CN113512022A - 一种基于pH响应的多功能荧光链接体及制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

一种基于pH响应的多功能荧光链接体及制备方法和应用，9‑(2‑羧基苯基)‑3,6‑双(二乙氨基)占吨翁氯化物与N‑Boc‑丁二胺在EDC·HCl的缩合下，得到带有Boc保护的氨基末端中间体；带有Boc保护的氨基末端中间体在CF3COOH的作用下，得到带有氨基末端的中间体；带有氨基末端的中间体与亚二硫基二乙酸在EDC·HCl的缩合下，得到基于pH响应的多功能荧光链接体。本发明的链接体分子能够化学修饰靶向抗肿瘤药物分子进而构建“诊疗一体化”药物，其进入体内，在肿瘤低pH微环境的催化下，荧光开启进行标记示踪，同时在高还原的肿瘤微环境下进行靶向抗肿瘤药物释放，从而实现诊疗一体化的目的。

Description

一种基于pH响应的多功能荧光链接体及制备方法和应用
技术领域
本发明属于药物制备技术领域，涉及一种基于pH响应的多功能荧光链接体及制备方法和应用。
背景技术
癌症，又称恶性肿瘤，是严重危害人类健康和生命的重大疾病之一。根据国际著名癌症期刊《CA:A Cancer Journal for Clinicians》关于中国癌症情况的最新报道显示，2015年中国约有429.2万例新发癌症病例和281.4万例癌症死亡病例，分别占全球新发和死亡病例的22％和27％。癌症正成为危害中国公共卫生安全的重要因素。因此，对于癌症及时、高效、精准的诊疗，不仅关系到人民的生命健康和生活质量，也关系到经济和社会的可持续发展。传统的肿瘤治疗方法主要包括手术切除、化学药物治疗(化疗)和放射治疗(放疗)。但是由于手术过程中肿瘤组织不易标识，且原癌细胞易转移，会导致术后易复发。与此同时，针对于不同个体，治疗效果也参差不齐，而放化疗一般也较为昂贵。因此，在治疗前对患者个体进行筛选成为首要一步。
“诊疗一体化”于1998年由John Funkhouser首次提出，其将诊疗一体化定义为“根据疾病状态干预治疗手段的能力”(The Ability to Affect Therapy or Treatment of ADisease State)。随着诊疗一体化的快速蓬勃发展，其定义也有了更广泛的扩充，现在普遍认为，诊疗一体化是一种将疾病的诊断或监测与治疗有机结合的新型生物医学技术。由于诊疗一体化将诊断和治疗功能整合为一体，因此相对于单一的诊断或治疗手段具有明显的优势。具体而言，癌症的诊疗一体化在患者分层及个性化医疗、实时监测药物治疗过程和反馈药物治疗效果等方面均展现巨大潜力。
个体差异使得统一的标准化治疗方案对于不同的癌症患者并不能获得最佳疗效，因此个性化医疗成为大势所趋。根据全球领先的个性化医疗机构-美国安德森癌症中心(MDAnderson Cancer Center)给出的解释，个性化医疗作为一种癌症治疗策略，其核心思想是基于各类肿瘤标志物以及肿瘤细胞对治疗的反应，分析患者对特定治疗手段响应的可能性，并结合考虑患者的遗传因素可能导致的对药物代谢、响应和毒性的不同表现，同时综合患者的肿瘤分子谱、肿瘤部位和其他生理特征，制定出一套针对个人的最优治疗方案。从以上定义可以看出，在个性化医疗当中，各类诊断和治疗手段需要在整个治疗的过程中有机结合，这完全与癌症诊疗一体化的理念不谋而合，因而，开发融合诊断和治疗功能的癌症诊疗一体化技术将有力推动个性化医疗的发展。在此基础上，将成像和治疗功能整合在一起，可以实时掌握具有诊疗一体化药物在肿瘤组织中的动态分布，从而把握最佳的刺激时机。
