体表面可控结合的可能性。其质量通常落入几千道尔顿至超过一万二千道尔顿的范围内。
根据优选的实施方案，本发明方法中使用的组分中存在的生物分子是衍生自骆驼科动物仅重链抗体的可变结构域（VHH）的单结构域抗体。
生物分子与组分A的酶促偶联可以通过使用转肽基酶例如分选酶来完成。本发明方法中使用的优选转肽基酶是分选酶A。
为了使生物分子能够与组分A偶联，生物分子携带C-末端基序作为转肽基酶的识别信号。因此，在本发明方法的适当实施方案中，生物分子在其与包含酶标记、亲水间隔基、接头和亲脂组分部分的组分（组分A）偶联之前携带C-末端基序用于通过转肽基酶，优选分选酶A进行酶促缀合。
根据合适的实施方案，生物分子携带由“亮氨酸-脯氨酸-X-苏氨酸-甘氨酸”（LPXTG）组成的氨基酸序列作为C-末端基序。在这种C-末端基序中，“X”可以是除半胱氨酸和色氨酸之外的任何蛋白原性（proteinogenic）氨基酸。因此，本发明还涉及一种方法，其中生物分子在其与组分偶联之前包含C-末端基序，所述C-末端基序由氨基酸序列“亮氨酸-脯氨酸-X-苏氨酸-甘氨酸”（LPXTG）组成，其中“X”可以是任何蛋白原性氨基酸。
如本文所用的术语“蛋白原性氨基酸”指除半胱氨酸和色氨酸之外的由真核生物的遗传密码直接编码用于蛋白质合成的21种氨基酸之一。因此，存在于C-末端基序中的蛋白原性氨基酸X是以下氨基酸之一：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸和组氨酸，由此谷氨酸是优选的。因此，本发明进一步涉及一种方法，其中LPXTG基序中存在的蛋白原性氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸或组氨酸，优选谷氨酸。
酶标记包含N-末端氨基官能。根据适当的实施方案，这种N-末端氨基官能由脂族胺、单甘氨酸或包含一个或多个N-末端甘氨酸，优选五甘氨酸的多肽序列提供，其C-末端连接至亲水间隔基。因此，本发明还涉及一种方法，其中酶标记是脂族胺、单甘氨酸或包含一个或多个N-末端甘氨酸，优选五甘氨酸的多肽序列，其C-末端连接至亲水间隔基。
与氨基酸或多肽链一起的“N-末端”指氨基酸上的游离胺基团，或多肽链第一个氨基酸残基上的游离胺基团。同样，与氨基酸或多肽链一起的“C-末端”指氨基酸上的游离羧基，或多肽链最后的氨基酸残基上的游离羧基。
如上文所解释的，亲水间隔基增加了组分或缀合物的水溶性。可存在于本发明方法中使用的组分A中的合适亲水间隔基包括亲水聚合原子团（对水溶液具有增加的亲和力），即在其亚烷基主链中含有包含一个或多个亲水（或极性）基团的重复结构单位的聚合物。可用的亲水聚合物原子团的实例包括聚氧(C2-C3)亚烷基（例如聚乙二醇（PEG）或聚丙二醇（PPG））、多糖（例如葡聚糖、支链淀粉、壳聚糖、透明质酸）和聚乙烯亚胺，由此优选聚乙二醇。因此，本发明的合适的实施方案进一步涉及一种方法，其中与生物分子用于这种方法中的包含酶标记、亲水间隔基、接头和亲脂部分的组分是聚氧(C2-C3)亚烷基（例如聚乙二醇或聚丙二醇）、多糖（例如葡聚糖、支链淀粉、壳聚糖、透明质酸）、多聚唾液酸、聚乙烯亚胺，优选聚乙二醇。
优选的亲水间隔基是“PEG”或“聚乙二醇”，其包括任何水溶性聚(环氧乙烷)。一般，“PEG”意指含有大部分例如>50%的作为-CH2CH2O-的亚单位的聚合物。不同形式的PEG在分子量、结构或几何形状中可能不同（例如，支化、线性、叉状PEGs、多功能的等）。可能存在于本发明方法中使用的组分A中的PEGs可以是“-OCH2CH2O(CH2CH2O)m-”，但也包括其中一个末端“-O-”基团被“-NH-”基团取代的形式，从而导致式“-NHCH2CH2O(CH2CH2O)m-。其中m为10至300，优选15至100，更优选20至70，甚至更优选25至50，尤其优选30至40，且最优选35。
接头通过共价键如C-C、C-O、C-N和C-S将亲水间隔基与亲脂部分连接。可用于与亲水间隔基和亲脂部分偶联的接头以及接头与亲水间隔基和亲脂部分的偶联是本领域已知的并且描述于，例如，EP 2825156 B1中。原则上，双功能试剂（即，具有两个官能（末端）基团的试剂），优选异双功能试剂（即，具有两个不同官能（末端）基团的试剂）发生反应，且从而与包含亲水间隔基和亲脂部分的组分偶联。典型的官能团包括，但不限于，基团如琥珀酰亚胺基酯、马来酰亚胺和吡啶基二硫化物（pyridyldisulfides）。在一些实施方案中，双功能试剂选自，但不限于，例如，碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺基-4-叠氮基水杨酸（NHS-ASA）、庚二亚氨酸二甲酯二盐酸盐（DMP）、辛二亚氨酸二甲酯（DMS）、3,3'-二硫代双丙亚氨酸（DTBP）、N-琥珀酰亚胺基3-[2-吡啶基二硫代]-丙酰胺基（SPDP）、α-甲基丁酸琥珀酰亚胺基酯、生物素酰胺己酰基-6-氨基-己酸N-羟基-琥珀酰亚胺酯（SMCC）、琥珀酰亚胺基-[(N-马来酰亚胺丙酰胺基)-十二甘醇]酯（NH SPEO12）、 (4-碘乙酰基)氨基苯甲酸N-琥珀酰亚胺基酯（SIAB）、S-乙酰基硫代乙酸N-琥珀酰亚胺基酯（SATA）、间马来酰亚胺苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯（MBS）和N-h-马来酰亚胺丁酰氧基-琥珀酰亚胺酯（GMBS）、琥珀酰亚胺基二羰基戊烷或辛二酸二琥珀酰亚胺基酯。
在本发明的方法中使用的包含酶标记、亲水间隔基、接头和亲脂部分的组分可以用任何这种接头制备。根据优选的实施方案，用于制备这种组分的接头是异谷氨酰胺，在与3-氨基-1,2-丙二醇连接的δ-位置酰胺上，且在与亲水间隔基连接的α-位置胺官能上。在包含酶标记、亲水间隔基、接头和亲脂部分的组分中，接头部分具有下式（I）：
Figure 408779DEST_PATH_IMAGE002
在这种式中，垂直虚线
Figure DEST_PATH_IMAGE003
表示与亲脂部分的原子键合，且垂直虚线
Figure 450554DEST_PATH_IMAGE004
表示与亲水间隔基的键合。
根据本发明的合适的实施方案，所述方法中使用的组分A含有一个或多个彼此独立的饱和或不饱和、直链或支链烃链作为亲脂部分，例如链长为6-30个碳原子的脂肪醇或脂肪酸，或甾醇如胆固醇。因此，本发明还涉及一种方法，其中组分A中存在的亲脂部分是一个或多个彼此独立的饱和或不饱和、直链或支链烃链，例如链长为6-30个碳原子的脂肪醇或脂肪酸，或甾醇如胆固醇。优选地，亲脂部分是饱和的直链烃链。
如本文所用的术语“脂肪醇”指包含6至30个碳原子并包含至少一个羟基OH的长链脂族醇。优选地，脂肪醇具有结构 R-OH，其中R表示线性烷基，任选地被一个或多个羟基取代，包括6至30个，更好10至30个，或甚至10至22个，且甚至更好14至18个碳原子。可以使用的脂肪醇可以单独作为混合物选自月桂醇（1-十二烷醇）、肉豆蔻醇（1-十四烷醇）、鲸蜡醇（1-十六烷醇）、硬脂醇（1-十八烷醇）、花生醇（arachidyl alcohol）（1-二十烷醇）、山萮醇（1-二十二烷醇）、木蜡醇（1-二十四烷醇）、蜡醇（1-十二六烷醇）、褐煤醇（1-二十八烷醇）和蜂花醇（1-三十烷醇）。在化合物A中，脂肪醇和接头优选通过醚键R1-O-R2彼此连接，其中R1是接头并且R2是脂肪醇的烷基。
