CN113493781B - 一种壳聚糖酶及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种壳聚糖酶CsnH的编码基因及其应用。本发明所述壳聚糖酶CsnH的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。与已有性质报道的壳聚糖酶序列相似度仅为67.64％。在大肠杆菌中重组表达后，壳聚糖酶产量可达665.3U/mL，本发明所述壳聚糖酶CsnH的最适反应温度为70℃，具有耐高温的特性，在80℃高温下孵育1小时仍能保持30.25％的活性，作用方式为内切，降解产物为壳二糖。可广泛应用于食品、养殖以及医药保健等行业。

Description

一种壳聚糖酶及其应用

技术领域

本发明涉及一种具有耐热特性的内切型壳聚糖酶CsnH的编码基因及其应用，属于生物技术领域。

背景技术

壳寡糖是水解壳聚糖后，得到的聚合度小于20，分子量小于3900的寡糖。其由N-乙酰-D-氨基葡萄糖(GLcNAc)和D-氨基葡萄糖(GLcN)通过β-l,4-糖苷键连接而成。壳寡糖因其多种生物活性而受到广泛关注，它们不仅水溶性，而且无毒，具有抗凝、抗氧化、炎症反应、免疫刺激、抗菌、抗癌等功能。这使得壳寡糖在食品、养殖以及医药保健等领域有了更大的应用价值。

壳寡糖可以通过物理方法(超声波处理、紫外线辐射和微波处理)、化学方法(酸水解、过氧化氢氧化)和酶法(特异性酶和非特异性酶)制备。酶降解法具有反应条件温和、反应过程容易控制等优点，且产物纯度较高，利用基因工程构建高产壳聚糖酶的工程菌是工业化制备壳寡糖的有效途径。目前，报道的壳聚糖酶活力较低，且不耐高温，严重限制了其工业化应用前景。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供了一种新型壳聚糖酶CsnH及其制备方法。本发明所述壳聚糖酶CsnH的最适反应温度为70℃，最适反应pH为5.5；其具有耐高温的特性，在80℃的高温下孵育1小时仍能保持30.25％的活性，利于解决催化过程中酶的稳定性和酶解效率的问题。该酶降解方式为内切，酶解主产物为壳二糖。

一方面，本发明提供一种新型壳聚糖酶CsnH，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

SEQ ID NO.1：

MVYLSARTLALVACVLSLLELGAPVPNLRTRTVAVAVGGLLIASGAIAGTAAQANAVSSLAPAITAVSAASTGDLSAPAKKEIAMQLVCSAEGNGQKLRCHNLVWHNQLPNWVTSGSWTNETLLAAQYGYIEDIDDDRGYTGGIIGFTSGTGDMLELVQNYANTKPDNNVLKPGAKIDGVGLQSHFIVGSTPSQSAQAQKYVDAWHQAAKDSVFLKEQDKLRDSMYFNPAVSQGKDSNMSNLGQFMYYDAIFMHGPGDSSDSFGGIRKSAMKNAYTAAAQGGDEKTYLQAFATARKKIMKQENAHSDTSRVDDAQLKFAVAQHWGQCGGQGWTGATSCATGYICTFVNDWYYEIK。