近些年来，诊疗一体化概念主要应用于纳米递送药物方面。很多研究工作已经证明，纳米材料并非有益而无害的，它们在细胞、亚细胞以及蛋白质水平上都影响着生物体的正常生理功能。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于pH响应的多功能荧光链接体及制备方法和应用，该基于pH响应的多功能荧光链接体用于化学修饰靶向抗肿瘤药物分子，并且可以用于验证基于pH响应的多功能荧光链接体构建的探针实现“诊疗一体化”的可行性。
为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种基于pH响应的多功能荧光链接体，该多功能荧光链接体结构式如下：
Figure BDA0003138452590000031
一种基于pH响应的多功能荧光链接体的制备方法，包括以下步骤：
a)9-(2-羧基苯基)-3,6-双(二乙氨基)占吨翁氯化物与N-Boc-丁二胺在EDC·HCl的缩合下，得到带有Boc保护的氨基末端中间体；
b)带有Boc保护的氨基末端中间体在CF3COOH的作用下，得到带有氨基末端的中间体；
c)带有氨基末端的中间体与亚二硫基二乙酸在EDC·HCl的缩合下，得到基于pH响应的多功能荧光链接体，结构式如下：
Figure BDA0003138452590000032
本发明进一步的改进在于，步骤a)的具体过程为：将9-(2-羧基苯基)-3,6-双(二乙氨基)占吨翁氯化物、EDC·HCl、HOBT溶于无水二氯甲烷中，0℃下搅拌均匀后，滴加DIPEA，滴毕后反应后，加入N-Boc-丁二胺，进行反应，得到带有Boc保护的氨基末端中间体。
本发明进一步的改进在于，所述步骤a)的具体过程为：将9-(2-羧基苯基)-3,6-双(二乙氨基)占吨翁氯化物1.13mmol、EDC·HCl 1.69mmol、HOBT 1.35mmol溶于无水二氯甲烷中，0℃下搅拌均匀后，滴加DIPEA 4.70mmol，滴毕后反应，然后加入N-Boc-丁二胺0.94mmol，在室温下进行反应4h，得到带有Boc保护的氨基末端中间体。
本发明进一步的改进在于，步骤b)的具体过程为：将带有Boc保护的氨基末端中间体溶于无水二氯甲烷中，在0℃条件下滴加CF3COOH，滴毕后搅拌1h后，TLC监测直至反应完成，待反应完成后加入饱和碳酸氢钠水溶液，滴定至体系呈中性，萃取，收集有机相，旋干得到带有氨基末端的中间体。
本发明进一步的改进在于，所述步骤b)的具体过程为：将0.37mmol带有Boc保护的氨基末端中间体溶于20mL无水二氯甲烷中，在0℃条件下滴加2mL CF3COOH，0℃下搅拌1h，然后在25-30℃条件下反应再24h，得到带有氨基末端的中间体。
本发明进一步的改进在于，步骤c)的具体过程为：将亚二硫基二乙酸溶于无水二氯甲烷中，加入EDC·HCl和HOBT，0℃下搅拌30min后滴加三乙胺，室温搅拌24h，得到基于pH响应的多功能荧光链接体。
本发明进一步的改进在于，所述步骤c)的具体过程为，在0℃下，将亚二硫基二乙酸3.991mmol、EDC·HCl 1.915mmol以及HOBT 1.915mmol溶于无水二氯甲烷中，0℃下搅拌30min后滴加三乙胺1.915mmol，然后加入带有氨基末端的中间体0.798mmol，25-30℃下搅拌24h，得到基于pH响应的多功能荧光链接体。
