CN114634955B - 一种生物酶催化制备l-叔亮氨酸的方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种生物酶催化制备L‑叔亮氨酸的方法及其应用。所述生物酶催化制备L‑叔亮氨酸的方法包括如下步骤：以2‑羟基‑3,3‑二甲基丁酸为底物，在2‑羟基酸脱氢酶与亮氨酸脱氢酶的催化下反应得到L‑叔亮氨酸。本发明采用三甲基丙酮酸的前体2‑羟基‑3,3‑二甲基丁酸作为底物，用筛选出的特异性的2‑羟基酸脱氢酶与亮氨酸脱氢酶偶联反应，实现了辅酶NADH自循环，节约了成本；三甲基丙酮酸生成后就被L‑亮氨酸脱氢酶转化成L‑叔亮氨酸，不会存在底物抑制。所述生物酶催化制备L‑叔亮氨酸的方法具有操作简单、无需添加额外NADH、收率高和生产成本低等优势，环保安全、绿色无污染，在工业生产上具有广阔的应用前景。

Description

一种生物酶催化制备L-叔亮氨酸的方法及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种生物酶催化制备L-叔亮氨酸的方法及其应用。
背景技术
叔亮氨酸是一种非天然氨基酸，是一种亮氨酸衍生物，叔亮氨酸的空间位阻大、疏水性强，适合用于药物制造，比如抗病毒药物，例如抗艾滋病药物阿扎那韦、抗丙肝病毒药物特拉匹韦以及最近的Paxlovid；L-叔亮氨酸的市场需求越来越大，现有的L-叔亮氨酸的合成方法主要包括拆分法、化学合成法和酶催化合成法。
CN105399642A公开了一种同时制备D-型叔亮氨酸和L-型叔亮氨酸的方法，所述方法包括以下步骤：将正丁醇与1,1-二氯乙烯反应，得到产物3,3-二甲基丁酸；在3,3-二甲基丁酸中加入催化剂，同时通入空气和氯气，进行氯代反应，得到2-氯-3,3-二甲基丁酸；对得到的2- 氯-3,3-二甲基丁酸进行氨解反应，得到D-,L-叔亮氨酸，对得到的D-,L-叔亮氨酸进行乙酰化和氯乙酰化，然后用L-热稳定氨基酸酰化酶进行拆分和其它处理，分别得到L-叔亮氨酸和 D-叔亮氨酸。但是采用化学合成法的收率低，需要使用有毒的气体，污染环境，工艺路线较长。
CN102533888A公开了一种使用酶连续拆分含氮有机化合物外消旋体制备旋光异构体的方法，所述方法以N-苯乙酰-DL-叔亮氨酸和无机碱为原料，通过氨基酰化酶反应柱，在酶催化作用下选择性水解N-苯乙酰-L-叔亮氨酸，生成L-叔亮氨酸和苯乙酸，反应结束后，将反应液调酸，酸化后抽滤，从滤液中提纯得到L-叔亮氨酸，从滤渣中分离出未反应的N-苯乙酰 -D-叔亮氨酸，将N-苯乙酰-D-叔亮氨酸经高温回流消旋后再投入拆分反应，从而实现连续化的循环拆分N-苯乙酰-DL-叔亮氨酸，制备L-叔亮氨酸。
CN104561161A公开了一种海洋酶催化不对称还原制备手性叔亮氨酸的方法及酶，所述酶是一种亮氨酸脱氢酶，所述亮氨酸脱氢酶来源于柴油食烷菌(Alcanivoraxdieselolei)。所述方法包括以下步骤：构建表达所述亮氨酸脱氢酶的工程菌，培养所述工程菌制备细胞液，利用细胞液催化三甲基丙酮酸不对称还原胺化得到产物手性叔亮氨酸。
酶催化具有绿色无污染的优势，并且光学纯度高，酶催化主要是用三甲基丙酮酸酶催化合成，但是底物和辅酶占成本的主要部分，同时在反应过程中存在底物抑制作用。因此，提供一种实现辅酶NADH自循环且没有底物抑制的生物酶催化制备L-叔亮氨酸的方法具有重要应用前景。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种生物酶催化制备L-叔亮氨酸的方法及其应用。本发明采用三甲基丙酮酸的前体2-羟基-3,3-二甲基丁酸作为底物，用筛选出的特异性的2-羟基酸脱氢酶与亮氨酸脱氢酶偶联反应，实现了辅酶NADH自循环，不用额外添加辅酶循环体系；三甲基丙酮酸生成后被L-亮氨酸脱氢酶反应掉转化成L-叔亮氨酸，没有底物抑制作用；本发明所述2-羟基酸脱氢酶是从乳酸菌属中筛选出来的，对α-羟基丁酸具有较宽的底物选择性。本发明中所述生物酶催化制备L-叔亮氨酸的方法具有操作简单、无需添加额外NADH、收率高和生产成本低等优势，环保安全、绿色无污染，在工业生产上具有广阔的应用前景。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种生物酶催化制备L-叔亮氨酸的方法，所述生物酶催化制备L- 叔亮氨酸的方法包括如下步骤：
以2-羟基-3,3-二甲基丁酸为底物，在2-羟基酸脱氢酶与亮氨酸脱氢酶的催化下反应得到 L-叔亮氨酸。
优选地，所述2-羟基酸脱氢酶包括D-2-羟基酸脱氢酶和L-2-羟基酸脱氢酶。
优选地，所述D-2-羟基酸脱氢酶的编码基因包括SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
优选地，所述L-2-羟基酸脱氢酶的编码基因包括SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
优选地，所述亮氨酸脱氢酶包括L-亮氨酸脱氢酶。
本发明以2-羟基-3,3-二甲基丁酸作为底物，在2-羟基酸脱氢酶与亮氨酸脱氢酶的催化下反应得到L-叔亮氨酸，本发明中的方法为酶催化生物合成法，具有操作简单、无需添加额外 NADH、收率高、生产成本低等优势。
优选地，所述L-亮氨酸脱氢酶的编码基因包括SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。
SEQ ID NO.1：
ATGAAGATCATCGCGTACGGCATTCGTGATGATGAACAGCCGTATCTGGAACAGTG GTCTAAAGACCAGGGTATCGAAGTTAAGGCGGTTAAAGAGCTGCTGGATGACTCCACCG TTGATCTGGCTAAGGGTTACGACGGCGCGGTGGTGTACCAGCAGAAACCGTACACCGCT TCCGTTCTGGATAAACTGGCGGCGAACGGTGTTACTAACCTGAGCCTGCGCAATGTTGG TGTCGACAACGTAGACGCGGACGCCGTGAAACGTAACGGTTTCAAGGTTACGAACGTACCAGCATACAGCCCGGAAGCCATCGCGGAGTTCACCGTTACTGAACTGATGCGTCTGCT GCGCCGTACTCCAACCTTTGACCGCAAACAGGCGAACGGCGATCTGCGTTGGGCACCA GATATCGCGGATGAACTGAACAGCATGACCGTGGGCGTTGTAGCGACCGGTCGCATTGG TCGTGCGGCAATGAAAATCTACCAGGGCTTTGGCGCGAAAGTTATCGCATACGACGTGT TTCACAACCCAGAACTGGAAAAACAGGGCATCTACGTAGATACGATGGACGAACTGTAC GCACAGGCTGACGTAATCTCTCTGCATGCACCGGCAACTAAAGACAACGAAAAAATGAT CAATGATGACGCTTTTTCCAAAATGAAAGATGGTGTTTGGCTGCTGAACCCGGCACGTG GTGCACTGGTAGACACCGATGCACTGATCCGTGCGCTGGATTCTGGCAAAGTAGCAGGT GCGGCTCTGGACGTTTACGAAGACGAAGTGGGTATCTTCAACACCGACTTCGGTTCCTT CGACGCAATCCCGGATGAACGTCTGAAAAACCTGATGAAACGTGAGAACGTTCTGGTG TCCCCGCATATCGCCTTCTACACCAAAACTGCCGTGAAAAACATGGTGCAGTATGCACTG AACAACAACAAACAGCTGATTGAAACCGGTAAAGCCGACAATGTAGTAAAATTCTAA。
SEQ ID NO.2：