如本文所用的术语“脂肪酸”指包含至少6个碳原子并且包含一个或两个、优选一个羧酸基团的长链脂族酸。优选地，脂肪酸具有结构R-COOH，其中R表示包含6至30个、更好10至30个、或甚至10至22个且甚至更好14至18个碳原子的线性烷基。合适的脂肪酸包括，例如，正癸酸（C10，癸酸）、正十二烷酸（C12，月桂酸）、正十四烷酸（C14，肉豆蔻酸）、正十八烷酸（C18，硬脂酸）、正二十烷酸（C20，花生酸）、正二十二烷酸（C22，山萮酸）、顺式-6 9-十八烷酸（C18，油酸）、全顺式-6 5,8,11,14-二十碳四烯酸（C20，花生四烯酸）等。在化合物A中，脂肪酸优选与具有羟基的接头连接，由此脂肪酸的羧基优选通过酯键与接头的羟基连接。
如本文所用的术语“甾醇”指含有至少一个羟基的类固醇。类固醇的特征在于存在稠合的四环甾烷环***。甾醇包括，但不限于，胆固醇（即，2,15-二甲基-14-(1,5-二甲基己基)四环[8.7.0.02,7.011,15]二十七碳-7-烯-5-醇）。在化合物A中，甾醇和接头优选通过醚键R1-O-R2’彼此连接，由此R1是接头并且R2’是甾醇的环状***。
根据本发明的尤其优选的实施方案，方法中使用的组分A包含两种各自与接头的3-氨基-1,2-丙二醇的二醇基团醚连接的肉豆蔻醇。因此，本发明还涉及一种方法，其中亲脂组分部分包含两种各自与3-氨基-1,2-丙二醇的二醇基团醚连接的肉豆蔻醇。
根据本发明的适当实施方案，方法包括以下步骤（a）制备包含酶标记、亲水间隔基、接头和亲脂部分的组分的水性分散体；（b）添加酶和生物分子；（c）温育在步骤（b）中获得的混合物以产生缀合物；（d）纯化步骤（c）中获得的缀合物。因此，本发明还涉及一种方法，其包括以下步骤
（a）制备包含酶标记、亲水间隔基、接头和亲脂部分的组分的水性分散体；
（b）添加酶和生物分子；
（c）温育在步骤（b）中获得的混合物以产生缀合物；
（d）纯化步骤（c）中获得的缀合物。
根据本发明的适当实施方案，方法使用连接酶作为酶。如本文所用的术语“连接酶”指可以通过形成新的化学键来催化两个大分子连接的酶，通常伴随着较大分子之一上的小化学侧基的水解，或催化两种化合物连接在一起的酶，例如，催化C-O、C-S、C-N等连接的酶。通常，连接酶催化以下反应：Ab + C → A-C + b。在本发明中，连接酶用于催化亲水间隔基与生物分子。
可用于本发明的连接酶包括分选酶、蝶豆粘酶（butelase）、trypsiligase、subtiligase、peptiligase和omniligase，由此优选分选酶A。因此，本发明进一步涉及一种方法，其中步骤（b）中的酶是连接酶，包括分选酶、蝶豆粘酶、trypsiligase、subtiligase、peptiligase和omniligase，优选分选酶A。
例如，M Schmidt等人: Enzyme-mediated ligation technologies forpeptides and proteins, Current Opinion in Chemical Biology (2017) 38, 第1-7页）描述了本发明中使用的酶。更具体地，分选酶例如由TT Hung等人: Purification andcharacterization of sortase, the transpeptidase that cleaves surface proteinsof Staphylococcus aureus at the LPXTG motif, PNAS, 1999, 96 (22) 12424-12429描述；蝶豆粘酶由GKT Nguyen等人: Butelase1 is an Asx-specific ligase enablingpeptide macrocyclization and synthesis. Nat Chem Biol 2014, 10:732-738描述；Trypsiligase由S Liebscher等人: N‐Terminal Protein Modification by Substrate‐Activated Reverse Proteolysis, Angewandte Chemie International Edition, 53-11, 1433-7851描述；Subtiligase由AC Braisted等人: Synthesis of proteins bysubtiligase. Methods Enzymol 1997, 289:298-313描述；Omniligase和Peptiligase由TNuijens T等人: Engineering of a diverse ligase toolbox for peptide segmentcondensation. Adv Synth Catal 2016, 358:4041-4048且由T Nuijens等人:Omniligase and selective Peptiligases, efficient biocatalysts for assemblinglinear and cyclic peptides and protein conjugates, Chem. Today 2016, 34:16-19描述。
根据本发明的优选实施方案，方法中使用的组分A具有式II
Figure DEST_PATH_IMAGE005
其中
m是15至60，优选25至45，更优选30至40，且最优选36的任何整数；
n是3至27，优选7至19，更优选11至15，且最优选11的任何整数；
p是0至9，优选2至7，更优选3至5，且最优选4的任何整数。
因此，本发明还涉及一种方法，其中包含酶标记、亲水间隔基、接头和亲脂部分的组分具有式II，
其中
m表示15至60；
n表示2至27；
p表示0至9。
在尤其优选的实施方案中，本发明的方法使用根据式I的化合物作为化合物A，其中n为11，m为36且p为4。
通过本发明的方法获得的缀合物非常适合用于修饰基于脂质的药物递送***，例如固体-脂质纳米颗粒、纳米乳剂（nanoemulsions）、微团或脂质体，优选脂质体。因此，本发明还涉及通过所述方法获得的缀合物用于修饰基于脂质的药物递送***例如固体-脂质纳米颗粒、纳米乳剂、微团或脂质体，优选脂质体的用途。
如本文所用的术语“纳米颗粒”指平均尺寸小于1 μm的颗粒。纳米颗粒优选具有规则形状，例如球状，但也可以具有不规则形状。
术语“纳米乳剂”指胶态分散体，一般是水包油的两相***。胶态分散体包含具有10至500 nm，优选20至200 nm的平均尺寸的液滴。如本文所用的，术语“平均尺寸（averagesize）”或“平均尺寸（mean size）”涉及液滴的平均直径。
这些***的平均尺寸可以通过本领域技术人员已知的标准方法例如动态光散射来测量。
如本文所用的术语“微团”指被装配以致于形成具有疏水内部和亲水外部的颗粒的两亲分子例如脂质的聚集体。微团通常是直径低于100 nm的球形组件，尽管本领域已知一系列微团直径和各不相同的微团形状，例如盘状微团。
如本文所用的术语“脂质体”指由一种或多种脂质、磷脂和/或表面活性剂组成的小泡，其可用于向哺乳动物递送药物（例如化疗剂）。脂质体的组分呈双层构造，类似于生物膜的脂质排列。
通过本发明的方法获得的缀合物进一步非常适合用于修饰活细胞，优选T细胞的膜。因此，本发明进一步涉及通过所述方法获得的缀合物用于修饰活细胞，优选T细胞的膜的用途。
如本文所用的术语“T细胞”指在胸腺中成熟的一类淋巴细胞。T细胞在细胞介导的免疫中发挥重要作用，并且与其他淋巴细胞（如 B 细胞）的区别在于细胞表面存在T细胞受体。T细胞可以是分离的（从动物起源的脾或人献血（blood donation））或从商业可获得的来源获得。“T细胞”包括表达CD3的所有类型的免疫细胞，包括T-辅助细胞（CD4+细胞）、细胞毒性T细胞（CD8+细胞）、天然杀伤T细胞、T-调节细胞（Treg）和γ-δ T细胞。“细胞毒性细胞”包括CD8+ T细胞、天然杀伤（NK）细胞和嗜中性粒细胞，这些细胞能够介导细胞毒性反应。
