CN113481327A - 基于RAA扩增和CRISPR-Cas12a的新型冠状病毒ORF1ab基因检测方法 - Google Patents
基于RAA扩增和CRISPR-Cas12a的新型冠状病毒ORF1ab基因检测方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113481327A CN113481327A CN202110781314.XA CN202110781314A CN113481327A CN 113481327 A CN113481327 A CN 113481327A CN 202110781314 A CN202110781314 A CN 202110781314A CN 113481327 A CN113481327 A CN 113481327A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- seq
- nucleic acid
- sequence
- dna
- crispr
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 111
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 title claims abstract description 59
- 230000003321 amplification Effects 0.000 title claims abstract description 56
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title abstract description 70
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 title abstract description 45
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 106
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 106
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 106
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 39
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 29
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 claims abstract description 21
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 claims abstract description 21
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 claims abstract description 13
- 241001678559 COVID-19 virus Species 0.000 claims abstract description 11
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 claims abstract description 11
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 73
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 34
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 28
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 24
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 24
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 23
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 21
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 18
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 claims description 13
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 claims description 8
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 claims description 8
- 108700004991 Cas12a Proteins 0.000 claims description 7
- 238000010791 quenching Methods 0.000 claims description 6
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 claims description 6
- 230000036541 health Effects 0.000 abstract description 2
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 description 12
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 11
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 description 10
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 10
- 238000011901 isothermal amplification Methods 0.000 description 10
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 9
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 7
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 6
- 108091036078 conserved sequence Proteins 0.000 description 6
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 238000013461 design Methods 0.000 description 5
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 5
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 5
- 244000309467 Human Coronavirus Species 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 3
- 241000315672 SARS coronavirus Species 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 3
- 208000025721 COVID-19 Diseases 0.000 description 2
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 2
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000711467 Human coronavirus 229E Species 0.000 description 2
- 241001109669 Human coronavirus HKU1 Species 0.000 description 2
- 241000482741 Human coronavirus NL63 Species 0.000 description 2
- 241001428935 Human coronavirus OC43 Species 0.000 description 2
- 238000007397 LAMP assay Methods 0.000 description 2
- 241000127282 Middle East respiratory syndrome-related coronavirus Species 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 2