ATGTCCAACACTCCGAACCACCAAAAAGTTGTTCTGGTGGGTGATGGTGCAGTGGG TTCCTCTTTCGCTTTCGCAATGGCCCAGCAGGGCATCGCGGAAGAGTTCGTAGTAGTAG ACGTGATCAAAGAGCGTACTCAGGGCGACGCACTGGATCTGGAAGACGCTACGCCGTT CACCTCTCCGAAAAAAATCTACTCCGGTGAGTACTCTGACTGCAAAGATGCTGACCTGG TTGTGATCACTGCTGGCGCACCGCAGAAACCGGGTGAAACCCGTCTGGACCTGGTGAA CAAGAATCTGAAGATTCTGAGCACCATCGTTAAACCGATTGTTGATTCTGGCTTCAACGG CATCTTCCTGGTAGCAGCGAACCCGGTTGACATCCTGACTTATGCGACTTGGAAATTTTC TGGTTTCCCGAAAGAAAAAGTTATTGGTTCTGGCATCTCTCTGGATACCGCTCGTCTGCG CGTAGCTCTGGGTAAAAAATTTAATATTAGCCCGGCATCTGTTGACGCTTACATTCTGGGT GAACACGGCGATTCCGAATTTGCAGGTTACAGCGCAGCGACCATCGGCACCAAACCGCTGCTGGAAATCGCCAAGGAAGAAGGTGTAAGCACCGACGACCTGGCTAAAATCGAAGAC GAAGTGCGTAATAAAGCTTATGAAATCATCAACAAAAAAGGTGCGACCTTCTACGGTGT AGCTACTGCTATGACCCGCATCAGCAAGGCCATCCTGCGTGATGAGAACGCCGTACTGC CGGTATCCGCGTATATGGATGGCCAGTATGATGGCCTGAAAGACATCTATATCGGTACTCC AGCGGTTATCAACGGCTCTGGTCTGGCACGTGTTATCGAATCTCCACTGAACGCGGACG AAAAGCAGAAAATGGCAGCATCCGCAAAAACCCTGAAGAAAGTTCTGAACGACGGCCT GGCCAACCTGGAAAAATAA。
SEQ ID NO.3：
ATGGCGCTGGAGATCTTCGAGTATCTGGAGAAATATGATTATGAGCAGGTGGTCTTC TGCCAGGATAAGGAGTCGGGCCTGAAGGCCATCATCGCGATCCATGATACCACCCTGGG CCCCGCGCTGGGCGGCACCCGCATGTGGACCTATGATTCGGAGGAGGCGGCCATCGAGG ATGCCCTGCGCCTGGCGAAGGGCATGACCTATAAGAACGCCGCGGCCGGCCTGAACCTG GGCGGCGCGAAGACCGTCATCATCGGCGATCCGCGCAAGGATAAATCGGAGGCCATGTTCCGCGCGCTGGGCCGCTATATCCAGGGCCTGAACGGCCGCTATATCACCGCCGAGGATG TGGGCACCACCGTCGATGATATGGATATCATCCATGAGGAGACCGATTTTGTCACCGGCA TCTCGCCCTCGTTTGGCTCGTCGGGCAACCCGTCGCCGGTGACCGCGTATGGCGTCTATC GCGGCATGAAAGCGGCGGCGAAAGAGGCGTTCGGCACCGATTCGCTGGAGGGCAAAG TGATCGCGGTCCAGGGCGTGGGCAACGTCGCGTATCATCTGTGCAAGCATCTGCATGCC GAGTCGGCCCAGCTGATCGTGACCGATATCAACAAGGAGGCCGTGCAGCGCGCGGTCG AGGAGTTTGGCGCCACCGCGGTCGAGCCCAACGAGATCTATTCGGTCGAGTGCGATATC TATGCCCCCTGCGCGCTGGGCGCCACCATCAATGATGAGACCATCCCCCAGTTCAAAGC GAAGGTCATCGCCGGCTCGGCCAACAACCAGCTGAAGGAGGATCGCCATGGCGATACC ATCCATGAGATGGGCATCGTCTATGCGCCGGATTATGTCATCAACGCGGGCGGCGTGATC AACGTGGCGGATGAGCTGTATGGCTATAACCGCGAGCGCGCCCTGAAGCGCGTCGAGTC GATCTATGATACCATCGCCAAGGTCATCGAGATCTCGAAGCGCGATGGCGTGCCCACCTA TGTCGCCGCGGATCGCCTGGCGGAGGAGCGCATCGCGTCGCTGAAAAACACCCGCTCG ACCTATCTGCGCAACGGCCATGATATCATCTCGCGCCGCTGA。
在本发明中，所述D-2-羟基酸脱氢酶、L-2-羟基酸脱氢酶和L-亮氨酸脱氢酶的组合方式，在以2-羟基-3,3-二甲基丁酸为底物的生物催化反应中具有较高的反应效率，所得产物的得率较高。本发明在众多2-羟基酸脱氢酶中发现D-2-羟基酸脱氢酶和L-2-羟基酸脱氢酶对底物2- 羟基-3,3-二甲基丁酸的催化效率更高，选择性更强；同时D-2-羟基酸脱氢酶和L-2-羟基酸脱氢酶在催化2-羟基-3,3-二甲基丁酸转化成3,3-二甲基2氧代丁酸会生成NADH，生成的NADH 能够作为第二步生物催化反应的辅因子，两步反应相互偶联，有利于增加反应的效率。
优选地，所述生物催化反应包括如下步骤：
将2-羟基-3,3-二甲基丁酸、氨基供体和水混合，加热升温，调节反应液的pH，加入2- 羟基酸脱氢酶与亮氨酸脱氢酶的混合酶粉和NAD+，进行生物催化反应。
优选地，所述2-羟基-3,3-二甲基丁酸、氨基供体和水混合的质量比为(1.3～1.5):(0.8～1.5):(20～40)，例如可以是1.3:0.8:20、1.4:1:25、1.5:1.2:30或1.5:1.5:40等。
优选地，所述氨基供体包括硫酸铵。
在本发明中，硫酸铵作为氨基供体参与生物催化反应，同时也可以作为生物催化的缓冲体系。在生物催化反应中，减少或增加硫酸铵的比例，会影响反应液的缓冲体系，抑制混合酶粉的催化活性；同时，氨基供体减少会降低反应的速率，降低产物的收率和纯度。
优选地，所述加热的温度为38～42℃，例如可以是38℃、39℃、39℃、40℃、41℃或42℃等。
优选地，采用pH调节剂调节反应液的pH为8.5～9.5，例如可以是8.5、8.7、8.9、9.0、 9.1、9.3或9.5等。
在本发明中，所述生物催化反应的温度和pH值影响产物的收率和纯度，本发明采用酶催化的方法制备L-叔亮氨酸，通过调节温度和pH值使D-2-羟基酸脱氢酶、L-2-羟基酸脱氢酶和L-亮氨酸脱氢酶均能达到最佳反应活性，从而提高反应的效率。
优选地，所述pH调节剂包括氨水。
优选地，所述2-羟基酸脱氢酶与亮氨酸脱氢酶的混合酶粉的添加量占反应液总质量的 0.2～0.4％，例如可以是0.2％、0.25％、0.3％、0.35％或0.4％等。优选地，所述NAD+的添加量占反应液总质量的0.3～0.8％，例如可以是0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％或0.8％等。
在本发明中，所述2-羟基酸脱氢酶与亮氨酸脱氢酶的混合酶粉的添加量过低，反应液的底物反应不完全，所述2-羟基酸脱氢酶与亮氨酸脱氢酶的混合酶粉的添加量过高，在反应过程中会增加副反应产物，影响后续的纯化，降低产物的纯度；在生物催化反应中，NAD+的添加量过低，会导致反应速率降低，增加反应时间，降低产物收率，同时NAD+成本较高，且 NAD+的添加量在适宜的范围内继续增加并不能进一步提高反应效率，反而增加成本；因此本发明将NAD+的添加量控制在一个能够实现收率较高且成本较低的水平。
优选地，所述生物催化反应的温度为35～40℃，例如可以是35℃、37℃、39℃或40℃等；所述生物催化反应的时间为1～4h，例如可以是1h、2h、3h或4h等。
优选地，所述2-羟基酸脱氢酶与亮氨酸脱氢酶的混合酶粉的制备方法包括如下步骤：
(1)制备表达D-2-羟基酸脱氢酶、L-2-羟基酸脱氢酶和L-亮氨酸脱氢酶的共表达载体，将共表达载体导入底盘细胞中，得到基因工程菌；