通过本发明的方法获得的缀合物进一步非常适合用于修饰对疏水物质如疏水聚苯乙烯具有亲和力的表面。因此，本发明此外涉及通过所述方法获得的缀合物用于修饰对疏水物质如疏水聚苯乙烯具有亲和力的表面的用途。
如本文所用的术语“疏水”指物质与水具有的亲和力程度。疏水物质基本上缺乏对水的亲和力，从而倾向于排斥而不是吸收水并且倾向于不溶于水或与水混合或被水润湿。
同样，通过本发明的方法获得的缀合物此外非常适合用于修饰外来体的膜，因此本发明还涉及通过所述方法获得的缀合物用于修饰外来体的膜的的用途。
如本文所用的术语“外来体”指包含包围内部空间的膜的细胞衍生的小的（直径为20-300 nm，更优选直径为40-200 nm）小泡，并且其由所述细胞通过直接质膜出芽或通过晚期内体与质膜融合产生。外来体包含脂质或脂肪酸和多肽并且任选地包含有效负载（例如，治疗剂）、接受者（例如，靶向部分）、多核苷酸（例如，核酸、RNA或DNA）、糖（例如，简单糖、多糖或聚糖）或其他分子。外来体可衍生自生产细胞，并基于其大小、密度、生化参数或其组合从生产细胞分离。外来体是一种细胞外小泡。
Figure 292608DEST_PATH_IMAGE006
Figure DEST_PATH_IMAGE007
Figure 809521DEST_PATH_IMAGE008
Figure DEST_PATH_IMAGE009
Figure 686210DEST_PATH_IMAGE010
实施例在不限于此的情况下举例说明本发明。
方法
对于蛋白质的表达，使用Bachran等人描述的方法（Bachran, M.等人: Theactivity of myeloid cell-specific VHH immunotoxins is target-, epitope-,subset- and organ dependent, Scientific Reports 7(1) (2017) 17916）。
为此，在大肠杆菌（E. coli）菌株WK6（VHHs）和 BL21（DE3）（SrtA表达）中表达了VHHs和重组SrtA28。在有合适的抗生素的情况下，在极品肉汤（terrific broth）（12 g/L胰蛋白胨、24 g/L酵母提取物、5 g/L甘油、2.3 g/L KH2PO4、12.5 g/L K2HPO4）中的表达培养物于37℃生长至0.8的OD600 nm。添加异丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷（BioChemica, #A1008,0025）至1 mM的终浓度，并将培养物于37℃进一步温育3小时。通过离心（15分钟，4000×g，4℃）收获细胞，将沉淀重悬浮于20 mL PBS（150 mM NaCl, 8.3 mM Na2HPO4, 1.7mM KH2PO4, pH 7.4）/400 mL培养物中。重悬浮的样品通过超声处理（2×1分钟超声处理，100%强度，50%负载周期，超声波仪（Sonicator）HD2070, Sonotrode KE76, Bandelin）裂解，离心（30分钟，38000×g，4℃）且将上清液施加到镍-次氮基三乙酸琼脂（Protino Ni-NTA, Macherey-Nagel）柱。所有表达的蛋白质都含有6×His-标记，从而允许通过金属螯合物层析纯化蛋白质。接着通过PBS、PBS + 20 mM咪唑和 PBS + 50 mM咪唑洗涤柱。蛋白质通过 PBS + 250 mM咪唑洗脱。洗脱的蛋白质在具有3 kDa截断值（对于VHHs）和10 kDa截断值（对于SrtA）的Amicon离心过滤设备（Millipore）中进行浓缩。浓缩的蛋白质针对PBS透析过夜。透析的蛋白质的浓度通过于280 nm的吸光度测量来确定。通过还原SDS-PAGE（12%凝胶）和考马斯染色分析纯化的蛋白质的纯度。最终材料被确定为>90%纯。
吸收系数基于一级蛋白质序列，并从在线软件ExPASy ProtParam, SIB,Lausanne, 瑞士计算。
使用的蛋白质的序列（单字母密码根据Nomenclature and symbolism for aminoacids and peptides (Recommendations 1983), Pure and Applied Chemistry, 1984,p. 595]）
分选酶A（SrtA7m）[SEQ ID_NO 1]
Figure DEST_PATH_IMAGE011
eGFP（增强型绿色荧光蛋白）[SEQ ID_NO 4]
Figure 570989DEST_PATH_IMAGE012
DMA-PEG-G5
DMA-PEG-G5是具有图1所示式的物质。
实施例1
在这里进一步称为DMA-PEG-G5的图1中结构2的原液（氯仿中25 mg/mL）在HPLC小瓶中等分。在温和的氮气流下蒸发氯仿，从而产生薄的脂质膜，其用DPBS（Dulbecco氏磷酸缓冲盐水，Sigma Aldrich, #D1408）pH 7.4水合为微团水性脂质分散体（2 mM）。另一方面，使用超声将DMA-PEG-G5溶解在DPBS pH 7.4（5-10 mg/mL）中。将400 μL的50 μM VHH、25 μM分选酶-A和1 mM DMA-PEG-G5（其对应于320 μg的靶产物质量）于4℃温育4小时，直到使用反相HPLC（rp-HPLC）分离缀合物为止。使用Aeris Widepore C4柱（3.6 μm颗粒大小，100 mm长度，2.1 mm直径，Waters Corporation, Milford, Massachusetts, 美国）和二元梯度模式（表）分离反应整体和产物。
表2：用于分离反应整体和产物的rp-HPLC梯度模式（A：具有0.1%三氟乙酸（TFA v/v的水；B：具有0.05% TFA v/v的乙腈）
Figure DEST_PATH_IMAGE013
洗脱液A是具有0.1%TFA 的水，洗脱液B是具有0.05% TFA的乙腈。分析在装备有脱气装置、二元泵、温度控制的自动进样器、柱烘箱、二极管阵列检测器（DAD）和分析型级分收集器（AFC），由EZChrom Elite软件（Agilent Technologies, Santa Clara, CA, 美国）控制的Agilent 1110 HPLC***上进行。柱温度调整到30℃，自动进样器温度为4℃。标准分析或分离注射体积分别为5 μL或25-100 μL。流速为0.5 mL/分钟。使用DAD在214和280 nm处记录数据。
缀合物峰是手动或使用自动级分收集器收集的。单一注射液的集合贮存在冰上，直到使用真空离心机去除洗脱液混合物为止（RVC 2-33 IR, Martin Christ, Osterodeam Harz, 德国；速度：1500 rpm；温度：40℃；100毫巴（mbar）达10分钟，继之以20毫巴达20分钟和进一步于2毫巴蒸发）。所得到的沉淀用水水合，且蛋白质浓度通过紫外分光术（NP80, Implen, Westlake Village, CA, 美国）使用由ExPASy ProtParam web应用程序（web application）（https://web.expasy.org/protparam, SIB, Lausanne, 瑞士）计算的消光系数进行测定。基于回收的蛋白质溶液的质量和浓度以及靶产物质量计算得率。纯度通过具有2-15分钟的自动峰检测的在214 nm处的rp-HPLC分析和从水空白的背景噪声获得的阈值水平来确定。
