CN114315795B - 68Ga标记的靶向成纤维细胞激活蛋白的抑制剂类放射性探针及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种68Ga标记的靶向成纤维细胞激活蛋白的抑制剂类放射性探针及其制备方法，属于放射性药物化学技术领域；本发明的放射性探针的结构式如下：
Figure DDA0003382433330000011
本发明的放射性探针的标记时间为5分钟，放射化学产率大于99％，radio‑HPLC测定产物的放射化学纯度大于99％，产物表现出对成纤维细胞激活蛋白的高亲和力和高特异性，同时具有很高的体外细胞摄取值，是较有潜力的成纤维细胞激活蛋白PET显像剂。

Description

68Ga标记的靶向成纤维细胞激活蛋白的抑制剂类放射性探针及其制备方法
技术领域
本发明涉及68Ga标记的靶向成纤维细胞激活蛋白(Fibroblast activationprotein， FAP)的抑制剂类放射性探针([68Ga]Ga-HBED-CC-04-DiF-Monomer、 [68Ga]Ga-HBED-CC-04-DiF-Dimer)及其制备方法，属于放射性药物化学技术领域。
背景技术
肿瘤肿块由肿瘤细胞和肿瘤间质组成，在高度促***增生肿瘤如乳腺癌、结肠癌和胰腺癌中，肿瘤间质占肿瘤肿块的90％以上。癌相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblasts，CAFs)，也称为肿瘤相关成纤维细胞(tumour-associatedfibroblasts，TAFs)或激活成纤维细胞，是肿瘤间质的重要组成部分，参与了肿瘤的生长、迁移和发展。CAFs表达不同的标志物如成纤维细胞激活蛋白(fibroblast activationprotein，FAP)、α-平滑肌肌动蛋白(alpha-smooth muscle actin，α-SMA)和波形蛋白(vimentin)等。
由于α-SMA和vimentin在静息成纤维细胞、周细胞以及血管平滑肌细胞中都有表达，而FAP仅在激活成纤维细胞中呈高度特异性表达，在良性肿瘤或正常成人组织中不表达，因此，FAP是CAFs最具潜力的分子标志物。此外，FAP还是促进肿瘤细胞增殖和转移、重塑细胞外基质、诱导新生血管生成、介导免疫抑制、参与肿瘤细胞能量代谢等必不可少的因素。因此，FAP成为了肿瘤显像和治疗的潜在靶点，进一步深入研究FAP对恶性肿瘤的诊断、治疗和预后判断来说具有重大意义。
值得注意的是，激活成纤维细胞不仅存在于肿瘤中，也存在于伤口愈合和基质重塑疾病如慢性炎症、心肌梗死和肝、肺或肾纤维化中，因此，FAP不仅高表达于肿瘤间质CAFs中，也高表达于许多组织重塑过程中。所以，FAP表达不具有肿瘤特异性。但同时，FAP靶向放射性药物不仅可应用于肿瘤显像和治疗，还可应用于许多非肿瘤疾病如心肌梗死、慢性炎症疾病和肺、肝或肾纤维化的显像。
FAP是97kDa的II型跨膜蛋白，其以170kDa的二聚体(FAP-FAP)形式存在时才具有活性。FAP靶向抑制剂类放射性药物用于肿瘤显像和治疗已有大量研究报道，是近年来的研究热点。
Loktev等人于2018年报道了[68Ga]Ga-FAPI-02。[68Ga]Ga-FAPI-02无论在体外还是体内，都表现出高的FAP特异性和结合亲和力，并且能被高表达FAP的细胞快速摄取和内化。在乳腺癌转移患者、肺癌转移患者、胰腺癌转移患者体内， [68Ga]Ga-FAPI-02快速清除，主要通过肾脏排出，在正常组织摄取低，在原发肿瘤、***以及骨转移病灶中，都观察到放射性的大量积累，获得的图像对比度高。比较[68Ga]Ga-FAPI-02和[18F]FDG在局部晚期肺腺癌患者中的显像，发现 [68Ga]Ga-FAPI-02明显优于[18F]FDG：[68Ga]Ga-FAPI-02在转移灶的摄取较高，本底较低，病灶对比度较高，可见性较好；与[18F]FDG在高葡萄糖代谢组织如大脑中的强烈摄取不同，[68Ga]Ga-FAPI-02选择性靶向FAP高表达的组织。虽然 [68Ga]Ga-FAPI-02显示出初步的良好的肿瘤显像性质，但其快速的清除速度可能不能很好地反映如头颈癌、卵巢癌和肝癌等肿瘤的情况，另外，短的肿瘤滞留时间也不适宜应用于治疗，因此，需要开发更长肿瘤滞留时间的FAP靶向抑制剂类放射性药物。
基于此目的，Lindner等人同年报道了FAPI-04，并应用于68Ga和177Lu的标记。[68Ga]Ga-FAPI-04表现出了和[68Ga]Ga-FAPI-02类似的快速肾脏清除、低本底和高肿瘤摄取。研究者使用177Lu对FAPI-04进行标记，得到了[177Lu]Lu-FAPI-04， HT1080-FAP荷瘤小鼠生物分布实验结果显示，[177Lu]Lu-FAPI-04比 [177Lu]Lu-FAPI-02有更高的肿瘤摄取和更长的肿瘤滞留，且两者本底都很低，在24 小时后，[177Lu]Lu-FAPI-04的有效肿瘤摄取率比[177Lu]Lu-FAPI-02高出100％，提示 FAPI-04在治疗方面具有潜力。在一例患者中使用[90Y]Y-FAPI-04进行治疗，显示了患者疼痛的显著降低，24小时可观察到转移病灶和低本底，未观察到如血液毒性的副作用，但临床数据有限，仍需进行更多的临床试验来验证其可行性。
为了进一步增加肿瘤摄取和肿瘤滞留时间，Loktev等人于2019年报道了 FAPI-21和FAPI-46。HT1080-FAP荷瘤小鼠生物分布结果显示，[68Ga]Ga-FAPI-21 和[68Ga]Ga-FAPI-46肿瘤摄取高于[68Ga]Ga-FAPI-04，但[68Ga]Ga-FAPI-21的肝脏摄取和肌肉摄取高于[68Ga]Ga-FAPI-04；[68Ga]Ga-FAPI-46的肿瘤/血、肿瘤/肌肉和肿瘤/肝比值均高于[68Ga]Ga-FAPI-04和[68Ga]Ga-FAPI-21。[177Lu]Lu-FAPI-21和 [177Lu]Lu-FAPI-46在注射后1-4小时的肿瘤积累高于[177Lu]Lu-FAPI-04；注射后24 小时，肿瘤保留率[177Lu]Lu-FAPI-21>[177Lu]Lu-FAPI-04>[177Lu]Lu-FAPI-46；三个化合物的血液放射性水平相当，[177Lu]Lu-FAPI-46的肿瘤/肝、肿瘤/肾和肿瘤/脑比值得到提高。在粘液表皮样癌、口咽癌、卵巢癌和结直肠癌患者中静脉注射[68Ga]Ga-FAPI-21和[68Ga]Ga-FAPI-46，两者均在原发肿瘤和转移瘤中迅速积累，给药1小时后，SUVmax分别为11.9±3.33和12.76±0.90，正常组织放射性摄取低，放射性从血液中快速清除，主要通过肾脏***；但观察到[68Ga]Ga-FAPI-21在口腔黏膜、甲状腺、腮腺和颌下腺的摄取增加，提示FAPI-21可能不适合作为治疗药物。值得注意的是，肿瘤积聚高度依赖于肿瘤类型。Lindner等人发现，注射 [68Ga]Ga-FAPI-21或者[68Ga]Ga-FAPI-46后，3小时内，在结肠直肠癌、卵巢癌、口咽癌和胰腺癌中，肿瘤的放射性保持相对稳定，而在乳腺癌中，肿瘤的放射性则持续下降；另外，一例原发不明的肿瘤患者，在给药后1-3小时内，肿瘤摄取持续增加。
人体肿瘤形成复杂的异质性结构，表达FAP的CAFs的数量和分布以及每个细胞的FAP分子数量可能不同，从而导致放射性药物在不同肿瘤类型具有不同的药代动力学性质。在临床研究中，观察到[68Ga]Ga-FAPI-21或者[68Ga]Ga-FAPI-46在不同类型的肿瘤中的摄取差异：在结肠直肠癌、卵巢癌、口咽癌和胰腺癌中的摄取相对稳定，而在乳腺癌中的摄取持续下降。这可能是CAFs的异质性来源造成的。由于起源的差异，这些CAFs可能表现出不同的蛋白质组，具有很强的变异，甚至缺乏 FAP表达。因此，具有较长肿瘤滞留时间的放射性药物可能比快速清除的放射性药物能更好地反映肿瘤的真实情况。另外，较长肿瘤滞留时间和高肿瘤摄取的放射性药物也是临床对治疗药物的要求。目前，最为成功的FAP靶向抑制剂类显像药物是 FAPI-02、FAPI-04和FAPI-46，且其68Ga标记的药物在临床上应用最多，但这些药物仍有改善的空间以获得更长的肿瘤滞留时间。
因此，提供一种新型抑制剂类放射性探针，能够表现出对成纤维细胞激活蛋白的高亲和力和高特异性，具有较好的肿瘤摄取量和较长的肿瘤滞留时间，就成为该技术领域急需解决的技术难题。
发明内容
本发明的目的之一在于提供68Ga标记的靶向成纤维细胞激活蛋白(Fibroblastactivation protein，FAP)的抑制剂类放射性探针，该类放射性探针表现出对成纤维细胞激活蛋白的高亲和力和高特异性，具有较好的肿瘤摄取量和较长的肿瘤滞留时间，是较有潜力的FAP/PET显像剂。
本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：
68Ga标记的靶向成纤维细胞激活蛋白的抑制剂类放射性探针，其结构式如图6所示。
本发明的另一目的在于提供上述68Ga标记的靶向成纤维细胞激活蛋白的抑制剂类放射性探针的制备方法。
本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：
68Ga标记的靶向成纤维细胞激活蛋白的抑制剂类放射性探针的制备方法，其步骤如下：在碱和缩合剂的存在下，使双功能连接剂HBED-CC和成纤维细胞激活蛋白抑制剂进行缩合反应，利用酸脱去保护基团后，将所得产物溶解在二甲基亚砜中，加入[68Ga]GaCl3溶液，混合均匀，加热，得到上述结构式所示的68Ga标记的靶向成纤维细胞激活蛋白的抑制剂类放射性探针。
反应式如图7所示。
优选地，所述碱为N,N-二异丙基乙胺，加入量为3-5当量；所述缩合剂为1- 羟基苯并***和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺，加入量均为1当量；所述成纤维细胞激活蛋白抑制剂为(S)-N-(2-(2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-基)-2-乙氧基)-6-(3-(哌嗪-1-基)丙氧基)喹啉-4-甲酰胺，加入量为1-5当量；所述酸为三氟乙酸，加入量为3毫升。
优选地，68Ga标记的靶向成纤维细胞激活蛋白的抑制剂类放射性探针的制备方法的具体步骤如下：
步骤1：68Ga标记的靶向成纤维细胞激活蛋白的抑制剂类放射性探针的标记前体的合成
将(S)-N-(2-(2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-基)-2-乙氧基)-6-(3-(哌嗪-1-基)丙氧基)喹啉-4-甲酰胺溶于无水二甲基甲酰胺，向混合溶液中加入1-羟基苯并***、N,N-二异丙基乙胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺和3,3’-(((2,2,13,13-四甲基-4,11-二氧 -3,12-二氧杂-6,9-二氮四癸烷-6,9-二基)二(亚甲基))二(4-羟基-3,1-苯基))二丙酸，室温下反应，过夜后，向混合溶液中加入乙酸乙酯和饱和食盐水，洗涤，收集有机相滤液；有机相滤液用无水硫酸钠干燥，过滤，除去固体杂质；利用旋转蒸发仪减压，除去滤液中的溶剂，用二氯甲烷、甲醇和25％氨水混合液(4/1/0.1，v/v/v)过硅胶柱分离，收集组分，旋转蒸发仪和油泵减压，除去溶剂，得到褐黄色油状物，将得到的褐黄色油状物溶于三氟乙酸中，室温下搅拌，利用旋转蒸发仪和油泵减压，除去溶剂，用***重结晶，得到褐黄色固体；将得到的褐黄色固体溶于二甲基亚砜中，经Semi-HPLC纯化，得到褐黄色固体HBED-CC-04-DiF-Monomer；
步骤2：68Ga标记的靶向成纤维细胞激活蛋白的抑制剂类放射性探针的标记
将步骤1得到的HBED-CC-04-DiF-Monomer(标记前体)溶于二甲基亚砜，再加入醋酸钠溶液，得到标记前体醋酸钠溶液，用高纯盐酸溶液淋洗锗镓发生器(iThembalaboratories，740MBq，20mCi)，将所得[68Ga]GaCl3盐酸溶液加入标记前体醋酸钠溶液中，混合均匀，95℃反应，冷却至室温，用带放射性检测器(Flow-Count，Eckert&Ziegler)的高效液相色谱(radio-HPLC，Agilent 1260Infinity II system)在0.1％三氟乙酸水溶液(v/v)和0.1％三氟乙酸乙腈溶液(v/v)的流动相中测定其标记率，得放射化学产率大于99％的[68Ga]Ga-HBED-CC-04-DiF-Monomer。
优选地，步骤2中，带放射性检测器的高效液相色谱的测试条件为：第一流动相为0.1％三氟乙酸水溶液(v/v)，第二流动相为0.1％三氟乙酸乙腈溶液(v/v)，梯度洗脱条件为：0-10分钟，100％-35％的第一流动相；10-12分钟，35％-100％的第一流动相；12-15分钟，100％的第一流动相；流动相的流速为1毫升/分钟。
优选地，68Ga标记的靶向成纤维细胞激活蛋白的抑制剂类放射性探针的制备方法的具体步骤如下：
步骤1：68Ga标记的靶向成纤维细胞激活蛋白的抑制剂类放射性探针的标记前体的合成
将(S)-N-(2-(2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-基)-2-乙氧基)-6-(3-(哌嗪-1-基)丙氧基)喹啉-4-甲酰胺溶于无水二甲基甲酰胺，向混合溶液中加入1-羟基苯并***、N,N-二异丙基乙胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺和3,3’-(((2,2,13,13-四甲基-4,11-二氧 -3,12-二氧杂-6,9-二氮四癸烷-6,9-二基)二(亚甲基))二(4-羟基-3,1-苯基))二丙酸，室温下反应，过夜后，向混合溶液中加入乙酸乙酯和饱和食盐水洗涤，收集有机相滤液；有机相滤液用无水硫酸钠干燥，过滤，除去固体杂质；利用旋转蒸发仪减压除去滤液中的溶剂，用二氯甲烷、甲醇和25％氨水混合液(20/1/0.1，v/v/v)过硅胶柱分离，收集组分，旋转蒸发仪和油泵减压，除去溶剂，得到褐红色油状物，将得到的褐红色油状物溶于三氟乙酸中，室温下搅拌，利用旋转蒸发仪和油泵减压，除去溶剂，用***重结晶，得到褐红色固体；将得到的褐红色固体溶于二甲基亚砜中，经 Semi-HPLC纯化，得到褐红色固体HBED-CC-04-DiF-Dimer；
步骤2：68Ga标记的靶向成纤维细胞激活蛋白的抑制剂类放射性探针的标记
将HBED-CC-04-DiF-Dimer(标记前体)溶于二甲基亚砜，再加入醋酸钠溶液，得到标记前体醋酸钠溶液，用高纯盐酸溶液淋洗锗镓发生器(iThemba laboratories， 740MBq，20mCi)，将所得[68Ga]GaCl3盐酸溶液加入标记前体醋酸钠溶液中，混合均匀，95℃反应，冷却至室温，用带放射性检测器(Flow-Count，Eckert&Ziegler)的高效液相色谱(radio-HPLC，Agilent 1260Infinity II system)在0.1％三氟乙酸水溶液(v/v)和0.1％三氟乙酸乙腈溶液(v/v)的流动相中测定其标记率，得放射化学产率大于99％的[68Ga]Ga-HBED-CC-04-DiF-Dimer。
优选地，步骤2中，带放射性检测器的高效液相色谱的测试条件为：第一流动相为0.1％三氟乙酸水溶液(v/v)，第二流动相为0.1％三氟乙酸乙腈溶液(v/v)，梯度洗脱条件为：0-10分钟，100％-35％的第一流动相；10-12分钟，35％-100％的第一流动相；12-15分钟，100％的第一流动相；流动相的流速为1毫升/分钟。
有益效果：
本发明的68Ga标记的靶向成纤维细胞激活蛋白的抑制剂类放射性探针表现出对成纤维细胞激活蛋白的高亲和力和高特异性，具有较好的肿瘤摄取量和较长的肿瘤滞留时间，是较有潜力的FAP/PET显像剂。
下面通过附图和具体实施方式对本发明做进一步说明，但并不意味着对本发明保护范围的限制。
附图说明
图1为本发明实施例1中制备的[68Ga]Ga-HBED-CC-04-DiF-Monomer的标记反应液的放射性HPLC图谱。
图2为本发明实施例2中制备的[68Ga]Ga-HBED-CC-04-DiF-Dimer的标记反应液的放射性HPLC图谱。
图3为本发明应用实施例1中体外HT1080-FAP细胞摄取 [68Ga]Ga-HBED-CC-04-DiF-Monomer和[68Ga]Ga-HBED-CC-04-DiF-Dimer的摄取量- 时间曲线图。
图4为本发明应用实施例1中体外HT1080-FAP细胞摄取实验分析 [68Ga]Ga-HBED-CC-04-DiF-Monomer和[68Ga]Ga-HBED-CC-04-DiF-Dimer与成纤维细胞激活蛋白的特异性结合图。
图5为本发明应用实施例2中IC50值测定实验分析HBED-CC-04-DiF-Monomer 和HBED-CC-04-DiF-Dimer与成纤维细胞激活蛋白的结合亲和力图。
图6为本发明68Ga标记的靶向成纤维细胞激活蛋白的抑制剂类放射性探针的结构式。
图7为本发明68Ga标记的靶向成纤维细胞激活蛋白的抑制剂类放射性探针的反应式。
图8为本发明应用实施例1中步骤(1)中HBED-CC-04-DiF-Monomer的合成反应方程式。
图9为本发明应用实施例1中步骤(2)中[68Ga]Ga-HBED-CC-04-DiF-Monomer 的标记反应方程式。
图10为本发明应用实施例2中步骤(1)中HBED-CC-04-DiF-Dimer的合成反应方程式。
图11为本发明应用实施例2中步骤(2)中[68Ga]Ga-HBED-CC-04-DiF-Dimer 的标记反应方程式。
具体实施方式：
除非特别说明，以下实施例和对比实施例中所述的制备方法和检测方法中所用的试剂和原料均为市场上可购得的商品，所用设备均为常用设备。
除非特别说明，以下实施例和对比实施例中所述的浓度和比例均为重量单位。
实施例1([68Ga]Ga-HBED-CC-04-DiF-Monomer)
步骤1：68Ga标记的靶向成纤维细胞激活蛋白的抑制剂类放射性探针的标记前体的合成
HBED-CC-04-DiF-Monomer即(S)-3-(5-甲基-((3-羧甲基)(2-((3-羧甲基)(5-(3-(4-(4-(4-(2-(2-(2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-基)-2-氧乙基)氨甲酰基)喹啉-7- 基)-4-氧丙基)哌嗪-1-基)-3-氧丙基)-2-羟基苄基)氨基)乙基)氨基)-4-羟基苯基)丙酸的合成反应方程式如图8所示。
合成方法：
将(S)-N-(2-(2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-基)-2-乙氧基)-6-(3-(哌嗪-1-基)丙氧基)喹啉-4-甲酰胺(52毫克，0.1毫摩尔)溶于2毫升无水二甲基甲酰胺，向混合溶液中加入1-羟基苯并***(17毫克，0.1毫摩尔)、N,N-二异丙基乙胺(68毫克，0.5毫摩尔)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(25毫克，0.1毫摩尔)和3,3’-(((2,2,13,13- 四甲基-4,11-二氧-3,12-二氧杂-6,9-二氮四癸烷-6,9-二基)二(亚甲基))二(4-羟基-3,1- 苯基))二丙酸(57毫克，0.1毫摩尔)，室温下反应，过夜后，向混合溶液中加入30 毫升乙酸乙酯和10毫升饱和食盐水，洗涤两次，收集有机相滤液；有机相滤液用无水硫酸钠干燥，过滤，除去固体杂质；利用旋转蒸发仪除去滤液中的有机溶剂，用二氯甲烷/甲醇/25％氨水(4/1/0.1，v/v/v)过硅胶柱(精制型柱层层析硅胶，200-300 目)分离，收集组分，利用旋转蒸发仪和油泵除去组分中的有机溶剂，得到褐黄色油状物，将得到的褐黄色油状物溶于3毫升三氟乙酸中，室温下搅拌7小时，利用旋转蒸发仪和油泵除去溶剂，用***重结晶，得到褐黄色固体；将得到的褐黄色固体溶于二甲基亚砜中，经Semi-HPLC纯化(0.1％三氟乙酸水/乙腈＝7/3，v/v)，得到褐黄色固体HBED-CC-04-DiF-Monomer 16毫克(产率：20％)；
化合物HBED-CC-04-DiF-Monomer的确认：
1H NMR(600MHz,DMSO)δ8.91-8.85(m,1H),8.05(dd,J＝9.2,2.0Hz,1H), 7.89(s,1H),7.66-7.59(m,1H),7.55-7.51(m,1H),7.07(t,J＝7.7Hz,4H),6.80(d,J ＝8.2Hz,2H),5.11(d,J＝7.4Hz,1H),4.45-4.35(m,2H),4.34-4.16(m,8H),4.16- 3.96(m,10H),3.33-3.28(m,2H),3.23-3.21(m,4H),2.95-2.80(m,2H),2.69(t,J＝ 7.3Hz,4H),2.60(d,J＝8.3Hz,2H),2.26-2.17(m,2H).
HRMS(ESI)理论分子量C50H58F2N8O12[M+H]+1001.4221，实测分子量 1001.4239[M+H]+；
步骤2：68Ga标记的靶向成纤维细胞激活蛋白的抑制剂类放射性探针的标记
[68Ga]Ga-HBED-CC-04-DiF-Monomer的标记反应方程式如图9所示。
标记方法：
将8微克的标记前体HBED-CC-04-DiF-Monomer溶于80微升二甲基亚砜，加入135微升的浓度为3摩尔/升的醋酸钠缓冲液，得到标记前体醋酸钠缓冲液；用6 毫升高纯0.6摩尔/升盐酸溶液淋洗锗镓发生器((iThemba laboratories，740MBq， 20mCi)，得[68Ga]GaCl3的盐酸溶液，取其中0.3毫升，加入标记前体醋酸钠缓冲液中，混合均匀，95℃反应5分钟，冷却至室温，用带放射性检测器(Flow-Count， Eckert&Ziegler)的高效液相色谱(radio-HPLC，Agilent 1260Infinity II system)在 0.1％三氟乙酸水溶液(v/v)和0.1％三氟乙酸乙腈溶液(v/v)的流动相中测定其标记率，得放射化学产率为99.56％的[68Ga]Ga-HBED-CC-04-DiF-Monomer；
如图1所示，为本发明实施例1中制备的[68Ga]Ga-HBED-CC-04-DiF-Monomer 的标记反应液的放射性HPLC图谱，图谱显示，[68Ga]Ga-HBED-CC-04-DiF-Monomer 的放射化学纯度大于99％；
上述步骤中所述radio-HPLC测定中，第一流动相为0.1％三氟乙酸水溶液(v/v)，第二流动相为0.1％三氟乙酸乙腈溶液(v/v)，梯度洗脱条件为：0-10分钟，100％-35％的第一流动相；10-12分钟，35％-100％的第一流动相；12-15分钟，100％的第一流动相；流动相的流速为1毫升/分钟。
实施例2([68Ga]Ga-HBED-CC-04-DiF-Dimer)
步骤1：68Ga标记的靶向成纤维细胞激活蛋白的抑制剂类放射性探针的标记前体的合成
HBED-CC-04-DiF-Dimer即2,2’-(乙烷-1,2-二基双(5-(3-(4-(4-(4-(2-(2-((S)-2-氰基 -4,4-二氟吡咯烷-1-基)-2-氧乙基)氨甲酰基)喹啉-7-基)-4-氧丙基)哌嗪-1-基)-3-氧丙基)-2-羟基苄基))氮杂环二乙酸的合成反应方程式如图10所示。
合成方法：
将(S)-N-(2-(2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-基)-2-乙氧基)-6-(3-(哌嗪-1-基)丙氧基)喹啉-4-甲酰胺(100毫克，0.2毫摩尔)溶于2毫升无水二甲基甲酰胺，向混合溶液中加入1-羟基苯并***(23毫克，0.2毫摩尔)、N,N-二异丙基乙胺(84毫克，0.6毫摩尔)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(32毫克，0.2毫摩尔)和3,3’-(((2,2,13,13- 四甲基-4,11-二氧-3,12-二氧杂-6,9-二氮四癸烷-6,9-二基)二(亚甲基))二(4-羟基-3,1- 苯基))二丙酸(23毫克，0.04毫摩尔)，室温下反应过夜后，向混合溶液中加入30 毫升乙酸乙酯和10毫升饱和食盐水，洗涤两次，收集有机相滤液；有机相滤液用无水硫酸钠干燥，过滤，除去固体杂质；利用旋转蒸发仪减压除去滤液中的溶剂，用二氯甲烷/甲醇/25％氨水(20/1/0.1，v/v/v)过硅胶柱(精制型柱层层析硅胶，200-300 目)分离，收集组分，利用旋转蒸发仪和油泵除去组分中的有机溶剂，得到褐红色油状物，将得到的褐红色油状物溶于3毫升三氟乙酸中，室温下搅拌7小时，利用旋转蒸发仪和油泵除去溶剂，用***重结晶，得到褐红色固体；将得到的褐红色固体溶于二甲基亚砜中，经Semi-HPLC纯化(0.1％三氟乙酸水/乙腈＝7/3，v/v)得到褐红色固体HBED-CC-04-DiF-Monomer 20毫克(产率：40％)；
化合物HBED-CC-04-DiF-Dimer的确认：
1H NMR(600MHz,DMSO)δ8.84(d,J＝4.3Hz,2H),8.03(d,J＝9.2Hz,2H), 7.88(d,J＝2.2Hz,2H),7.56(d,J＝4.2Hz,2H),7.48(dd,J＝9.2,1.5Hz,2H),7.13- 7.06(m,4H),6.80(d,J＝8.0Hz,2H),5.13(dd,J＝9.2,2.3Hz,2H),4.28-4.18(m, 12H),4.02-3.99(m,4H),3.66-3.63(m,8H),3.34-3.31(m,10H),3.21-3.19(m,6H), 2.98-2.76(m,6H),2.72-2.69(m,4H),2.62-2.59(m,4H),2.25-2.20(m,4H).
HRMS(ESI)理论分子量C74H84F4N14O14[M+H]+1469.6306，实测分子量1469.6306[M+H]+；
步骤2：68Ga标记的靶向成纤维细胞激活蛋白的抑制剂类放射性探针的标记
[68Ga]Ga-HBED-CC-04-DiF-Dimer的标记反应方程式如图11所示。
标记方法：
将12微克的标记前体HBED-CC-04-DiF-Dimer溶于120微升二甲基亚砜，加入135微升3摩尔/升醋酸钠缓冲液，得到前体溶液；用6毫升高纯0.6摩尔/升盐酸溶液淋洗锗镓发生器(iThemba laboratories，740MBq，20mCi)，将所得[68Ga]GaCl3的盐酸溶液取其中0.3毫升加入前体溶液中，混合均匀，95℃反应5分钟，冷却至室温，用带放射性检测器(Flow-Count，Eckert&Ziegler)的高效液相色谱(radio-HPLC，Agilent 1260Infinity II system)在0.1％三氟乙酸水溶液(v/v)和0.1％三氟乙酸乙腈溶液(v/v)的流动相中测定其标记率，得放射化学产率为99.89％的 [68Ga]Ga-HBED-CC-04-DiF-Dimer；
如图2所示，为本发明实施例2中制备的[68Ga]Ga-HBED-CC-04-DiF-Dimer的标记反应液的放射性HPLC图谱，图谱显示，[68Ga]Ga-HBED-CC-04-DiF-Dimer的放射化学纯度大于99％；
上述步骤中所述radio-HPLC测定中，第一流动相为0.1％三氟乙酸水溶液(v/v)，第二流动相为0.1％三氟乙酸乙腈溶液(v/v)，梯度洗脱条件为：0-10分钟，100％-35％的第一流动相；10-12分钟，35％-100％的第一流动相；12-15分钟，100％的第一流动相；流动相的流速为1毫升/分钟。
应用实施例1
[68Ga]Ga-HBED-CC-04-DiF-Monomer和[68Ga]Ga-HBED-CC-04-DiF-Dimer的体外细胞摄取
(1)将HT1080-FAP(FAP阳性)细胞(～5×105/孔)接种在6孔板中，于培养箱中培养60小时，细胞覆盖率为90-100％；60小时后，吸走培养液，用磷酸缓冲盐溶液清洗细胞两次，向孔板中加12μCi的[68Ga]Ga-HBED-CC-04-DiF-Monomer或 [68Ga]Ga-HBED-CC-04-DiF-Dimer或[68Ga]Ga-FAPI-04，在37℃孵育10、30、60、 90和120分钟，使用10μM UAMC-1110(FAP抑制剂)在60分钟时阻断细胞摄取，孵育结束后，吸出溶液，用磷酸缓冲盐溶液快速洗细胞三次，终止细胞摄取；用氢氧化钠裂解全部细胞，收集裂解液进行放射性计数；
(2)由体外细胞摄取实验结果可知：[68Ga]Ga-HBED-CC-04-DiF-Monomer和[68Ga]Ga-HBED-CC-04-DiF-Dimer在体外HT1080-FAP(FAP阳性)细胞中的摄取很高，随着时间增加而增加，10分钟的摄取均高于[68Ga]Ga-FAPI-04的最高摄取，120 分钟的摄取(>60％)均显著高于[68Ga]Ga-FAPI-04；加入成纤维细胞激活蛋白抑制剂UAMC-1110后，两者的摄取均被阻断，说明[68Ga]Ga-HBED-CC-04-DiF-Monomer 和[68Ga]Ga-HBED-CC-04-DiF-Dimer特异性结合成纤维细胞激活蛋白。
如图3所示，为本发明应用实施例1中体外HT1080-FAP细胞摄取 [68Ga]Ga-HBED-CC-04-DiF-Monomer和[68Ga]Ga-HBED-CC-04-DiF-Dimer的摄取量- 时间曲线图，n＝3。
如图4所示，为本发明应用实施例1中体外HT1080-FAP细胞摄取实验分析 [68Ga]Ga-HBED-CC-04-DiF-Monomer和[68Ga]Ga-HBED-CC-04-DiF-Dimer与成纤维细胞激活蛋白的特异性结合图，n＝3，未加入UAMC1110组和加入UAMC1110组细胞摄取的显著性差异显示：[68Ga]Ga-HBED-CC-04-DiF-Monomer和 [68Ga]Ga-HBED-CC-04-DiF-Dimer与成纤维细胞激活蛋白特异性结合。
应用实施例2
HBED-CC-04-DiF-Monomer和HBED-CC-04-DiF-Dimer的IC50值测定