一种如上所述的基于pH响应的多功能荧光链接体在制备用于***的诊疗一体化药物方面的应用。
本发明进一步的改进在于，在0℃下，将pH响应的多功能荧光链接体、PyBop于无水二氯甲烷中，0℃下搅拌均匀后滴加三乙胺，然后加入抗肿瘤药物，25℃搅拌24h，得到诊疗一体化药物。
本发明进一步的改进在于，在0℃下，将pH响应的多功能荧光链接体0.074mmol、PyBop0.148mmol于无水二氯甲烷中，0℃下搅拌30min后滴加三乙胺0.295mmol，然后加入抗肿瘤药物0.074mmol，室温搅拌24h，得到诊疗一体化药物。
本发明进一步的改进在于，抗肿瘤药物为利尼伐尼、索拉菲尼、贝伐珠单抗或阿替珠单抗；肿瘤为人脐血管静脉细胞、***细胞或乳腺癌细胞。
一种如上所述的基于pH响应的多功能荧光链接体在构建用于示踪的药物探针方面的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明通过使用9-(2-羧基苯基)-3,6-双(二乙氨基)占吨翁氯化物、N-Boc-丁二胺、亚二硫基二乙酸合成基于pH响应的多功能荧光链接体，该链接体分子能够化学修饰靶向抗肿瘤药物分子进而构建“诊疗一体化”药物，其进入体内，在肿瘤低pH微环境的催化下，荧光开启进行标记示踪，同时在高还原的肿瘤微环境下进行靶向抗肿瘤药物释放，从而实现诊疗一体化的目的。本发明的pH响应的多功能荧光链接体制备方法简单，易于实现，并且应用范围广。
本发明中的pH响应的多功能荧光链接体可以对靶向抗肿瘤药物分子进行化学共价修饰构建“诊疗一体化”药物，进而通过肿瘤(肝癌、肺癌、乳腺癌、***等)微环境的刺激，触发荧光点亮进行肿瘤部位的荧光标记，同时释放靶向抗肿瘤药物分子，从而达到对肿瘤的标记示踪以及治疗。利用该链接体所构建的探针分子可以改善纳米递送药物体系在诊疗一体化概念应用方面的生物毒性，同时扩充诊疗一体化概念的应用多元性。本发明的pH响应的多功能荧光链接体能够用于构建“诊疗一体化”药物以及验证该药物在实现诊断与治疗一体化的可行性。
附图说明
图1为本发明提供的pH响应的多功能荧光链接体的合成路线图；
图2为细胞成像结果。
图3为A549细胞增殖抑制结果。
图4为EA.hy926细胞增殖抑制结果。
图5为Hela细胞增殖抑制结果。
图6为MDA-MB-231细胞增殖抑制结果。
图7为pH敏感型荧光链接体荧光光谱图。
图8为pH敏感型荧光链接体-酸碱度定量曲线。
其中，化合物1为9-(2-羧基苯基)-3,6-双(二乙氨基)占吨翁氯化物，化合物2为N-Boc-丁二胺，化合物3为N-(9-(2-((4-((叔丁氧基羰基)氨基)丁基)氨基甲酰基)苯基)-6(二乙氨基)-8a,10a-二氢-3H-呫吨-3-亚基)-N-乙基乙胺，化合物4为N-(9-(2-((4-氨基丁基)氨基甲酰基)苯基)-6-(二乙氨基)-8a,10a-二氢-3H-呫吨-3-亚基)-N-乙基乙胺，化合物5为亚二硫基二乙酸。试剂与条件：(a)EDC·HCl,HOBT,DIPEA,DCM,0℃to rt,24h；(b)TFA,DCM,0℃to rt,24h；(c)EDC·HCl,HOBT,TEA,DCM,0℃to rt,24h.