为了验证反应产物，将方法转移到装备有电喷射离子化质谱仪（ESI-MS, amaZonSL, Bruker Corporation, Billerica, Massachusetts, 美国）的类似HPLC***中。离子源类型调整到具有正极性的ESI。毛细管出口（Capillary exit）为140 V，阱深（trapdrive）调整到“94”。质量范围模式调整到增强的分辨率，而扫描范围为100-2200 m/z。每次运行对5个光谱求平均值。使用原始光谱的去褶合（deconvolution）计算质量。
实施例2
将来自实施例1的分离的VHH ENH缀合物或天然VHH ENH（100 nM）掺加到100 nMeGFP。VHH ENH因其在结合时增加eGFP的内在荧光的能力而众所周知。使用具有分别调整到485 nm和535 nm的激发和发射的Spark平板阅读器（Plate Reader）（Tecan Group, Männedorf, 瑞士）在黑色96-孔平板（Thermo Fisher Scientific, Waltham,Massachusetts, 美国）中测量与单独eGFP相比荧光强度中的增加。
实施例3
FITC-葡聚糖（异硫氰酸荧光素）标记的脂质体如别处所述进行制备[4]。简而言之，DPPC（1,2-二棕榈酰磷脂酰胆碱）胆固醇、DPPG（1,2-二棕榈酰-磷脂酰甘油）和DMA-PEG-G5的混合物（59.4 : 34.6 : 5.0 : 1.0，摩尔分数）在甲醇中溶解至32 mM，并通过计算机控制的二元泵***使用具有27G针的定制的T-部件注射到DPBS pH 7.4 中的10 mg/mLFITC（异硫氰酸荧光素）葡聚糖溶液中。通过切向流过滤纯化和浓缩分散体。脂质浓度通过别处描述的具有蒸发光散射检测的rp-HPLC方法来确定[5]。为了制备免疫脂质体，将脂质化的VHH ENH或VHH DC13添加到脂质体分散体中至每μM 磷脂（PL）0.25-2 nM VHH。将混合物彻底涡旋并于50℃温育30分钟。
鼠骨髓来源的抑制性CD11b+Gr-1+细胞（MDSC）来源于骨髓源来源的NUP-祖先细胞[6]。MDSC在补加有10%热灭活的胎牛血清、100 U/mL青霉素（Life Technologies, #15140122）、100 μg/mL链霉素（Life Technologies, #15140122）、1 mM 丙酮酸钠（LifeTechnologies, #11360070）、50 μM 2-巯基乙醇（Life Technologies, #31350-010）和1×非必需氨基酸（Life Technologies, #11140-035）补加有20 ng/mL白细胞介素-6和20 ng/mL粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（Biolegend, #576304, San Diego, 美国）的完全RPMI（RPMI 1640 培养基，Life Technologies, #21875-034, Carlsbad, CA, 美国）中分化四天。为了调查VHH-修饰的脂质体的结合，将MDSC与500 μM 的脂质体（基于总脂质含量）于4℃温育4小时。用FACS缓冲液（1×PBS + 2%热灭活的胎牛血清）洗涤细胞，并在FACS缓冲液中有Fc受体阻断（TruStain FcX, BioLegend, #422302）的情况下进行细胞的抗体染色。SytoxBlue（Thermo Fisher Scientific, S34857）用于排除死细胞。通过包囊的FITC-葡聚糖检测脂质体。
实施例4
从于海德堡大学（University of Heidelberg）动物设施在无特定病原体条件下维持且在注册的规程T47/16的指导下实施安死术的C57BL/6j小鼠的脾中分离T细胞。将脾捣碎且在红细胞裂解（ACK裂解缓冲液，#A1049201, Thermo Fisher Scientific）后使用根据制造商的说明使用的小鼠CD8a+ T细胞分离试剂盒（#130-104-075, Miltenyi Biotec,Bergisch-Gladbach, 德国）和磁力细胞分离（LS柱，#130-042-401, Miltenyi Biotec）分离CD8+ 细胞。纯化的CD8+ T细胞于35℃由1 nM Cell Tracer Far Red (#C34564, ThermoFisher Scientific）染色5分钟，且用FACS缓冲液洗涤。染色的T细胞（1.65×108个细胞/mL）与650 nM天然或脂质化的VHH DC13和VHH ENH于4℃温育1小时。通过FITC-抗美洲驼抗体检测脂质化的VHH与T细胞的结合。
鼠骨髓来源的抑制性CD11b+Gr-1+细胞（MDSC）来源于骨髓源来源的NUP-祖先细胞[6]。MDSC在补加有10%热灭活的胎牛血清、100 U/mL青霉素（Life Technologies, #15140122）、100 μg/mL链霉素（Life Technologies, #15140122）、1 mM 丙酮酸钠（LifeTechnologies, #11360070）、50 μM 2-巯基乙醇（Life Technologies, #31350-010）和1×非必需氨基酸（Life Technologies, #11140-035）补加有20 ng/mL白细胞介素-6和20 ng/mL粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（Biolegend, #576304, San Diego, 美国）的完全RPMI（RPMI 1640 培养基，Life Technologies, #21875-034, Carlsbad, CA, 美国）中分化四天。为了调查脂质化的VHHs的膜***，将MDSC（107个细胞/mL）与500 nM 的天然或脂质化的VHH ENH或VHH DC13于4℃温育30分钟。用FACS缓冲液（1×PBS + 2%热灭活的胎牛血清）洗涤细胞，并在FACS（荧光辅助细胞分选）缓冲液中有Fc受体阻断（TruStain FcX,BioLegend, #422302）的情况下进行细胞的抗体染色。SytoxBlue（Thermo FisherScientific, S34857）用于排除死细胞。通过FITC-抗美洲驼抗体（Invitrogen, #A16061）检测***细胞膜中的脂质化的VHH。所有细胞分析均通过流式细胞术进行。流式细胞术在FACSAria II（Beckton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, 美国）上进行，且结果由FlowJo（Tree Star, V.10.0.8）分析。
实施例5
将来自实施例4的CD11b+Gr-1+细胞与100 μg/mL eGFP于4℃温育30分钟，以检测eGFP与***细胞膜中的脂质化的VHH ENH的结合。对于eGFP的荧光，流式细胞术在FACSAriaII（Beckton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, 美国）上进行，结果由FlowJo（Tree Star, V.10.0.8）分析。
实施例6
