CN113493810A - 一种超富硒盐生杜氏藻制品及其制备方法和应用 - Google Patents

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CN113493810A CN202110773649.7A CN202110773649A CN113493810A CN 113493810 A CN113493810 A CN 113493810A CN 202110773649 A CN202110773649 A CN 202110773649A CN 113493810 A CN113493810 A CN 113493810A
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Abstract

本发明公开了一种超富硒盐生杜氏藻制品及其制备方法和应用，其中，一种超富硒盐生杜氏藻粉的制备方法，包括培育：将盐生杜氏藻在培养基中培养；无机硒的添加：在培养基中加入无机硒；成品获取：在无机硒加入后继续培养至少3天，收集并干燥即可。本发明可以采用盐生杜氏藻将无机硒转化为有机硒，制备过程简单易行；并且可以使盐生杜氏藻中有机硒的含量达到1000mg/kg以上，其中有机硒含量为总硒含量的80‑99％，达到超富硒的标准；同时，制备得到的超富硒盐生杜氏藻制品可在常温状态下加入到食品、保健品和药品中，通过人体和动物的消化***吸收利用。

Description

一种超富硒盐生杜氏藻制品及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及微藻领域，具体涉及一种超富硒盐生杜氏藻制品及其制备方法和应用。
背景技术
硒在生物体内主要以有机硒的形态存在，并通过硒酶发挥其作用。包括微藻和细菌在内的一些低等生物以及哺乳动物、鸟类和鱼类，硒是其必需微量营养素，硒代半胱氨酸(SeCys)为活性基团是硒蛋白活性位点部分。硒是30余种人体硒酶的组成部分，这些酶参与包括甲状腺激素代谢、免疫防御***、抗氧化防御与繁殖机能等在内的许多重要代谢途径，参与抗癌、保护生物膜、防衰老、清除自由基、增进免疫等重要的生物学功能。世界卫生组织推荐成人每日的硒需求约为40μg，通常人们通过一些药物或者富硒食品补硒，然而大部分的药物都是无机硒，较难吸收，且毒性比食品中有机硒更高。
现有技术中，绿色微藻会优先将***盐和硒酸盐中的硒元素结合到硒蛋白和含硒氨基酸上，特别是硒代蛋氨酸SeMet和硒代半胱氨酸SeCys。目前利用微藻进行富硒的藻株包括莱茵衣藻、雨生红球藻、小球藻、四尾栅藻等，这些藻的富集量在140～500mg/kg干重，但远未达到超富硒植物1000～15000mg/kg的含硒临界标准。
盐生杜氏藻属于绿藻门(Chlorophyta)、绿藻纲(Chlorophyceae)、团藻目(Volvocales)、盐藻科(Dunaliellaceae)、盐藻属(Dunaliella)，可以在0.05～5.5mol/L的氯化钠(NaCl)环境中生长，细胞内能积累丰富的甘油。此外，盐生杜氏藻富含类胡萝卜素，普通野生型的含量通常为3～5％，而通过选育，并优化培养条件后可达10％，在已知生物中含量最高。现有技术中并没有公开盐生杜氏藻可以用于将***盐和硒酸盐中的硒元素结合到硒蛋白和含硒氨基酸上形成有机硒的记载。
发明内容
因此，本发明的目的是提供一种超富硒盐生杜氏藻制品及其制备方法和应用，可以采用盐生杜氏藻将无机硒转化为有机硒，可以使盐生杜氏藻中有机硒的含量达到1000mg/kg以上，其中有机硒含量为总硒含量的80～99％，达到超富硒的标准；并且，制备得到的超富硒盐生杜氏藻制品可在常温状态下加入到食品、保健品和药品中，通过人体和动物的消化***吸收利用。
一种盐生杜氏藻在利用无机硒转化为有机硒中的应用。
一种超富硒盐生杜氏藻粉的制备方法，包括：
培育：将盐生杜氏藻在培养基中培养；
无机硒的添加：在培养基中加入无机硒；该无机硒的加入即可以是接种盐生杜氏藻之前，也可以是在盐生杜氏藻培育过程中；
成品获取：在无机硒加入后继续培养至少3天，收集并干燥即可。
盐生杜氏藻在培养基中培育至少6天后再在培养基中添加无机硒。
所述盐生杜氏藻在培养基中的总培养时间为9～15天。
在无机硒添加之前，盐生杜氏藻在培养基中培育的时间为9天；盐生杜氏藻在培养基中的总培养时间为15天。
所述无机硒为***盐或/和硒酸盐，优选为***钠；
盐生杜氏藻的接种量为5～10×105cell/mL；所述培养基中***钠的终浓度为8～64mg/L。
所述培养基中***钠的终浓度为8～16mg/L。
所述培养基组成为：
H3BO3：9.28mg/L，CoCl2·6H2O：0.05mg/L，ZnCl2：0.11mg/L，MnCl2·4H2O：1.98mg/L，Na2MoO4：0.49mg/L，NaVO3：0.24mg/L，CuCl2·6H2O：0.05mg/L，MgSO4·7H2O：1.23g/L，KCl：0.2g/L，CaCl2·2H2O：0.044g/L，KNO3：0.2～0.8g/L，KH2PO：0.014g/L，FeCl3·6H2O：0.0005g/L，Na2EDTA：0.074g/L，NaHCO3：2～4g/L，NaCl：58.44～116.88g/L。
一种盐生杜氏藻制品，包括上述制备方法制备得到的超富硒盐生杜氏藻粉。
一种盐生杜氏藻制品在食品、保健品或药品中的应用。
本发明技术方案，具有如下优点：
1.本发明提供了一种盐生杜氏藻在利用无机硒转化为有机硒中的应用，可以采用盐生杜氏藻将无机硒转化为有机硒，且该盐生杜氏藻中还能积累β-胡萝卜素。
2.本发明提供了一种超富硒盐生杜氏藻粉的制备方法，其利用盐生杜氏藻高效富硒生产超富硒盐生杜氏藻制品，可以使盐生杜氏藻中总硒化物的含量达到10～15000mg/kg，其中有机硒含量在80～99％；同时通过培育条件的优化可以使有机硒含量达到1000mg/kg以上，满足超富硒的临界标准，并且制备过程简单易行。
3.本发明提供了一种盐生杜氏藻制品，该制品中包括有同时包含有机硒和β-胡萝卜素的超富硒盐生杜氏藻粉；由于有机硒与β-胡萝卜素有协同作用，使盐生杜氏藻具有超强的抗氧化性，因此，通过盐生杜氏藻作为载体可保护两者；因此，本发明中的一种盐生杜氏藻制品可在常温状态下加入到其他产品中，通过人体和动物的消化***吸收利用。
4.本发明提供了一种盐生杜氏藻制品在食品、保健品或药品中的应用；该盐生杜氏藻制品中同时包含有β-胡萝卜和有机硒，该β-胡萝卜素顺式异构体尚未能化学合成，而这种顺式异构体已被证明在抗心血管疾病、抗氧化方面的作用强于反式异构体；有机硒和盐生杜氏藻中的β-胡萝卜素是许多食品、保健品和药品中的有效成分，因此，该利用盐生杜氏藻高效富硒生产超富硒盐生杜氏藻制品在食品、保健品和药品制备中有重要的应用价值，其可以有效应用在食品、保健品或药品中。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例1中盐生杜氏藻的生长曲线图；
图2是本发明实施例2中盐生杜氏藻的生长曲线图；
图3是本发明实施例3中盐生杜氏藻的生长曲线图；
图4是本发明实施例1中盐生杜氏藻的最大光合作用效率曲线图；
图5是本发明实施例1中盐生杜氏藻的实际光合作用效率曲线图；
图6是本发明实施例2中盐生杜氏藻的最大光合作用效率曲线图；
图7是本发明实施例2中盐生杜氏藻的实际光合作用效率曲线图；
图8是本发明实施例3中盐生杜氏藻的最大光合作用效率曲线图；
图9是本发明实施例3中盐生杜氏藻的实际光合作用效率曲线图；
图10是本发明实施例1中盐生杜氏藻内总硒的富集量柱状图；
图11是本发明实施例2中盐生杜氏藻内总硒的富集量柱状图；
图12是本发明实施例3中盐生杜氏藻内有机硒及总硒的富集量柱状图。
具体实施方式
在本发明中以下实施例中采用的盐生杜氏藻均为购买自中科院水生所的对无机硒耐受性较强且硒蛋白和类胡萝卜素含量高、生长快速的盐生杜氏藻FCHB-435。
实施例1
一种超富硒盐生杜氏藻粉的制备方法，包括：
a)将盐生杜氏藻在培养基中培养，培养温度为25±0.5℃，光强50μmol·m-2s-1，接种量为5×105cell/mL；盐生杜氏藻的生长分为接种阶段、营养生长阶段、硒转化阶段。
所述的培养基组成如下：H3BO3：9.28mg/L，CoCl2·6H2O：0.05mg/L，ZnCl2：0.11mg/L，MnCl2·4H2O：1.98mg/L，Na2MoO4：0.49mg/L，NaVO3：0.24mg/L，CuCl2·6H2O：0.05mg/L，MgSO4·7H2O：1.23g/L，KCl：0.2g/L，CaCl2·2H2O：0.044g/L，KNO3：0.5g/L，KH2PO：0.014g/L，FeCl3·6H2O：0.0005g/L，Na2EDTA：0.074g/L，NaHCO3：2.1g/L，NaCl：87.7g/L。所述培养基在加入NaHCO3前pH为7.5。
所述的每个培养基的体积设置为150mL，该培养基中可以添加***钠使整个体系中***钠的浓度控制在0.01-8mg/L，亦可不添加***钠。本实施例中不添加***钠。
b)选取4个培养基，于培养的第一天向4个培养基添加***钠，使培养体系中***钠的终浓度分别为8mg/L、16mg/L、32mg/L和64mg/L；该终浓度是指培养体系中未转化的***钠的浓度。
c)总共培养21天，每天上午下午各摇一次。
d)收集培养后的超富硒盐生杜氏藻，冷冻干燥后即得超富硒盐生杜氏藻粉。
实施例2
一种超富硒盐生杜氏藻粉的制备方法，包括：
a)将盐生杜氏藻在培养基中培养，培养温度为25±0.5℃，光强50μmol·m-2s-1，接种量为5×105cell/mL；盐生杜氏藻的生长分为接种阶段、营养生长阶段、硒转化阶段。
所述的培养基组成如下：H3BO3：9.28mg/L，CoCl2·6H2O：0.05mg/L，ZnCl2：0.11mg/L，MnCl2·4H2O：1.98mg/L，Na2MoO4：0.49mg/L，NaVO3：0.24mg/L，CuCl2·6H2O：0.05mg/L，MgSO4·7H2O：1.23g/L，KCl：0.2g/L，CaCl2·2H2O：0.044g/L，KNO3：0.5g/L，KH2PO：0.014g/L，FeCl3·6H2O：0.0005g/L，Na2EDTA：0.074g/L，NaHCO3：2.1g/L，NaCl：87.7g/L。所述培养基在加入NaHCO3前pH为7.5。
所述的每个培养基的体积设置为150mL，该培养基中可以添加***钠使整个体系中***钠的浓度控制在0.01～8mg/L，亦可不添加***钠。本实施例中不添加***钠。
b)选取4个培养基，分三次加硒，分别于培养的第3、6、9天向4个培养基添加***钠，使培养体系中***钠的终浓度分别为8mg/L、16mg/L、32mg/L和64mg/L；该终浓度是指培养体系中未转化的***钠的浓度。
c)总共培养21天，每天上午下午各摇一次。
d)收集培养后的超富硒盐生杜氏藻，冷冻干燥后即得超富硒盐生杜氏藻粉。
实施例3
一种超富硒盐生杜氏藻粉的制备方法，包括：
a)将盐生杜氏藻在培养基中培养，培养温度为25±0.5℃，光强50μmol·m-2s-1，接种量为5×105cell/mL；盐生杜氏藻的生长分为接种阶段、营养生长阶段、硒转化阶段。
所述的培养基组成如下：H3BO3：9.28mg/L，CoCl2·6H2O：0.05mg/L，ZnCl2：0.11mg/L，MnCl2·4H2O：1.98mg/L，Na2MoO4：0.49mg/L，NaVO3：0.24mg/L，CuCl2·6H2O：0.05mg/L，MgSO4·7H2O：1.23g/L，KCl：0.2g/L，CaCl2·2H2O：0.044g/L，KNO3：0.5g/L，KH2PO：0.014g/L，FeCl3·6H2O：0.0005g/L，Na2EDTA：0.074g/L，NaHCO3：2.1g/L，NaCl：87.7g/L。所述培养基在加入NaHCO3前pH为7.5。
所述的每个培养基的体积设置为150mL，该培养基中可以添加***钠使整个体系中***钠的浓度控制在0.01～8mg/L，亦可不添加***钠。本实施例中不添加***钠。
b)选取4个培养基，于对数期(第9天)加硒，即分别在对数期向4个培养基添加***钠，使培养体系中***钠的终浓度分别为8mg/L、16mg/L、32mg/L和64mg/L；该终浓度是指培养体系中未转化的***钠的浓度。
c)总共培养21天，每天上午下午各摇一次。
d)收集培养后的超富硒盐生杜氏藻，冷冻干燥后即得超富硒盐生杜氏藻粉。
实施例4
一种超富硒盐生杜氏藻粉的制备方法，包括：
a)将盐生杜氏藻在培养基中培养，培养温度为25±0.5℃，光强40μmol·m-2s-1，接种量为5×105cell/mL。
所述的培养基组成如下：H3BO3：9.28mg/L，CoCl2·6H2O：0.05mg/L，ZnCl2：0.11mg/L，MnCl2·4H2O：1.98mg/L，Na2MoO4：0.49mg/L，NaVO3：0.24mg/L，CuCl2·6H2O：0.05mg/L，MgSO4·7H2O：1.23g/L，KCl：0.2g/L，CaCl2·2H2O：0.044g/L，KNO3：0.8g/L，KH2PO：0.014g/L，FeCl3·6H2O：0.0005g/L，Na2EDTA：0.074g/L，NaHCO3：3.1g/L，NaCl：60.7g/L。所述培养基在加入NaHCO3前pH为7.0。
培养基的体积设置为150mL。
b)于对数期(第9天)加硒，使培养体系中***钠的终浓度为16mg/L。
c)总共培养21天，每天上午下午各摇一次。
d)收集培养后的超富硒盐生杜氏藻，冷冻干燥后即得超富硒盐生杜氏藻粉。
实施例5
一种超富硒盐生杜氏藻粉的制备方法，包括：
a)将盐生杜氏藻在培养基中培养，培养温度为25±0.5℃，光强60μmol·m-2s-1，接种量为10×105cell/mL。
所述的培养基组成如下：H3BO3：9.28mg/L，CoCl2·6H2O：0.05mg/L，ZnCl2：0.11mg/L，MnCl2·4H2O：1.98mg/L，Na2MoO4：0.49mg/L，NaVO3：0.24mg/L，CuCl2·6H2O：0.05mg/L，MgSO4·7H2O：1.23g/L，KCl：0.2g/L，CaCl2·2H2O：0.044g/L，KNO3：0.2g/L，KH2PO：0.014g/L，FeCl3·6H2O：0.0005g/L，Na2EDTA：0.074g/L，NaHCO3：3.8g/L，NaCl：110.7g/L。所述培养基在加入NaHCO3前pH为8.0。
培养基的体积设置为150mL。
b)于对数期(第9天)加硒，使培养体系中***钠的终浓度为16mg/L。
c)总共培养21天，每天上午下午各摇一次。
d)收集培养后的超富硒盐生杜氏藻，冷冻干燥后即得超富硒盐生杜氏藻粉。
实施例6
一种盐生杜氏藻制品在食品中应用，包括：采用上述实施例中制备得到超富硒盐生杜氏藻粉，根据食品制作的需求进行破碎，将破碎后的粉末加入到面包、面条，或者奶粉、咖啡中，混合均匀，按照常规方法制备即可得到富硒食品。
实施例7
一种盐生杜氏藻制品在保健品中应用，包括：采用上述实施例中制备得到超富硒盐生杜氏藻粉，根据保健品制作的需求进行纳米粉碎，将粉碎后的粉末加入到纤维素等片剂辅料中，例如：采用藻粉：辅料＝1:3的比例制成片剂或者胶囊，进而得到高硒蛋白盐生杜氏藻的保健品。
实施例8
一种盐生杜氏藻制品在药品中应用，包括：采用上述实施例中制备得到超富硒盐生杜氏藻粉，利用高压液相色谱、氢化物原子荧光谱法检测β-胡萝卜素和硒蛋白的含量，藻粉可以直接用于药品制备或与其他组分混合后制备药品。或者，可以将藻粉中的硒蛋白、虾青素等有效成分提取出来，用于制备含高硒蛋白盐生杜氏藻的药品，如抗癌药物、抗病毒药物等。
实验例1
对实施例1～3中制备得到盐生杜氏藻细胞计数并绘制生长曲线，结果如图1～3所示。
同时测定实施例1～3中制备得到盐生杜氏藻细胞的最大光合作用效率和实际光合作用效率，并绘制效率曲线，结果如图4～图9所示。
通过图1～图3可知：在***钠浓度为8-64mg/L，培养前9天时，藻的细胞数目基本上与不加硒对照组的数目一致，这表明在生长前期，8-64mg/L浓度情况下，***钠对盐生杜氏藻的生长基本上没有影响；9天后，***钠浓度提高到16mg/L时，盐生杜氏藻细胞数目出现下降，细胞生长受到抑制，而且随着硒浓度的增加，抑制效果增强，当***钠浓度增加到64mg/L时，藻细胞最大浓度降至107个细胞/mL以下。
通过图4～图9可知：从光合作用效率可以看到，16mg/L的***钠处理在培养15天后才出现下降。可以得出，当培养体系中***钠的终浓度为16mg/L时，可以在获取较多的有机硒、最终又得到较多的盐生杜氏细胞两者之间取得最佳的平衡。
实验例2
离心收集实施例1-实施例5中不同浓度的***钠处理的藻细胞样品，真空冷冻干燥24h，称取0.0100g样品，分别加入10mL ddH2O中，使用可控温电热炉进行加热至近沸，保持10min；冷却后，转入10mL容量瓶中定容。摇匀，过滤，取滤液7mL，加入10mL环己烷萃取，水相转入15mL离心管，使用ICP-MS测定无机硒含量。
再称取0.0100g，放入消解罐内，再加入3mL 95％的浓硝酸和1mL20％的过氧化氢溶液(比例为3:1)，在微波消解仪中进行消解，将消解后的样品倒入烧杯内，保持近沸除去多余的浓硝酸，ddH2O定容到10mL，使用ICP-MS测定总硒含量。
有机硒的含量＝总硒含量－无机硒含量。
检测结果如图10-图12所示；通过图10-图12可知：在培养体系中***钠的终浓度8-64mg/L时，藻内有机硒及总硒的富集量均随着硒浓度的增加而增加；但根据生理生化数据显示当在16mg/L***钠培养的情况下，盐生杜氏藻可以在富集较多的硒的情况下，受到较少的影响；因此，当培养体系中***钠的终浓度为16mg/L时，藻细胞中的有机硒组分含量达到1262.67μg/g，而有机硒含量则达到1112.07μg/g，效果最佳。并且，在***钠的终浓度为16mg/L时，实施例4和实施例5制备得到的有机硒组分含量与实施例3中终浓度为16mg/L时的有机硒含量差别不大，分别为：1087.78μg/g、1214.41μg/g，均能达到1000μg/g以上。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种盐生杜氏藻在利用无机硒转化为有机硒中的应用。
2.一种超富硒盐生杜氏藻粉的制备方法，其特征在于，包括：
培育：将盐生杜氏藻在培养基中培养；
无机硒的添加：在培养基中加入无机硒；
成品获取：在无机硒加入后继续培养至少3天，收集并干燥即可。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，盐生杜氏藻在培养基中培育至少6天后再在培养基中添加无机硒。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述盐生杜氏藻在培养基中的总培养时间为9-15天。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，在无机硒添加之前，盐生杜氏藻在培养基中培育的时间为9天；盐生杜氏藻在培养基中的总培养时间为15天。
6.根据权利要求2-5任一所述的制备方法，其特征在于，所述无机硒为***盐或/和硒酸盐，优选为***钠；
所述盐生杜氏藻的接种量为5～10×105cell/mL；所述培养基中***钠的终浓度为8-64mg/L。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述培养基中***钠的终浓度为8-16mg/L。
8.根据权利要求2-7任一所述的制备方法，其特征在于，所述培养基组成为：
H3BO3：9.28mg/L，CoCl2·6H2O：0.05mg/L，ZnCl2：0.11mg/L，MnCl2·4H2O：1.98mg/L，Na2MoO4：0.49mg/L，NaVO3：0.24mg/L，CuCl2·6H2O：0.05mg/L，MgSO4·7H2O：1.23g/L，KCl：0.2g/L，CaCl2·2H2O：0.044g/L，KNO3：0.2～0.8g/L，KH2PO：0.014g/L，FeCl3·6H2O：0.0005g/L，Na2EDTA：0.074g/L，NaHCO3：2～4g/L，NaCl：58.44～116.88g/L。
9.一种盐生杜氏藻制品，其特征在于，包括权利要求2-8任一所述的制备方法制备得到的超富硒盐生杜氏藻粉。
10.权利要求9所述的一种盐生杜氏藻制品在食品、保健品或药品中的应用。
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