另一方面，本发明还提供一种新型壳聚糖酶CsnH对应的核酸序列，如SEQ ID NO.2所示。

SEQ ID NO.2：

Atggtgtatctgagcgcgcgcaccctggcgctggtggcgtgcgtgctgagcctgctggaactgggcgcgccggtgccgaacctgcgcacccgcaccgtggcggtggcggtgggcggcctgctgattgcgagcggcgcgattgcgggcaccgcggcgcaggcgaacgcggtgagcagcctggcgccggcgattaccgcggtgagcgcggcgagcaccggcgatctgagcgcgccggcgaaaaaagaaattgcgatgcagctggtgtgcagcgcggaaggcaacggccagaaactgcgctgccataacctggtgtggcataaccagctgccgaactgggtgaccagcggcagctggaccaacgaaaccctgctggcggcgcagtatggctatattgaagatattgatgatgatcgcggctataccggcggcattattggctttaccagcggcaccggcgatatgctggaactggtgcagaactatgcgaacaccaaaccggataacaacgtgctgaaaccgggcgcgaaaattgatggcgtgggcctgcagagccattttattgtgggcagcaccccgagccagagcgcgcaggcgcagaaatatgtggatgcgtggcatcaggcggcgaaagatagcgtgtttctgaaagaacaggataaactgcgcgatagcatgtattttaacccggcggtgagccagggcaaagatagcaacatgagcaacctgggccagtttatgtattatgatgcgatttttatgcatggcccgggcgatagcagcgatagctttggcggcattcgcaaaagcgcgatgaaaaacgcgtataccgcggcggcgcagggcggcgatgaaaaaacctatctgcaggcgtttgcgaccgcgcgcaaaaaaattatgaaacaggaaaacgcgcatagcgataccagccgcgtggatgatgcgcagctgaaatttgcggtggcgcagcattggggccagtgcggcggccagggctggaccggcgcgaccagctgcgcgaccggctatatttgcacctttgtgaacgattggtattatgaaattaaa。

另一方面，本发明还提供一种壳聚糖酶CsnH的制备与纯化方法。

另一方面，本发明还提供了所述壳聚糖酶CsnH在降解壳聚糖中的应用。

另一方面，一种降解壳聚糖的方法，所选用的壳聚糖酶为CsnH。

优选：所述降解条件中反应温度为0～90℃。最适反应温度为70℃。

优选：所述降解条件中反应pH为4.9～7.1。最适反应pH为5.5。

有益效果：

1.本发明的壳聚糖酶CsnH为结构与功能新颖的褐藻胶裂解酶，其氨基酸序列与已有性质报道的壳聚糖酶序列相似度仅为67.64％。

2.本发明提供了一种制备壳聚糖酶CsnH的方法，即利用基因工程的技术方法，将CsnH的基因序列异源重组表达到大肠杆菌，经发酵后，发酵液酶活力高达665.3U/mL，具有工业化生产的潜质。该酶纯化方法简单，利用镍柱对其进行一步亲和纯化，回收率高达88.3％，蛋白质纯度高达95.1％。

3.本发明的壳聚糖酶CsnH具有优良的理化性质，该酶最适反应pH为5.5，其具有耐高温的特性，最适反应温度为70℃，在80℃的温度下孵育1小时仍能保持30.25％的活性。利用该重组酶进行了降解产物分析，该酶降解主产物为壳寡糖二糖。本发明所述的壳聚糖酶CsnH具有良好的工业化应用前景。

附图说明

图1为本发明壳聚糖酶CsnH蛋白质分离纯化图(M，蛋白质标准品；1，纯化所得壳聚糖酶CsnH)；

图2为本发明壳聚糖酶CsnH的温度和pH适应性分析(A，壳聚糖酶CsnH的最适反应温度；B，壳聚糖酶CsnH的温度稳定性；C，壳聚糖酶CsnH的最适反应pH；D，壳聚糖酶CsnH的pH稳定性)；

图3为薄层层析(TLC)法检测本发明壳聚糖酶CsnH的酶解产物(M，壳寡糖DP＝2-4标准品；0-2依次为该酶降解壳聚糖0min、60min和360min)；

具体实施方式

实施例1壳聚糖酶CsnH的序列分析及重组表达

本发明所述壳聚糖酶CsnH的产酶基因csnH来源于海洋细菌Pseudoalteromonasesp.SY52，包含有1065个碱基序列，编码355氨基酸序列。利用National Center forBiotechnology Information(NCBI)中的保守结构域分析Conserved domain(CDD)和多重序列比对Basic Local Alignment Search Tool(Blast)发现，该序列包含有一段多糖水解酶GH家族的壳聚糖酶保守区。已经报道的壳聚糖酶中，与CsnH氨基酸序列相似度最高的为多糖水解酶第46家族(GH46)的壳聚糖酶(Genbank ABY24857.1)，两者之间的氨基酸序列相似度(Identity)为67.64％。该发明所述的壳聚糖酶CsnH归属于多糖水解酶(GH46)家族。