(2)将步骤(1)所得基因工程菌进行发酵培养得到菌体；
(3)将步骤(2)所得菌体制成2-羟基酸脱氢酶与亮氨酸脱氢酶的混合酶粉。
优选地，步骤(1)中，所述基因工程菌的制备方法包括如下步骤：
合成编码D-2-羟基酸脱氢酶与L-亮氨酸脱氢酶的基因片段a，合成编码L-2-羟基酸脱氢酶与L-亮氨酸脱氢酶的基因片段b；
将基因片段a和基因片段b克隆至表达载体上，获得共表达载体，将共表达载体导入底盘细胞中，得到基因工程菌。
优选地，所述基因片段a中还包括RBS序列。
优选地，所述基因片段b中还包括RBS序列。
在本发明中，在羟基酸脱氢酶与亮氨酸脱氢酶的编码基因中间加入了RBS序列，用RBS 序列调节双酶的表达量，使得到的酶粉中两种酶的含量更合适，从而更好地进行生物催化反应。本发明将D-2-羟基酸脱氢酶与L-亮氨酸脱氢酶共表达，将L-2-羟基酸脱氢酶与L-亮氨酸脱氢酶共表达，形成融合表达的蛋白，能够将第一步反应和第二步反应偶联在一起，拉近反应物之间的空间距离，增加了反应的效率。
优选地，所述RBS序列包括SEQ ID NO.4～6所示的核苷酸序列中任意一种。
SEQ ID NO.4：AAGGAGATATACAA。
SEQ ID NO.5：AGGAAGGATATACAA。
SEQ ID NO.6：AAGGAGGATATACAA。
优选地，所述表达载体包括pRSFDuet1质粒。
优选地，所述底盘细胞包括大肠杆菌。
优选地，步骤(2)中，所述基因工程菌进行发酵培养得到菌体包括如下步骤：
将所述基因工程菌经活化和扩大培养后进行发酵，并在所述发酵过程中补加碳源，进行诱导处理，得到生物酶发酵液。
优选地，所述活化的温度为33～37℃，例如可以是33℃、34℃、35℃、36℃或37℃等，所述活化的时间为8～12h，例如可以是8h、10h或12h等。
优选地，所述活化采用的培养基按质量浓度计包括4.5～5.5g/L酵母提取物、9～11g/L蛋白胨、9～11g/L NaCl和45～55μg/mL卡那霉素，溶剂为水。
本发明中，所述活化采用的培养基中酵母提取物的质量浓度为4.5～5.5g/L，例如可以是 4.5g/L、5.0g/L或5.5g/L等。
本发明中，所述活化采用的培养基中蛋白胨的质量浓度为9～11g/L，例如可以是9g/L、 10g/L或11g/L等。
本发明中，所述活化采用的培养基中NaCl的质量浓度为9～11g/L，例如可以是9g/L、 10g/L或11g/L等。
本发明中，所述活化采用的培养基中卡那霉素的质量浓度为45～55μg/mL，例如可以是45μg/mL、48μg/mL、50μg/mL、52μg/mL或55μg/mL等。
优选地，所述扩大培养包括一级扩大培养和二级扩大培养。
优选地，所述一级扩大培养的温度为33～37℃，例如可以是33℃、34℃、35℃、36℃或 37℃等，所述一级扩大培养的时间为16～20h，例如可以是16h、17h、18h、19h或20h等，所述一级扩大培养使用的培养基的体积为3～5mL，例如可以是3mL、4mL或5mL等。
优选地，所述二级扩大培养的温度为33～37℃，例如可以是33℃、34℃、35℃、36℃或 37℃等，所述二级扩大培养的时间为4～8h，例如可以是4h、5h、6h、7h或8h等，所述二级扩大培养使用的培养基的体积为250～300mL，例如可以是250mL、280mL或300mL 等。
优选地，所述扩大培养采用的培养基按质量浓度计包括4.5～5.5g/L酵母提取物、9～11g/L 蛋白胨、9～11g/L NaCl和45～55μg/mL卡那霉素，溶剂为水。
本发明中，所述扩大培养采用的培养基中酵母提取物的质量浓度为4.5～5.5g/L，例如可以是4.5g/L、5.0g/L或5.5g/L等。
本发明中，所述扩大培养采用的培养基中蛋白胨的质量浓度为9～11g/L，例如可以是9 g/L、10g/L或11g/L等。
本发明中，所述扩大培养采用的培养基中NaCl的质量浓度为9～11g/L，例如可以是9g/L、 10g/L或11g/L等。
本发明中，所述扩大培养采用的培养基中卡那霉素的质量浓度为45～55μg/mL，例如可以是45μg/mL、48μg/mL、50μg/mL、52μg/mL或55μg/mL等。
优选地，所述发酵采用的培养基按质量浓度计包括5～7g/L Na2HPO4、2.5～3.5g/LKH2PO4、 0.246～0.25g/L MgSO4 .7H2O、2.24～2.3g/L(NH4)2SO4、0.45～0.5g/L NaCl、18～22g/L葡萄糖和 45～55μg/mL卡那霉素，溶剂为水。
本发明中，所述发酵的采用培养基中Na2HPO4的质量浓度为5～7g/L，例如可以是5g/L、 6g/L或7g/L等。
本发明中，所述发酵采用的培养基中KH2PO4的质量浓度为2.5～3.5g/L，例如可以是2.5 g/L、3.0g/L或3.5g/L等。
本发明中，所述发酵采用的培养基中MgSO4 .7H2O的质量浓度为0.246～0.25g/L，例如可以是0.246g/L、0.248g/L或0.25g/L等。
本发明中，所述发酵采用的培养基中(NH4)2SO4的质量浓度为2.24～2.3g/L，例如可以是 2.24g/L、2.26g/L、2.28g/L或2.3g/L等。
本发明中，所述发酵采用的培养基中NaCl的质量浓度为0.45～0.5g/L，例如可以是0.45 g/L、0.46g/L、0.48g/L或0.5g/L等。
本发明中，所述发酵采用的培养基中葡萄糖的质量浓度为18～22g/L，例如可以是18g/L、 20g/L或22g/L等。
本发明中，所述发酵采用的培养基中卡那霉素的质量浓度为45～55μg/mL，例如可以是 45μg/mL、48μg/mL、50μg/mL、52μg/mL或55μg/mL等。
优选地，所述发酵的搅拌速度为300～600rpm，例如可以是300rpm、350rpm、400rpm、 450rpm、500rpm、550rpm或600rpm等，所述发酵的温度为33～37℃，例如可以是33℃、 34℃、35℃、36℃或37℃等，所述发酵的时间为6～8h，例如可以是6h、7h或8h等。
优选地，所述发酵的溶氧值为20％以上，例如可以是20％、22％、24％、26％或28％等，所述发酵的通风比为1:(1～4)，例如可以是1:1、1:2、1:3或1:4等。
优选地，所述发酵过程中还包括使用pH调节剂调节发酵液pH的步骤。
优选地，所述pH调节剂包括氨水。
优选地，所述发酵液的pH值维持在7.0～7.3之间，pH值例如可以是7.0、7.1、7.2或7.3 等。
优选地，所述碳源包括葡萄糖溶液。
优选地，补加碳源后发酵液中所述碳源的终浓度为15～20g/L，例如可以是15g/L、16g/L、 17g/L、18g/L、19g/L或20g/L等。
优选地，所述诱导处理包括如下步骤：在发酵液中添加诱导剂进行诱导处理。
优选地，所述诱导处理中发酵液的温度为20～25℃，例如可以是20℃、22℃、24℃或25℃等。
优选地，所述诱导处理中发酵液的OD600为28～32，OD600例如可以是28、29、30、31或32等。
优选地，所述诱导剂包括IPTG。
优选地，所述诱导剂在发酵液中的终浓度为0.8～1.2mM，例如可以是0.8mM、1.0mM或1.2mM等。
优选地，所述诱导表达的时间为20～24h，例如可以是20h、22h或24h等。
优选地，步骤(3)中，所述将步骤(2)所得菌体制成2-羟基酸脱氢酶与亮氨酸脱氢酶的混合酶粉包括如下步骤：
将发酵液离心，收集菌体，用缓冲液重悬菌体并裂解，将裂解液离心收集上清，将上清浓缩干燥制成2-羟基酸脱氢酶与亮氨酸脱氢酶的混合酶粉。
优选地，所述发酵液离心的离心力为5000～6000g，例如可以是5000g、5500g或、6000 g等，所述发酵液离心的温度为0～4℃，例如可以是0℃、2℃或4℃等，所述发酵液离心的时间为30～35min，例如可以是30min、31min、33min或35min等。
优选地，所述缓冲液包括PBNa缓冲液。