对于细胞-细胞相互作用实验，从于海德堡大学（University of Heidelberg）动物设施在无特定病原体条件下维持且在注册的规程T47/16的指导下实施安死术的C57BL/6j小鼠的脾中分离T细胞。将脾捣碎且在红细胞裂解（ACK裂解缓冲液，#A1049201, ThermoFisher Scientific）后使用根据制造商的说明使用的小鼠CD8a+ T细胞分离试剂盒（#130-104-075, Miltenyi Biotec, Bergisch-Gladbach, 德国）和磁力细胞分离（LS柱，#130-042-401, Miltenyi Biotec）分离CD8+ 细胞。纯化的CD8+ T细胞于35℃由1 nM CellTracer Far Red (#C34564, Thermo Fisher Scientific）染色5分钟，且用FACS缓冲液洗涤。染色的T细胞（1.65×108个细胞/mL）与650 nM天然或脂质化的VHH DC13和VHH ENH于4℃温育1小时。VHH-标记的T细胞用FACS缓冲液洗涤两次并且3×107个T细胞与1.1×107个MDSC（如实施例4中所述获得的）于4℃温育1小时。T细胞和MDSC装载到LS柱上，用于CD8+ T细胞的磁珠分离和与T细胞结合的MDSC的共纯化。洗脱的细胞通过抗-CD11b-亮紫605和抗-Gr-1-FITC（#101237和#108405, Biolegend）染色，并如上所述通过流式细胞术进行分析。
实施例7
在ThermoFisher Polysorp 96-孔平板（# Nunc 475094）中，将天然或脂质化的VHH ENH（实施例1的批次#3）与在DPBS pH 7.4（1×, Sigma, #D1408）中的eGFP以不同的变化混合。变化包括：PBS、具有eGFP（50 nM）的PBS、具有eGFP（50 nM）的PBS + 天然VHH ENH（50 nM）、具有eGFP（50 nM）的PBS + 脂质化的VHH ENH（5-50 nM）。将平板在定轨振荡器中以60 rpm、37℃温育1.5小时。后来，将平板@300g离心1分钟以收集孔底部的所有液体。然后使用具有485 nm的激发和525 nm的发射的TecanReader Spark（ThermoFischer）测量平板。后来，将孔中的液体交换5次。在每个1.、2.、3.和5.交换步骤之后，测量荧光。
令人惊讶的是，已经发现由酶标记、亲水间隔基、接头和亲脂部分组成的化合物（图1中的结构2）可以溶解在水性缓冲液中最多到10 mg/mL（4 mM）（实施例1）。
在制备1 mM结构2、25 µM转肽基酶分选酶A和50 µM LPETG-修饰的单结构域抗体（实施例1）（结构1）的混合物后，在通过反相HPLC分析后4小时后观察到结构1的有效脂质化（图3，用作结构1的VHH ENH的示例性层析谱）。
此外，如通过目测所分析的，在反应过程中没有观察到脂质化的产物的聚集或沉淀（实施例1）。
质谱分析法证实了对于两种不同单结构域抗体的预期分子量（VHH ENH（图4），VHHDC13（图5），（实施例1）。
通过在玻璃小瓶中收集“脂质化的VHH”峰的所述反相HPLC方法的柱流出物来纯化反应整体。通过真空离心除去由水、乙腈和三氟乙酸组成的洗脱液混合物。如此获得的沉淀可以溶解在水中至~1 mg/mL蛋白质含量（实施例1）。
如此获得的脂质化的单结构域抗体的纯度通过与在214 nm的UV检测组合的反相FIPLC进行分析。其揭示对于以下批次（图6，表1）高于>95%的纯度（基于UV面积）（实施例1）。
表1
Figure 900340DEST_PATH_IMAGE014
基于回收的蛋白质溶液的质量和浓度以及靶产物质量（每批次320 µg蛋白质）计算得率。除了在没有冷却柱流出物的情况下制备的VHH ENH批次#3之外，获得了>50%的良好得率（实施例1）。
通过脂质化的VHH ENH在结合时增加eGFP的荧光的能力来分析经反相HPLC纯化的缀合物的生物活性（实施例2）[1]。
三个不同批次与eGFP一起温育，并将于485 nm激发和535 nm发射的荧光强度与天然VHH ENH的荧光强度进行比较。数据揭示批次#1和批次#2中没有结合的丧失（图7）（实施例2）。批次#3是在没有冷却柱流出物的情况下制备的，且显示出eGFP的稍微降低的荧光增强（实施例 2）。
将脂质化的和分离的单结构域抗体VHH ENH和VHH DC13以不同的VHH与磷脂比例与FITC-标记的脂质体药物递送***（实施例3）一起温育。然后通过这种后***方法修饰的脂质体与培养的鼠CD11b+Gr-1+细胞一起温育。VHH DC13与细胞表面受体CD11b结合，并且VHH DC13-修饰的脂质体在流式细胞术分析期间显示与CD11b+Gr-1+细胞的明显的细胞缔合（图8，显示了2 nM/µM磷脂的脂质体上的VHH DC13表面密度的数据，每个点图（dot plot）中的百分比表示标记的门中的阳性细胞数目。FSC：前向散射）（实施例3）。
当脂质体与不同比例的脂质化的VHH DC13与磷脂浓度一起温育时，对于0.5 nMVHH DC13/µM磷脂观察到细胞上的最佳结合（图8）（实施例3）。
为了评估脂质化的VHH是否可用于细胞膜重塑，将CD11b+Gr-1+细胞或T细胞与脂质化的或天然VHH ENH或VHH DC13一起温育（实施例4）。洗涤细胞后，用FITC-抗美洲驼抗体染色细胞后，通过流式细胞术确认细胞表面上存在VHH（实施例4，图10）。脂质化的VHHs明显增加了在流式细胞术中从细胞获得的荧光信号（实施例4）。如果VHH DC13与CD11b+细胞一起温育，则未检测到脂质化的形式和非脂质化的形式之间的差异，这是因为VHH DC13与CD11b的直接结合超越了疏水***效应（实施例4）。
为了评估存在于细胞表面上的脂质化的VHHs是否也可对可溶性抗原可接近，将CD11b+Gr-1+细胞与脂质化的或天然VHH ENH或VHH DC13一起温育（实施例 5）。细胞洗涤后，将细胞与VHH ENH对应的抗原eGFP一起温育。流式细胞术揭示已用脂质化的VHH ENH处理的细胞选择性捕获eGFP（实施例5，图11）。
为了评估存在于细胞表面上的脂质化的VHHs是否也能够促进细胞-细胞相互作用（实施例6），将分离的CD8+ T细胞与脂质化的或天然VHH ENH或VHH DC13一起温育。后来，将如此修饰的细胞与CD11b+Gr-1+细胞一起温育。所述细胞混合物首先通过对抗原CD8特异性的磁珠辅助的细胞分选进行分离。后来，CD8+保留物（retentate）被对于CD11b和Gr-1染色，并通过流式细胞术进行分析（图14）（实施例6）。与脂质化的VHH DC13预温育的细胞群体在CD8-阳性柱保留物中导致MDSC的更高信号，从而表明VHH促进的MDSC和T细胞之间的细胞相互作用（图13）（实施例6）。
为了评估脂质化的VHHs是否可以固定在疏水表面例如疏水聚苯乙烯上，将脂质化的或天然VHH ENH在Polysorp® 96-孔平板中在有50 nM eGFP（VHH ENH的相应抗原）的情况下温育（实施例7）。经过几次洗涤步骤后，对于25 nM和50 nM包被在孔中观察到显著的包被和保留eGFP（图14）。数据表明脂质化的VHHs对于抗原或细胞捕获或固定在细胞上的可用性（实施例7）。其还可用于蛋白质的纯化。
序列表
<110> Wöll Steffen
Schiller Stefan
Geißler Simon
Scherließ Regina
<120> 用于脂质化蛋白质结构的制备的方法
<130> I
<160> 4
<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 186