- 230000006819 RNA synthesis Effects 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- 239000003344 environmental pollutant Substances 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 231100000719 pollutant Toxicity 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 2
- 206010001052 Acute respiratory distress syndrome Diseases 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 206010008479 Chest Pain Diseases 0.000 description 1
- 206010011224 Cough Diseases 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 208000000059 Dyspnea Diseases 0.000 description 1
- 206010013975 Dyspnoeas Diseases 0.000 description 1
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 101000833492 Homo sapiens Jouberin Proteins 0.000 description 1
- 101000651236 Homo sapiens NCK-interacting protein with SH3 domain Proteins 0.000 description 1
- 206010022004 Influenza like illness Diseases 0.000 description 1
- 102100024407 Jouberin Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000025370 Middle East respiratory syndrome Diseases 0.000 description 1
- 102000006833 Multifunctional Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108010047290 Multifunctional Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108010061100 Nucleoproteins Proteins 0.000 description 1
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 101100029566 Rattus norvegicus Rabggta gene Proteins 0.000 description 1
- 208000013616 Respiratory Distress Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 101710198474 Spike protein Proteins 0.000 description 1
- 101800005109 Triakontatetraneuropeptide Proteins 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 201000000028 adult respiratory distress syndrome Diseases 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 230000006806 disease prevention Effects 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 206010016256 fatigue Diseases 0.000 description 1
- 230000002550 fecal effect Effects 0.000 description 1
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 1
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000006210 lotion Substances 0.000 description 1
- UEGPKNKPLBYCNK-UHFFFAOYSA-L magnesium acetate Chemical group [Mg+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O UEGPKNKPLBYCNK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940069446 magnesium acetate Drugs 0.000 description 1
- 235000011285 magnesium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011654 magnesium acetate Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 239000012521 purified sample Substances 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- NMEHNETUFHBYEG-IHKSMFQHSA-N tttn Chemical group C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 NMEHNETUFHBYEG-IHKSMFQHSA-N 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Virology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供了一种crRNA分子及用于CRISPR‑Cas12a检测SARS‑CoV‑2核酸的方法。本发明提供的方法简便、易行、快速，当结合重组酶聚合酶核酸扩增技术时，检测SARS‑CoV‑2的ORF1ab基因灵敏度为1000拷贝/mL，显示出了极高的灵敏度。在实际应用中，检测灵敏度为96.00％，特异度为100.00％，阳性预测值为100.00％，阴性预测值为96.15％，可有效检测新冠病毒核酸样本。本方法仅需要提供37℃‑42℃即可完成全部反应，通过简单的荧光读取设备即可判读结果，适合仪器条件较为简单的卫生机构或疫情现场开展使用。
Description
技术领域
本发明涉及一种病毒核酸的检测方法，属于微生物检测应用领域。
背景技术
新型冠状病毒(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus-2， SARS-CoV-2)是单股正链RNA病毒，其功能性编码基因包括开放阅读框1ab 基因(Open ReadingFrame 1ab，ORF1ab)、刺突蛋白基因(Spike protein，S)、 包膜蛋白基因(Envelopeprotein，E)、膜蛋白基因(Membrane，M)和核蛋 白基因(Nucleocapsid，N)。新型冠状病毒感染人体后可造成新型冠状病毒肺 炎(Corona Virus Disease 2019，COVID-19)，患者出现发热、咳嗽、胸闷、乏 力等流感样症状，严重者可出现呼吸困难、急性呼吸窘迫综合征甚至死亡。新 型冠状肺炎的传染源为新冠病毒感染者，通过呼吸道飞沫，直接接触新冠病毒 污染物，粪口途径等多种途径在人群中迅速传播，所有人群均易感。目前，新 型冠状病毒的检测和确诊方法有：核酸检测法、免疫学检测方法和病毒分离培 养，其中核酸检测是认可度最高的检测方法。
CRISPR-Cas(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats-CRISPR associated gene)全称为“簇状、规律间隔的、短回文重复序列”， 该***首先在大肠杆菌中被发现。随着对CRISPR-Cas***作用机制和Cas蛋 白功能的逐步揭示，研究人员发现该***具有强大和广泛的应用潜力，如：作 为基因编辑工具，调节基因表达，用于核酸检测和诊断，核酸成像技术，对细 菌进行快速分子分型等。新发现的Cas12a***可用于核酸检测，实现病原体 的快速诊断。CRISPR-Cas12a***用于核酸检测的原理为：Cas12a蛋白首先 与相应的crRNA结合形成Cas12a-crRNA复合体，随后识别目标DNA处前间 隔序列邻近基序(Protospacer-Adjacent Motif，PAM)，crRNA与DNA双链中 的目标链互补结合形成R环，DNA双链解螺旋，RuvC核酸内切酶催化位点 构象激活，由于该核酸内切酶位点每次只能嵌入一条DNA链，因此目标DNA 双链依次断裂，首先剪切非目标链，随后剪切目标链。切割产物从复合上释放 出去后，Cas12a蛋白的RuvC核酸内切酶催化位点保持激活状态，可随机剪切 降解任意单链DNA。基于该原理，将单链DNA制备成荧光淬灭探针，通过监 测荧光信号的释放实现对目的序列的特异性检测。然而，使用单一的 CRISPR-Cas核酸检测的灵敏度非常有限，通常将核酸扩增技术与该检测技术 联合应用，可大幅度提高检测的灵敏度。