优选地，所述PBNa缓冲液的浓度为45～55mmol，例如可以是45mmol、48mmol、50mmol、52mmol或55mmol等。
优选地，所述PBNa缓冲液与菌体的体积比为(3～4):1，例如可以是3:1、3.5:1或4:1等。
优选地，所述裂解采用超声波裂解的方式。
优选地，所述裂解液离心的离心力为10000～11000g，例如可以是10000g、10500g或 11000g等，所述裂解液离心的温度为0～4℃，例如可以是0℃、2℃或4℃等，所述裂解液离心的时间为10～15min，例如可以是10min、11min、13min或15min等。
优选地，所述浓缩干燥采用真空冷冻干燥的方式。
优选地，所述真空冷冻干燥的参数条件为：-60～-50℃、2～7Pa的压力下真空冷冻干燥 10～20h，真空冷冻干燥的温度例如可以是-60℃、-58℃、-55℃、-52℃或-50℃等，真空冷冻干燥的压力例如可以是2Pa、3Pa、4Pa、5Pa、6Pa或7Pa等，真空冷冻干燥的时间例如可以10h、12h、14h、16h、18h或20h等。
作为本发明的优选技术方案，所述生物酶催化制备L-叔亮氨酸的方法包括如下步骤：
(1)合成编码D-2-羟基酸脱氢酶与L-亮氨酸脱氢酶的基因片段a，合成编码L-2-羟基酸脱氢酶与L-亮氨酸脱氢酶的基因片段b，所述基因片段a和基因片段b中还包括RBS序列，所述RBS序列包括SEQ ID NO.4～6所示的核苷酸序列中任意一种；将基因片段a和基因片段 b克隆至表达载体上，获得共表达载体，将共表达载体导入底盘细胞中，得到基因工程菌。
(2)将所述基因工程菌活化、一级扩大培养和二级扩大培养，进行发酵，并在所述发酵过程中补加葡萄糖溶液，在发酵液中添加IPTG进行诱导处理，得到生物酶发酵液。
所述活化采用的培养基按质量浓度计包括4.5～5.5g/L酵母提取物、9～11g/L蛋白胨、9～11 g/L NaCl和45～55μg/mL卡那霉素，溶剂为水；
所述扩大培养采用的培养基按质量浓度计包括4.5～5.5g/L酵母提取物、9～11g/L蛋白胨、 9～11g/L NaCl和45～55μg/mL卡那霉素，溶剂为水；
所述发酵采用的培养基按质量浓度计包括5～7g/L Na2HPO4、2.5～3.5g/LKH2PO4、 0.246～0.25g/L MgSO4 .7H2O、2.24～2.3g/L(NH4)2SO4、0.45～0.5g/L NaCl、18～22g/L葡萄糖和45～55μg/mL卡那霉素，溶剂为水。
所述活化的温度为33～37℃，所述活化的时间为8～12h。
所述一级扩大培养的温度为33～37℃，所述一级扩大培养的时间为16～20h，所述一级扩大培养使用的培养基的体积为3～5mL，所述二级扩大培养的温度为33～37℃，所述二级扩大培养的时间为4～8h，所述二级扩大培养使用的培养基的体积为250～300mL。
所述发酵的发酵罐参数包括：
整个发酵过程溶氧值控制在20％以上，通风比为1:(1～4)，搅拌速度为100～300rpm，发酵培养的温度控制在33～37℃，使用氨水调节发酵液pH在7.0～7.3之间；发酵培养6～8h，补加葡萄糖溶液，补加碳源后发酵液中所述碳源的终浓度为15～20g/L；OD600为28～32开始加入诱导剂IPTG进行诱导，所述IPTG在发酵液中的终浓度为0.8～1.2mM，诱导表达的温度控制在20～25℃，诱导表达20～24h。
(3)将发酵液在离心力为5000～6000g、0～4℃离心30～35min，收集菌体，用浓度为45～55 mmol的PBNa缓冲液重悬菌体并裂解，所述PBNa缓冲液与菌体的体积比为(3～4):1，将裂解液在离心力为10000～11000g、0～4℃离心10～15min，收集上清，将上清浓缩干燥制成2-羟基酸脱氢酶与亮氨酸脱氢酶的混合酶粉。
将2-羟基-3,3-二甲基丁酸、氨基供体和水按质量比为(1.3～1.5):(0.8～1.5):(20～40)混合，加热升温到38～42℃，调节反应液的pH为8.5～9.5，加入2-羟基酸脱氢酶与亮氨酸脱氢酶的混合酶粉和NAD+进行生物催化反应，所述生物催化反应的温度为35～40℃，反应的时间为1～4 h，所述2-羟基酸脱氢酶与亮氨酸脱氢酶的混合酶粉的添加量占反应液总质量的0.2～0.4％，所述NAD+的添加量占反应液总质量的0.3～0.8％。
第二方面，本发明提供一种第一方面所述的生物酶催化制备L-叔亮氨酸的方法在制备抗病毒药物中的应用。
本发明所述的数值范围不仅包括上述例举的点值，还包括没有例举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明以2-羟基-3,3-二甲基丁酸作为底物，在2-羟基酸脱氢酶与亮氨酸脱氢酶的催化下反应得到L-叔亮氨酸，该方法为酶催化生物合成方法，具有操作简单、无需添加额外 NADH、收率高、生产成本低等优势，收率达到90％～92.5％，其中e.e.值为99.5％～99.9％。
(2)本发明中筛选出的2-羟基酸脱氢酶包括D-2-羟基酸脱氢酶和L-2-羟基酸脱氢酶，所述2-羟基酸脱氢酶对α-羟基丁酸具有较宽的底物选择性，反应效率较高。
(3)本发明中将D-2-羟基酸脱氢酶与L-亮氨酸脱氢酶共表达、将L-2-羟基酸脱氢酶与 L-亮氨酸脱氢酶共表达，形成融合表达的蛋白，能够将第一步反应和第二步反应偶联在一起，拉近反应物之间的空间距离，增加了反应的效率。
附图说明
图1为实施例1中所述生物催化过程的示意图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
以下实施例和对比例中所用各组分来源如下所示：
实施例1
本实施例提供一种生物酶催化制备L-叔亮氨酸的方法，所述生物酶催化制备L-叔亮氨酸的方法包括如下步骤：
(1)制备表达D-2-羟基酸脱氢酶、L-2-羟基酸脱氢酶和L-亮氨酸脱氢酶的共表达载体，将共表达载体导入大肠杆菌中，得到基因工程菌：
合成编码D-2-羟基酸脱氢酶与L-亮氨酸脱氢酶的基因片段a，基因片段a中还包括RBS 序列，使用NcoⅠ和BamHⅠ将基因片段a克隆至pET28a载体中，获得D2DH-BcLeuDH-pET28a质粒；
合成编码L-2-羟基酸脱氢酶与L-亮氨酸脱氢酶的基因片段b，所述基因片段b中还包括 RBS序列，使用NdeⅠ和XhoⅠ将基因片段b克隆至pET24a载体中，获得 L2DH-BcLeuDH-pET24a质粒；
将L2DH-BcLeuDH-pET24a质粒中的L2DH-BcLeuDH片段使用NdeⅠ和XhoⅠ克隆至pRSFDuet1载体上，得到L2DH-BcLeuDH-pRSFDuet1质粒；将D2DH-BcLeuDH-pET28a质粒中的D2DH-BcLeuDH片段使用NcoⅠ和BamHⅠ克隆至L2DH-BcLeuDH-pRSFDuet1质粒中，获得共表达载体L2DH-BcLeuDH-D2DH-BcLeuDH-pRSFDuet1。
所述编码D-2-羟基酸脱氢酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
所述编码L-2-羟基酸脱氢酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
所述编码L-亮氨酸脱氢酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
所述基因片段a中的RBS序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
所述基因片段b中的RBS序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
上述核苷酸序列均由常州基宇生物技术公司合成。
(2)将所述基因工程菌活化、一级扩大培养和二级扩大培养，进行发酵，并在所述发酵过程中补加葡萄糖溶液，在发酵液中添加IPTG进行诱导处理，得到生物酶发酵液。
所述活化采用的培养基：5g/L酵母提取物、10g/L蛋白胨、10g/L NaCl和50μg/mL卡那霉素，溶剂为水；
所述扩大培养采用的培养：5g/L酵母提取物、10g/L蛋白胨、10g/L NaCl和50μg/mL卡那霉素，溶剂为水；