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 1
Met Gly His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro Arg Gly
1 5 10 15
Ser Gly Met Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln His Met
20 25 30
Asp Ser Pro Asp Leu Gly Thr Gln Ala Lys Pro Gln Ile Pro Lys Asp
35 40 45
Lys Ser Lys Val Ala Gly Tyr Ile Glu Ile Pro Asp Ala Asp Ile Lys
50 55 60
Glu Pro Val Tyr Pro Gly Pro Ala Thr Arg Glu Gln Leu Asn Arg Gly
65 70 75 80
Val Ser Phe Ala Lys Glu Asn Ala Ser Leu Asp Asp Gln Asn Ile Ser
85 90 95
Ile Ala Gly His Thr Phe Ile Asp Arg Pro Asn Tyr Gln Phe Thr Asn
100 105 110
Leu Lys Ala Ala Lys Lys Gly Ser Met Val Tyr Phe Lys Val Gly Asn
115 120 125
Glu Thr Arg Lys Tyr Lys Met Thr Ser Ile Arg Asn Val Lys Pro Thr
130 135 140
Ala Val Glu Val Leu Asp Glu Gln Lys Gly Lys Asp Lys Gln Leu Thr
145 150 155 160
Leu Ile Thr Cys Asp Asp Tyr Asn Glu Glu Thr Gly Val Trp Glu Thr
165 170 175
Arg Lys Ile Phe Val Ala Thr Glu Val Lys
180 185
<210> 2
<211> 132
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 2
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser His Asn Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Ser Leu
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Thr Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Asn Ile Met Arg Ser Gly Ser Ser Val Phe Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Ala His
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Ala Thr Arg Gly Ala Trp Pro Ala Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Leu Pro Glu Thr Gly Gly His His
115 120 125
His His His His
130
<210> 3
<211> 129
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 3
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Ala Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Pro Val Asn Arg Tyr
20 25 30
Ser Met Arg Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Trp Val
35 40 45
Ala Gly Met Ser Ser Ala Gly Asp Arg Ser Ser Tyr Glu Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ala Arg Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Asn Val Asn Val Gly Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Gly Gly Leu Pro Glu Thr Gly Gly His His His His His
115 120 125
His
<210> 4
<211> 245
<212> PRT
<213> 维多利亚多管发光水母（Aequorea victoria）
<400> 4
Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu
1 5 10 15
Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly
20 25 30
Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile
35 40 45
Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr
50 55 60
Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys
65 70 75 80
Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu
85 90 95
Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu
100 105 110
Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly
115 120 125
Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr
130 135 140
Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn
145 150 155 160
Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser
165 170 175
Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly
180 185 190
Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu
195 200 205
Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe
210 215 220
Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys His
225 230 235 240
His His His His His
245