常用的核酸扩增方法有：聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction， PCR),重组酶聚合酶核酸扩增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA 或Recombinase-aid Amplification，RAA)，环介导等温核酸扩增(Loop-mediated isothermalamplification，LAMP)，滚环扩增(Rolling Circle Amplification，RCA) 等。其中RAA可在较低温度下(37～42℃)，短时间内完成核酸扩增反应，具 有操作简便、快速、灵敏度高和特异性强的特点，在病原的快速检测领域有很 大的应用潜力。
本发明的目的是基于CRISPR-Cas***，结合RT-RAA/RAA恒温扩增与 CRISPR荧光检测方法，建立一种可以快速检测新型冠状病毒的高灵敏、高特 异的核酸检测方法。
发明内容
基于上述目的，本发明首先提供了一种用于CRISPR-Cas12a技术检测 SARS-CoV-2核酸的crRNA分子，所述crRNA分子的序列选自SEQ ID NO.1、 SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7中任一序列。
其次，本发明还提供了一种应用上述crRNA分子基于非诊断目的的 CRISPR-Cas12a技术检测SARS-CoV-2核酸的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)制备样本核酸模板；
(2)使步骤(1)获取的核酸模板，Cas12a蛋白、荧光基团和荧光淬灭基 团双标记的DNA探针，以及所述crRNA分子在CRISPR-Cas12a反应体系里 反应；
(3)对步骤(2)的反应体系进行荧光强度的检测。
在一个优选的实施方案中，步骤(1)所述的样本核酸模板由重组酶聚合 酶核酸扩增方法制备。
在一个更为优选的实施方案中，所述重组酶聚合酶核酸扩增的上游引物选 自含有SEQ ID NO.10-14任一所示序列的核酸，所述重组酶聚合酶核酸扩增的 下游引物选自含有SEQ ID NO.15-19任一所示序列的核酸。
尤为优选地，所述重组酶聚合酶核酸扩增的上游引物的序列由SEQ ID NO. 14所示，所述重组酶聚合酶核酸扩增的下游引物的序列由SEQ ID NO.17所示。
在另一个优选的实施方案中，步骤(2)所述crRNA分子的序列如SEQ ID NO.7所示。
在又一个优选的实施方案中，步骤(2)所述DNA探针的序列如SEQ ID NO.9所示。
第三，本发明还提供了一种CRISPR-Cas12a技术检测试剂盒，所述试剂 盒包括权利要求1所述的crRNA分子，Cas12a蛋白、荧光基团和荧光淬灭基 团双标记的DNA探针，以及用于重组酶聚合酶核酸扩增的含有SEQ ID NO.10-14任一所示序列的上游引物，用于重组酶聚合酶核酸扩增的含有SEQ ID NO.15-19任一所示序列的下游引物。
在一个优选的实施方案中，所述crRNA分子的序列如SEQ ID NO.7所示， 所述重组酶聚合酶核酸扩增的上游引物的序列由SEQ ID NO.14所示，所述重 组酶聚合酶核酸扩增的下游引物的序列由SEQ ID NO.17所示。
在另一个优选的实施方案中，所述DNA探针的序列如SEQ ID NO.9所示。
第四，本发明提供了一种用于制备上述crRNA的上游DNA单链和下游 DNA单链，所述上游DNA单链的序列如SEQ ID NO.20所示，所述下游DNA 单链的序列选自SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8 中任一序列。
在一个优选的实施方案中，所述下游DNA单链的序列为SEQ ID NO.8所 示。
第五，本发明提供了一种用于制备上述crRNA的方法，所述方法为，先 使序列如SEQ ID NO.20所示的上游DNA单链和序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQID NO.8中任一所示的下游DNA单链进行杂交制 备DNA体外转录模板，再根据所述DNA体外转录模板转录制备所述crRNA。
在一个优选的实施方案中，所述下游DNA单链的序列为SEQ ID NO.8所 示。
最后，本发明提供了一种用于评价上述试剂盒灵敏度和/或特异性的质粒， 所述质粒是在序列如SEQ ID NO.21所示的pUC57质粒的402bp至424bp区 间***序列如SEQ IDNO.22所示的核酸构建而成。在本发明的一个具体实施 方案中，所述pUC57质粒的402bp至424bp区间被序列如SEQ ID NO.22所 示的核酸所替换。
本发明提供的CRISPR-Cas11a技术检测SARS-CoV-2的ORF1ab基因的 方法简便易行快速，针对样本核酸一步即可完成检测，仅需30-60分钟，便于 基层的快速检测。当结合重组酶聚合酶核酸扩增(Recombinase-aid Amplification，RAA)技术时，即RAA-Cas12a检测技术的灵敏度高，至少可 达到1000copies/mL。在对新冠病毒样本核酸的ORF1ab基因进行检测的实际 应用中，该检测方法的检测灵敏度为96.00％，特异度为100.00％，阳性预测值为100.00％，阴性预测值为96.15％，可有效检测新冠病毒核酸样本,与荧光 定量PCR法一致性较高。本方法仅需要提供37℃-42℃即可完成全部反应，通 过简单的荧光读取设备即可判读结果，适合仪器条件较为简单的卫生机构或疫 情现场开展使用。
附图说明
图1.ORF1ab基因CRISPR-Cas12a核酸检测靶点基因序列比对结果图；
图2.crRNA T7体外转录单链DNA的设计示意图；
图3.含目的基因序列的pUC57质粒图谱；
图4.ORF1ab基因检测靶点筛选结果图；
图5.ORF1ab-4恒温扩增引物筛选电泳图；
图6.ORF1ab-4检测靶点特异性结果图；
图7.ORF1ab-4靶点的检测下限结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着 描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的权利要求所限 定的保护范围构成任何限制。
实验材料
试剂：重组CRISPR-Cas12a蛋白(北京科昕生物科技有限公司)、RT-基础 型核酸扩增试剂(RAA法)(杭州众测生物科技有限公司)、基础型核酸扩增试 剂(RAA法)(杭州众测生物科技有限公司)、Monarch RNA纯化试剂盒(T2030L) (美国New England Biolabs生物公司)、HiScribe T7快速高效RNA合成试剂 盒(E2050S)(美国New England Biolabs生物公司)、DNase I(美国New England Biolabs生物公司)、无酶水(北京宝日医生物技术有限公司(takara中国))、 新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒(荧光PCR法)(上海伯杰医疗科技 有限公司)
仪器：Eppendorf 5424离心机(德国Eppendorf公司)、DeNovix DS-11FX 超微量分光光度计(美国DeNovix公司)、7500FAST荧光定量PCR仪(美 国Applied Biosystems公司)、Bio-Rad CFX96荧光定量PCR仪(美国 Bio-Rad公司)、多功能酶标仪(美国MolecularDevices公司)
构建实施例基于RAA扩增和CRISPR-Cas12a的新型冠状病毒核酸检测 方法的建立
1.1新型冠状病毒基因序列分析寻找新型冠状病毒CRISPR-Cas核酸检测 靶点
方法：从NCBI数据库中下载506条新型冠状病毒基因序列，使用mafft 软件进行基因序列比对，参数设置为自动，得到新冠病毒的保守基因序列。同 时，从NCBI数据库中下载其它六种可感染人的冠状病毒的基因序列，包括 HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、SARS-CoV和 MERS-CoV，将这些冠状病毒的基因序列与新型冠状病毒的基因序列再次进行 比对，得到新型冠状病毒的特异性保守基因序列。
CRISPR-Cas12a***的核酸检测目的基因序列5’端PAM序列为TTTN。 在序列比对得到的新冠病毒ORF1ab基因序列保守区寻找CRISPR-Cas12a*** 的核酸检测靶点。
结果：506条新型冠状病毒基因序列经过比较后，共找到4个ORF1ab基 因的CRISPR-Cas12a核酸检测靶点，见表1，与其它六种可感染人的冠状病毒 基因序列无交叉，4个检测靶点的基因序列均有良好的特异性，见图1。图1 中：a：ORF1ab-1检测靶点，b：ORF1ab-2检测靶点，c：ORF1ab-3检测靶点， d：ORF1ab-4检测靶点
表1.ORF1ab基因CRISPR-Cas12a核酸检测靶点
注：检测靶点的位置以NC 045512基因序列为参照。
1.2设计合成各检测靶点的crRNA
方法：根据各靶点的基因序列以及CRISPR-Cas12核酸检测***，设计相 应的crRNA。crRNA序列由两部分构成：5’端的保守基因序列(scaffold/repeat 部分)，以及3’端的靶基因序列的互补序列构成。crRNA序列可由生物公司直 接合成，或通过T7体外转录的方式获得。本发明主要通过T7体外转录的方 式得到各核酸检测靶点的crRNA，下文将对该过程进行详细介绍。
1.2.1设计并合成crRNA的T7体外转录模板