具体实施方式
下面结合附图和具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
本发明在小分子的基础上构建诊疗一体化分子，利用其实现标记及治疗的作用，以扩充诊疗一体化在癌症治疗方面的实现手段。
本发明通过使用9-(2-羧基苯基)-3,6-双(二乙氨基)占吨翁氯化物、N-Boc-丁二胺、亚二硫基二乙酸合成pH响应的多功能荧光链接体分子，该链接体可以用于化学修饰靶向抗肿瘤药物分子构建“诊疗一体化”药物。
本发明提供的pH响应的多功能荧光链接体，其结构如下：
Figure BDA0003138452590000061
本发明所述的pH响应的多功能荧光链接体名称如下：
N-(9-(2-((4-(2-((羧甲基)二硫烷基)乙酰胺基)丁基)氨基甲酰基)苯基)-6-(二乙氨基)-3H-呫吨-3-亚基)-N-乙基乙胺。
下面结合图1中所示的合成路线和具体的合成实施例来详细说明本发明提供的具有构建“诊疗一体化”药物的pH响应的多功能荧光链接体的制备方法。
参见图1，一种pH响应的多功能荧光链接体的合成路线，包括以下步骤：
a)9-(2-羧基苯基)-3,6-双(二乙氨基)占吨翁氯化物与N-Boc-丁二胺在EDC·HCl的缩合下，得到带有Boc保护的氨基末端中间体；
所述步骤a)的具体操作为：
将9-(2-羧基苯基)-3,6-双(二乙氨基)占吨翁氯化物、EDC·HCl、HOBT溶于无水二氯甲烷中，0℃下搅拌均匀后，滴加DIPEA，反应3min后，加入N-Boc-丁二胺，在室温下进行反应4h，得到带有Boc保护的氨基末端中间体粗品，经饱和碳酸氢钠洗涤三次、饱和氯化钠洗涤、无水硫酸钠干燥有机相，柱色谱分离即得带有Boc保护的氨基末端中间体；
b)带有Boc保护的氨基末端中间体在CF3COOH的作用下，得到带有氨基末端中间体；
所述步骤b)的具体操作为：
带有Boc保护的氨基末端中间体溶于无水二氯甲烷中，在0℃条件下滴加CF3COOH，搅拌1h后，TLC监测直至反应完成，即得含有氨基末端中间体粗品，经饱和碳酸氢钠调节体系pH至中性，经萃取收集有机相，分别经饱和氯化钠、无水硫酸钠干燥洗涤有机相，减压旋干即得带有氨基末端中间体。
c)带有氨基末端的中间体与亚二硫基二乙酸在EDC·HCl的缩合下，得到基于pH响应的多功能荧光链接体。
所述步骤c)的具体操作为：
在0℃下，将亚二硫基二乙酸、EDC·HCl、HOBT溶于无水二氯甲烷中，0℃下搅拌30min后滴加三乙胺，接下来加入带有氨基末端中间体，室温搅拌24h，得到基于pH响应的多功能荧光链接体粗品，经饱和碳酸氢钠洗涤三次、饱和氯化钠洗涤、无水硫酸钠干燥有机相，柱色谱分离即得基于pH响应的多功能荧光链接体。
上述含有pH响应的多功能荧光链接体在构建“诊疗一体化”药物方面的应用。
实施例1
该含有pH响应的多功能荧光链接体的制备过程如图1所示，
a)9-(2-羧基苯基)-3,6-双(二乙氨基)占吨翁氯化物与N-Boc-丁二胺在EDC·HCl的缩合下，得到带有N-Boc保护的氨基末端中间体，具体过程如下：
将9-(2-羧基苯基)-3,6-双(二乙氨基)占吨翁氯化物(1.13mmol，0.50g)、EDC·HCl(1.69mmol,0.32g)、HOBT(1.35mmol,0.18g)溶于无水二氯甲烷中，0℃下搅拌均匀后，滴加DIPEA(4.70mmol,0.61g)，反应3min后，加入N-Boc-丁二胺(0.94mmol,0.18g)在室温下进行反应4h，得到带有Boc保护的氨基末端中间体粗品，经饱和碳酸氢钠洗涤三次、饱和氯化钠洗涤、无水硫酸钠干燥有机相，减压蒸去溶剂，得粗品，用层析柱分离纯化粗品，使用乙酸乙酯洗脱得到目标化合物，重0.23g，收率39.70％，得到带有N-Boc保护的氨基末端中间体；