将CsnH的产酶序列以限制性内切酶Nco I和Xho I为酶切位点，设计重组引物如下(下划线为限制性内切酶位点，斜体为限制性内切酶保护碱基)：

正向引物：SEQ ID NO.3：Pcsnh-F：

5’-CATGCCATGGAAGTTGTCTTGTATCGCT-3’(Nco I)

反向引物：SEQ ID NO.4：Pcsnh-R：

5’-CCGCTCGAGCTTGATTTCGTATGGGTCA-3’(Xho I)

PCR扩增条件为：94℃预变性3min；94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1min，共30个循环；72℃延伸5min；4℃稳定15min。PCR反应所用DNA聚合酶为Primerstar HS购自大连宝生物公司。

PCR产物用限制性内切酶Nco I和Xho I进行双酶切，通过琼脂糖凝胶电泳回收酶切后的PCR产物。pET22b(+)质粒DNA(美国Invitrogen公司)，同样用限制性内切酶Nco I和Xho I进行双酶切，进行琼脂糖凝胶电泳并回收酶切后的产物片段。酶切所用酶和底物反应体系(温度、时间、DNA用量等)均参照大连宝生物提供的产品说明操作。

双酶切处理的PCR产物和pET-22b(+)质粒载体参照DNA连接酶(大连宝生物公司)说明书进行连接反应；连接产物转化至大肠杆菌DH5α菌株(美国Invitrogen公司)，涂布在Luria-Bertani(LB)培养基固体平板上(含有50μg/mL氨苄青霉素的)，37℃温箱中培养12-16小时后，挑取单克隆；将单克隆转接至LB液体培养基中(含有50μg/mL氨苄青霉素)，转速为180rpm的37℃摇床中培养过夜。将单克隆进行序列测定，选择阳性克隆，并将其命名为pET22b-csnH。重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)(购自大连宝生物公司)，将重组大肠菌株命名为BL21(DE3)/pET22b-csnH，保存在-80℃备用。

需要说明的是，在本发明公开了壳聚糖酶CsnH的氨基酸序列和对应的核苷酸序列的前提下，本领域普通技术人员可以利用人工合成或其他技术手段获得壳聚糖酶CsnH的氨基酸序列和对应的核苷酸序列。在已知氨基酸序列的前提下可以推导出多种能够表达的核苷酸序列，这些核苷酸序列都应理解为在本发明保护范围内。

实施例2壳聚糖酶CsnH的制备及纯化方法

将重组菌株BL21(DE3)/pET22b-csnH在100mL的LB液体培养基中(50μg/mL氨苄青霉素)，在37℃摇床中180rpm震荡培养至OD₆₀₀＝0.6，加入终浓度为0.1mM的诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，在20℃诱导20h。壳聚糖酶活性测定方法为：100μL酶液加入900μL 0.3％壳聚糖底物(20mM醋酸-醋酸钠，pH＝5.9)，在40℃下反应10min，加入750μL的DNS试剂，沸水中反应10min进行显色，在OD520下检测其吸光度。酶活力定义为1U为每min产生1μM还原糖所需要的酶量。经检测，发酵液中壳聚糖酶活力可达665.3U/mL。

发酵停止后，12000rpm离心10min，弃菌体，收集上清液；发酵上清液上样于10mL镍离子亲和层析柱，上样流速为5mL/min，利用10mM咪唑洗脱，去除杂蛋白，再利用150mM的咪唑洗脱，收集洗脱组分。将活性成分透析去除咪唑，分装储存在-20℃备用。通过镍离子一步亲和纯化，蛋白回收率达到88.3％。纯化所得壳聚糖酶进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，如图1所示，纯化所得壳聚糖酶CsnH的分子量约为38kDa，与序列分析中预测的蛋白大小一致。通过凝胶分析发现，纯化所得壳聚糖酶CsnH的蛋白纯度达到95.1％以上。