在CRISPR-Cas12a***中，依据双链DNA中目标基因序列的互补基因序 列，在其5’端***CRISPR-Cas12a核酸检测***的保守基因序列，即可得到 该检测靶点的crRNA序列。在该crRNA序列的5’端***T7启动子基因序列： taatacgactcactataggg(SEQ ID NO.20)，将该基因序列反向互补后即可得到该检 测靶点的T7体外转录单链DNA模板，如图2所示。图2中，crRNA序列中 划线部分为CRISPR-Cas12a核酸检测***的保守基因序列，体外转录模板序 列中划线的部分为T7启动子的反向互补序列。
1.2.2T7体外转录生成crRNA
1.2.2.1退火生成T7体外转录所需双链DNA
使用退火的方法生成T7体外转录双链DNA时，需要上游DNA单链和下 游DNA单链，其中上游(T7-Foward)为T7启动子序列，下游(T7-Reverse) 为各核酸检测靶点的T7体外转录单链DNA模板序列，按照表2所示方案配 置退火反应体系。将该反应体系置于PCR仪、水浴锅或恒温金属浴中，95℃ 孵育10分钟，关闭仪器电源，仪器温度自然降至室温后取出；或将该反应体 系放入PCR仪中95℃孵育10分钟后，以0.1℃/s的速率降温至4℃后取出， 退火产物于-20℃保存备用。
表2.退火反应体系
1.2.2.2 T7体外转录生成crRNA
将各核酸检测靶点的退火产物作为样本DNA，使用T7体外转录试剂盒 (HiScribeT7快速高效RNA合成试剂盒，NEB)进行体外转录，体外转录反 应体系如表3所示。将配置好的转录体系混匀并短暂离心后，置于37℃恒温 培养箱或恒温金属浴中过夜孵育(12-16小时)。
表3.退火体外转录反应体系
1.2.2.3 crRNA的纯化回收
将过夜孵育的样本取出，向反应管中依次加入20μL无酶水和2μL DNase I，以去除残留的DNA核酸，混匀并短暂离心后置于37℃恒温培养箱或恒温 金属浴中孵育15分钟后取出。
使用Monarch RNA纯化回收试剂盒，按照说明书对crRNA进行纯化回收， 具体步骤如下：
a)添加100μL RNA Cleanup Binding Buffer至50μL的样本中，吹打混匀 后室温静置10分钟，以确保crRNA与反应液充分结合；
b)添加150μL无水乙醇至样本中并吹打混匀，将吸附柱放入收集管中， 添加样品反应液至吸附柱中，静置几分钟后13000r离心1分钟，弃废液；
c)将吸附柱重新放回收集管中，向吸附柱中加入500μL RNA Cleanup WashBuffer，13000r离心1分钟，弃废液，该步骤重复两次；洗液第一次使 用时应根据说明加入相应体积的无水乙醇；
d)将吸附柱转移至1.5ml无酶管中，加入20-30μL无酶水至吸附膜，对 纯化的样本crRNA进行洗脱，室温下静置10分钟后13000r离心1分钟，收 集离心液；使用超微量分光光度计测量crRNA浓度，于-80℃冰箱保存备用。
所有的T7体外转录单链DNA模板序列，以及T7启动子基因序列均由北 京天一辉远生物科技有限公司合成。
结果：根据CRISPR-Cas12a***核酸检测的原理，以及其crRNA的保守 基因序列，设计得到4个N基因的crRNA和crRNA T7体外转录单链DNA序 列，通过直接合成或T7体外转录的方式得到检测靶点的crRNA。具体基因序 列详见表4。
表4.ORF1ab基因crRNA和crRNA T7体外转录基因序列
1.3靶点阳性质粒标准品
方法：将包括ORF1ab基因CRISPR-Cas12a核酸检测靶点的目的基因序列， 以及该基因序列其前后各200-300bp的核苷酸序列，***pUC57质粒骨架中 替换402至424bp区间，合成相应核酸检测靶点的阳性质粒，用于评价检测靶 点的特异性。在本发明的一个具体实施方案中，***的核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示，pUC57质粒序列见SEQ ID NO.21。使用相同的方法，选择近似 位置的基因序列，合成其它六种可感染人的冠状病毒的ORF1ab基因的阳性质 粒标准品，其中***的SARS-CoV的ORF1ab基因序列如SEQ ID NO.23所示， ***的MERS-CoV的ORF1ab基因序列如SEQ ID NO.24所示，***的 HCoV-OC43的ORF1ab基因序列如SEQ ID NO.25所示，***的HCoV-NL63 的ORF1ab基因序列如SEQ ID NO.26所示，***的HCoV-HKU1的ORF1ab 基因序列如SEQ ID NO.27所示，***的HCoV-229E的ORF1ab基因序列如 SEQ ID NO.28所示。pUC57质粒的质粒图谱如图3所示，Target标识处为插 入序列所在位置。所有的质粒全基因组序列均由北京天一辉远生物科技有限 公司合成。
1.4基于CRISPR-Cas12a***的核酸检测
1.4.1合成单链DNA荧光报告探针
在单链DNA基因序列的两端分别标记FAM荧光基团和BHQ1荧光淬灭 基团，即可构成单链DNA荧光报告探针。报告探针的基因序列为： 5’-FAM-tttttttttttt-BHQ1-3’(SEQID NO.9)，由北京天一辉远生物科技有限公 司合成。
1.4.2CRISPR-Cas12a***的荧光检测
使用本发明建立的CRISPR-Cas12a核酸检测体系对新冠病毒ORF1ab基因 各检测靶点的基因扩增产物进行检测，按照表5配制荧光检测体系。将配制好 的反应液加入96孔板中，使用多功能酶标仪或荧光定量PCR仪进行荧光强度 检测，其中酶标仪设置激发光波长495nm、发射光波长520nm，荧光定量PCR 仪选择FAM荧光通道。反应温度为37℃，每隔2分钟检测一次荧光值，连续 检测30-60分钟，观察各靶点CRISPR检测反应中荧光强度升高情况。
表5.CRISPR-Cas12a荧光检测体系
注：荧光定量PCR仪的反应体系总体积为25μL，表中各反应组分均减半。
1.4.3阳性结果判定
与阴性对照相比，检测60分钟时荧光强度有明显升高，经过统计学分析， 三次重复实验的荧光强度值与阴性对照间有统计学差异。
1.5核酸扩增(RT-RAA/RAA法)
1.5.1设计各检测靶点的恒温扩增引物
RAA恒温扩增引物的设计要求为：引物长度为30-35bp，引物的5’端为 AT碱基富集区，引物的3’端为CG碱基富集区，避免引物自身形成发夹结构， 避免上下游引物之间形成引物二聚体，可不考虑引物本身的溶解温度Tm值。 在本实施例中，设计恒温扩增引物时，在保证引物扩增效率的情况下，使扩增 产物的片段长度尽量小。
在每个CRISPR核酸检测目的基因处设计多条上游扩增引物和多条下游 扩增引物，配对组合后对含有各检测靶点基因序列的阳性质粒标准品进行扩增。
所有的引物均由北京天一辉远生物科技有限公司合成。
1.5.2RAA扩增
使用基础型核酸扩增试剂(RAA法)对各靶点阳性质粒进行扩增，按照 表6的方案配制恒温扩增体系。将各反应溶液加入酶反应干粉管中，充分混匀 后短暂离心，将反应管置于39℃恒温金属浴或PCR仪中反应30分钟，扩增 完成后取出，扩增产物于4℃保存备用。
各引物对的核酸扩增效果可通过DNA凝胶电泳检测判定。
表6.RAA恒温扩增体系
注：A液为水化溶液，B液为乙酸镁。
1.5.3反转录-RAA扩增(RT-RAA)
使用RT-基础型核酸扩增试剂(RAA法)，对新型冠状病毒样本核酸进行 一步法反转录-恒温扩增反应，核酸扩增体系同表6。将配置好的反应溶液置于 42℃恒温金属浴或PCR仪中反应30分钟，扩增完成后取出，扩增产物于4℃ 保存备用。
核酸扩增效果可通过DNA凝胶电泳检测判定，实验方法同上。
1.6筛选新冠ORF1ab基因CRISPR-Cas12a核酸检测靶点
结果：相同浓度含有各检测靶点基因序列的阳性质粒为DNA样本，使用 相同的CRISPR-Cas12a核酸检测体系，检测体系中保持各靶点crRNA浓度一 致，相同的反应时间和条件下，对ORF1ab基因的4个核酸检测靶点进行 CRISPR荧光检测。四个检测靶点的荧光值与阴性对照相比均有统计学差异， 选择荧光值最高的ORF1ab-1和ORF1ab-4检测靶点作为ORF1ab基因的 CRISPR-Cas12a***的核酸检测靶点，并进一步评价该靶点的检测特异性和检 测下限。检测结果如图4所示，4个检测靶点的荧光值与阴性对照相比均有统 计学差异，P＜0.0001，选荧光值最高的检测靶点ORF1ab-4为ORF1ab基因的 CRISPR-Cas12a核酸检测靶点，进一步评价该靶点的特异性和检测下限。图4 中，4个核酸检测靶点CRISPR荧光检测时，60分钟内各靶点荧光值变化折线 图；b：4个核酸检测靶点荧光检测60分钟时的荧光强度值；各组荧光值与阴 性对照组比较，****为P＜0.0001。NC为阴性对照。
1.6.1ORF1ab-4检测靶点恒温扩增引物的设计和筛选
结果：ORF1ab-4检测靶点共设计合成了5条上游引物，5条下游引物， 各引物基因序列信息见表7。将上下游引物两两配对组合，恒温扩增该靶点基 因的阳性质粒，各引物对核酸扩增情况如图5所示。对于扩增效果近似的引物 对，对其扩增产物进行CRISPR-Cas12a核酸检测，最终选取核酸扩增片段较 短的引物对ORF1ab-4-AF5/ORF1ab-4-AR3建立ORF1ab-4靶点的恒温扩增体 系。图5中，1-5泳道：1F与1R-5R依次配对；6-10泳道：2F与1R-5R依次 配对；11-15泳道：3F与1R-5R依次配对；16-20泳道：4F与1R-5R依次配对； 21-25泳道：5F与1R-5R依次配对。23泳道为最终选择引物对扩增结果。
表7.ORF1ab-4检测靶点恒温扩增引物
1.6.2ORF1ab-4检测靶点的特异性