Claims (20)

1.用于制备缀合物的方法，其中所述缀合物包含生物分子、酶标记、亲水间隔基、接头和亲脂部分，这种方法包括在水性介质中酶促偶联包含酶标记、亲水间隔基、接头和亲脂部分的组分与生物分子和缀合物的纯化。
2.根据权利要求1的方法，其中所述生物分子是多肽。
3.根据权利要求2的方法，其中所述生物分子是抗原、细胞黏着蛋白如整联蛋白或钙黏着蛋白，肽激素，如生长因子，细胞因子如白细胞介素，或与任何这些分子相关的受体，酶或天然或人工抗体或其片段。
4.根据权利要求3的方法，其中所述抗体是单克隆抗体或其片段，例如单链可变片段（scFv），可变片段（Fv），或抗原结合片段（Fab、Fab’或F(ab’)2）；骆驼科动物或软骨鱼来源的仅重链抗体或其片段，例如VHH或vNAR，或其中人工抗体是DARPin、adnectine、anticalin或affibody。
5.根据权利要求3或4的方法，其中所述生物分子是衍生自骆驼科动物仅重链抗体的可变结构域（VHH）的单结构域抗体。
6.根据权利要求1-5的方法，其中所述生物分子在其与包含酶标记、亲水间隔基、接头和亲脂部分的组分偶联之前携带C-末端基序用于通过转肽基酶，优选分选酶A进行酶促缀合。
7.根据权利要求6的方法，其中所述C-末端基序由氨基酸序列“亮氨酸-脯氨酸-X-苏氨酸-甘氨酸”（LPXTG）组成，其中“X”可以是任何蛋白原性氨基酸。
8.根据权利要求7的方法，其中存在于所述LPXTG基序中的所述蛋白原性氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸或组氨酸，优选谷氨酸。
9.根据权利要求1-8中一项或多项的方法，其中所述酶标记是脂族胺，单甘氨酸，具有一个或多个N-末端甘氨酸，优选五甘氨酸的肽序列，其C-末端连接至亲水间隔基。
10.根据权利要求1-9中一项或多项的方法，其中所述亲水间隔基是聚氧(C2-C3)亚烷基（例如聚乙二醇或聚丙二醇）、多糖（例如葡聚糖、支链淀粉、壳聚糖、透明质酸）、多聚唾液酸、聚乙烯亚胺，优选聚乙二醇。
11.根据权利要求1-10中一项或多项的方法，其中所述接头是异谷氨酰胺，在与3-氨基-1,2-丙二醇连接的δ-位置酰胺上，且在与亲水间隔基连接的α-位置胺官能上。
12.根据权利要求1-11中一项或多项的方法，其中所述亲脂部分是一个或多个彼此独立的饱和或不饱和、直链或支链烃链，例如链长为6-30个碳原子的脂肪醇或脂肪酸，或甾醇如胆固醇。
13.根据权利要求12的方法，其中所述亲脂部分包含两种各自与3-氨基-1,2-丙二醇的二醇基团醚连接的肉豆蔻醇。
14.根据权利要求1-13中一项或多项的方法，其中所述包含酶标记、亲水间隔基、接头和亲脂部分的组分（组分A）是DMA-PEG-G5。
15.根据权利要求1-14中一项或多项的方法，其包括步骤
（a）制备包含酶标记、亲水间隔基、接头和亲脂部分的组分的水性分散体；
（b）添加酶和生物分子；
（c）温育在步骤（b）中获得的混合物以产生缀合物；
（d）纯化步骤（c）中获得的缀合物。
16.根据权利要求15的方法，其中所述步骤（b）中的酶是连接酶，包括分选酶、蝶豆粘酶、trypsiligase、subtiligase、peptiligase和omniligase，优选分选酶A。
17.通过根据权利要求1-16中一项或多项的方法获得的缀合物用于修饰基于脂质的药物递送***例如固体-脂质纳米颗粒、纳米乳剂、微团或脂质体，优选脂质体的用途。
18.通过根据权利要求1-16中一项或多项的方法获得的缀合物用于修饰活细胞，优选T细胞的膜的用途。
19.通过根据权利要求1-16中一项或多项的方法获得的缀合物用于修饰对疏水物质如疏水聚苯乙烯具有亲和力的表面的用途。
20.通过根据权利要求1-15中一项或多项的方法获得的缀合物用于修饰外来体的膜的的用途。
CN202080020874.7A 2019-03-13 2020-03-10 用于脂质化蛋白质结构的制备的方法 Pending CN113518923A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP19162511 2019-03-13
EP19162511.0 2019-03-13
PCT/EP2020/056339 WO2020182807A1 (en) 2019-03-13 2020-03-10 Process for the preparation of lipidated proteinaceous structures

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN113518923A true CN113518923A (zh) 2021-10-19

Family

ID=65801983

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202080020874.7A Pending CN113518923A (zh) 2019-03-13 2020-03-10 用于脂质化蛋白质结构的制备的方法

Country Status (8)

Country Link
US (1) US20220184223A1 (zh)
EP (1) EP3938784A1 (zh)
JP (1) JP2022524537A (zh)
CN (1) CN113518923A (zh)
AU (1) AU2020235801A1 (zh)
CA (1) CA3133136A1 (zh)
IL (1) IL286078A (zh)
WO (1) WO2020182807A1 (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20230148183A (ko) * 2021-02-09 2023-10-24 진콴텀 헬스케어 (쑤저우) 씨오., 엘티디. 결합 장치 및 결합 화합물을 생성하는 방법
CN113121636B (zh) * 2021-04-08 2022-04-22 山东大丰园农业有限公司 用于富集正三十醇结合物的复合体及其制备方法与应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101778937A (zh) * 2007-06-04 2010-07-14 诺和诺德公司 使用n-乙酰葡糖胺转移酶的o-联糖基化
WO2010087994A2 (en) * 2009-01-30 2010-08-05 Whitehead Institute For Biomedical Research Methods for ligation and uses thereof
CN102037004A (zh) * 2008-01-08 2011-04-27 生物种属学股份公司 使用寡糖基转移酶的多肽的糖缀合

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
US5587458A (en) 1991-10-07 1996-12-24 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof
EP1997894B1 (en) 1992-02-06 2011-03-30 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Biosynthetic binding protein for cancer marker