实施例3温度和pH对壳聚糖酶CsnH的影响

将实施例2中纯化所得壳聚糖酶CsnH在不同条件下进行酶活力测定，检测不同温度和pH对酶活力的影响。在不同温度(0-90℃)下反应10min，检测不同反应温度对酶活力的影响，以最高酶活力为100％，计算不同温度下CsnH的相对酶活力。如图2A所示，壳聚糖酶CsnH的最适反应温度为70℃。

将实施例2中纯化所得壳聚糖酶CsnH在不同温度(0-90℃)下孵育1h，取出后，立即在其最适反应温度(70℃)下检测其酶活力，以孵育前的活力作为100％，如图2B所示，壳聚糖酶CsnH温度稳定性较好，在80℃下孵育1h，酶活性仍保持30.25％。

将实施例2中纯化所得壳聚糖酶CsnH与用不同的缓冲液体系配成不同PH的壳聚糖底物反应，使用的缓冲液分别为乙酸钠缓冲液(50mM，pH4.49-5.9)，磷酸盐缓冲液(50mM，pH5.88-7.12)和Tris-HCl缓冲液(50mM，pH6.22-7.11)。在最适温度下检测活性，酶活性最高值为100％。如图2C所示，壳聚糖酶CsnH的最适反应pH为5.5。

将实施例2中纯化所得壳聚糖酶CsnH在不同pH条件(4.7-10.8)下孵育24h，取出后，立即在其最适反应pH(5.5)下检测其酶活力，以孵育前的活力作为100％，如图2D所示。

实施例4壳聚糖酶CsnH酶解产物薄层层析分析

将实施例2中纯化所得壳聚糖酶CsnH纯酶与0.3％壳聚糖在70℃下分别孵育0min和60min，然后在高效薄层层析(HPTLC)检测。具体为：将HPTLC层析板裁剪成7cm宽合适大小的样本，将孵育前后样品点样在原点处，置于有展开剂(正丁醇:冰醋酸:水＝2:2:1)的展缸中30min，吹干层析板，浸入显色剂(0.5％茚三酮乙醇溶液)中2s，取出吹干，80℃烘烤，至样品出现。如图3所示，与标准品迁徙率比较发现，壳聚糖酶CsnH酶解主产物为壳二糖(DP2)。

序列表

<110> 青岛大学

<120> 一种壳聚糖酶及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 355

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Val Tyr Leu Ser Ala Arg Thr Leu Ala Leu Val Ala Cys Val Leu