结果：使用筛选得到的ORF1ab-4检测靶点的扩增引物，对其它六种冠状 病毒的ORF1ab基因阳性质粒进行RAA恒温扩增，随后进行CRISPR-Cas12a 检测，观测荧光值升高情况。检测结果如图6所示：ORF1ab-4靶点的特异性 较好，检测60分钟时，除新冠病毒ORF1ab基因阳性质粒荧光值升高外，其 它冠状病毒的荧光值均无升高。因此，最终选择ORF1ab-4作为新冠病毒ORF1ab基因的CRISPR-Cas12a核酸检测靶点，并进一步评价其检测下限。图 6中NC为阴性对照。
1.7ORF1ab-4检测靶点的检测下限
方法：将ORF1ab-4靶点的阳性质粒作为标准品，用于评价各靶点 RAA-CRISPR荧光检测的灵敏度/检测下限。使用超微量分光光度计测量阳性 质粒的浓度，根据质粒浓度和质粒片段大小计算质粒拷贝数。对质粒浓度进行 十倍梯度稀释，直至稀释到单拷贝每微升为止。
质粒拷贝数计算公式：
注：c为质粒浓度，DNA length为阳性质粒的基因序列全长，x为最终得 到的质粒拷贝数。
结果：使用筛选得到的ORF1ab-4靶点的扩增引物对，RAA恒温扩增梯度 稀释的各浓度新冠病毒ORF1ab-4靶点阳性质粒，并对扩增产物进行 CRISPR-Cas12a检测。结果如图7，反应30min后，ORF1ab-4靶点的检测下 限即可达到1000拷贝/ml，CRISPR检测荧光值与阴性对照相比P＜0.05，其 它浓度阳性质粒样本的荧光值与阴性对照相比P值均小于0.0001。图7中，a： ORF1ab-4检测靶点CRISPR荧光检测时，30分钟内各浓度样本荧光值变化折 线图；b：各浓度样本ORF1ab-4靶点检测30分钟的荧光强度值，各组荧光值 与阴性对照组比较，*为P＜0.05。NC为阴性对照。
因此，本发明建立的基于CRISPR-Cas12a核酸检测***，RAA核酸扩增 联合ORF1ab-4检测靶点的CRISPR荧光检测，对新冠病毒ORF1ab基因的检 测灵敏度高，至少可达到1000copies/mL。
应用实施例新型冠状病毒核酸样本检测
方法：使用上述建立的新冠病毒ORF1ab基因的核酸检测平台，对经过核 酸检测金标准“荧光定量PCR法”确认的新冠病毒核酸样本进行检测，验证各 靶点RT-RAA-CRISPR荧光检测对实际核酸样本的检出情况。
RT-PCR方法：使用上海伯杰医疗科技有限公司的新型冠状病毒 2019-nCoV核酸检测试剂盒(荧光PCR法)，对新型冠状病毒样本核酸进行检 测与鉴定。按照说明书配制反应体系，使用Bio-Rad CFX96荧光定量PCR仪 对样本核酸进行检测，按照说明书设置反应条件，选择FAM，HEX，ROX荧 光通道，根据各荧光通道的CT值判定新冠病毒核酸样本的检测结果。
结果：收集了25份新型冠状病毒阳性临床核酸样本，25份阴性样本，阴 性样本来自无症状一般人群，经荧光定量RT-PCR实验验证后，所有核酸样本 的完整性较好。使用本发明建立的，RT-RAA恒温扩增联合CRISPR-Cas12a ***，对新冠病毒样本核酸的ORF1ab基因进行检测。新冠病毒核酸样本的 ORF1ab-4靶点核酸检测结果如表8所示，阳性样本检出24个，阴性样本全部 检出，该检测方法的检测灵敏度为96.00％，特异度为100.00％，阳性预测值 为100.00％，阴性预测值为96.15％，可有效检测新冠病毒核酸样本,与荧光定 量PCR法一致性较高。
表8.样本荧光定量RT-PCR检测与CRISPR检测一致性(ORF1ab-4)
序列表
<110> 中国人民解放军疾病预防控制中心
<120> 基于RAA扩增和CRISPR-Cas12a的新型冠状病毒ORF1ab基因检测方法
<160> 28
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 41
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
uaauuucuac uaaguguaga uaacucucau gaagugugau c 41
<210> 2
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gatcacactt catgagagtt atctacactt agtagaaatt accctatagt gagtcgtatt 60
a 61
<210> 3
<211> 41
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
uaauuucuac uaaguguaga uuuggaauuu gcgagaaaug c 41
<210> 4
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gcatttctcg caaattccaa atctacactt agtagaaatt accctatagt gagtcgtatt 60
a 61
<210> 5
<211> 41
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
uaauuucuac uaaguguaga uagagaagug aggacuauua a 41
<210> 6
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ttaatagtcc tcacttctct atctacactt agtagaaatt accctatagt gagtcgtatt 60
a 61
<210> 7
<211> 41
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
uaauuucuac uaaguguaga uuauugcaua gacggugcuu u 41
<210> 8
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aaagcaccgt ctatgcaata atctacactt agtagaaatt accctatagt gagtcgtatt 60
a 61
<210> 9
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tttttttttt tt 12
<210> 10
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gctcagtatg aacttaagca tggtacattt acttg 35
<210> 11
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ccacctgctc agtatgaact taagcatggt acatt 35
<210> 12
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
caagctacaa aatatctagt acaacaggag tcacc 35
<210> 13
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
caagctacaa aatatctagt acaacaggag tcacc 35
<210> 14
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
cttaagcatg gtacatttac ttgtgctagt gagta 35
<210> 15
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
tgtctttctt ataataattg tccaacttag ggtca 35
<210> 16
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
tcgaagcttg cgtttggata tggttggttt ggta 34
<210> 17
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
atccgtaata ggacctttgt attctgagga ctttg 35
<210> 18
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ctggttttat ggttgttgtg taactgtttt ctttg 35
<210> 19
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
ccaatttata agtaactggt tttatggttg ttgtg 35
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
taatacgact cactataggg 20
<210> 21
<211> 2710
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60
cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120
ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180
accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240
attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300
tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360
tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt cgagctcggt acctcgcgaa 420