WO2013135359A1 (en) 2012-03-16 2013-09-19 Merck Patent Gmbh Targeting aminoacid lipids

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101778937A (zh) * 2007-06-04 2010-07-14 诺和诺德公司 使用n-乙酰葡糖胺转移酶的o-联糖基化
CN102037004A (zh) * 2008-01-08 2011-04-27 生物种属学股份公司 使用寡糖基转移酶的多肽的糖缀合
WO2010087994A2 (en) * 2009-01-30 2010-08-05 Whitehead Institute For Biomedical Research Methods for ligation and uses thereof

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JOHN R. SILVIUS等: "A Novel "Prebinding" Strategy Dramatically Enhances Sortase-Mediated Coupling of Proteins to Liposomes", 《BIOCONJUGATE CHEMISTRY》, vol. 28, no. 4, 6 April 2017 (2017-04-06), pages 1271 - 1282, XP055694846, DOI: 10.1021/acs.bioconjchem.7b00087 *
STEFFEN WÖLL等: "Pentaglycine lipid derivates – rp-HPLC analytics for bioorthogonal anchor molecules in targeted, multiple-composite liposomal drug delivery systems", 《INTERNATIONAL JOURNAL OF PHARMACEUTICS》, vol. 547, 25 August 2018 (2018-08-25), pages 602 - 610, XP055694444, DOI: 10.1016/j.ijpharm.2018.05.052 *
STEFFEN WÖLL等: "Sortaggable liposomes: Evaluation of reaction conditions for single-domain antibody conjugation by Sortase-A and targeting of CD11b+ myeloid cells", 《EUROPEAN JOURNAL OF PHARMACEUTICS AND BIOPHARMACEUTICS》, vol. 133, 31 December 2018 (2018-12-31), pages 138 - 150, XP085537700, DOI: 10.1016/j.ejpb.2018.09.017 *
STEFFEN WÖLL等: "Sortagged anti-EGFR immunoliposomes exhibit increased cytotoxicity on target cells", 《EUROPEAN JOURNAL OF PHARMACEUTICS AND BIOPHARMACEUTICS》, vol. 136, 21 January 2019 (2019-01-21), pages 203 - 212, XP085600103, DOI: 10.1016/j.ejpb.2019.01.020 *
TRAVIS J. ANTES等: "Targeting extracellular vesicles to injured tissue using membrane cloaking and surface display", 《JOURNAL OF NANOBIOTECHNOLOGY》, vol. 16, 30 August 2018 (2018-08-30) *

Also Published As

Publication number Publication date
AU2020235801A1 (en) 2021-11-04
IL286078A (en) 2021-10-31
JP2022524537A (ja) 2022-05-06
US20220184223A1 (en) 2022-06-16
CA3133136A1 (en) 2020-09-17
WO2020182807A1 (en) 2020-09-17
EP3938784A1 (en) 2022-01-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11884721B2 (en) Erythrocyte-binding therapeutics
JP7054948B2 (ja) プロテアーゼ切断耐性、志賀毒素ａサブユニットエフェクターポリペプチド及びそれを含む細胞標的化分子
JP7014843B2 (ja) キメラ抗原受容体及びその使用方法
CN111094341A (zh) 在可变域和恒定域之间的肘区中具有功能域的抗体
CN105829349B (zh) 肽嵌合抗原受体t细胞开关和其用途
JP6813488B2 (ja) アントラサイクリン誘導体を含む、結合タンパク質薬物複合体（Ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）
CA2811734C (en) Multimeric il-15 soluble fusion molecules and methods of making and using same
RU2703952C2 (ru) Молекулярные конструкции с нацеливающими и эффекторными элементами и способы их применения
CN104271148A (zh) 红细胞结合性治疗剂
EA028178B1 (ru) Улучшенные связывающие сывороточный альбумин варианты
US20230167185A1 (en) Cd40 binding protein
US20220184223A1 (en) Process for the preparation of lipidated proteinaceous structures
JP2023550191A (ja) Ｄｒ４および／またはｄｒ５を標的とするポリペプチドならびに関連する組成物および方法
Wöll et al. Sortase-A mediated chemoenzymatic lipidation of single-domain antibodies for cell membrane engineering
JP2023535809A (ja) 血清半減期延長ｐｄ－ｌ１抑制性ポリペプチド
WO2004087058A2 (en) Targeted mhc class i alpha3 vaccine delivery systems
JP2024506669A (ja) メソテリンポリペプチドに結合する分子

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination