CN111321163B - 一种枯草芽孢杆菌线性质粒***的构建与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种枯草芽孢杆菌线性质粒***的构建与应用，属于枯草芽孢杆菌基因工程领域。本发明以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)作为表达宿主，通过在枯草芽孢杆菌内表达来源于枯草芽孢杆菌噬菌体phi29的基因组复制相关基因簇，从而实现线性质粒在胞内的复制与表达。通过更换不同的启动子，可以控制线性质粒的拷贝数与表达水平。经验证，应用该线性质粒***表达绿色荧光蛋白，在摇瓶培养70h后未发生质粒丢失的情况，这种新型的表达工具为实现枯草芽孢杆菌高效稳定的基因表达，基因编辑，代谢工程改造等奠定了基础。

Description

一种枯草芽孢杆菌线性质粒***的构建与应用

技术领域

本发明涉及一种枯草芽孢杆菌线性质粒***的构建与应用，属于枯草芽孢杆菌基因工程领域。

背景技术

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)在自然界广泛分布，包括土壤表面，水环境和动物胃。作为革兰氏阳性菌的模型微生物，用于孢子形成机制和代谢调节的实验室研究。它是一种非致病微生物，不含内毒素，通常被美国食品和药物管理局(FDA)认可为安全的(GRAS)食品级微生物。此外，枯草芽孢杆菌具有许多优点，包括：生长速度快，培养时间短，培养要求低；分泌信号肽的***十分高效，使得其分泌蛋白能力强，这对后续蛋白提取工艺提供了很大便利；其分子伴侣***十分高效，使得其在表达大部分真核来源的蛋白时，可以使得蛋白仍然保持其原有构象和活性。枯草芽孢杆菌的优势使得其在发酵行业应用十分广泛，其被广泛用于工业酶生产，高附加值产品的生物合成。其表达***在分泌和表达活性蛋白上的优点逐渐引起人们的关注,并有可能成为继大肠杆菌之后的重要的原核表达***。然而，用于提高蛋白表达量的工具质粒却十分不稳定，容易发生丢失的情况，需要抗生素维持(Zhang XZ,Cui ZL,Hong Q,Li SP.High-level expression and secretion of methylparathion hydrolase in Bacillus subtilis WB800.Applied and environmentalmicrobiology.2005；71(7):4101-3)，因此带有工具质粒的枯草芽孢杆菌菌株难以用于工业生产且不适用于食品及制药的生产。

对于实现枯草芽孢杆菌新一代工具载体的开发，目前尚未有报道，对于基因的表达目前主要使用的是环形质粒和在基因组上表达两种，开发新型有效的的线性质粒***可能为后续酶工程、代谢工程等领域打下基础。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种适用于枯草芽孢杆菌的线性质粒工具及其应用，通过在枯草芽孢杆菌内表达来源于枯草芽孢杆菌噬菌体phi29的基因组复制相关基因簇，以实现线性质粒在胞内的复制与表达。

本发明的第一个目的是提供一种线性质粒，依次含有左复制原点、启动子、目的基因和右复制原点，所述左复制原点如SEQ ID NO.3所示，所述右复制原点如SEQ ID NO.4所示。

在一种实施方式中，所述启动子为启动子P₄₃。

在一种实施方式中，所述线性质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

本发明的第二个目的是提供一种表达***，所述表达***为(a)或(b)，目的基因通过线性质粒表达；其中，

(a)含有所述线性质粒及携带SEQ ID NO.1所示基因簇的质粒；

(b)含有所述线性质粒及在基因组上整合了SEQ ID NO.1所示基因簇的细胞。

在一种实施方式中，(a)为双质粒表达***，(b)为单质粒表达***。

在一种实施方式中，所述双质粒表达***的两个质粒均位于同一细胞中。

在一种实施方式中，携带SEQ ID NO.1所示基因簇的质粒为p43NMK。

在一种实施方式中，双质粒表达***中，携带SEQ ID NO.1所示基因簇的质粒具有如SEQ ID NO.2所示核苷酸序列。

在一种实施方式中，所述线性质粒中表达的绿色荧光蛋白基因可替换为其它目的基因，包括但不限于编码目的蛋白的基因，或参与微生物代谢调控的基因。

在一种实施方式中，所述线性质粒上编码目的蛋白的目的基因包括但不限于绿色荧光蛋白，其GenBank登录号为AF324408.1。

本发明的第三个目的是保护含有所述线性质粒的细胞。

在一种实施方式中，所述细胞是枯草芽孢杆菌细胞。

在一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌为Bacillus subtilis 168△spo0A::lox72，是在Bacillus subtilis 168中敲除了spo0A基因。

在一种实施方式中，所述spo0A基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

本发明的第四个目的是提供所述线性质粒的构建方法，所述方法将带启动子的pP43NMK重组质粒转化入宿主后，通过电转化的方法再将线性质粒转化入宿主。

本发明还要求保护所述线性质粒在表达天然蛋白，人工蛋白，代谢途径基因，多肽中的应用。

有益效果：本发明构建了一种利用噬菌体phi29作为调控开关调控目的基因表达的表达***。应用该***表达绿色荧光蛋白，在摇瓶培养70h后未发生质粒丢失的情况，而对照质粒p43NMK丢失率达到50％。本发明提供的表达工具对于实现枯草芽孢杆菌高效稳定的基因表达，基因编辑，代谢工程改造具有重要的应用价值。

附图说明

图1不同菌株GFP的表达水平；其中，CK：Bacillus subtilis 168野生型，带有含P₄₃启动子的P43NMK重组质粒；P43NMK-P₄₃-Phi29+LP3:Bacillus subtilis 168野生型，带含P₄₃启动子的P43NMK重组质粒和线性质粒LP3；P43NMK-P_lytR-Phi29+LP3:Bacillus subtilis168野生型，带有含P_lytzR启动子的P43NMK重组质粒和线性质粒LP3；

△spo0A-P43NMK-P43-Phi29+LP3:Bacillus subtilis 168△spo0A::lox72，带有含P₄₃启动子的P43NMK重组质粒和线性质粒LP3；P43NMK-P₄₃-GFP：Bacillus subtilis 168△spo0A::lox72，带质粒P43NMK-P₄₃-GFP。

具体实施方式

重组枯草芽孢杆菌种子培养及发酵：

培养基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10。

绿色荧光蛋白表达量的测定方法：在96孔板中每孔加入200μL稀释后的发酵液，使用Cytation3细胞成像微孔板检测仪(美国伯腾仪器有限公司)，激发波长：488nm，发射波长：523nm，增益：60。

实施例1重组质粒pP43NMK-phi29的构建

重组质粒是在Pp43NMK质粒的P₄₃启动子之后***枯草芽孢杆菌phi29噬菌体复制相关基因簇序列，以转化到枯草芽孢杆菌中进行表达。为了将枯草芽孢杆菌phi29噬菌体复制相关基因簇序列引入P₄₃启动子之后，设计引物rh_p43NMK-Phi29_F：5’-GGTACCATTATAGATGGCAAAAATGATGCAGAGAGAAATCAC-3’，rh_p43NMK-Phi29_R：5’-ACGCCAAGCTTTCATCATACAAACATCTCCTTTTAAACAAACGTTTATTTGATTG-3’,以含有枯草芽孢杆菌phi29噬菌体复制相关基因簇序列的大肠杆菌为模板，通过菌落PCR，得到枯草芽孢杆菌phi29噬菌体复制相关基因簇序列片段(如SEQ ID NO.1所示)；设计引物

fx_p43NMK-Phi29_F：5’-GGAGATGTTTGTATGATGAAAGCTTGGCGTAATCATGGTC’，fx_p43NMK-Phi29_R：5’-CATTTTTGCCATCTATAATGGTACCGCTATCACTTTATATTTTACATAATCGC-3’,

以质粒pP43NMK为模板，通过PCR反向扩增得到质粒片段；最后通过GibsonAssembly Clonging Kit(New England Biolabs)构建重组质粒，测序验证，确认重组pP43NMK-Phi29质粒构建成功。然后，将构建成功的pP43NMK-Phi29质粒转化进入枯草芽孢杆菌168，得到枯草芽孢杆菌P43NMK-P₄₃-Phi29。

实施例2线性质粒LP3构建

线性质粒LP3是由四部分组成的，从左到右依次是：左复制原点，P₄₃启动子与GFP编码基因，氯霉素抗性基因，右复制原点。设计引物用以扩增左复制子：

rh1_LP3_F：5’-AAAGTAAGCCCCCACCCTCACATGATACCA-3’，

rh1_LP3_R：5’-CAGCATCTTTCCTCTGCGACACAGACGAAGCGCTA-3’；

设计引物用以扩增绿色荧光蛋白基因：

rh2_LP3_F：5’-CGTCTGTGTCGCAGAGGAAAGATGCTGTTCTTGTAAATGAGTTGCTAG-3’，

rh2_LP3_R：5’-GGGAAAACCCTGGCGTTAACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGT-3’；

设计引物用以扩增氯霉素抗性基因：

rh3_LP3_F：5’-GGAAGCATAAAGTGTTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’，

rh3_LP3_R：5’-CCAATCATAGGAGGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGAT-3’；

设计引物用以扩增右复制子：

rh4_LP3_F：5’-GGGTACCGAGCTCGAATTCCTCCTATGATTGGTTGTCTTATTACCTTACTTC-3’，

rh4_LP3_R：5’-AAAGTAGGGTACAGCGACAACATACACCATTTCC-3’；

以含有相应基因的大肠杆菌为模板，通过菌落PCR，分别得到四个片段，后经融合PCR得到最终LP3模板，纯化后，使用带有5’端磷酸化的引物rh1_LP3_F，rh4_LP3_R，得到线性质粒LP3(核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示)，将LP3以电转化或化转的方式转化进入实施例1构建的宿主枯草芽孢杆菌P43NMK-P₄₃-Phi29中，得到枯草芽孢杆菌P43NMK-P₄₃-Phi29+LP3。

实施例3重组枯草芽孢杆菌P43NMK-P_lytr-Phi29+LP3的构建

具体实施方式同实施例1～2，区别在于，将P₄₃启动子替换为P_lytr，构建获得枯草芽孢杆菌P43NMK-P_lytr-Phi29+LP3。

实施例4重组枯草芽孢杆菌△spo0A-P43NMK-P₄₃-Phi29+LP3的构建

具体实施方式同实施例1～2，区别在于，将枯草芽孢杆菌168替换为枯草芽孢杆菌168△spo0A::lox72，构建获得枯草芽孢杆菌△spo0A-P43NMK-P₄₃-Phi29+LP3。

所述枯草芽孢杆菌168△spo0A::lox72的构建方法为：

设计引物用以扩增左同源臂：

Sqc-Spo0A-F：5’-AGATTCTGCTGCTGGCATCGGCACTAT-3’，

Sqc-Spo0A-1R：5’-CCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCTTGCTACATGTTTACATTCGACAAAACCGC-3’；

设计引物用以扩增壮观酶素抗性基因：

Sqc-Spo0A-2F：5’-GTCGAATGTAAACATGTAGCAAGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAAC-3’，

Sqc-Spo0A-2R：5’-CAGCGCAAACTAATAAATAACGCCAGGGTTTTCCCAGTC-3’；

设计引物用以扩增右同源臂：

Sqc-Spo0A-3F：5’-GACTGGGAAAACCCTGGCGTTATTTATTAGTTTGCGCTGATAAATAGGAGGCG-3’，

Sqc-Spo0A-R：5’-AACATCACTCTGCACTCAAGATATTCAGTCGGTAA-3’；

以含有相应基因的枯草芽孢杆菌168为模板，通过菌落PCR，分别得到三个片段，后经融合PCR得到最终敲除框，纯化后，以电转化或化转的方式转化进入野生型宿主枯草芽孢杆菌168中，得到枯草芽孢杆菌168△spo0A::lox72。

实施例5转化入线性质粒后GFP的表达水平测定

将37℃、750rpm、700μL LB培养基、96孔深孔板中培养10h的枯草芽孢杆菌P43NMK-P₄₃-Phi29+LP3种子液以5％的接种量转入190μL LB培养基，于37℃、750rpm条件下培养至OD₆₀₀＝1。相同条件下，不转化线性质粒的枯草芽孢杆菌P43NMK-P₄₃-Phi29平均荧光强度约为333；而转化线性质粒之后，测得枯草芽孢杆菌P43NMK-P₄₃-Phi29+LP3的荧光强度平均值为3591(图1)。

实施例6质粒丢失率测定

分别将带有普通质粒与线性质粒的菌株使用37℃、750rpm、1mL LB培养基培养种子10h。之后，以5％的接种量转入50mL LB培养基，于37℃、750rpm条件下培养70h。然后，将菌液梯度稀释后，分别涂布无氯霉素平板与含氯霉素抗性的平板，分别计数两种平板的菌落数，质粒丢失率＝(1-无抗平板菌落数/氯霉素抗性平板菌落数)×100％。含线性质粒的菌株在两种平板上的菌落数几乎一致，而含普通质粒的工程菌株质粒丢失率约为50％。

实施例7转化入线性质粒后红色荧光蛋白RFP的表达水平测定

按照实施例2的策略构建表达红色荧光蛋白RFP(SEQ ID NO.6)的线性质粒LP4，在与实施例3相同培养条件下，不转化线性质粒的对照组平均荧光强度约为23；而转化线性质粒之后，测得荧光强度平均值为359。

对照例1构建pP43NMK-GFP重组质粒并验证

pP43NMK载体为目前枯草芽孢杆菌中最常用的高拷贝载体之一，用其表达GFP作为对照。将pP43NMK-GFP重组质粒转化进入宿主后，使用37℃、750rpm、700μL LB条件培养基、96孔深孔板培养种子10h。之后，以5％的接种量转入190μL LB培养基，于37℃、750rpm条件下培养至OD₆₀₀＝1，测得荧光强度平均值为5059，可见，线性质粒的蛋白表达水平达到了常用高拷贝载体蛋白表达水平的70％。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种枯草芽孢杆菌线性质粒***的构建与应用

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 3777

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atggcaaaaa tgatgcagag agaaatcaca aagacaaccg tcaacgttgc caaaatggtg 60

atggtggacg gagaggttca ggtagagcaa ctaccatctg aaacatttgt gggtaatctg 120

acaatggaac aggctcaatg gagaatgaag cgcaaatata aaggcgaacc tgttcaagtg 180

gtaagcgttg aacctaacac agaggtttat gagctacctg tagaaaaatt ccttgaagtt 240

gctaccgttc gggtagagaa agacgaagat caagaggaac aaacagaagc tccagaagaa 300

caggttgctg aatgatggaa acacaagaga aggttctagt attagttgga gcgctattca 360

taaacacctt caatcttaat tataaaagca ttgacctaac acacgattca gaacaagctt 420

acgggtttaa agataaatgg gaagcgcaga aagttgccgc aaatgtaggc ggacaagttg 480

tcatcagaac aaccagtttc aagatcgttt aactcttaac actctcttaa cacgcacgac 540

ctatcaaata aaccaaaatg aaaaggatga ttaataatgg aaaacacaaa catcgtaaag 600

gctacttttg acacagaaac tcttgaagga caaatcaaaa tctttaatgc tcagacaggc 660

ggcggacaat cttttaaaaa ccttccagat ggaacaatta tagaagccaa cgccattgct 720

caatataagc aagtgtccga tacatacggg gacgctaagg aagaaacagt tactactatt 780

tttgcggctg acgggtcgtt atattccgct atctctaaga ctgtagcaga agccgcatct 840

gacttaattg accttgtgac tcgtcataag cttgaaacgt ttaaggttaa agtggttcaa 900

ggaacatcta gtaaaggtaa cgtattcttt agcttacaac tatccctata aacaggaggt 960

aaaatataga tgcctaaaac acaaagaggt atctatcata acttgaagga atctgaatac 1020

gtggcatcta acaccgatgt cacgtttttc ttttcaagtg aattgtattt gaacaagttt 1080

ctcgatggat accaagaata caggaagaaa tttaataaga agatagaacg ggtcgctgtt 1140

acaccgtgga atatggatat gctcgcagac atcacgttct attcagaagt tgaaaagcgt 1200

ggtttccatg cttggttgaa aggagataac gcaacatggc gagaagtcca cgtatacgca 1260

ttaaggataa tgacaaagcc gaatacgctc gattggtcaa gaatacaaaa gccaagattg 1320

cgagaacgaa gaaaaagtat ggtgtagacc ttaccgctga aattgatata cctgaccttg 1380

attcatttga aacacgggcg cagttcaata agtggaagga acaagcgtcc tctttcacta 1440

accgtgctaa tatgcgttat cagttcgaaa agaatgcata cggtgtggtg gctagtaaag 1500

ctaagatagc tgagattgaa cgtaacacaa aagaggttca gcggttagta gatgagaaaa 1560

tcaaggctat gaaagacaaa gaatactatg caggcggtaa gccgcaaggg acaattgaac 1620

aacggatagc tatgacaagt cctgcacacg ttacaggaat taatagaccc catgattttg 1680

actttagcaa ggtgcgaagc tatagccgtt tgcgaaccct agaagaaagc atggagatga 1740

gaacagaccc tcagtattat gaaaagaaaa tgatacagtt acagttaaac tttattaaga 1800

gcgttgaggg tagtttcaat tcatttgatg cggcagatga actgatcgaa gaattaaaaa 1860

agatacctcc tgatgacttc tatgaattgt ttctcagaat atcagaaata tcctttgagg 1920

aatttgatag tgagggaaac acagtggaga acgtagaagg taatgtatat aaaatactgt 1980

catacttgga acagtatcga aggggtgact ttgatctaag cttaaagggg ttctaggctc 2040

cgttaaagga tgaagcatat gccgagaaag atgtatagtt gtgactttga gacaactact 2100

aaagtggaag actgtagggt atgggcgtat ggttatatga atatagaaga tcacagtgag 2160

tacaaaatag gtaatagcct ggatgagttt atggcgtggg tgttgaaggt acaagctgat 2220

ctatatttcc ataacctcaa atttgacgga gcttttatca ttaactggtt ggaacgtaat 2280

ggttttaagt ggtcggctga cggattgcca aacacatata atacgatcat atctcgcatg 2340

ggacaatggt acatgattga tatatgttta ggctacaaag ggaaacgtaa gatacataca 2400

gtgatatatg acagcttaaa gaaactaccg tttcctgtta agaagatagc taaagacttt 2460

aaactaactg ttcttaaagg tgatattgat taccacaaag aaagaccagt cggctataag 2520

ataacacccg aagaatacgc ctatattaaa aacgatattc agattattgc ggaagctctg 2580

ttaattcagt ttaagcaagg tttagaccgg atgacagcag gcagtgacag tctaaaaggt 2640

ttcaaggata ttataaccac taagaaattc aaaaaggtgt ttcctacatt gagtcttgga 2700

ctcgataagg aagtgagata cgcctataga ggtggtttta catggttaaa tgataggttc 2760

aaagaaaaag aaatcggaga aggcatggtc ttcgatgtta atagtctata tcctgcacag 2820

atgtatagcc gtctccttcc atatggtgaa cctatagtat tcgagggtaa atacgtttgg 2880

gacgaagatt acccactaca catacagcat atcagatgtg agttcgaatt gaaagagggc 2940

tatataccca ctatacagat aaaaagaagt aggttttata aaggtaatga gtacctaaaa 3000

agtagcggcg gggagatagc cgacctctgg ttgtcaaatg tagacctaga attaatgaaa 3060

gaacactacg atttatataa cgttgaatat atcagcggct taaaatttaa agcaactaca 3120

ggtttgttta aagattttat agataaatgg acgtacatca agacgacatc agaaggagcg 3180

atcaagcaac tagcaaaact gatgttaaac agtctatacg gtaaattcgc tagtaaccct 3240

gatgttacag ggaaagtccc ttatttaaaa gagaatgggg cgctaggttt cagacttgga 3300

gaagaggaaa caaaagaccc tgtttataca cctatgggcg ttttcatcac tgcatgggct 3360

agatacacga caattacagc ggcacaggct tgttatgatc ggataatata ctgtgatact 3420

gacagcatac atttaacggg tacagagata cctgatgtaa taaaagatat agttgaccct 3480

aagaaattgg gatactgggc acatgaaagt acattcaaaa gagctaaata tctgagacag 3540

aagacctata tacaagacat ctatatgaaa gaagtagatg gtaagttagt agaaggtagt 3600

ccagatgatt acactgatat aaaatttagt gttaaatgtg cgggaatgac tgacaagatt 3660

aagaaagagg ttacgtttga gaatttcaaa gtcggattca gtcggaaaat gaagcctaag 3720

cctgtgcaag tgccgggcgg ggtggttctg gttgatgaca cattcacaat caaataa 3777

<210> 2

<211> 10490

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

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cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120

ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180

accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240

attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300

tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360

tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt ccttaaggaa cgtacagacg 420

gcttaaaagc ctttaaaaac gtttttaagg ggtttgtaga caaggtaaag gataaaacag 480

cacaattcca agaaaaacac gatttagaac ctaaaaagaa cgaatttgaa ctaactcata 540

accgagaggt aaaaaaagaa cgaagtcgag atcagggaat gagtttataa aataaaaaaa 600

gcacctgaaa aggtgtcttt ttttgatggt tttgaacttg ttctttctta tcttgataca 660

tatagaaata acgtcatttt tattttagtt gctgaaaggt gcgttgaagt gttggtatgt 720

atgtgtttta aagtattgaa aacccttaaa attggttgca cagaaaaacc ccatctgtta 780

aagttataag tgactaaaca aataactaaa tagatggggg tttcttttaa tattatgtgt 840

cctaatagta gcatttattc agatgaaaaa tcaagggttt tagtggacaa gacaaaaagt 900

ggaaaagtga gaccatggag agaaaagaaa atcgctaatg ttgattactt tgaacttctg 960

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gttgctgaag ttattaaaca aaagccaaca gttcgttggt tgtttctcac attaacagtt 1200

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cgccgaatga tgcaatataa aaaaattaat aaaaatcttg ttggttttat gcgtgcaacg 1320

gaagtgacaa taaataataa agataattct tataatcagc acatgcatgt attggtatgt 1380

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acacatggtc aatttttctc tattttgccg atttatgatt caggtggata cttagagaaa 2340

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agtgatgaag gctggcgcct cgtagtaatg attcaccggt ttgtacaggt gcggagtcgt 3180

ttattgctgg tactgctagt tgccgcattg aagtagaggg aattgatgaa ttatatcaac 3240

atattaagcc tttgggcatt ttgcacccca atacatcatt aaaagatcag tggtgggatg 3300

aacgagactt tgcagtaatt gatcccgaca acaatttgat tagctttttt caacaaataa 3360

aaagctaaaa tctattatta atctgttcag caatcgggcg cgattgctga ataaaagata 3420

cgagagacct ctcttgtatc ttttttattt tgagtggttt tgtccgttac actagaaaac 3480

cgaaagacaa taaaaatttt attcttgctg agtctggctt tcggtaagct agacaaaacg 3540

gacaaaataa aaattggcaa gggtttaaag gtggagattt tttgagtgat cttctcaaaa 3600

aatactacct gtcccttgct gatttttaaa cgagcacgag agcaaaaccc ccctttgctg 3660

aggtggcaga gggcaggttt ttttgtttct tttttctcgt aaaaaaaaga aaggtcttaa 3720

aggttttatg gttttggtcg gcactgccgc gcctcgcaga gcacacactt tatgaatata 3780

aagtatagtg tgttatactt tacttggaag tggttgccgg aaagagcgaa aatgcctcac 3840

atttgtgcca cctaaaaagg agcgatttac atatgagtta tgcagtttgt agaatgcaaa 3900

aagtgaaatc agctggacta aaaggcatgc aatttcataa tcaaagagag cgaaaaagta 3960

gaacgaatga tgatattgac catgagcgaa cacgtgaaaa ttatgatttg aaaaatgata 4020

aaaatattga ttacaacgaa cgtgtcaaag aaattattga atcacaaaaa acaggtacaa 4080

gaaaaacgag gaaagatgct gttcttgtaa atgagttgct agtaacatct gaccgagatt 4140

tttttgagca actggatcct gataggtggt atgttttcgc ttgaactttt aaatacagcc 4200

attgaacata cggttgattt aataactgac aaacatcacc ctcttgctaa agcggccaag 4260

gacgccgccg ccggggctgt ttgcgttctt gccgtgattt cgtgtaccat tggtttactt 4320

atttttttgc caaggctgta atggctgaaa attcttacat ttattttaca tttttagaaa 4380

tgggcgtgaa aaaaagcgcg cgattatgta aaatataaag tgatagcggt accattatag 4440

atggcaaaaa tgatgcagag agaaatcaca aagacaaccg tcaacgttgc caaaatggtg 4500

atggtggacg gagaggttca ggtagagcaa ctaccatctg aaacatttgt gggtaatctg 4560

acaatggaac aggctcaatg gagaatgaag cgcaaatata aaggcgaacc tgttcaagtg 4620

gtaagcgttg aacctaacac agaggtttat gagctacctg tagaaaaatt ccttgaagtt 4680

gctaccgttc gggtagagaa agacgaagat caagaggaac aaacagaagc tccagaagaa 4740

caggttgctg aatgatggaa acacaagaga aggttctagt attagttgga gcgctattca 4800

taaacacctt caatcttaat tataaaagca ttgacctaac acacgattca gaacaagctt 4860

acgggtttaa agataaatgg gaagcgcaga aagttgccgc aaatgtaggc ggacaagttg 4920

tcatcagaac aaccagtttc aagatcgttt aactcttaac actctcttaa cacgcacgac 4980

ctatcaaata aaccaaaatg aaaaggatga ttaataatgg aaaacacaaa catcgtaaag 5040

gctacttttg acacagaaac tcttgaagga caaatcaaaa tctttaatgc tcagacaggc 5100

ggcggacaat cttttaaaaa ccttccagat ggaacaatta tagaagccaa cgccattgct 5160

caatataagc aagtgtccga tacatacggg gacgctaagg aagaaacagt tactactatt 5220

tttgcggctg acgggtcgtt atattccgct atctctaaga ctgtagcaga agccgcatct 5280

gacttaattg accttgtgac tcgtcataag cttgaaacgt ttaaggttaa agtggttcaa 5340

ggaacatcta gtaaaggtaa cgtattcttt agcttacaac tatccctata aacaggaggt 5400

aaaatataga tgcctaaaac acaaagaggt atctatcata acttgaagga atctgaatac 5460

gtggcatcta acaccgatgt cacgtttttc ttttcaagtg aattgtattt gaacaagttt 5520

ctcgatggat accaagaata caggaagaaa tttaataaga agatagaacg ggtcgctgtt 5580

acaccgtgga atatggatat gctcgcagac atcacgttct attcagaagt tgaaaagcgt 5640

ggtttccatg cttggttgaa aggagataac gcaacatggc gagaagtcca cgtatacgca 5700

ttaaggataa tgacaaagcc gaatacgctc gattggtcaa gaatacaaaa gccaagattg 5760

cgagaacgaa gaaaaagtat ggtgtagacc ttaccgctga aattgatata cctgaccttg 5820

attcatttga aacacgggcg cagttcaata agtggaagga acaagcgtcc tctttcacta 5880

accgtgctaa tatgcgttat cagttcgaaa agaatgcata cggtgtggtg gctagtaaag 5940

ctaagatagc tgagattgaa cgtaacacaa aagaggttca gcggttagta gatgagaaaa 6000

tcaaggctat gaaagacaaa gaatactatg caggcggtaa gccgcaaggg acaattgaac 6060

aacggatagc tatgacaagt cctgcacacg ttacaggaat taatagaccc catgattttg 6120

actttagcaa ggtgcgaagc tatagccgtt tgcgaaccct agaagaaagc atggagatga 6180

gaacagaccc tcagtattat gaaaagaaaa tgatacagtt acagttaaac tttattaaga 6240

gcgttgaggg tagtttcaat tcatttgatg cggcagatga actgatcgaa gaattaaaaa 6300

agatacctcc tgatgacttc tatgaattgt ttctcagaat atcagaaata tcctttgagg 6360

aatttgatag tgagggaaac acagtggaga acgtagaagg taatgtatat aaaatactgt 6420

catacttgga acagtatcga aggggtgact ttgatctaag cttaaagggg ttctaggctc 6480

cgttaaagga tgaagcatat gccgagaaag atgtatagtt gtgactttga gacaactact 6540

aaagtggaag actgtagggt atgggcgtat ggttatatga atatagaaga tcacagtgag 6600

tacaaaatag gtaatagcct ggatgagttt atggcgtggg tgttgaaggt acaagctgat 6660

ctatatttcc ataacctcaa atttgacgga gcttttatca ttaactggtt ggaacgtaat 6720

ggttttaagt ggtcggctga cggattgcca aacacatata atacgatcat atctcgcatg 6780

ggacaatggt acatgattga tatatgttta ggctacaaag ggaaacgtaa gatacataca 6840

gtgatatatg acagcttaaa gaaactaccg tttcctgtta agaagatagc taaagacttt 6900

aaactaactg ttcttaaagg tgatattgat taccacaaag aaagaccagt cggctataag 6960

ataacacccg aagaatacgc ctatattaaa aacgatattc agattattgc ggaagctctg 7020

ttaattcagt ttaagcaagg tttagaccgg atgacagcag gcagtgacag tctaaaaggt 7080

ttcaaggata ttataaccac taagaaattc aaaaaggtgt ttcctacatt gagtcttgga 7140

ctcgataagg aagtgagata cgcctataga ggtggtttta catggttaaa tgataggttc 7200

aaagaaaaag aaatcggaga aggcatggtc ttcgatgtta atagtctata tcctgcacag 7260

atgtatagcc gtctccttcc atatggtgaa cctatagtat tcgagggtaa atacgtttgg 7320

gacgaagatt acccactaca catacagcat atcagatgtg agttcgaatt gaaagagggc 7380

tatataccca ctatacagat aaaaagaagt aggttttata aaggtaatga gtacctaaaa 7440

agtagcggcg gggagatagc cgacctctgg ttgtcaaatg tagacctaga attaatgaaa 7500

gaacactacg atttatataa cgttgaatat atcagcggct taaaatttaa agcaactaca 7560

ggtttgttta aagattttat agataaatgg acgtacatca agacgacatc agaaggagcg 7620

atcaagcaac tagcaaaact gatgttaaac agtctatacg gtaaattcgc tagtaaccct 7680

gatgttacag ggaaagtccc ttatttaaaa gagaatgggg cgctaggttt cagacttgga 7740

gaagaggaaa caaaagaccc tgtttataca cctatgggcg ttttcatcac tgcatgggct 7800

agatacacga caattacagc ggcacaggct tgttatgatc ggataatata ctgtgatact 7860

gacagcatac atttaacggg tacagagata cctgatgtaa taaaagatat agttgaccct 7920

aagaaattgg gatactgggc acatgaaagt acattcaaaa gagctaaata tctgagacag 7980

aagacctata tacaagacat ctatatgaaa gaagtagatg gtaagttagt agaaggtagt 8040

ccagatgatt acactgatat aaaatttagt gttaaatgtg cgggaatgac tgacaagatt 8100

aagaaagagg ttacgtttga gaatttcaaa gtcggattca gtcggaaaat gaagcctaag 8160

cctgtgcaag tgccgggcgg ggtggttctg gttgatgaca cattcacaat caaataaacg 8220

tttgtttaaa aggagatgtt tgtatgatga aagcttggcg taatcatggt catagctgtt 8280

tcctgtgtga aattgttatc cgctcacaat tccacacaac atacgagccg gaagcataaa 8340

gtgtaaagcc tggggtgcct aatgagtgag ctaactcaca ttaattgcgt tgcgctcact 8400

gcccgctttc cagtcgggaa acctgtcgtg ccagctgcat taatgaatcg gccaacgcgc 8460

ggggagaggc ggtttgcgta ttgggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg 8520

ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa tacggttatc 8580

cacagaatca ggggataacg caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag 8640

gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca 8700

tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca 8760

ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg 8820

atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag 8880

gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt 8940

tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca 9000

cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg 9060

cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc tacactagaa gaacagtatt 9120

tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc 9180

cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg 9240

cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg 9300

gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta 9360

gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa agtatatatg agtaaacttg 9420

gtctgacagt taccaatgct taatcagtga ggcacctatc tcagcgatct gtctatttcg 9480

ttcatccata gttgcctgac tccccgtcgt gtagataact acgatacggg agggcttacc 9540

atctggcccc agtgctgcaa tgataccgcg agacccacgc tcaccggctc cagatttatc 9600

agcaataaac cagccagccg gaagggccga gcgcagaagt ggtcctgcaa ctttatccgc 9660

ctccatccag tctattaatt gttgccggga agctagagta agtagttcgc cagttaatag 9720

tttgcgcaac gttgttgcca ttgctacagg catcgtggtg tcacgctcgt cgtttggtat 9780

ggcttcattc agctccggtt cccaacgatc aaggcgagtt acatgatccc ccatgttgtg 9840

caaaaaagcg gttagctcct tcggtcctcc gatcgttgtc agaagtaagt tggccgcagt 9900

gttatcactc atggttatgg cagcactgca taattctctt actgtcatgc catccgtaag 9960

atgcttttct gtgactggtg agtactcaac caagtcattc tgagaatagt gtatgcggcg 10020

accgagttgc tcttgcccgg cgtcaatacg ggataatacc gcgccacata gcagaacttt 10080

aaaagtgctc atcattggaa aacgttcttc ggggcgaaaa ctctcaagga tcttaccgct 10140

gttgagatcc agttcgatgt aacccactcg tgcacccaac tgatcttcag catcttttac 10200

tttcaccagc gtttctgggt gagcaaaaac aggaaggcaa aatgccgcaa aaaagggaat 10260

aagggcgaca cggaaatgtt gaatactcat actcttcctt tttcaatatt attgaagcat 10320

ttatcagggt tattgtctca tgagcggata catatttgaa tgtatttaga aaaataaaca 10380

aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccacct gacgtctaag aaaccattat 10440

tatcatgaca ttaacctata aaaataggcg tatcacgagg ccctttcgtc 10490

<210> 3

<211> 191

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

aaagtaagcc cccaccctca catgatacca ttctcctaat atcgacataa tccgtcgatc 60

ctcggcatac catgatcagg gagggaaact actacttaat atatcaatct atagacctac 120

tagataggtt tgtcaatgaa caacataaaa cgacacagaa tcccacgttt tagcgcttcg 180

tctgtgtcgc a 191

<210> 4

<211> 194

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cctcctatga ttggttgtct tattacctta cttctattat agtataacat gttaaacgat 60

agtttgtcta cccttttcga caaattgatg ataataaata gtataggtat atagtcgtga 120

tttagttgtt agattcttgt cgaagatagt cggtcaatgg ggaaatggtg tatgttgtcg 180

ctgtacccta cttt 194

<210> 5

<211> 2878

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

aaagtaagcc cccaccctca catgatacca ttctcctaat atcgacataa tccgtcgatc 60

ctcggcatac catgatcagg gagggaaact actacttaat atatcaatct atagacctac 120

tagataggtt tgtcaatgaa caacataaaa cgacacagaa tcccacgttt tagcgcttcg 180

tctgtgtcgc agaggaaaga tgctgttctt gtaaatgagt tgctagtaac atctgaccga 240

gatttttttg agcaactgga tcctgatagg tggtatgttt tcgcttgaac ttttaaatac 300

agccattgaa catacggttg atttaataac tgacaaacat caccctcttg ctaaagcggc 360

caaggacgcc gccgccgggg ctgtttgcgt tcttgccgtg atttcgtgta ccattggttt 420

acttattttt ttgccaaggc tgtaatggct gaaaattctt acatttattt tacattttta 480

gaaatgggcg tgaaaaaaag cgcgcgatta tgtaaaatat aaagtgatag cggtaccatt 540

ataggtaaga gaggaatgta cacatgaaaa tcaaaaacaa ccaacaaaaa aatgaactga 600

ttcaaatgag taaaggagaa gaacttttca ctggagttgt cccaattctt gttgaattag 660

atggtgatgt taatgggcac aaattttctg tcagtggaga gggtgaaggt gatgcaacat 720

acggaaaact tacccttaaa tttatttgca ctactggaaa gcttcctgtt ccttggccaa 780

cacttgtcac tactcttact tatggtgttc aatgcttttc aagataccca gatcatatga 840

agcggcacga cttcttcaag agcgccatgc ctgagggata cgtgcaggag aggaccatct 900

tcttcaagga cgacgggaac tacaagacac gtgctgaagt caagtttgag ggagacaccc 960

tcgtcaacag aatcgagctt aagggaatcg atttcaagga ggacggaaac atcctcggcc 1020

acaagttgga atacaactac aactcccaca acgtatacat catggcagac aaacaaaaga 1080

atggaatcaa agttaacttc aaaattagac acaacattga agatggaagc gttcaactag 1140

cagaccatta tcaacaaaat actccaattg gcgatggccc tgtcctttta ccagacaacc 1200

attacctgtc cacacaatct gccctttcga aagatcccaa cgaaaagaga gaccacatgg 1260

tccttcttga gtttgtaaca gctgctggga ttacacatgg catggatgaa ctatacaaat 1320

aatgatgaaa gcttggcgta atcatggtca tagctgtttc ctgtgtgaaa ttgttatccg 1380

ctcacaattc cacacaacat acgagccgga agcataaagt gttaacgcca gggttttccc 1440

agtcacgacg ttgtaaaacg acggccagtg ccaagcttgc atgcctgcag gtcgacgatt 1500

ctaccgttcg tataatgtat gctatacgaa gttatttatt ggtatgactg gttttaagcg 1560

caaaaaaagt tgctttttcg tacctattaa tgtatcgtta gaaaaccgac tgtaaaaagt 1620

acagtcggca ttatctcata ttataaaagc cagtcattag gcctatctga caattcctga 1680

atagagttca taaacaatcc tgcatgataa ccatcacaaa cagaatgatg tacctgtaaa 1740

gatagcggta aatatattga attaccttta ttaatgaatt ttcctgctgt aataatgggt 1800

agaaggtaat tactattatt attgatattt aagttaaacc cagtaaatga agtccatgga 1860

ataatagaaa gagaaaaagc attttcaggt ataggtgttt tgggaaacaa tttccccgaa 1920

ccattatatt tctctacatc agaaaggtat aaatcataaa actctttgaa gtcattcttt 1980

acaggagtcc aaataccaga gaatgtttta gatacaccat caaaaattgt ataaagtggc 2040

tctaacttat cccaataacc taactctccg tcgctattgt aaccagttct aaaagctgta 2100

tttgagttta tcacccttgt cactaagaaa ataaatgcag ggtaaaattt atatccttct 2160

tgttttatgt ttcggtataa aacactaata tcaatttctg tggttatact aaaagtcgtt 2220

tgttggttca aataatgatt aaatatctct tttctcttcc aattgtctaa atcaatttta 2280

ttaaagttca tttgatatgc ctcctaaatt tttatctaaa gtgaatttag gaggcttact 2340

tgtctgcttt cttcattaga atcaatcctt ttttaaaagt caatattact gtaacataaa 2400

tatatatttt aaaaatatcc cactttatcc aattttcgtt tgttgaacta atgggtgctt 2460

tagttgaaga ataaaagacc acattaaaaa atgtggtctt ttgtgttttt ttaaaggatt 2520

tgagcgtagc gaaaaatcct tttctttctt atcttgataa taagggtaac tattgccgtc 2580

gtccattccg acagcatcgc cagtcactat ggcataactt cgtataatgt atgctatacg 2640

aacggtacaa tctctagagg atccccgggt accgagctcg aattcctcct atgattggtt 2700

gtcttattac cttacttcta ttatagtata acatgttaaa cgatagtttg tctacccttt 2760

tcgacaaatt gatgataata aatagtatag gtatatagtc gtgatttagt tgttagattc 2820

ttgtcgaaga tagtcggtca atggggaaat ggtgtatgtt gtcgctgtac cctacttt 2878

<210> 6

<211> 699

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

atggtttctg aactgatcaa agaaaacatg cacatgaaac tgtacatgga aggtaccgtt 60

aacaaccacc acttcaaatg cacctctgaa ggtgaaggta aaccgtacga aggtacccag 120

accatgcgta tcaaagctgt tgaaggtggt ccgctgccgt tcgcttttga catcctggct 180

acctctttca tgtacggttc taaaaccttc atcaaccaca cccagggtat cccggacttt 240

ttcaaacagt ctttcccgga aggtttcacc tgggaacgtg ttaccaccta cgaagacggt 300

ggtgttctga ccgctaccca ggacacctct ctgcaagacg gttgcctgat ctacaacgtt 360

aaaatccgtg gtgttaactt cccgtctaac ggtccggtta tgcagaaaaa aaccctgggt 420

tgggaagctt ctaccgaaac cctgtacccg gctgacggtg gtctggaagg tcgtgctgac 480

atggctctga aactggttgg tggtggtcac ctgatctgca acctgaaaac cacctaccgt 540

tctaaaaaac cggctaaaaa cctgaaaatg ccgggtgttt actacgttga ccgtcgtctg 600

gaacgtatca aagaagctga caaagaaacc tacgttgaac agcacgaagt tgctgttgct 660

cgttactgcg acctgccgtc taaactgggt caccgttaa 699

<210> 7

<211> 804

<212> DNA

<213> Bacillus subtilis

<400> 7

gtggagaaaa ttaaagtttg tgttgctgat gataatcgag agctggtaag cctgttaagt 60

gaatatatag aaggacagga agacatggaa gtgatcggcg ttgcttataa cggacaggaa 120

tgcctgtcgc tgtttaaaga aaaagatccc gatgtgctcg tattagatat tattatgccg 180

catctagacg gacttgcggt tttagagagg ctgagggaat cagatctgaa aaaacagccg 240

aatgtcatta tgctgacagc ctttgggcag gaagatgtca cgaaaaaggc cgtcgattta 300

ggcgcgtcct actttattct caaaccgttt gatatggaaa accttgtcgg ccatatccgc 360

caggtcagcg gaaatgccag cagtgtgacg catcgtgcgc catcatcgca aagcagtatt 420

atacgcagca gccagcctga accaaagaag aaaaatctcg acgcgagcat cacaagcatt 480

atccatgaaa tcggcgtccc agcccatatt aaaggctatc tctatctgcg cgaagcaatc 540

tcaatggtat acaatgacat cgaattgctc ggcagcatta caaaagtcct ctatccggac 600

atcgccaaaa aatttaacac aaccgcaagc cgtgtagaaa gagcgatccg ccatgcaatt 660

gaagtggcat ggagcagagg aaacattgat tccatttcct cgttgtttgg ttatactgtc 720

agcatgacaa aagctaaacc taccaacagt gaattcattg caatggttgc ggataagctg 780

aggttagagc ataaggcttc ttaa 804

Claims (9)

1.一种基因表达***，其特征在于，所述表达***含有线性质粒及（a）或（b），所述线性质粒从5’端向3’端依次含有左复制原点、启动子、目的基因和右复制原点，所述左复制原点如SEQ ID NO.3所示，所述右复制原点如SEQ ID NO.4所示；其中，

（a）为携带SEQ ID NO.1所示基因簇的质粒；

（b）为在基因组上整合了SEQ ID NO.1所示基因簇的细胞；

所述细胞是枯草芽孢杆菌细胞。

2.根据权利要求1所述的基因表达***，其特征在于，所述启动子为启动子P_lytr或P₄₃。

3.根据权利要求1所述的基因表达***，其特征在于，所述携带SEQ ID NO.1所示基因簇的质粒核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述线性质粒的序列如SEQ ID NO.5所示。

4.根据权利要求3所述的基因表达***，其特征在于，所述线性质粒中编码绿色荧光蛋白基因替换为其它目的基因，所述其它目的基因为编码目的蛋白的基因。

5.含有线性质粒的细胞；

所述线性质粒依次含有左复制原点、启动子、目的基因和右复制原点，所述左复制原点如SEQ ID NO.3所示，所述右复制原点如SEQ ID NO.4所示；

所述细胞还含有携带SEQ ID NO.1所示基因簇的质粒，或所述细胞基因组上整合了SEQID NO.1所示基因簇；

所述细胞是枯草芽孢杆菌细胞。

6.根据权利要求5所述的细胞，其特征在于，所述细胞是枯草芽孢杆菌168或枯草芽孢杆菌168 △spo0A::lox72；

所述枯草芽孢杆菌168 △spo0A::lox72，是在枯草芽孢杆菌168中敲除了spo0A基因，所述spo0A基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

7.一种构建权利要求1~4任一所述基因表达***的方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）构建含有左复制原点、启动子、目的基因和右复制原点的线性质粒；（2）将步骤（1）构建的线性质粒转入整合有SEQ ID NO.1所示基因的宿主细胞中，或将步骤（1）构建的线性质粒与含有携带SEQ ID NO.1所示基因的质粒转入宿主细胞中。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中左复制原点、启动子、目的基因和右复制原点通过吉布森组装融合。

9.权利要求1~4任一所述的基因表达***在表达天然蛋白、人工蛋白或多肽中的应用。

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