LC-MS(ESI,m/z):380.14[M+H]+，378.10[M-H]--。
b)N-Boc保护的氨基末端中间体在CF3COOH的作用下，得到带有氨基末端的中间体，具体过程如下：
将带有Boc保护的氨基末端中间体(0.37mmol，0.23g)溶于20mL无水二氯甲烷中，在0℃条件下滴加2mL CF3COOH，在0℃下反应1h后，25-30℃下反应24h即得含有生物可降解基团二硫键的光亲和链接体粗品，经饱和碳酸氢钠调节体系pH至中性(pH≈7-8)，经二氯甲烷萃取收集有机相，有机相分别经饱和氯化钠、无水硫酸钠干燥洗涤有机相，减减压蒸去溶剂，得到带有氨基末端的中间体，重0.16g，收率84.20％。
LC-MS(ESI,m/z):514.71[M+H]+，512.65[M-H]-。
c)带有氨基末端的中间体与亚二硫基二乙酸在EDC·HCl的缩合下，得到带,具体过程如下：
在0℃下，将亚二硫基二乙酸(3.991mmol，0.77g)、EDC·HCl(1.915mmol，0.39g)、HOBT(1.915mmol，0.27g)溶于无水二氯甲烷中，0℃下搅拌30min后滴加三乙胺(1.915mmol，0.20g)，接下来加入带有氨基末端的中间体(0.798mmol，0.43g)，25-30℃下搅拌24h，得到一种基于pH响应的多功能荧光链接体粗品，经饱和碳酸氢钠洗涤三次、饱和氯化钠洗涤、无水硫酸钠干燥有机相，减压蒸去溶剂，得粗品，用层析柱分离纯化粗品，使用乙酸乙酯/甲醇(V/V＝10/1)洗脱得到目标化合物，重0.46g，收率85.15％，得到pH响应的多功能荧光链接体。
LC-MS(ESI,m/z):678.10[M+H]+，676.80[M-H]--。
含有pH响应的多功能荧光链接体能够在诊疗一体化方面应用。其应用范围较广，为一类通用型的基于pH响应的多功能荧光链接体，其可以用于修饰具有抗肿瘤活性的活性生物小分子如利尼伐尼，索拉菲尼等，也可以用于修饰具有治疗作用的单克隆抗体药物分子，例如抗血管生成类单克隆抗体药物贝伐珠单抗等，PD1/PDL1单克隆抗体药物阿替珠单抗等。
优选的，本发明利用pH响应的多功能荧光链接体化学修饰靶向抗肿瘤药物分子利尼伐尼，构建了利尼伐尼“诊疗一体化”药物分子，并且利用其对一些肿瘤细胞进行示踪定位成像分析及活性筛选。
利尼伐尼“诊疗一体化”药物分子的构建：在0℃下，将pH响应的多功能荧光链接体(0.074mmol，0.05g)、PyBop(0.148mmol，0.08g)溶于无水二氯甲烷中，0℃下搅拌30min后滴加三乙胺(0.295mmol，0.03g)，接下来加入利尼伐尼(0.074mmol，0.03g)，室温搅拌24h，得到利尼伐尼“诊疗一体化”药物分子粗品，经饱和碳酸氢钠洗涤三次、饱和氯化钠洗涤、无水硫酸钠干燥有机相，减压蒸去溶剂，得粗品，用层析柱分离纯化粗品，使用乙酸乙酯/甲醇(V/V＝10/1)洗脱得到目标化合物，重0.02g，收率27.6％，得到利尼伐尼“诊疗一体化”药物分子。
含有pH响应的多功能荧光链接体构建的“诊疗一体化”靶向抗肿瘤药物分子在原位肿瘤成像方面的应用。
利用上述设计合成的利尼伐尼“诊疗一体化”药物分子对EA.hy926细胞进行成像分子。
具体细胞成像步骤：
1)细胞种板：每孔细胞密度为4.3*105细胞/mL，37℃孵育过夜；
2)细胞给药：每孔探针浓度为4μmol/L,37℃孵育2h；
3)洗涤：利用PBS洗涤三次细胞，除去过量探针分子；
4)细胞固定：洗涤完成后，在室温下，在细胞中加入1mL 3.7％多聚甲醛(925ul4％多聚甲醛+75ul PBS)，固定30分钟，用PBS洗涤两次(轻微搅拌1-2分钟)，并在室温下用含有0.1％Triton X-100的PBS溶液透化10分钟。然后用PBS将细胞洗涤两次，缓慢搅拌1分钟，在室温下，用含2％BSA的PBS(含0.05％Tween-20)封闭30分钟，并用PBS(含0.05％Tween-20)洗涤两次。每次5分钟，轻轻晃动。
5)封片：在各组加入5ul抗荧光淬灭封片剂，周围加指甲油封片。
6)荧光显微镜进行检测：细胞成像结果如图2所示，探针浓度为4μmol/L，从图2可以看出，肿瘤细胞被荧光标记，说明构建的探针可以实现“诊疗一体化”中的标记即诊断一步。
含有pH响应的多功能荧光链接体构建的“诊疗一体化”靶向抗肿瘤药物分子在抗肿瘤活性方面的应用。
利用上述设计合成的利尼伐尼“诊疗一体化”药物分子对EA.hy926细胞(人脐血管静脉细胞)、Hela(***细胞)、MDA-MB-231(乳腺癌细胞)进行增殖抑制分析评价。
利用MTT对其进行活性评价：
1)细胞种板：96孔板种板，每孔细胞密度为1*105细胞/mL，每孔加入180μL细胞悬液,37℃孵育过夜。
2)细胞给药：设置6个浓度梯度，分别为20μmol/L,4μmol/L,0.8μmol/L,0.16μmol/L,0.032μmol/L,0.0064μmol/L,每个孔加入20ml,37℃孵育24h；
3)细胞给MTT：每孔加入22μmol/L,37℃孵育4h；
4)细胞处理：吸去每孔液体,加入150μLDMSO,室温于摇床上孵育10min。
5)吸光度测定：将96孔板置于酶标仪上测定其在490nm处的吸光度。
6)抑制率计算：抑制率＝阴性孔OD-给孔OD/阴性孔OD-空孔白OD
细胞增殖抑制结果如图3-图6所示，从图3-图6可以看出，构建的探针分子表现出与阳性药物分子近似的抗细胞增殖活性。即可表明构建的探针分子可以实现“诊疗一体化”概念中治疗一步。
1)基于pH响应的多功能荧光链接体荧光点亮特性考察：Britton-Robinson(B-R)缓冲溶液的配制
将浓度皆为0.04mol/L的磷酸、硼酸和醋酸的酸混合液，与0.2mol/L NaOH溶液按不同比例配置成不同pH的B-R缓冲溶液，具体配制方法如下表1所示：
表1不同pH的B-R缓冲溶液配置表
Figure BDA0003138452590000111
Figure BDA0003138452590000121
2)储备液的配制
取pH敏感型荧光链接体0.0678g溶于5mL DMSO溶剂中，配置成为浓度为0.02mol/L的母液。再将稀释200倍，即配制出浓度为1×10-4mol/L的利尼伐尼荧光探针储备液。
3)不同pH链接体溶液的配制
移取100μL荧光链接体的储备液至10mL容量瓶中，并加入不同pH的B-R缓冲溶液，定容至10mL，配制成相应pH条件下浓度为1μmol/L的链接体溶液。
4)探针溶液的荧光测定
将配置所得的不同pH的荧光链接体溶液，测定激发波长为λ＝365nm时，λ＝500～700nm的荧光发射光谱，得到荧光强度最强的发射波长，作出在该发射波长下的pH敏感型荧光链接体-酸碱度定量曲线。
不同pH条件下，pH敏感型荧光链接体的扫描荧光光谱如图7所示：
根据图7可以得出，pH敏感型荧光链接体在不同pH条件下，都在发射波长λ＝580nm和λ＝645nm处出现峰值，其中发射波长为λ＝580nm时荧光强度最大，故选择λ＝580nm为酸碱度定量所用发射波长。