所述发酵采用的培养基：6g/L Na2HPO4、3g/L KH2PO4、0.246g/L MgSO4 .7H2O、2.24g/L (NH4)2SO4、0.5g/L NaCl、20g/L葡萄糖和50μg/mL卡那霉素，溶剂为水。
所述活化的温度为37℃，所述活化的时间为10h。
所述一级扩大培养的温度为37℃，时间为18h，使用的培养基的体积为3mL；所述二级扩大培养的温度为37℃，时间为6h，使用的培养基的体积为300mL。
所述发酵的发酵罐参数包括：
整个发酵过程溶氧值控制在20％，通风比为1:3，搅拌速度为400rpm，发酵培养温度控制在37℃，使用氨水调节发酵液pH为7.2；发酵培养7h溶氧突变，补加葡萄糖溶液，补加碳源后发酵液中葡萄糖的终浓度为18g/L；发酵液的OD600为30开始加入诱导剂IPTG进行诱导，所述IPTG在发酵液中的终浓度为1mM，诱导温度控制在25℃，诱导表达22h。
(3)将发酵液在离心力为5500g、4℃离心30min，收集菌体，用浓度为50mmol的PBNa缓冲液重悬菌体并裂解，所述PBNa缓冲液与菌体的体积比为3:1，将裂解液在离心力为10000 g、4℃离心10min，收集上清，将上清真空冷冻干燥制成2-羟基酸脱氢酶与亮氨酸脱氢酶的混合酶粉，所述真空冷冻干燥的参数条件为：-55℃、6Pa的压力下真空冷冻干燥15h。
本实施例中所述生物催化过程的示意图如图1所示。所述生物催化过程如下：
将2-羟基-3,3-二甲基丁酸、硫酸铵和水按质量比为1.3:1.32:40混合，加热升温到40℃，调节反应液的pH为9.0，加入2-羟基酸脱氢酶与亮氨酸脱氢酶的混合酶粉和NAD+进行生物催化反应，所述生物催化反应的温度为38℃，反应的时间为3h，所述2-羟基酸脱氢酶与亮氨酸脱氢酶的混合酶粉的添加量占反应液总质量的0.3％，所述NAD+的添加量占反应液总质量的0.5％。
实施例2
本实施例提供一种生物酶催化制备L-叔亮氨酸的方法，所述生物酶催化制备L-叔亮氨酸的方法包括如下步骤：
(1)基因工程菌的制备过程参照实施例1。
(2)将所述基因工程菌活化、一级扩大培养和二级扩大培养，进行发酵，并在所述发酵过程中补加葡萄糖溶液，在发酵液中添加IPTG进行诱导处理，得到生物酶发酵液。
所述活化、一级扩大培养、二级扩大培养和发酵所采用的培养基参照实施例1。
所述活化的温度为36℃，所述活化的时间为8h。
所述一级扩大培养的温度为36℃，时间为16h，使用的培养基的体积为4mL；所述二级扩大培养的温度为36℃，时间为4h，使用的培养基的体积为280mL。
所述发酵的发酵罐参数包括：
整个发酵过程溶氧值控制在25％，通风比为1:2，搅拌速度为300rpm，发酵培养温度控制在36℃，使用氨水调节发酵液pH为7.3；培养6h溶氧突变，补加葡萄糖溶液，补加碳源后发酵液中葡萄糖的终浓度为15g/L；发酵液的OD600为32开始加入诱导剂IPTG进行诱导，所述IPTG在发酵液中的终浓度为1.2mM，诱导温度控制在23℃，诱导表达20h。
(3)将发酵液在离心力为5000g、4℃离心30min，收集菌体，用浓度为50mmol的PBNa缓冲液重悬菌体并裂解，所述PBNa缓冲液与菌体的体积比为4:1，将裂解液在离心力为10500 g、4℃离心12min，收集上清，将上清真空冷冻干燥制成2-羟基酸脱氢酶与亮氨酸脱氢酶的混合酶粉，所述真空冷冻干燥的参数条件为：-60℃、5Pa的压力下真空冷冻干燥17h。
将2-羟基-3,3-二甲基丁酸、硫酸铵和水按质量比为1.5:0.8:20混合，加热升温到38℃，调节反应液的pH为8.5，加入2-羟基酸脱氢酶与亮氨酸脱氢酶的混合酶粉和NAD+进行生物催化反应，所述生物催化反应的温度为35℃，反应的时间为4h，所述2-羟基酸脱氢酶与亮氨酸脱氢酶的混合酶粉的添加量占反应液总质量的0.4％，所述NAD+的添加量占反应液总质量的0.3％。
实施例3
本实施例提供一种生物酶催化制备L-叔亮氨酸的方法，所述生物酶催化制备L-叔亮氨酸的方法包括如下步骤：
(1)基因工程菌的制备过程参照实施例1。
(2)将所述基因工程菌活化、一级扩大培养和二级扩大培养，进行发酵，并在所述发酵过程中补加葡萄糖溶液，在发酵液中添加IPTG进行诱导处理，得到生物酶发酵液。
所述活化、一级扩大培养、二级扩大培养和发酵所采用的培养基参照实施例1。
所述活化的温度为35℃，所述活化的时间为12h。
所述一级扩大培养的温度为35℃，时间为20h，使用的培养基的体积为5mL；所述二级扩大培养的温度为35℃，时间为8h，使用的培养基的体积为300mL。
所述发酵的发酵罐参数包括：
整个发酵过程溶氧值控制在28％，通风比为1:4，搅拌速度为600rpm，发酵培养温度控制在35℃，使用氨水调节发酵液pH为7；培养8h溶氧突变，补加浓度为650g/L葡萄糖溶液，补加碳源后发酵液中葡萄糖的终浓度为20g/L；发酵液的OD600为28开始加入诱导剂IPTG进行诱导，所述IPTG在发酵液中的终浓度为0.8mM，诱导温度控制在20℃，诱导表达24h。
(3)将发酵液在离心力为6000g、4℃离心35min，收集菌体，用浓度为50mmol的PBNa缓冲液重悬菌体并裂解，所述PBNa缓冲液与菌体的体积比为3.5:1，将裂解液在离心力为11000g、4℃离心15min，收集上清，将上清真空冷冻干燥制成2-羟基酸脱氢酶与亮氨酸脱氢酶的混合酶粉，所述真空冷冻干燥的参数条件为：-50℃、7Pa的压力下真空冷冻干燥13h。
将2-羟基-3,3-二甲基丁酸、硫酸铵和水按质量比为1.3:1.5:40混合，加热升温到42℃，调节反应液的pH为9.5，加入2-羟基酸脱氢酶与亮氨酸脱氢酶的混合酶粉和NAD+进行生物催化反应，所述生物催化反应的温度为40℃，反应的时间为2h，所述2-羟基酸脱氢酶与亮氨酸脱氢酶的混合酶粉的添加量占反应液总质量的0.2％，所述NAD+的添加量占反应液总质量的0.8％。
实施例4
本实施例提供一种生物酶催化制备L-叔亮氨酸的方法，所述生物酶催化制备L-叔亮氨酸的方法与实施例1的区别仅在于，在酶催化反应中，所述2-羟基-3,3-二甲基丁酸、硫酸铵和水的质量比为1.3:0.6:40，其余步骤参照实施例1。
实施例5
本实施例提供一种生物酶催化制备L-叔亮氨酸的方法，所述生物酶催化制备L-叔亮氨酸的方法与实施例1的区别仅在于，在酶催化反应中，所述2-羟基-3,3-二甲基丁酸、硫酸铵和水的质量比为1.3:2:40，其余步骤参照实施例1。
实施例6
本实施例提供一种生物酶催化制备L-叔亮氨酸的方法，所述生物酶催化制备L-叔亮氨酸的方法与实施例1的区别仅在于，在酶催化反应中，所述反应液的pH为8，其余步骤参照实施例1。
实施例7
本实施例提供一种生物酶催化制备L-叔亮氨酸的方法，所述生物酶催化制备L-叔亮氨酸的方法与实施例1的区别仅在于，在酶催化反应中，所述反应液的pH为10，其余步骤参照实施例1。
实施例8
本实施例提供一种生物酶催化制备L-叔亮氨酸的方法，所述生物酶催化制备L-叔亮氨酸的方法与实施例1的区别仅在于，在酶催化反应中，所述生物催化反应的温度为30℃，其余步骤参照实施例1。
实施例9
本实施例提供一种生物酶催化制备L-叔亮氨酸的方法，所述生物酶催化制备L-叔亮氨酸的方法与实施例1的区别仅在于，在酶催化反应中，所述生物催化反应的温度为45℃，其余步骤参照实施例1。
实施例10
本实施例提供一种生物酶催化制备L-叔亮氨酸的方法，所述生物酶催化制备L-叔亮氨酸的方法与实施例1的区别仅在于，在酶催化反应中，所述生物催化反应的时间为0.5h，其余步骤参照实施例1。
实施例11
本实施例提供一种生物酶催化制备L-叔亮氨酸的方法，所述生物酶催化制备L-叔亮氨酸的方法与实施例1的区别仅在于，在酶催化反应中，所述生物催化反应的时间为5h，其余步骤参照实施例1。
实施例12
本实施例提供一种生物酶催化制备L-叔亮氨酸的方法，所述生物酶催化制备L-叔亮氨酸的方法与实施例1的区别仅在于，在酶催化反应中，所述2-羟基酸脱氢酶与亮氨酸脱氢酶的混合酶粉的添加量占反应液总质量的0.1％，其余步骤参照实施例1。
实施例13
本实施例提供一种生物酶催化制备L-叔亮氨酸的方法，所述生物酶催化制备L-叔亮氨酸的方法与实施例1的区别仅在于，在酶催化反应中，所述2-羟基酸脱氢酶与亮氨酸脱氢酶的混合酶粉的添加量占反应液总质量的0.6％，其余步骤参照实施例1。
实施例14
本实施例提供一种生物酶催化制备L-叔亮氨酸的方法，所述生物酶催化制备L-叔亮氨酸的方法与实施例1的区别仅在于，在酶催化反应中，所述NAD+的添加量占反应液总质量的 0.1％，其余步骤参照实施例1。
实施例15
本实施例提供一种生物酶催化制备L-叔亮氨酸的方法，所述生物酶催化制备L-叔亮氨酸的方法与实施例1的区别仅在于，所述2-羟基酸脱氢酶为L-2羟基酸脱氢酶，所述L-2羟基酸脱氢酶的NCBI数据库中的编码为EFK28653.1，其余步骤参照实施例1。
实施例16
本实施例提供一种生物酶催化制备L-叔亮氨酸的方法，所述生物酶催化制备L-叔亮氨酸的方法与实施例1的区别仅在于，所述2-羟基酸脱氢酶为D-2羟基酸脱氢酶，所述D-2羟基酸脱氢酶的NCBI数据库中的编码为EPB99484.1，其余步骤参照实施例1。
实施例17
本实施例提供一种生物酶催化制备L-叔亮氨酸的方法，所述生物酶催化制备L-叔亮氨酸的方法与实施例1的区别仅在于，所述亮氨酸脱氢酶的NCBI数据库中的编码为AIY34661.1，其余步骤参照实施例1。
实施例18
本实施例提供一种生物酶催化制备L-叔亮氨酸的方法，所述生物酶催化制备L-叔亮氨酸的方法与实施例1的区别仅在于，所述亮氨酸脱氢酶的NCBI数据库中的编码为 WP_012369820.1，其余步骤参照实施例1。
实施例19
本实施例提供一种生物酶催化制备L-叔亮氨酸的方法，所述生物酶催化制备L-叔亮氨酸的方法与实施例1的区别仅在于，所述2-羟基酸脱氢酶与亮氨酸脱氢酶为单独表达的酶粉，其余步骤参照实施例1。
实施例1～19的制备方法所得的L-叔亮氨酸的收率、纯度和e.e.值如表1所示：
表1
通过表1的结果可知，本发明中通过生物酶催化制备L-叔亮氨酸的方法绿色安全无污染，反应产品的收率高、得到的产品纯度高，具有重要的应用价值。
通过实施例1与实施例4～5对比可知，在生物催化反应中，减少或增加硫酸铵的比例，会影响反应液的缓冲体系，抑制混合酶粉的催化活性；同时，氨基供体减少会降低反应的速率，降低产物的收率和纯度。
通过实施例1与实施例6～9对比可知，在生物催化反应中，pH值过低或过高，会抑制混合酶粉的催化活性，影响反应速率和产物的收率和纯度；反应的温度过低酶的活性会减弱，反应速率较低；反应的温度过高会抑制混合酶粉的催化活性，影响反应速率和产物的收率和纯度。
通过实施例1与实施例10～11对比可知，反应的时间过短，反应不完全，会降低收率，反应的时间过长，会产生较多的副产物，降低产物的纯度。
通过实施例1与实施例12～14对比可知，所述2-羟基酸脱氢酶与亮氨酸脱氢酶的混合酶粉的添加量过低，反应液的底物反应不完全，所述2-羟基酸脱氢酶与亮氨酸脱氢酶的混合酶粉的添加量过高，在反应过程中会增加副反应产物，降低产物的纯度；在生物催化反应中， NAD+的添加量过低，会导致反应速率降低，增加反应时间，降低产物收率。
通过实施例1与实施例15～19对比可知，所述D-2-羟基酸脱氢酶、L-2-羟基酸脱氢酶和L-亮氨酸脱氢酶的组合方式，在以2-羟基-3,3-二甲基丁酸为底物的生物催化反应中具有较高的反应效率，所得产物的得率较高。同时只有D-2-羟基酸脱氢酶和L-亮氨酸脱氢酶的组合，能够高效地将2-羟基-3,3-二甲基丁酸氧化成3,3-二甲基2氧代丁酸，其他的2-羟基酸脱氢酶的催化活性较低，在反应的第一步的速率较慢，同时副产物较多。
综上，本发明中所述生物酶催化制备L-叔亮氨酸的方法具有操作简单、无需添加额外 NADH、收率高、生产成本低等优势，收率达到90％～92.5％，其中e.e.值为99.5％～99.9％。采用三甲基丙酮酸的前体2-羟基-3,3-二甲基丁酸作为底物，用筛选出的特异性的2-羟基酸脱氢酶与亮氨酸脱氢酶偶联反应，实现了辅酶NADH自循环，不用额外添加辅酶循环体系；三甲基丙酮酸生成后被L-亮氨酸脱氢酶转化成L-叔亮氨酸，不会存在底物抑制。与传统的化学方法相比较，本发明中所述生物酶催化的方法更加环保、步骤简单，同时本发明设计的偶联反应能够降低成本，反应效率较高，在药物制备领域具有重要的应用前景。
申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
序列表
<110> 金达威生物技术（江苏）有限公司；内蒙古金达威药业有限公司；南京桦冠生物技术有限公司
<120> 一种生物酶催化制备L-叔亮氨酸的方法及其应用
<130> 2022
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 996
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atgaagatca tcgcgtacgg cattcgtgat gatgaacagc cgtatctgga acagtggtct 60
aaagaccagg gtatcgaagt taaggcggtt aaagagctgc tggatgactc caccgttgat 120
ctggctaagg gttacgacgg cgcggtggtg taccagcaga aaccgtacac cgcttccgtt 180
ctggataaac tggcggcgaa cggtgttact aacctgagcc tgcgcaatgt tggtgtcgac 240
aacgtagacg cggacgccgt gaaacgtaac ggtttcaagg ttacgaacgt accagcatac 300
agcccggaag ccatcgcgga gttcaccgtt actgaactga tgcgtctgct gcgccgtact 360
ccaacctttg accgcaaaca ggcgaacggc gatctgcgtt gggcaccaga tatcgcggat 420
gaactgaaca gcatgaccgt gggcgttgta gcgaccggtc gcattggtcg tgcggcaatg 480
aaaatctacc agggctttgg cgcgaaagtt atcgcatacg acgtgtttca caacccagaa 540
ctggaaaaac agggcatcta cgtagatacg atggacgaac tgtacgcaca ggctgacgta 600
atctctctgc atgcaccggc aactaaagac aacgaaaaaa tgatcaatga tgacgctttt 660
tccaaaatga aagatggtgt ttggctgctg aacccggcac gtggtgcact ggtagacacc 720
gatgcactga tccgtgcgct ggattctggc aaagtagcag gtgcggctct ggacgtttac 780
gaagacgaag tgggtatctt caacaccgac ttcggttcct tcgacgcaat cccggatgaa 840
cgtctgaaaa acctgatgaa acgtgagaac gttctggtgt ccccgcatat cgccttctac 900
accaaaactg ccgtgaaaaa catggtgcag tatgcactga acaacaacaa acagctgatt 960
gaaaccggta aagccgacaa tgtagtaaaa ttctaa 996
<210> 2
<211> 963
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atgtccaaca ctccgaacca ccaaaaagtt gttctggtgg gtgatggtgc agtgggttcc 60
tctttcgctt tcgcaatggc ccagcagggc atcgcggaag agttcgtagt agtagacgtg 120
atcaaagagc gtactcaggg cgacgcactg gatctggaag acgctacgcc gttcacctct 180
ccgaaaaaaa tctactccgg tgagtactct gactgcaaag atgctgacct ggttgtgatc 240
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ggtaaaaaat ttaatattag cccggcatct gttgacgctt acattctggg tgaacacggc 540
gattccgaat ttgcaggtta cagcgcagcg accatcggca ccaaaccgct gctggaaatc 600
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taa 963
<210> 3
<211> 1101
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
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gcgctgggcg gcacccgcat gtggacctat gattcggagg aggcggccat cgaggatgcc 180
ctgcgcctgg cgaagggcat gacctataag aacgccgcgg ccggcctgaa cctgggcggc 240
gcgaagaccg tcatcatcgg cgatccgcgc aaggataaat cggaggccat gttccgcgcg 300
ctgggccgct atatccaggg cctgaacggc cgctatatca ccgccgagga tgtgggcacc 360
accgtcgatg atatggatat catccatgag gagaccgatt ttgtcaccgg catctcgccc 420
tcgtttggct cgtcgggcaa cccgtcgccg gtgaccgcgt atggcgtcta tcgcggcatg 480
aaagcggcgg cgaaagaggc gttcggcacc gattcgctgg agggcaaagt gatcgcggtc 540
cagggcgtgg gcaacgtcgc gtatcatctg tgcaagcatc tgcatgccga gtcggcccag 600
ctgatcgtga ccgatatcaa caaggaggcc gtgcagcgcg cggtcgagga gtttggcgcc 660
accgcggtcg agcccaacga gatctattcg gtcgagtgcg atatctatgc cccctgcgcg 720
ctgggcgcca ccatcaatga tgagaccatc ccccagttca aagcgaaggt catcgccggc 780
tcggccaaca accagctgaa ggaggatcgc catggcgata ccatccatga gatgggcatc 840
gtctatgcgc cggattatgt catcaacgcg ggcggcgtga tcaacgtggc ggatgagctg 900
tatggctata accgcgagcg cgccctgaag cgcgtcgagt cgatctatga taccatcgcc 960
aaggtcatcg agatctcgaa gcgcgatggc gtgcccacct atgtcgccgc ggatcgcctg 1020
gcggaggagc gcatcgcgtc gctgaaaaac acccgctcga cctatctgcg caacggccat 1080
gatatcatct cgcgccgctg a 1101
<210> 4
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
aaggagatat acaa 14
<210> 5
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
aggaaggata tacaa 15
<210> 6
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
aaggaggata tacaa 15

Claims (42)

1.一种生物酶催化制备L-叔亮氨酸的方法，其特征在于，所述生物酶催化制备L-叔亮氨酸的方法包括如下步骤：
以2-羟基-3,3-二甲基丁酸为底物，在2-羟基酸脱氢酶与亮氨酸脱氢酶的催化下反应得到L-叔亮氨酸；
所述2-羟基酸脱氢酶包括D-2-羟基酸脱氢酶和L-2-羟基酸脱氢酶；
所述D-2-羟基酸脱氢酶的编码基因如SEQ ID NO.1所示；
所述L-2-羟基酸脱氢酶的编码基因如SEQ ID NO.2所示；
所述亮氨酸脱氢酶包括L-亮氨酸脱氢酶；
所述L-亮氨酸脱氢酶的编码基因如SEQ ID NO.3所示；
所述生物酶催化包括如下步骤：
将2-羟基-3,3-二甲基丁酸、硫酸铵和水混合，所述2-羟基-3,3-二甲基丁酸、硫酸铵和水混合的质量比为(1.3~1.5):(0.8~1.5):(20~40)；加热升温，调节反应液的pH，加入2-羟基酸脱氢酶与亮氨酸脱氢酶的混合酶粉和NAD+，所述2-羟基酸脱氢酶与亮氨酸脱氢酶的混合酶粉的添加量占反应液总质量的0.2~0.4%；所述NAD+的添加量占反应液总质量的0.3~0.8%；进行生物催化反应。
2.根据权利要求1所述的生物酶催化制备L-叔亮氨酸的方法，其特征在于，所述加热的温度为38~42℃。
3.根据权利要求1所述的生物酶催化制备L-叔亮氨酸的方法，其特征在于，采用pH调节剂调节反应液的pH为8.5~9.5。
4.根据权利要求3所述的生物酶催化制备L-叔亮氨酸的方法，其特征在于，所述pH调节剂包括氨水。
5.根据权利要求1所述的生物酶催化制备L-叔亮氨酸的方法，其特征在于，所述生物催化反应的温度为35~40℃，所述生物催化反应的时间为1~4 h。
6.根据权利要求1所述的生物酶催化制备L-叔亮氨酸的方法，其特征在于，所述2-羟基酸脱氢酶与亮氨酸脱氢酶的混合酶粉的制备方法包括如下步骤：
（1）制备表达D-2-羟基酸脱氢酶、L-2-羟基酸脱氢酶和L-亮氨酸脱氢酶的共表达载体，将共表达载体导入底盘细胞中，得到基因工程菌；
（2）将步骤（1）所得基因工程菌进行发酵培养得到菌体；
（3）将步骤（2）所得菌体制成2-羟基酸脱氢酶与亮氨酸脱氢酶的混合酶粉。
7.根据权利要求6所述的生物酶催化制备L-叔亮氨酸的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述基因工程菌的制备方法包括如下步骤：
合成编码D-2-羟基酸脱氢酶与L-亮氨酸脱氢酶的基因片段a，合成编码L-2-羟基酸脱氢酶与L-亮氨酸脱氢酶的基因片段b；
将基因片段a和基因片段b克隆至表达载体上，获得共表达载体，将共表达载体导入底盘细胞中，得到基因工程菌。
8.根据权利要求7所述的生物酶催化制备L-叔亮氨酸的方法，其特征在于，所述基因片段a中还包括RBS序列；所述基因片段b中还包括RBS序列。
9.根据权利要求8所述的生物酶催化制备L-叔亮氨酸的方法，其特征在于，所述RBS序列包括SEQ ID NO.4~6所示的核苷酸序列中任意一种。
10.根据权利要求7所述的生物酶催化制备L-叔亮氨酸的方法，其特征在于，所述表达载体包括pRSFDuet1质粒。
11.根据权利要求7所述的生物酶催化制备L-叔亮氨酸的方法，其特征在于，所述底盘细胞包括大肠杆菌。
12.根据权利要求6所述的生物酶催化制备L-叔亮氨酸的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述基因工程菌进行发酵培养得到菌体包括如下步骤：
将所述基因工程菌经活化和扩大培养后进行发酵，并在所述发酵过程中补加碳源，进行诱导处理，得到生物酶发酵液。
13.根据权利要求12所述的生物酶催化制备L-叔亮氨酸的方法，其特征在于，所述活化的温度为33~37℃，所述活化的时间为8~12 h。
14.根据权利要求12所述的生物酶催化制备L-叔亮氨酸的方法，其特征在于，所述活化采用的培养基按质量浓度计包括4.5~5.5 g/L酵母提取物、9~11 g/L蛋白胨、9~11 g/LNaCl和45~55 μg/mL卡那霉素，溶剂为水。
15.根据权利要求12所述的生物酶催化制备L-叔亮氨酸的方法，其特征在于，所述扩大培养包括一级扩大培养和二级扩大培养。
16.根据权利要求15所述的生物酶催化制备L-叔亮氨酸的方法，其特征在于，所述一级扩大培养的温度为33~37℃，所述一级扩大培养的时间为16~20 h。
17.根据权利要求15所述的生物酶催化制备L-叔亮氨酸的方法，其特征在于，所述二级扩大培养的温度为33~37℃，所述二级扩大培养的时间为4~8 h。
18.根据权利要求12所述的生物酶催化制备L-叔亮氨酸的方法，其特征在于，所述扩大培养采用的培养基按质量浓度计包括4.5~5.5 g/L酵母提取物、9~11 g/L蛋白胨、9~11 g/LNaCl和45~55 μg/mL卡那霉素，溶剂为水。
19.根据权利要求12所述的生物酶催化制备L-叔亮氨酸的方法，其特征在于，所述发酵采用的培养基按质量浓度计包括5~7 g/L Na2HPO4、2.5~3.5 g/L KH2PO4、0.246~0.25 g/LMgSO4 .7H2O、2.24~2.3 g/L (NH4)2SO4、0.45~0.5 g/L NaCl、18~22 g/L葡萄糖和45~55 μg/mL卡那霉素，溶剂为水。
20.根据权利要求12所述的生物酶催化制备L-叔亮氨酸的方法，其特征在于，所述发酵的搅拌速度为300~600 rpm，所述发酵的温度为33~37℃，所述发酵的时间为6~8 h。
21.根据权利要求12所述的生物酶催化制备L-叔亮氨酸的方法，其特征在于，所述发酵的溶氧值为20%以上，所述发酵的通风比为1:(1~4)。
22.根据权利要求12所述的生物酶催化制备L-叔亮氨酸的方法，其特征在于，所述发酵过程中还包括使用pH调节剂调节发酵液pH的步骤。
23.根据权利要求22所述的生物酶催化制备L-叔亮氨酸的方法，其特征在于，所述pH调节剂包括氨水。
24.根据权利要求23所述的生物酶催化制备L-叔亮氨酸的方法，其特征在于，所述发酵液的pH值维持在7.0~7.3之间。
25.根据权利要求12所述的生物酶催化制备L-叔亮氨酸的方法，其特征在于，所述碳源包括葡萄糖溶液。
26.根据权利要求25所述的生物酶催化制备L-叔亮氨酸的方法，其特征在于，补加碳源后发酵液中所述碳源的终浓度为15~20 g/L。
27.根据权利要求12所述的生物酶催化制备L-叔亮氨酸的方法，其特征在于，所述诱导处理包括如下步骤：在发酵液中添加诱导剂进行诱导处理。
28.根据权利要求27所述的生物酶催化制备L-叔亮氨酸的方法，其特征在于，所述诱导处理中发酵液的温度为20~25℃。
29.根据权利要求27所述的生物酶催化制备L-叔亮氨酸的方法，其特征在于，所述诱导处理中发酵液的OD600为28~32。
30.根据权利要求27所述的生物酶催化制备L-叔亮氨酸的方法，其特征在于，所述诱导剂包括IPTG。
31.根据权利要求30所述的生物酶催化制备L-叔亮氨酸的方法，其特征在于，所述诱导剂在发酵液中的终浓度为0.8~1.2 mM。
32.根据权利要求27所述的生物酶催化制备L-叔亮氨酸的方法，其特征在于，所述诱导处理的时间为20~24 h。
33.根据权利要求6所述的生物酶催化制备L-叔亮氨酸的方法，其特征在于，步骤（3）中，所述将步骤（2）所得菌体制成2-羟基酸脱氢酶与亮氨酸脱氢酶的混合酶粉包括如下步骤：
将发酵液离心，收集菌体，用缓冲液重悬菌体并裂解，将裂解液离心收集上清，将上清浓缩干燥制成2-羟基酸脱氢酶与亮氨酸脱氢酶的混合酶粉。
34.根据权利要求33所述的生物酶催化制备L-叔亮氨酸的方法，其特征在于，所述发酵液离心的离心力为5000~6000 g，所述发酵液离心的温度为0~4℃，所述发酵液离心的时间为30~35 min。
35.根据权利要求33所述的生物酶催化制备L-叔亮氨酸的方法，其特征在于，所述缓冲液包括PBNa缓冲液。
36.根据权利要求35所述的生物酶催化制备L-叔亮氨酸的方法，其特征在于，所述PBNa缓冲液的浓度为45~55 mmol。
37.根据权利要求36所述的生物酶催化制备L-叔亮氨酸的方法，其特征在于，所述PBNa缓冲液与菌体的体积比为(3~4):1。
38.根据权利要求33所述的生物酶催化制备L-叔亮氨酸的方法，其特征在于，所述裂解采用超声波裂解的方式。
39.根据权利要求33所述的生物酶催化制备L-叔亮氨酸的方法，其特征在于，所述裂解液离心的离心力为10000~11000 g，所述裂解液离心的温度为0~4℃，所述裂解液离心的时间为10~15 min。
40.根据权利要求33所述的生物酶催化制备L-叔亮氨酸的方法，其特征在于，所述浓缩干燥采用真空冷冻干燥的方式。
41.根据权利要求40所述的生物酶催化制备L-叔亮氨酸的方法，其特征在于，所述真空冷冻干燥的参数条件为：-60~-50℃、2~7 Pa的压力下真空冷冻干燥10~20 h。
42.权利要求1~41中任一项所述的生物酶催化制备L-叔亮氨酸的方法在制备抗病毒药物中的应用。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998039316A1 (en) * 1997-03-04 1998-09-11 Monsanto Company N-hydroxy 4-sulfonyl butanamide compounds
WO2006074194A2 (en) * 2005-01-05 2006-07-13 Biotechnology Research And Development Corporation Engineered phosphite dehydrogenase mutants for nicotinamide cofactor regeneration
CN105399642A (zh) * 2015-12-29 2016-03-16 南京瓦尔生物医药有限公司 一种同时制备d-和l-型叔亮氨酸的方法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003054155A2 (en) * 2001-12-19 2003-07-03 Bristol-Myers Squibb Company Pichia pastoris formate dehydrogenase and uses therefor
US20040087569A1 (en) * 2002-10-31 2004-05-06 Nelson Todd D. N-heterocyclic bicyclic lactone compounds

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998039316A1 (en) * 1997-03-04 1998-09-11 Monsanto Company N-hydroxy 4-sulfonyl butanamide compounds
WO2006074194A2 (en) * 2005-01-05 2006-07-13 Biotechnology Research And Development Corporation Engineered phosphite dehydrogenase mutants for nicotinamide cofactor regeneration
CN105399642A (zh) * 2015-12-29 2016-03-16 南京瓦尔生物医药有限公司 一种同时制备d-和l-型叔亮氨酸的方法

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