tgcatctaga tatcggatcc cgggcccgtc gactgcagag gcctgcatgc aagcttggcg 480
taatcatggt catagctgtt tcctgtgtga aattgttatc cgctcacaat tccacacaac 540
atacgagccg gaagcataaa gtgtaaagcc tggggtgcct aatgagtgag ctaactcaca 600
ttaattgcgt tgcgctcact gcccgctttc cagtcgggaa acctgtcgtg ccagctgcat 660
taatgaatcg gccaacgcgc ggggagaggc ggtttgcgta ttgggcgctc ttccgcttcc 720
tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc agctcactca 780
aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg caggaaagaa catgtgagca 840
aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg 900
ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg 960
acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt 1020
ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt 1080
tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc 1140
tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt 1200
gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt 1260
agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc 1320
tacactagaa gaacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa 1380
agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt 1440
tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct 1500
acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catgagatta 1560
tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa 1620
agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt taccaatgct taatcagtga ggcacctatc 1680
tcagcgatct gtctatttcg ttcatccata gttgcctgac tccccgtcgt gtagataact 1740
acgatacggg agggcttacc atctggcccc agtgctgcaa tgataccgcg agacccacgc 1800
tcaccggctc cagatttatc agcaataaac cagccagccg gaagggccga gcgcagaagt 1860
ggtcctgcaa ctttatccgc ctccatccag tctattaatt gttgccggga agctagagta 1920
agtagttcgc cagttaatag tttgcgcaac gttgttgcca ttgctacagg catcgtggtg 1980
tcacgctcgt cgtttggtat ggcttcattc agctccggtt cccaacgatc aaggcgagtt 2040
acatgatccc ccatgttgtg caaaaaagcg gttagctcct tcggtcctcc gatcgttgtc 2100
agaagtaagt tggccgcagt gttatcactc atggttatgg cagcactgca taattctctt 2160
actgtcatgc catccgtaag atgcttttct gtgactggtg agtactcaac caagtcattc 2220
tgagaatagt gtatgcggcg accgagttgc tcttgcccgg cgtcaatacg ggataatacc 2280
gcgccacata gcagaacttt aaaagtgctc atcattggaa aacgttcttc ggggcgaaaa 2340
ctctcaagga tcttaccgct gttgagatcc agttcgatgt aacccactcg tgcacccaac 2400
tgatcttcag catcttttac tttcaccagc gtttctgggt gagcaaaaac aggaaggcaa 2460
aatgccgcaa aaaagggaat aagggcgaca cggaaatgtt gaatactcat actcttcctt 2520
tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt tattgtctca tgagcggata catatttgaa 2580
tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccacct 2640
gacgtctaag aaaccattat tatcatgaca ttaacctata aaaataggcg tatcacgagg 2700
ccctttcgtc 2710
<210> 22
<211> 533
<212> DNA
<213> SARS-CoV-2
<400> 22
ctgttatgta catgggcaca ctttcttatg aacaatttaa gaaaggtgtt cagatacctt 60
gtacgtgtgg taaacaagct acaaaatatc tagtacaaca ggagtcacct tttgttatga 120
tgtcagcacc acctgctcag tatgaactta agcatggtac atttacttgt gctagtgagt 180
acactggtaa ttaccagtgt ggtcactata aacatataac ttctaaagaa actttgtatt 240
gcatagacgg tgctttactt acaaagtcct cagaatacaa aggtcctatt acggatgttt 300
tctacaaaga aaacagttac acaacaacca taaaaccagt tacttataaa ttggatggtg 360
ttgtttgtac agaaattgac cctaagttgg acaattatta taagaaagac aattcttatt 420
tcacagagca accaattgat cttgtaccaa accaaccata tccaaacgca agcttcgata 480
attttaagtt tgtatgtgat aatatcaaat ttgctgatga tttaaaccag tta 533
<210> 23
<211> 210
<212> DNA
<213> SARS-CoV
<400> 23
tgtggtaaac aagctacaca atatctagta caacaagagt caccttttgt tatgatgtct 60
gcaccacccg cccaatatga acttaagcat ggtacatttg tttgtgctag tgagtatact 120
ggtaattacc agtgtggtca ctacaaacat ataacttcta aagaaacctt gtattgtata 180
gatggtgctt tactcacaaa gtcctctgag 210
<210> 24
<211> 210
<212> DNA
<213> MERS
<400> 24
gccattatgt tcatgcttgc ctgaagggtg gtcttatttt aaagtttgac tctggcaccg 60
ttagcaagac ttcagactgg aagtgcaagg tgacagatgt acttttcccc ggccaaaaat 120
acagtagcga ttgtaatgtc gtacggtatt ctttggacgg taatttcaga acagaggttg 180
atcccgacct atctgctttc tatgttaagg 210
<210> 25
<211> 210
<212> DNA
<213> HCoV
<400> 25
gtggactgtt cttgcggtaa aaagctaatt cattgtgtac gatttgatgt accattttta 60
atttgcagta atacacctgc tagtgtaaaa ttacctaagg gtgtaggaag tgcaaatatt 120
tttataggtg ataatgttgg tcattatgtt catgttaagt gtgaacaatc ttatcagctt 180
tatgatgctt ctaatgttaa gaaggttaca 210
<210> 26
<211> 210
<212> DNA
<213> HCoV
<400> 26
taaaagtact gtagttgaag ttaaaagtgc tattgtttgt gctagtgtgc ttaaagatgg 60
ttgtgatgtt ggtttttgtc cacacagaca taaattgcgt tcacgtgtta agtttgttaa 120
tggacgtgtt gttattacca atgttggtga acctataatt tcacaatctt ctaagttgct 180
taatggtatt gcttatacaa cattttcagg 210
<210> 27
<211> 210
<212> DNA
<213> HCoV
<400> 27
cttaaattta ataaatggca gtggcaggaa gcatggtatg aatttcgtgc tggcagacca 60
catagattag ttgctcttgt tttagctaaa ggtcatttta aatttgatga accatcagat 120
gctactgatt ttattcgtgt tgttttgaaa caagctgatt tatcaggtgc aatttgtgaa 180
ttagaactta tttgtgattg tggtattaaa 210
<210> 28
<211> 210
<212> DNA
<213> HCoV
<400> 28
aagtatcttg ctaatgaagc tcaagttcaa ttagaacatt atagttcttg tgttgaatgt 60
gatgctaaat ttaaaaactc tgttacatct atcaattctg ctatagtttg tgctagtgtc 120
aaacgtgatg gtgtgcaagt tggttattgt gtccatggta ttaagtacta ttcacgtgtt 180
aaaagtgtta gaggtagagc tattatagtc 210
Claims (15)
1.一种用于CRISPR-Cas12a技术检测SARS-CoV-2核酸的crRNA分子，所述crRNA分子的序列选自SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7中任一序列。
2.一种应用权利要求1所述crRNA分子基于非诊断目的的CRISPR-Cas12a技术检测SARS-CoV-2核酸的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)制备样本核酸模板；
(2)使步骤(1)获取的核酸模板，Cas12a蛋白、荧光基团和荧光淬灭基团双标记的DNA探针，以及所述crRNA分子在CRISPR-Cas12a反应体系里反应；
(3)对步骤(2)的反应体系进行荧光强度的检测。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述的样本核酸模板由重组酶聚合酶核酸扩增方法制备。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述重组酶聚合酶核酸扩增的上游引物选自含有SEQ ID NO.10-14任一所示序列的核酸，所述重组酶聚合酶核酸扩增的下游引物选自含有SEQ ID NO.15-19任一所示序列的核酸。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述重组酶聚合酶核酸扩增的上游引物的序列由SEQ ID NO.14所示，所述重组酶聚合酶核酸扩增的下游引物的序列由SEQ ID NO.17所示。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述crRNA分子的序列如SEQ IDNO.7所示。
7.根据权利要求2-6任一所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述DNA探针的序列如SEQID NO.9所示。
8.一种CRISPR-Cas12a技术检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的crRNA分子，Cas12a蛋白、荧光基团和荧光淬灭基团双标记的DNA探针，以及用于重组酶聚合酶核酸扩增的含有SEQ ID NO.10-14任一所示序列的上游引物，用于重组酶聚合酶核酸扩增的含有SEQ ID NO.15-19任一所示序列的下游引物。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述crRNA分子的序列如SEQ ID NO.7所示，所述重组酶聚合酶核酸扩增的上游引物的序列由SEQ ID NO.14所示，所述重组酶聚合酶核酸扩增的下游引物的序列由SEQ ID NO.17所示。
10.根据权利要求8或9任一所述的试剂盒，其特征在于，所述DNA探针的序列如SEQ IDNO.9所示。
11.一种用于制备权利要求1所述crRNA的上游DNA单链和下游DNA单链，其特征在于，所述上游DNA单链的序列如SEQ ID NO.20所示，所述下游DNA单链的序列选自SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8中任一序列。
12.根据权利要求11所述的上游DNA单链和下游DNA单链，其特征在于，所述下游DNA单链的序列为SEQ ID NO.8所示。
13.一种用于制备权利要求1所述crRNA的方法，其特征在于，先使序列如SEQ ID NO.20所示的上游DNA单链和序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8中任一所示的下游DNA单链进行杂交制备DNA体外转录模板，再根据所述DNA体外转录模板转录制备所述crRNA。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述下游DNA单链的序列为SEQ ID NO.8所示。
15.一种用于评价权利要求8所述试剂盒灵敏度和/或特异性的质粒，其特征在于，所述质粒是在序列如SEQ ID NO.21所示的pUC57质粒的402bp至424bp区间***序列如SEQ IDNO.22所示的核酸构建而成。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110781314.XA CN113481327B (zh) | 2021-07-10 | 2021-07-10 | 基于RAA扩增和CRISPR-Cas12a的新型冠状病毒ORF1ab基因检测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110781314.XA CN113481327B (zh) | 2021-07-10 | 2021-07-10 | 基于RAA扩增和CRISPR-Cas12a的新型冠状病毒ORF1ab基因检测方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN113481327A true CN113481327A (zh) | 2021-10-08 |
| CN113481327B CN113481327B (zh) | 2024-03-05 |
Family
ID=77938591
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202110781314.XA Active CN113481327B (zh) | 2021-07-10 | 2021-07-10 | 基于RAA扩增和CRISPR-Cas12a的新型冠状病毒ORF1ab基因检测方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN113481327B (zh) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114277102A (zh) * | 2021-12-07 | 2022-04-05 | 泰州市人民医院 | 用于检测人体液中的HLA-B27基因的RAA引物、CrRNA、试剂盒及检测方法 |
| CN114350854A (zh) * | 2022-01-10 | 2022-04-15 | 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 | 一种基于RAA-CRISPR检测SARS-CoV-2 69-70del位点的方法 |
| CN115807130A (zh) * | 2022-11-16 | 2023-03-17 | 武汉大学 | 猴痘病毒快速检测方法 |
| CN115873991A (zh) * | 2022-11-02 | 2023-03-31 | 中创科瑞(北京)生物科技有限公司 | 嵌段crRNA、使crRNA能够开关控制与Cas12a结合的功能及其功能验证方法 |
| CN115927747A (zh) * | 2022-08-26 | 2023-04-07 | 深圳市卓润生物科技有限公司 | 新型冠状病毒检测试剂、检测试剂盒和检测方法 |
| CN115960902A (zh) * | 2022-12-14 | 2023-04-14 | 武汉珈创生物技术股份有限公司 | 基于CRISPR-Cas***的用于检测多种支原体的引物、crRNA及其应用 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111500771A (zh) * | 2020-04-20 | 2020-08-07 | 上海国际旅行卫生保健中心(上海海关口岸门诊部) | 一种新型冠状病毒SARS-CoV-2检测的引物组和试剂盒 |