发射波长为λ＝580nm时不同pH的荧光链接体荧光测定结果如图8所示，根据图8可以看出，所合成的pH敏感型荧光链接体在pH＝5.72～7.54区间出现了明显的变化趋势。荧光链接体在pH＝5.72～6.09区间内，荧光强度随着pH值的增大而增大，且荧光强度的变化幅度大；在pH＝6.09～7.54区间内，荧光强度随着pH值的增大而减小，荧光强度的变化幅度相对较小。并且，这种pH的变化区间，正好符合了肿瘤微环境与正常人体组织微环境pH的差别，即在正常组织pH条件(pH介于7.2～7.4)下，pH敏感型荧光链接体显示较弱的荧光，而在肿瘤组织的pH条件(pH值介于6.2～6.9)下，探针发出了更强的荧光。所以，该pH敏感型荧光链接体的荧光随pH的变化趋势符合肿瘤微环境与正常人体组织微环境pH的不同，可以达到链接该链接体的荧光探针在进入肿瘤微环境后，产生荧光进行荧光示踪的目的。

Claims (10)

1.一种基于pH响应的多功能荧光链接体，其特征在于，该多功能荧光链接体结构式如下：
Figure FDA0003138452580000011
2.一种基于pH响应的多功能荧光链接体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
a)9-(2-羧基苯基)-3,6-双(二乙氨基)占吨翁氯化物与N-Boc-丁二胺在EDC·HCl的缩合下，得到带有Boc保护的氨基末端中间体；
b)带有Boc保护的氨基末端中间体在CF3COOH的作用下，得到带有氨基末端的中间体；
c)带有氨基末端的中间体与亚二硫基二乙酸在EDC·HCl的缩合下，得到基于pH响应的多功能荧光链接体，结构式如下：
Figure FDA0003138452580000012
3.根据权利要求2所述的一种基于pH响应的多功能荧光链接体的制备方法，其特征在于，步骤a)的具体过程为：将9-(2-羧基苯基)-3,6-双(二乙氨基)占吨翁氯化物、EDC·HCl、HOBT溶于无水二氯甲烷中，0℃下搅拌均匀后，滴加DIPEA，滴毕后反应后，加入N-Boc-丁二胺，进行反应，得到带有Boc保护的氨基末端中间体。
4.根据权利要求2所述的一种基于pH响应的多功能荧光链接体的制备方法，其特征在于，步骤b)的具体过程为：将带有Boc保护的氨基末端中间体溶于无水二氯甲烷中，在0℃条件下滴加CF3COOH，滴毕后搅拌1h后，TLC监测直至反应完成，待反应完成后加入饱和碳酸氢钠水溶液，滴定至体系呈中性，萃取，收集有机相，旋干得到带有氨基末端的中间体。
5.根据权利要求2所述的一种基于pH响应的多功能荧光链接体的制备方法，其特征在于，步骤c)的具体过程为：将亚二硫基二乙酸溶于无水二氯甲烷中，加入EDC·HCl和HOBT，0℃下搅拌30min后滴加三乙胺，室温搅拌24h，得到基于pH响应的多功能荧光链接体。
6.一种如权利要求1所述的基于pH响应的多功能荧光链接体在制备用于***的诊疗一体化药物方面的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，在0℃下，将pH响应的多功能荧光链接体、PyBop于无水二氯甲烷中，0℃下搅拌均匀后滴加三乙胺，然后加入抗肿瘤药物，25℃搅拌24h，得到诊疗一体化药物。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，在0℃下，将pH响应的多功能荧光链接体0.074mmol、PyBop 0.148mmol于无水二氯甲烷中，0℃下搅拌30min后滴加三乙胺0.295mmol，然后加入抗肿瘤药物0.074mmol，室温搅拌24h，得到诊疗一体化药物。
9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，抗肿瘤药物为利尼伐尼、索拉菲尼、贝伐珠单抗或阿替珠单抗；肿瘤为人脐血管静脉细胞、***细胞或乳腺癌细胞。
10.一种如权利要求1所述的基于pH响应的多功能荧光链接体在构建用于示踪的药物探针方面的应用。
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