(1)将HT1080-FAP(FAP阳性)细胞(～5×105/孔)接种在6孔板中，于培养箱中培养60小时，细胞覆盖率为90-100％，60小时后，吸走培养液，用磷酸缓冲盐溶液清洗细胞两次，向孔板中加12μCi的[68Ga]Ga-FAPI-04和 HBED-CC-04-DiF-Monomer或HBED-CC-04-DiF-Dimer或FAPI-04，使 HBED-CC-04-DiF-Monomer或HBED-CC-04-DiF-Dimer或FAPI-04的最终的浓度分别为10-9.5、10-9、10-8.5、10-8、10-7和10-6摩尔/升，在37℃孵育60分钟后，吸出溶液，用磷酸缓冲盐溶液快速洗细胞三次，终止细胞摄取，用氢氧化钠裂解全部细胞，收集裂解液进行放射性计数；
如图5所示，为本发明应用实施例2中IC50值测定实验分析 HBED-CC-04-DiF-Monomer和HBED-CC-04-DiF-Dimer与成纤维细胞激活蛋白的结合亲和力图，n＝3，nM级别的IC50值显示：HBED-CC-04-DiF-Monomer和 HBED-CC-04-DiF-Dimer对成纤维细胞激活蛋白的结合亲和力高；
(2)由IC50值测定实验结果可知：HBED-CC-04-DiF-Monomer和 HBED-CC-04-DiF-Dimer对成纤维细胞激活蛋白的结合亲和力高，IC50值分别为 5.06±1.09nM和5.10±1.41nM，和FAPI-04(5.16±0.75nM)基本一致。
本发明的68Ga标记的靶向成纤维细胞激活蛋白的抑制剂类放射性探针，具备优良的68Ga标记性质，得益于N,N’-双[2-羟基-5-(羧乙基)-苄基]乙二胺-N,N’-二乙酸(HBED-CC)这一优良的Ga3+双功能连接剂，HBED-CC与Ga3+的热力学稳定常数高(logKML：38.5)，配位所需能量低，因此，[68Ga]Ga-HBED-CC的标记快速高效。对比[68Ga]Ga-FAPI-04需要在100℃条件下加热20分钟制备放射化学纯度大于90％的产物，本发明的68Ga标记的靶向成纤维细胞激活蛋白的抑制剂类放射性探针可在 95℃条件下加热5分钟快速制备，产物的放射化学产率和放射化学纯度高(均>99％)、稳定性高。
本发明的68Ga标记的靶向成纤维细胞激活蛋白的抑制剂类放射性探针含有(S)-N-(2-(2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-基)-2-乙氧基)-6-(3-(哌嗪-1-基)丙氧基)喹啉-4-甲酰胺基团，该基团具有良好的成纤维细胞激活蛋白亲和性；另外，HBED-CC的引入可能增加肿瘤摄取量。我们预期[68Ga]Ga-HBED-CC-04-DiF-Monomer和 [68Ga]Ga-HBED-CC-04-DiF-Dimer对表达成纤维细胞激活蛋白的肿瘤亲和性好、肿瘤摄取值高和肿瘤滞留时间长。因此，本发明的68Ga标记的靶向成纤维细胞激活蛋白的抑制剂类放射性探针可作为肿瘤正电子分子探针，用于肿瘤显像。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。

Claims (6)

1.68Ga标记的靶向成纤维细胞激活蛋白的抑制剂类放射性探针，分别是：[68Ga]Ga-HBED-CC-04-DiF-Monomer或[68Ga]Ga-HBED-CC-04-DiF-Dimer，其结构式分别如下：
Figure FDA0003382433300000011
2.68Ga标记的靶向成纤维细胞激活蛋白的抑制剂类放射性探针的制备方法，其步骤如下：在碱和缩合剂的存在下，使双功能连接剂HBED-CC和成纤维细胞激活蛋白抑制剂进行缩合反应，利用酸脱去保护基团后，将所得产物溶解在二甲基亚砜中，加入[68Ga]GaCl3溶液，混合均匀，加热，得到68Ga标记的靶向成纤维细胞激活蛋白的抑制剂类放射性探针。
3.根据权利要求2所述的靶向成纤维细胞激活蛋白的抑制剂类放射性探针的制备方法，其特征在于：所述碱为N,N-二异丙基乙胺，加入量为3-5当量；所述缩合剂为1-羟基苯并***和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺，加入量均为1当量；所述成纤维细胞激活蛋白抑制剂为(S)-N-(2-(2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-基)-2-乙氧基)-6-(3-(哌嗪-1-基)丙氧基)喹啉-4-甲酰胺，加入量为1-5当量；所述酸为三氟乙酸，加入量为3毫升。
4.根据权利要求2所述的靶向成纤维细胞激活蛋白的抑制剂类放射性探针的制备方法，其特征在于：具体步骤如下：
步骤1：靶向成纤维细胞激活蛋白的抑制剂类放射性探针的标记前体的合成
将(S)-N-(2-(2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-基)-2-乙氧基)-6-(3-(哌嗪-1-基)丙氧基)喹啉-4-甲酰胺溶于无水二甲基甲酰胺，向混合溶液中加入1-羟基苯并***、N,N-二异丙基乙胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺和3,3’-(((2,2,13,13-四甲基-4,11-二氧-3,12-二氧杂-6,9-二氮四癸烷-6,9-二基)二(亚甲基))二(4-羟基-3,1-苯基))二丙酸，室温下反应，过夜后，向混合溶液中加入乙酸乙酯和饱和食盐水洗涤，收集有机相滤液；有机相滤液用无水硫酸钠干燥，过滤，除去固体杂质；利用旋转蒸发仪减压除去滤液中的溶剂，用二氯甲烷、甲醇和25％氨水混合液(4:1:0.1，v/v/v)过硅胶柱分离，收集组分，利用旋转蒸发仪和油泵除去组分中的有机溶剂，得到褐黄色油状物，将得到的褐黄色油状物溶于三氟乙酸中，室温下搅拌，利用旋转蒸发仪和油泵除去溶剂，用***重结晶，得到褐黄色固体；将得到的褐黄色固体溶于二甲基亚砜中，经Semi-HPLC纯化得到褐黄色固体HBED-CC-04-DiF-Monomer；
步骤2：靶向成纤维细胞激活蛋白的抑制剂类放射性探针的标记
将步骤1得到的HBED-CC-04-DiF-Monomer溶于二甲基亚砜，再加入醋酸钠溶液，得到标记前体醋酸钠溶液，用高纯盐酸溶液淋洗锗镓发生器，将所得[68Ga]GaCl3盐酸溶液加入标记前体醋酸钠溶液中，混合均匀，95℃反应，冷却至室温，用带放射性检测器的高效液相色谱(radio-HPLC)测定其标记率，得放射化学产率大于99％的[68Ga]Ga-HBED-CC-04-DiF-Monomer。
5.根据权利要求2所述的靶向成纤维细胞激活蛋白的抑制剂类放射性探针的制备方法，其特征在于：具体步骤如下：
步骤1：靶向成纤维细胞激活蛋白的抑制剂类放射性探针的标记前体的合成
将(S)-N-(2-(2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-基)-2-乙氧基)-6-(3-(哌嗪-1-基)丙氧基)喹啉-4-甲酰胺溶于无水二甲基甲酰胺，向混合溶液中加入1-羟基苯并***、N,N-二异丙基乙胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺和3,3’-(((2,2,13,13-四甲基-4,11-二氧-3,12-二氧杂-6,9-二氮四癸烷-6,9-二基)二(亚甲基))二(4-羟基-3,1-苯基))二丙酸，室温下反应，过夜后，向混合溶液中加入乙酸乙酯和饱和食盐水洗涤，收集有机相滤液；有机相滤液用无水硫酸钠干燥，过滤，除去固体杂质；利用旋转蒸发仪减压除去滤液中的溶剂，用二氯甲烷、甲醇和25％氨水混合液(20:1:0.1，v/v/v)过硅胶柱分离，混合液的体积比为20:1:0.1，收集组分，利用旋转蒸发仪和油泵除去组分中的有机溶剂，得到褐红色油状物，将得到的褐红色油状物溶于三氟乙酸中，室温下搅拌，利用旋转蒸发仪和油泵除去溶剂，用***重结晶，得到褐红色固体；将得到的褐红色固体溶于二甲基亚砜中，经Semi-HPLC纯化得到褐红色固体HBED-CC-04-DiF-Dimer；
步骤2：靶向成纤维细胞激活蛋白的抑制剂类放射性探针的标记
将步骤2得到的HBED-CC-04-DiF-Dimer溶于二甲基亚砜，再加入醋酸钠溶液，得到标记前体醋酸钠溶液，用高纯盐酸溶液淋洗锗镓发生器，将所得[68Ga]GaCl3盐酸溶液加入标记前体醋酸钠溶液中，混合均匀，95℃反应，冷却至室温，用带放射性检测器的高效液相色谱测定其标记率，得放射化学产率大于99％的[68Ga]Ga-HBED-CC-04-DiF-Dimer。
6.根据权利要求4或5所述的靶向成纤维细胞激活蛋白的抑制剂类放射性探针的制备方法，其特征在于：步骤2中，带放射性检测器的高效液相色谱的测试条件为：第一流动相为0.1％三氟乙酸水溶液，第二流动相为0.1％三氟乙酸乙腈溶液，梯度洗脱条件为：0-10分钟，100％-35％的第一流动相；10-12分钟，35％-100％的第一流动相；12-15分钟，100％的第一流动相；流动相的流速为1毫升/分钟。
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