1 5 10 15

Ser Leu Leu Glu Leu Gly Ala Pro Val Pro Asn Leu Arg Thr Arg Thr

20 25 30

Val Ala Val Ala Val Gly Gly Leu Leu Ile Ala Ser Gly Ala Ile Ala

35 40 45

Gly Thr Ala Ala Gln Ala Asn Ala Val Ser Ser Leu Ala Pro Ala Ile

50 55 60

Thr Ala Val Ser Ala Ala Ser Thr Gly Asp Leu Ser Ala Pro Ala Lys

65 70 75 80

Lys Glu Ile Ala Met Gln Leu Val Cys Ser Ala Glu Gly Asn Gly Gln

85 90 95

Lys Leu Arg Cys His Asn Leu Val Trp His Asn Gln Leu Pro Asn Trp

100 105 110

Val Thr Ser Gly Ser Trp Thr Asn Glu Thr Leu Leu Ala Ala Gln Tyr

115 120 125

Gly Tyr Ile Glu Asp Ile Asp Asp Asp Arg Gly Tyr Thr Gly Gly Ile

130 135 140

Ile Gly Phe Thr Ser Gly Thr Gly Asp Met Leu Glu Leu Val Gln Asn

145 150 155 160

Tyr Ala Asn Thr Lys Pro Asp Asn Asn Val Leu Lys Pro Gly Ala Lys

165 170 175

Ile Asp Gly Val Gly Leu Gln Ser His Phe Ile Val Gly Ser Thr Pro

180 185 190

Ser Gln Ser Ala Gln Ala Gln Lys Tyr Val Asp Ala Trp His Gln Ala

195 200 205

Ala Lys Asp Ser Val Phe Leu Lys Glu Gln Asp Lys Leu Arg Asp Ser

210 215 220

Met Tyr Phe Asn Pro Ala Val Ser Gln Gly Lys Asp Ser Asn Met Ser

225 230 235 240

Asn Leu Gly Gln Phe Met Tyr Tyr Asp Ala Ile Phe Met His Gly Pro

245 250 255

Gly Asp Ser Ser Asp Ser Phe Gly Gly Ile Arg Lys Ser Ala Met Lys

260 265 270

Asn Ala Tyr Thr Ala Ala Ala Gln Gly Gly Asp Glu Lys Thr Tyr Leu

275 280 285

Gln Ala Phe Ala Thr Ala Arg Lys Lys Ile Met Lys Gln Glu Asn Ala

290 295 300

His Ser Asp Thr Ser Arg Val Asp Asp Ala Gln Leu Lys Phe Ala Val

305 310 315 320

Ala Gln His Trp Gly Gln Cys Gly Gly Gln Gly Trp Thr Gly Ala Thr

325 330 335

Ser Cys Ala Thr Gly Tyr Ile Cys Thr Phe Val Asn Asp Trp Tyr Tyr

340 345 350

Glu Ile Lys

355

<210> 2

<211> 1065

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggtgtatc tgagcgcgcg caccctggcg ctggtggcgt gcgtgctgag cctgctggaa 60

ctgggcgcgc cggtgccgaa cctgcgcacc cgcaccgtgg cggtggcggt gggcggcctg 120

ctgattgcga gcggcgcgat tgcgggcacc gcggcgcagg cgaacgcggt gagcagcctg 180

gcgccggcga ttaccgcggt gagcgcggcg agcaccggcg atctgagcgc gccggcgaaa 240

aaagaaattg cgatgcagct ggtgtgcagc gcggaaggca acggccagaa actgcgctgc 300

cataacctgg tgtggcataa ccagctgccg aactgggtga ccagcggcag ctggaccaac 360

gaaaccctgc tggcggcgca gtatggctat attgaagata ttgatgatga tcgcggctat 420

accggcggca ttattggctt taccagcggc accggcgata tgctggaact ggtgcagaac 480

tatgcgaaca ccaaaccgga taacaacgtg ctgaaaccgg gcgcgaaaat tgatggcgtg 540

ggcctgcaga gccattttat tgtgggcagc accccgagcc agagcgcgca ggcgcagaaa 600

tatgtggatg cgtggcatca ggcggcgaaa gatagcgtgt ttctgaaaga acaggataaa 660

ctgcgcgata gcatgtattt taacccggcg gtgagccagg gcaaagatag caacatgagc 720

aacctgggcc agtttatgta ttatgatgcg atttttatgc atggcccggg cgatagcagc 780

gatagctttg gcggcattcg caaaagcgcg atgaaaaacg cgtataccgc ggcggcgcag 840

ggcggcgatg aaaaaaccta tctgcaggcg tttgcgaccg cgcgcaaaaa aattatgaaa 900

caggaaaacg cgcatagcga taccagccgc gtggatgatg cgcagctgaa atttgcggtg 960

gcgcagcatt ggggccagtg cggcggccag ggctggaccg gcgcgaccag ctgcgcgacc 1020

ggctatattt gcacctttgt gaacgattgg tattatgaaa ttaaa 1065

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

catgccatgg aagttgtctt gtatcgct 28

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ccgctcgagc ttgatttcgt atgggtca 28

Claims (8)

1.一种壳聚糖酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.如权利要求1所述的壳聚糖酶，其特征是，编码所述壳聚糖酶的核苷酸如SEQ IDNO.2所示。

3.如权利要求1所述的壳聚糖酶在降解壳聚糖中的应用。

4.一种降解壳聚糖的方法，其特征是，所选用的壳聚糖酶为权利要求1所述的壳聚糖酶。

5.如权利要求4所述的方法，其特征是，降解条件中反应温度为0~90℃。

6.如权利要求4所述的方法，其特征是，降解条件中反应温度为70℃。

7.如权利要求4所述的方法，其特征是，降解条件中反应pH为4.9~7.1。

8.如权利要求4所述的方法，其特征是，降解条件中反应pH为5.5。