| CN111534641A (zh) * | 2020-04-01 | 2020-08-14 | 上海科技大学 | 一种核酸检测试剂盒、检测方法及应用 |
| CN111534643A (zh) * | 2020-07-10 | 2020-08-14 | 上海科技大学 | 一种检测呼吸道病原的核酸的试剂盒、检测方法及应用 |
| CN111808991A (zh) * | 2020-07-09 | 2020-10-23 | 深圳市第二人民医院(深圳市转化医学研究院) | 一种基于RT-RPA体系和CRISPR/Cas体系的基因检测方法及***及其应用 |
| CN111876525A (zh) * | 2020-07-08 | 2020-11-03 | 广州再生医学与健康广东省实验室 | 用于检测SARS-CoV-2的gRNA、引物及试剂盒 |
-
2021
- 2021-07-10 CN CN202110781314.XA patent/CN113481327B/zh active Active
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111534641A (zh) * | 2020-04-01 | 2020-08-14 | 上海科技大学 | 一种核酸检测试剂盒、检测方法及应用 |
| CN111500771A (zh) * | 2020-04-20 | 2020-08-07 | 上海国际旅行卫生保健中心(上海海关口岸门诊部) | 一种新型冠状病毒SARS-CoV-2检测的引物组和试剂盒 |
| CN111876525A (zh) * | 2020-07-08 | 2020-11-03 | 广州再生医学与健康广东省实验室 | 用于检测SARS-CoV-2的gRNA、引物及试剂盒 |
| CN111808991A (zh) * | 2020-07-09 | 2020-10-23 | 深圳市第二人民医院(深圳市转化医学研究院) | 一种基于RT-RPA体系和CRISPR/Cas体系的基因检测方法及***及其应用 |
| CN111534643A (zh) * | 2020-07-10 | 2020-08-14 | 上海科技大学 | 一种检测呼吸道病原的核酸的试剂盒、检测方法及应用 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| DAN XIONG等: "Rapid detection of SARS-CoV-2 with CRISPR-Cas12a", PLOS BIOLOGY, pages 1 - 12 * |
| HONGBO LIU等: "Highly sensitive and rapid detection of SARS‐CoV‐2 via a portable CRISPR‐Cas13a‐based lateral flow assay", J MED VIROL, pages 1 - 9 * |
| SUN ET AL.: "One‑tube SARS‑CoV‑2 detection platform based on RT‑RPA and CRISPR/Cas12a", J TRANSL MED, pages 1 - 10 * |
| 李晓红;冯佳;谢芳莘;王蓓蕊;何苗;张勇刚;马峰;陈强;: "重组酶聚合酶扩增结合Cas12a输血相关病原体核酸检测方法的可行性", 中国输血杂志, no. 05, pages 41 - 46 * |
Cited By (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114277102A (zh) * | 2021-12-07 | 2022-04-05 | 泰州市人民医院 | 用于检测人体液中的HLA-B27基因的RAA引物、CrRNA、试剂盒及检测方法 |
| CN114277102B (zh) * | 2021-12-07 | 2023-09-19 | 泰州市人民医院 | 用于检测人体液中的HLA-B27基因的RAA引物、CrRNA、试剂盒及检测方法 |
| CN114350854A (zh) * | 2022-01-10 | 2022-04-15 | 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 | 一种基于RAA-CRISPR检测SARS-CoV-2 69-70del位点的方法 |
| CN115927747A (zh) * | 2022-08-26 | 2023-04-07 | 深圳市卓润生物科技有限公司 | 新型冠状病毒检测试剂、检测试剂盒和检测方法 |
| CN115927747B (zh) * | 2022-08-26 | 2023-11-10 | 深圳市卓润生物科技有限公司 | 新型冠状病毒检测试剂、检测试剂盒和检测方法 |
| CN115873991A (zh) * | 2022-11-02 | 2023-03-31 | 中创科瑞(北京)生物科技有限公司 | 嵌段crRNA、使crRNA能够开关控制与Cas12a结合的功能及其功能验证方法 |
| CN115873991B (zh) * | 2022-11-02 | 2024-03-01 | 中创科瑞(北京)生物科技有限公司 | 嵌段crRNA、使crRNA能够开关控制与Cas12a结合的功能及其功能验证方法 |
| CN115807130A (zh) * | 2022-11-16 | 2023-03-17 | 武汉大学 | 猴痘病毒快速检测方法 |
| CN115960902A (zh) * | 2022-12-14 | 2023-04-14 | 武汉珈创生物技术股份有限公司 | 基于CRISPR-Cas***的用于检测多种支原体的引物、crRNA及其应用 |
| CN115960902B (zh) * | 2022-12-14 | 2023-07-11 | 武汉珈创生物技术股份有限公司 | 基于CRISPR-Cas***的用于检测多种支原体的引物、crRNA及其应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN113481327B (zh) | 2024-03-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN113481327B (zh) | 基于RAA扩增和CRISPR-Cas12a的新型冠状病毒ORF1ab基因检测方法 | |
| CN113549618B (zh) | 基于RAA扩增和CRISPR-Cas13a***的SARS-CoV-2核酸检测方法 | |
| US20020025561A1 (en) | Vectors for gene-self-assembly | |
| CN108395996B (zh) | 一种猪瘟病毒亚单位疫苗及其制备方法和用途 | |
| CN108531471B (zh) | 一种长基因合成方法 | |
| CN108285886A (zh) | 重组枯草芽孢杆菌全细胞转化生产n-乙酰神经氨酸的方法 | |
| CN109609579B (zh) | 一种产β-胡萝卜素的基因工程菌及其构建方法 | |
| CN113584223B (zh) | 基于CRISPR-Cas12a的SARS-CoV-2中D614G突变鉴定方法 | |
| CN113604505A (zh) | pSFV-p32病毒样颗粒及其制备方法和应用 | |
| CN114933970B (zh) | 缺失6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶1基因的弓形虫基因敲除虫株 | |
| CN109652352B (zh) | 一株用于屎肠球菌谷氨酸脱羧酶高效固定化的基因工程菌及固定化方法 | |
| CN111321163B (zh) | 一种枯草芽孢杆菌线性质粒***的构建与应用 | |
| CN114292864B (zh) | 高产表面活性素的贝莱斯芽孢杆菌突变株及其构建方法和应用 | |
| CN112322706A (zh) | 一种特异性人源基因片段及其引物探针和应用 | |
| CN111378718A (zh) | 一种基因测序文库的构建方法 | |
| CN114540345B (zh) | 一种发夹结构的标签荧光探针和荧光检测方法 | |
| CN113073097B (zh) | 一种cho细胞内源性的温度敏感型启动子及其应用 | |
| CN111979134B (zh) | 一种合成胭脂红酸的重组酿酒酵母的构建及其应用 | |
| CN113718047B (zh) | 荧光定量方法检测人母乳内10属细菌的试剂盒及其应用 | |
| CN107661496A (zh) | 一种猪细小病毒免疫组合物及其制备方法与应用 | |
| CN110607380B (zh) | 桑树植原体ltrA基因及其在桑树植原体分子检测中的应用 | |
| CN112626116B (zh) | 定点整合大片段外源dna的方法 | |
| CN114214459A (zh) | 非洲猪瘟病毒和猪圆环病毒2型双重数字pcr检测引物组合物及其检测方法 | |
| CN112301059A (zh) | 一种基于复制缺陷性重组慢病毒的car-nk转基因载体及其构建方法和应用 | |
| CN114214346B (zh) | 靶向肝前体细胞的质粒***及应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |