CN113481104B - 一种抗黄曲霉促作物生长的无孢子木霉制剂及其制备与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗黄曲霉促作物生长的无孢子木霉制剂及其制备与应用。本发明将哈茨木霉菌H‑13L(保藏编号为GDMCC No：60530)和产毒黄曲霉GIM3.493进行混合发酵培养，在木霉分泌的几丁质酶、β‑1,3‑葡聚糖酶等酶作用下，获得含有来自黄曲霉细胞壁的酶解片段：含乙酰基的几丁质寡糖和含带正电荷氨基的壳寡糖的木霉制剂。该制剂能抑制土壤中黄曲霉菌落的生长和黄曲霉毒素的分泌，能促进植物的碳代谢和氮代谢，进而发挥促生长效应，促进种子的萌发、促进胚轴伸长、促进幼苗鲜重、株高、主根长、侧枝数和侧枝长和叶绿素合成，还能逆转黄曲霉对作物生长发育的抑制作用，是一种绿色的农药兼肥料，具有良好的应用前景。

Description

一种抗黄曲霉促作物生长的无孢子木霉制剂及其制备与应用

技术领域

本发明涉及微生物源制剂技术领域，特别涉及一种抗黄曲霉促作物生长的无孢子木霉制剂及其制备与应用。

背景技术

据***粮食及农业组织(FAO)统计，全球约四分之一的粮油作物受到真菌毒素的污染，而由于气候和管理不善等原因，我国是世界上受真菌毒素污染最严重的国家之一。黄曲霉毒素污染农产品并通过食物链传递给人类，对人类健康造成了巨大危害。世界卫生组织(WHO)/欧盟等国家2002年规定供人直接食用的花生黄曲霉毒素含量需≤2ppb。

黄曲霉广泛存在于土壤中，其在自然环境下对生长条件要求不高，可以对玉米、花生、豆类、棉籽、大米、坚果类、茶叶等农产品造成污染，并产生黄曲霉毒素，其中花生、玉米污染最为严重。研究和培育抗黄曲霉新品种是解决农产品黄曲霉毒素污染的根本方法。但目前，抗黄曲霉又高产的农作物新品种还有待培育。

木霉属的哈茨木霉(Trichoderma harzianum)是众所周知的针对植物病原真菌的强效寄生真菌，已在许多大田和温室试验中被证实具有生防潜力。不幸的是，在大多数情况下，生防菌株的效果是难以预测的，也不能与化学杀菌剂竞争。直接应用由真菌生防剂产生的抗微生物化合物，而不是整个“活的”有机体，在工农业上有许多优点，而且由于药剂不能繁殖和传播，可能会更顺从公众舆论。因此，亟需开发一种理想的兼具抗黄曲霉和促进植物生长发育作用的木霉制剂。

几丁寡糖和壳聚糖寡糖(通称为寡糖，COS)已经分别被公认为负责植物的抗性诱导激发剂和生长刺激剂。激发子对植物固有免疫力的刺激是农业中一项新兴技术，它为无残留作物保护做出了越来越多的贡献。带正电荷游离氨基的壳寡糖更是为从土壤源头阻断病原菌侵害带来希望。商购壳寡糖通常是来自脱乙酰化产物，其异质性导致其生物学效应远不尽人意，酶法降解虽是制备壳寡糖理想途径，但存在活性、工艺和成本等瓶颈。因此，有必要另辟蹊径。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种抗黄曲霉促作物生长的无孢子木霉制剂的制备方法。本发明通过经氮离子注入筛选获得的一株哈慈木霉(H-13L)与产毒黄曲霉经液体共培养获得发酵液，发酵液含有在木霉分泌的几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶作用下获得的来自产毒黄曲霉细胞壁的酶解片段：含乙酰基的几丁质寡糖和含带正电荷氨基的壳寡糖以及木霉孢子，去除孢子后得到的溶液即为抗黄曲霉促作物生长的木霉制剂。具体制备过程如下描述：先经平板对峙培养初筛出最佳拮抗组(以生长抑制率和AFB1分泌量作为标志物)；再参考此接种量比例经适度调节进行液体发酵共培养的二次筛选，标志物有：几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶和AFB1。野生型木霉(T.h GIM3.442)作为实验对照组。最终筛选出最佳诱导物使用量：40mL PDB液体培养基中诱导物产毒黄曲霉接种量为10⁵个/mL，木霉(H-13L)为10²个/mL。

本发明的另一目的在于提供一种通过上述制备方法得到的抗黄曲霉促作物生长的无孢子木霉制剂。

本发明的再一目的在于提供上述抗黄曲霉促作物生长的无孢子木霉制剂的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种抗黄曲霉促作物生长的无孢子木霉制剂的制备方法，包括如下步骤：

S1、在培养基中接入哈茨木霉菌(Trichoderma harzianum)H-13L孢子与黄曲霉GIM3.493孢子，至哈茨木霉菌H-13L的孢子浓度为(0.8～1.2)×10²cfu/mL，黄曲霉GIM3.493的孢子浓度为10²～10⁶cfu/mL，培养，得到发酵液；

S2、将步骤(1)所得发酵液过滤，即得所述的无孢子木霉制剂。

步骤S1中所述的哈茨木霉菌(Trichoderma harzianum)H-13L，于2018年12月21日保藏于位于广州市先烈中路100号大院59号楼的广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：60530。该菌株是发明人经N⁺离子诱变筛选获得的一株哈茨木霉菌。本研究选用该菌株来研究其对黄曲霉的拮抗性，旨在利用木霉的强重寄生作用，通过控制共培养条件获取大量来自木霉降解黄曲霉细胞壁而获得的活性壳寡糖激活子、壳聚糖、几丁质酶和β-1,3葡聚糖酶等活性物质，不仅发挥直接抑杀土壤中黄曲霉作用，还能模拟MAMP诱导易感黄曲霉的花生触发MTI免疫响应，诱导植物获得对黄曲霉的诱导***抗性(ISR)木霉刺激植物防御***，使经菌剂处理的花生玉米不仅能抗土壤中的黄曲霉，还能像木霉那样具有促植物生长作用。总之，本发明制备的制剂不仅含有诱导产生包括抗黄曲霉在内的多种抗生素，而且含有能赋予植物ISR的激发子。预计该抗黄曲霉“疫苗”型无孢子木霉生防菌剂具有潜在的产业化前景。

进一步的，步骤S1中，所述的培养基为含0.1％吐温20的PDB培养基。

以体积1L计，所述的PDB培养基配方为：20％马铃薯汁1L、葡萄糖16.80～20.54g、KH₂PO₄ 3.6～4.4g、MgSO₄·7H₂O 1.17～1.43g、Vitanib B1(硫胺素)7.2～8.8mg，pH自然；更优选为：20％马铃薯汁1L、葡萄糖18.67g、KH₂PO₄ 4g、MgSO₄·7H₂O 1.30g、Vitanib B1(硫胺素)8mg，pH自然。

以体积1L计，所述的20％马铃薯汁的配制方法为：取去皮马铃薯200g，切成小块，加水1000mL煮沸20min，滤去马铃薯块，将滤液补足1000mL。

进一步的，步骤S1中，所述的培养的条件为温度26℃～30℃，转速140～160r/min，时间8～10d；更优选为28℃，150r/min恒温摇床中进行振荡培养9d。

进一步的，步骤S1中，黄曲霉GIM3.493的孢子浓度为10⁴～10⁶cfu/mL，更进一步为(0.8～1.2)×10⁵cfu/mL。

进一步的，步骤S2中，所述的过滤是指将发酵液先采用100μm的细胞滤网过滤，之后再经过0.22μm针式滤器过滤。

一种抗黄曲霉促作物生长的无孢子木霉制剂，通过上述制备方法得到。

上述抗黄曲霉促作物生长的无孢子木霉制剂的应用，为如下应用中的至少一种：

1)在抑杀黄曲霉菌中的应用；

2)在抑制黄曲霉毒素分泌中的应用；

3)在诱导作物抗性中的应用；

4)在促进作物生长发育中的应用；

5)在促进作物的碳代谢中的应用；

6)在促进作物的氮代谢中的应用；

7)在逆转黄曲霉对作物生长发育抑制作用中的应用。

进一步的，所述的诱导作物抗性是指诱导作物抵抗黄曲霉侵染，其抗性机制相关防御酶活性提高，所述的黄曲霉防御相关酶包括过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、脂肪酶(Lipase)和脂氧合酶(LOX)。由于酶诱导合成是一个大量消耗ATP和还原力的过程，抗性诱导过度势必严重影响花生等作物正常生长发育，表现出黄曲霉组幼苗生长状况明显比对照组要差，而经制剂浸种预处理的组其长势与制剂组相近而显著好于对照组和染毒组，所以染毒组因抵御黄曲霉侵染胁迫，导致光合功能损伤、有效能量耗竭而严重抑制其生长发育。

进一步的，所述的促进作物生长发育涉及促进种子萌发、促进胚轴伸长、促进幼苗鲜重、株高、主根长、侧枝数和侧枝长和促进叶绿素合成。

通过本发明制剂壳寡糖的施用，可以促进植物的碳代谢和氮代谢，进而发挥促生长效应。

进一步的，所述的促进作物的碳代谢是指提高作物碳代谢相关酶的活性，所述的碳代谢相关酶包括核酮糖-1,5二磷酸羧化酶(加氧酶，RuBisCO)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)。

进一步的，所述的促进作物的氮代谢是指提高作物氮代谢相关酶的活性，所述的氮代谢相关酶包括谷氨酰胺合成酶(GS)和硝酸还原酶(NR)。

进一步的，所述的无孢子木霉制剂的施用方法为种子浸种、叶面喷施或两者相结合。

更进一步的，当所述的无孢子木霉制剂的施用方法为种子浸种时，所用的浸种液为所述的作物疫苗型无孢子制剂的10倍稀释液(稀释所用的试剂为无菌水)，浸种的时间为7～9h(优选为8h)。

此时，所述的应用包括如下步骤：

1)种子处理：挑选籽粒饱满的植物种子，浸入0.1％的升汞中10～20min(优选15min)表面消毒，用水冲洗种子表面以去除升汞残留；将所得植物种子置于所述的无孢子木霉制剂的10倍稀释液中浸泡7～9h(优选为8h)，于28℃下光照恒温培养70～75h(优选72h)；

2)种子栽种：将萌发的花生种子栽入灭菌的黑土中；

3)培养：自然条件下培养，定时补水。

更进一步的，当所述的无孢子木霉制剂的施用方法为叶面喷施时，所用的喷施液为所述的无孢子木霉制剂的500倍稀释液，方式为喷施叶面和叶背，剂量为欲滴为宜，每两天定时喷施，连续喷施10次。

此时，所述的应用包括如下步骤：

1)种子处理：挑选籽粒饱满的植物种子，浸入0.1％的升汞中10～20min(优选15min)表面消毒，用水冲洗种子表面以去除升汞残留；将所得植物种子置于所述的作物疫苗型无孢子制剂中浸泡7～9h(优选为8h)，于28℃下光照恒温培养70～75h(优选72h)；

2)种子栽种：将萌发的花生种子栽入灭菌的黑土中；

3)培养及叶面喷施：定时补水，自然条件下培养10天，开始进行叶面喷施：喷施叶面和叶背，剂量为欲滴为宜，喷施液为所述的作物疫苗型无孢子制剂的500倍稀释液，每两天定时喷施，连续喷施10次。

进一步的，所述的作物包括但不限于各种粮油作物，包括玉米、花生、豆类、棉籽、大米、坚果、茶叶等；更进一步为花生、玉米；最优选为花生粤油7号品种I或粤油7号品种II。

我国是花生生产和出口大国，花生是最重要最普遍的油料作物，黄曲霉污染原自土壤中的黄曲霉。

本发明的原理为：将木霉菌和黄曲霉菌进行混合发酵培养，可以让木霉分泌的细胞壁降解酶直接降解共培养体系中的黄曲霉细胞壁，释放出低聚寡糖。且木霉分泌的真菌细胞壁降解酶多数属于诱导酶类，酶的底物如几丁质和葡聚糖、纯化的病原菌细胞壁、寄主真菌都能诱导木霉产生更多细胞壁降解酶，从而使共培养发酵液中产生更多的寡糖类物质。这些由黄曲霉细胞壁产生的寡糖类物质作用于植物，能针对性诱导植物对黄曲霉菌的抗性，减少黄曲霉菌对植物的侵害。

虽然大量研究已经证明了COS对多种植物病原真菌具有抑菌性以及诱导植物产生抗性，但是COS的生物活性与其分子量、脱乙酰化程度以及聚合度等极为相关，且对于不同细胞壁组成的真菌，COS的杀菌作用也不同。目前有关制备COS的方法都较复杂，且很难制备出对某种病原菌具有特定杀菌作用的COS组分。

本发明通过将哈茨木霉菌H-13L和产毒黄曲霉GIM3.493进行混合发酵培养，研发出一种COS制剂，结果证明该制剂功效成分为COS，该COS制剂添加到土壤中能直接抑制土壤中黄曲霉菌落的生长和黄曲霉毒素的分泌。进一步研究制剂的生物活性发现：利用该制剂浸种处理，能促进被黄曲霉侵染种子的萌发及幼苗的生长，还能逆转黄曲霉对植物生长发育的抑制作用；制剂中的激活子也能激活幼苗的防御反应，提高了花生幼苗防御酶PPO、POD和PAL活性，使幼苗更好的防御黄曲霉菌的侵染以及减轻侵染后带来的伤害。利用该制剂喷施叶面，除了株高和根长都有较为明显的增加外，还能提高幼苗的碳氮代谢，从而促进生长。进一步比较感染黄曲霉菌的花生在浸种、叶片喷施、浸种+叶片喷施这三种处理下其幼苗生长以及各种代谢酶活发现，浸种和喷施联合处理下更能促进幼苗生长和减轻花生感染黄曲霉菌所带来的损害。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

1、本发明制剂对土壤中黄曲霉菌具有抑制作用，添加到土壤中能直接抑制土壤中黄曲霉菌落的生长和黄曲霉毒素的分泌，可以直接施用到土壤中从而减少黄曲霉对花生的侵染。

2、本发明制剂浸种能促进花生种子的萌发、幼苗的生长以及提高对黄曲霉菌的防御性，逆转黄曲霉菌侵染对花生所带来的的伤害。制剂在花生幼苗期进行叶片喷施还能促进幼苗碳氮代谢酶和防御酶的活性。使用该制剂侵泡花生种子以及在出苗后用2％浓度的COS制剂进行叶片喷施，能最大限度的促进幼苗的生长以及减少黄曲霉侵染花生后带来的不良影响。

3、本发明可开发为三类主要产品，即土壤黄曲霉消杀剂、诱导对黄曲霉抗性(即绿色农药)和对正常花生在种子萌发、幼苗生长发育期各阶段的促进剂(即促生长剂，也即绿色肥料)；而这些特征往往与花生后期开花、结果有直接关联。

4、本发明提供的方法工艺简单，制作方便，成本低廉，具有广阔的产业化前景。

附图说明

图1是实施例1两组最佳拮抗活性组的菌落生长情况图；其中，A、B、C、D分别为野生哈茨木霉GIM3.442与黄曲霉对峙培养第2、3、4、5d的图，E、F、G、H分别为突变哈茨木霉H-13L与黄曲霉对峙培养第2、3、4、5的图，a、b、c、d分别为黄曲霉单独培养第2、3、4、5的图。

图2是实施例1两组最佳拮抗活性组的对峙实验中菌落直径和抑菌率测定结果图；其中，A为对峙实验中对峙组黄曲霉和对照组黄曲霉菌落直径，B为对峙实验中木霉对黄曲霉抑菌率。

图3是实施例1两组最佳拮抗活性组的对峙实验中黄曲霉毒素含量和黄曲霉毒素抑制率结果图；其中，C为对峙实验中对峙组和对照组黄曲霉毒素含量，D为对峙实验中黄曲霉毒素抑制率。

图4是实施例2哈茨木霉与不同浓度黄曲霉液体混合培养的生长情况图；其中，A、D、G分别代表浓度为10⁴、10⁵、10⁶cfu/mL的黄曲霉单独培养组，B、E、H分别代表由接种浓度为10²cfu/mL的哈茨木霉H-13L和接种浓度为10ⁿcfu/mL(其中n分别为4、5、6)的哈茨木霉黄曲霉混合培养组，C、F、I分别代表由接种浓度为10²cfu/mL的哈茨木霉GIM3.442和接种浓度为10ⁿ个/mL(其中n分别为4、5、6)的哈茨木霉黄曲霉混合培养组。

图5是实施例2哈茨木霉与不同浓度黄曲霉液体混合培养培养液中酶活变化率结果图；其中，A为几丁质酶变化率，B为β-1,3-葡聚糖酶活变化率。

图6是实施例3不同发酵时间下的几丁质酶和β-1,3葡聚糖酶活性变化图。

图7是实施例3各黄曲霉孢子浓度培养2天后其菌落生长情况图。

图8是实施例3制剂对土壤中不同浓度黄曲霉的毒素抑制情况图。

图9是实施例4不同处理组花生种子萌发情况图。

图10是实施例4各处理组花生种子的萌发率和胚轴长度图。

图11是实施例4不同处理组花生幼苗第12天生长状况图。

图12是实施例4不同处理组花生每天生长状况图。

图13是实施例4不同处理组花生幼苗POD、PPO、PAL活性变化图。

图14是实施例4不同处理组花生幼苗LOX和Lipase活性变化对照图。

图15是实施例5不同喷施浓度下花生幼苗叶片PAL和LOX活性的变化图。

图16是实施例5不同喷施浓度下花生幼苗叶片碳代谢酶活性的变化图。

图17是实施例5不同喷施浓度下花生幼苗叶片氮代谢酶活性的变化图。

图18是实施例6不同处理组花生幼苗的生长状况图。

图19是实施例6不同处理组花生幼苗氧化酶类活性变化图。

图20是实施例6不同处理组花生幼苗脂氧合酶和脂肪酶活性变化图。

图21是实施例6不同处理组花生幼苗碳代谢酶活性变化图。

图22是实施例6不同处理组花生幼苗氮代谢酶活性变化图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

下述实施例中所用的试剂配方：

马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)：20％马铃薯汁1L，葡萄糖20g，KH₂PO₄ 3g，MgSO₄·7H₂O 1.5g，Vitanib B1(硫胺素)8mg，琼脂20g，pH自然。

马铃薯葡萄糖液体培养基(PDB)：20％马铃薯汁1L，葡萄糖20g，KH₂PO₄3 g，MgSO₄·7H₂O 1.5g，Vitanib B1(硫胺素)8mg，pH自然。

20％马铃薯汁配制方法：取去皮马铃薯200g，切成小块，加水1000mL煮沸20min，滤去马铃薯块，将滤液补足1000mL。

PBS缓冲液：用900mL去离子水完全溶解8.7g NaCl，3.0g Na₂HPO₄和0.25gNaH₂PO₄，然后将溶液倒入容量瓶中，定容至1000mL，pH值为7.4。经高压蒸汽灭菌后置于4℃保存。

下述实施例中所用哈茨木霉H-13L保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC 60530；黄曲霉GIM3.493购于广东省微生物菌种保藏中心。

下述实施例中所用花生种子花生粤油7号品种I、粤油7号品种II均购于广东省农业科学院作物研究所。

实施例1哈茨木霉与黄曲霉平板对峙培养及最佳浓度组筛选

(1)取100μL浓度为10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²cfu/mL的哈茨木霉(哈茨木霉H-13L、哈茨木霉GIM3.442)和黄曲霉GIM3.493孢子悬浮液分别均匀涂布于PDA培养基上，28℃下培养48h。

(2)从菌落边缘打取直径5mm的菌饼，将哈茨木霉和黄曲霉菌饼进行不同浓度组合，分别置于PDA(φ9cm)平板一侧的中央进行对峙培养，共形成15组木霉-黄曲霉对峙实验(如表1所示)。同时将黄曲霉菌饼单独置于空白PDA平板中培养，作为对照。每组设3个平行组。

(3)将平板置于28℃恒温培养箱中倒置培养，24h后连续每天拍照观察并记录各组对峙效应。

表1不同菌块浓度进行排列组合

(4)每天拍照观察平板中菌丝体生长状况，从第三天开始，量取对峙培养中黄曲霉菌落生长直径，以单独培养的黄曲霉菌落直径为对照计算抑菌率。抑菌率＝(对照组菌落直径-对峙组菌落直径)/对照组菌落直径×100％。

(5)平板培养14天后测量AFB1含量：将培养皿加热，使PDA培养基融化，将融化培养基混合均匀，吸取1mL混合液到离心管中，加入5mL 50％甲醇萃取，涡旋7分钟，静置半小时，离心(4000r/min、5min)，取上清，将上清液进行稀释后，按照AFB1 Elisa试剂盒说明书进行黄曲霉毒素B1含量测定，以单独培养的黄曲霉组为对照，计算黄曲霉毒素B1的减少率。黄曲霉毒素B1计算公式为I＝(C-T)/C×100，I代表抑制率，C是单独培养黄曲霉的黄曲霉毒素B1产量，T是混合培养时黄曲霉的黄曲霉毒素B1产量。

2、结果

在对峙效应相同或相近的情况下，筛选出低浓度木霉和高浓度黄曲霉组成的对峙组，即为最佳拮抗活性组。通过菌丝体观察、抑菌率和黄曲霉毒素测定筛选到如图1所示的两组最佳拮抗活性组：野生哈茨木霉GIM3.442(10²cfu/mL)-黄曲霉(10⁵cfu/mL)、突变哈茨木霉H-13L(10²cfu/mL)-黄曲霉(10⁵cfu/mL)。

上述两组对峙组的对峙实验菌落直径和抑菌率测定如图2所示。从图2B中可以看出两种木霉在抑菌率方面的差异，从第三天到第五天野生木霉抑菌率分别为25％、38％、52％；突变木霉从第三天到第五天抑菌率分别为3％、18％、20％，由此可见，对峙实验中，野生哈茨木霉GIM3.442对黄曲霉生长的抑制能力明显比突变哈茨木霉H-13L强。

采用AFB1 Elisa测试试剂盒测得上述两组对峙组的对峙实验中黄曲霉毒素含量和黄曲霉毒素抑制率如图3所示。对照组中的黄曲霉，其毒素合成量为14684.98μg/kg，野生哈茨木霉GIM3.442对峙培养组中AFB1含量为547.93μg/kg，抑制产毒率为96％；突变哈茨木霉H-13L-黄曲霉对峙培养组毒素含量为6307.64μg/kg，抑制产毒率为57％。

实施例2哈茨木霉与黄曲霉液体混合发酵培养最佳拮抗组筛选及混合菌剂的确定

1、实验过程

1.1液体混合培养接种量组合设计

基于对峙实验中最佳拮抗活性组的哈茨木霉和黄曲霉接种量，设计以下3种液体混合培养接种量：哈茨木霉(10²cfu/mL)-黄曲霉(10⁴cfu/mL)、哈茨木霉(10²cfu/mL)-黄曲霉(10⁵cfu/mL)、哈茨木霉(10²cfu/mL)-黄曲霉(10⁶cfu/mL)。在含40mL PDB(含0.1％吐温20)的150mL锥形瓶中分别接入哈茨木霉孢子和黄曲霉孢子组成的混合悬浮液，并设三个平行组；置于28℃、150r/min恒温摇床中进行振荡培养。每天拍照观察菌丝体生长变化。

1.2混合培养液黄曲霉毒素含量的测定

液体混合培养13天后，发酵液经100μm细胞滤网过滤，吸取1mL滤液到离心管中，加入5mL 50％的甲醇后涡旋5min，静置半小时，离心(4000r/min、5min)，得待测上清液。将待测上清液进行稀释后，进行黄曲霉毒素B1含量测定(方法参考实施例1)。

1.3混合培养液几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶活性的测定

液体混合培养13天后，发酵液经100μm细胞滤网过滤，将滤液在4℃下、8000g离心10min，上清经0.22μm滤膜过滤除菌，得待测液。根据Elisa酶试剂盒说明书进行酶活性测量，对照为单独培养的哈茨木霉。酶活变化率＝(混合培养液酶活性-单独培养哈茨木霉酶活性)/单独培养哈茨木霉酶活性×100％。

2、结果

2.1液体混合培养菌丝体形态观察及黄曲霉毒素产量分析

从图4A、图4D、图4G的比较可以看出，单独培养的黄曲霉随着孢子浓度增大，其球状菌丝体体积逐渐减小，且发酵液颜色也在逐渐变浅。从表2可知，其毒素含量在逐渐减少。从图4B、图4E、图4H的比较可以看出，混合培养下，随着黄曲霉孢子浓度的增大，黄曲霉球状菌丝体也在逐渐增加，在图4B中完全看不到黄曲霉球状菌丝体，其它两组中均可看见黄曲霉球状菌丝体。

通过菌丝体观察和黄曲霉毒素测定结果可以看出，突变哈茨木霉H-13L和野生哈茨木霉GIM3.442对黄曲霉次生生长均有显著抑制作用，且抑制作用相似。黄曲霉孢子浓度最低组(哈茨木霉：黄曲霉，10²:10⁴)，即图4B图4C所示，溶液呈均一状，完全看不到黄曲霉球状菌丝体，表明两种哈茨木霉对黄曲霉生长具有很强抑制作用。在黄曲霉孢子接种量分别为10⁵cfu/mL和10⁶cfu/mL的混合组中，两种哈茨木霉对黄曲霉有明显的抑制作用，表现为球形黄曲霉菌丝体明显比黄曲霉单独培养的对照组小且少。但在哈茨木霉为10⁵cfu/mL的混合组中突变哈茨木霉H-13L相比野生哈茨木霉GIM3.442表现出对黄曲霉更大的产毒抑制率，突变哈茨木霉H-13L对黄曲霉的拮抗作用更强。

表2混合培养中黄曲霉毒素B1产量和产毒抑制率

2.2混合培养液中几丁质酶分析

如图5A所示，突变哈茨木霉H-13L混合组中，除10²:10⁴组几丁质酶活性表现显著下降外，其它两个混合组几丁质酶活性均显著提高，尤其是10²:10⁵组，其几丁质酶活性提高几乎是10²:10⁶混合组的两倍。图4中可以看出E、F、H菌液中都有黄曲霉菌丝体，结合几丁质酶分析，存在黄曲霉菌丝体的培养液中几丁质酶都有所增加，表明黄曲霉细胞壁诱导木霉分泌几丁质酶。

2.3混合培养液中β-1,3-葡聚糖酶分析

如图5B所示，突变哈茨木霉H-13L混合组中β-1,3-葡聚糖酶活变化与几丁质酶活变化趋势相同。10²:10⁵混合组两种酶的增加率之和明显高于10²:10⁶组，这与哈茨木霉H-13L对黄曲霉毒素抑制率相一致。

通过上述实验结果可知，哈茨木霉H-13L(10²cfu/mL)-黄曲霉(10⁵cfu/mL)为最佳拮抗组，其黄曲霉毒素含量为0.6μg/kg，该AFB1含量已经符合能直接食用的限量标准，几丁质酶活和β-1,3-葡聚糖酶活分别提高48％、28％。基于混合液体培养中哈茨木霉H-13L对黄曲霉极强的拮抗作用及黄曲霉对哈茨木霉H-13L良好的诱导作用，本发明选用哈茨木霉H-13L：黄曲霉(10²:10⁵)混合培养的发酵液作为最佳混合菌剂，并进行后续研究。

实施例3制剂对土壤黄曲霉的抑制作用

1、菌株活化及不同浓度孢子菌悬液制备

将哈茨木霉H-13L、黄曲霉GIM3.493孢子分别接种于PDA培养基试管斜面上活化，置于28℃生化培养箱中培养7～9d，收集孢子，将孢子均匀涂布于PDA培养基平板上二次活化，置于28℃生化培养箱中培养7～9d后。用PBS轻轻冲洗PDA培养基表面收集二次活化后的木霉孢子和黄曲霉孢子，利用涡旋振荡器将其混合均匀，置于4℃条件下储存备用。

2、哈茨木霉和黄曲霉混合发酵最适时间确定

在100mL装有40mL PDB(含0.1％吐温20)培养基的三角锥瓶中接种哈茨木霉和黄曲霉孢子，置于28℃150r/min恒温摇床中混合培养，培养第三天开始取3瓶出来，100μm过滤器过滤后，8000g离心10分钟取上清液，上清0.22μm过滤后得待测粗酶液，根据Elisa试剂盒操作测粗酶液的几丁质酶活和β-1,3葡聚糖酶活性。后面每隔两天取三瓶出来检测酶活性。

不同发酵时间下发酵液中几丁质酶和β-1,3葡聚糖酶活性的变化如图6所示。可以看出，随着发酵时间的延长两种酶活性均呈现先升高后降低的趋势，在第九天时这两种酶活性均达到最高，分别为4.82U/mL和26.31U/mL，之后酶活性开始降低。

3、制剂对土壤中黄曲霉菌落的抑制率测定

制剂制备：在含40mL PDB(含0.1％吐温20)锥形瓶中分别接入木霉孢子和黄曲霉孢子(10²:10⁵)；置于28℃，150r/min恒温摇床中进行振荡培养9d，发酵液经100μm细胞滤网过滤，获得的滤液再经0.22μm针式滤器过滤，获得制剂，再用无菌水稀释10倍，获得制剂10倍稀释液，密封保存于4℃冰箱。

土壤接种：将15g土壤装入培养皿中，在121℃，30min下进行高温高压灭菌后，向含有灭菌土壤的培养皿中加入不同浓度的黄曲霉孢子，实验分为4组，使每组土壤中的黄曲霉孢子数分别为200、400、800、1600cfu/g，实验组中每皿再加入1mL的制剂10倍稀释液，对照组则加1mL的无菌水，每组设置3个平行。各处理组混匀后将平板放入28℃恒温培养箱中培养48h。

菌落检测：48小时后开始取样，每皿取1g土壤放入含有9mL无菌水的试管中(10^-1)，震荡混匀，在试管中进行梯度稀释到10^-2、10^-3、10^-4、10^-5，每个梯度吸取0.2mL稀释悬液到PDA培养基中进行涂板，将培养皿放入28℃恒温培养箱中培养，48h观察菌落生长情况并拍照记录。

各黄曲霉孢子浓度培养2天后其菌落生长情况如图7所示。从图中可以看出在浓度为200、400、800cuf/g的三组中，土壤中添加制剂的实验组菌落数明显少于加无菌水的对照组，在1600cfu/g的组中实验组和对照组差异不明显。表3为制剂对土壤中不同浓度黄曲霉的菌落抑制率，四个浓度的抑制率分别为34％、32％、20％以及8％，与图7的趋势一致。

表3制剂对土壤中不同浓度黄曲霉的抑菌情况

4、制剂对土壤黄曲霉毒素的抑制率测定

制剂制备和土壤接种参见步骤(3)。

黄曲霉毒素测定：接种黄曲霉的平板在28℃恒温培养箱中培养7天后，从中取2g土壤样品置于15mL离心管中，加入10mL样品提取液(V甲醇：V去离子水＝7:3)，震荡5分钟，室温400r/min离心10min，取1mL上清，加入1mL去离子水，混匀。再取混匀的液体1mL加入4mL的35％甲醇进行稀释，最终稀释倍数为50倍。取50μL进行黄曲霉毒素分析。根据AFB1 Elisa试剂盒操作测黄曲霉毒素。

制剂对土壤中不同浓度黄曲霉的毒素抑制情况如图8所示。在200、400、800、1600cfu/g四个浓度中添加制剂培养7天后，其黄曲霉毒素的抑制率分别为39％、27％、15％以及7％，随着土壤中最初添加的黄曲霉孢子数增加，制剂对土壤中黄曲霉毒素的抑制率也出现减弱的趋势，与上面菌落抑制率的情况一致。可见土壤中黄曲霉菌落的数量直接影响其毒素分泌。因此对于高黄曲霉污染的土壤，也需增加制剂的使用量从而提高对黄曲霉毒素分泌的抑制。

上述实验结果表明，向土壤中添加本发明制剂能有效抑制黄曲霉菌落生长以及黄曲霉毒素的分泌。该制剂直接施用到花生种植地的土壤中，能够有效控制土壤中的黄曲霉生长和产毒，从而减少对花生的侵染。

实施例4制剂浸种对黄曲霉菌染毒花生的抗性和促生长作用

1、制剂对黄曲霉浸染的花生种子萌发的影响

制剂制备：参见实施例2。

种子处理：

(1)挑选籽粒饱满程度一致的花生种子(粤油7号品种I)数粒。

(2)将花生种子浸入0.1％的升汞中15min表面消毒。

(3)用无菌水将表面消毒的种子冲洗4到5次，以去除升汞残留。

(4)实验共设4个处理，即对照组、制剂处理组、制剂处理后再侵染黄曲霉组和黄曲霉组。制剂处理组和制剂处理后再侵染黄曲霉组均先用制剂10倍稀释液浸种8h，黄曲霉组和对照组用无菌水浸种8h，浸种完成后单独将需要侵染黄曲霉的种子放入1×10⁷cfu/mL的黄曲霉孢子悬浮液中浸泡5S。将各处理的种子沥出移入装有被灭菌水浸润的滤纸的培养皿中，每皿放入11粒花生种子，每个处理设3个重复，置于光照培养箱中于28℃下恒温培养。

(5)72h后调查各处理种子的萌发情况，种子发芽以胚根突破种皮后长度为种长一半时为发芽标准。计算和测量种子发芽率和胚轴长度。

不同处理组的花生种子萌发如图9所示。从图中可以看出制剂组种子的萌发情况最好，黄曲霉组较差，而经制剂预处理的染菌组较未处理的染菌组发芽率有明显改善，可以推定，这与制剂既能直接抑杀黄曲霉菌又能提高种子抗性有关。

不同处理组的花生种子发芽率和胚轴长度如图10所示。从图中可以看出，对照组、制剂组、黄曲霉组以及制剂加黄曲霉组的花生种子在培养72h后，其中制剂组萌发率最高胚轴最长，分别为95％和14.32mm；黄曲霉组相应参数最低，分别为59％和8.68；在经制剂预处理后的染菌组比未预处理组有明显提高，分别提高了25％和41％，与上面种子萌发图片情况相一致，同时这种差异预示着种子在出苗率上将有不同趋势。上述实验结果表明制剂稀释液含有功能性寡糖。

2、制剂对曲霉浸染的花生幼苗生长及酶活性的影响

种子处理：参考步骤1。

种子栽种：72h后，将萌发的花生种子载入灭菌的黑土花盆中，每盆载3粒花生种子，每个处理设3个重复；自然条件下培养，定时补水，每天拍照观察花生生长状况。

幼苗各生长指标测定：花盆中培养12天后，将幼苗拨出，去除根上黑土，测量花生幼苗株高、根长、侧枝长及鲜重，计数花生幼苗成活率和侧枝数。

叶绿素含量测定：每个花生幼苗取100mg叶片，测定叶绿素含量，叶绿素含量测定方法参照邱念伟等。

幼苗防御酶活性测定：取500mg幼苗叶片，置于预冷过的研钵中，加入2mL磷酸盐缓冲液(pH7.4)，冰浴充分研磨后，加入8mL磷酸盐缓冲液混匀，装入15mL离心管，4000r/min，4℃离心10min，收集上清液，将上清液8000g，4℃离心10min，上清即为酶粗提液。根据Elisa酶试剂盒说明书分别测量PAL(苯丙氨酸解氨酶)、POD(过氧化物酶)、PPO(多酚氧化酶)、Lipase(脂肪酶)和LOX(脂氧合酶)活性。

数据处理：所有实验都设立至少3个平行组。实验数据进行最小显著性差异法(LSD)分析，P<0.05则被认为差异具有统计学意义，并用Graphpad软件进行绘图。

随培养天数增加各组出苗率变化如下表4所示。从表中可以看出，在栽培第7天时，制剂组的出苗率分别是对照组的1.8倍、(制剂组+黄曲霉组)的1.5倍和黄曲霉制剂处理组的2.7倍，染菌组的出苗率是56％。制剂组和制剂预处理后再染菌组在第十天时出苗率达到100％，而对照组在第十二天才达到100％的出苗率。因此，经制剂处理过花生种子的出苗耗时最短。

表4随培养天数增加各组出苗率变化

不同处理组花生幼苗第12天生长状况如图11所示。从图中可以看出，制剂组花生幼苗生长整体状况最好，显然染菌组长势最差。生长状况差异与株高、根系发达程度以及侧枝数目、长度等生长指标差异相吻合，其中主茎和根系差异最为明显。

不同处理组花生幼苗的主要生长指标如下表5所示。从表中可以看出，经制剂处理的花生最早出苗，且随着时间的延长，制剂组和制剂+黄曲霉组的幼苗生长更快，株高更长，侧枝也较多，而在同样时间下对照组和黄曲霉组长势较差，显然抗性酶大量合成消耗过多ATP是影响其生长发育的重要原因之一。与对照组相比，经制剂处理的染菌组长势更好，因此使用制剂浸种能完全逆转黄曲霉对花生的抑制作用。

表5不同处理组花生幼苗的主要生长指标

不同处理组花生苗7-12天的生长状况如图12所示。从图中可以看出经制剂处理的花生最早出苗，且随着时间的延长，制剂组和制剂+黄曲霉组的幼苗生长更快，株高更长，侧枝也较多，而在同样时间下对照组和黄曲霉组长势较差，显然抗性酶大量合成消耗过多ATP是影响其生长发育的重要原因之一。与对照组相比，经制剂处理的染菌组长势更好，因此使用制剂浸种能完全逆转黄曲霉对花生的抑制作用。

不同处理组叶绿素a和b含量变化如下表6所示。从表中可以看出，与对照组相比，制剂组的叶绿素a和叶绿素b分别增加了38％和17％，而染菌组则分别减少了11％和30％。因此，制剂浸泡处理种子后可以增加其幼苗叶片的叶绿素合成，提高幼苗的光合作用，并且相比叶绿素b，叶绿素a含量变化更明显。相反，花生种子经黄曲霉处理后，其幼苗叶片的叶绿素a、b含量均有明显减少，相应其幼苗的光合作用也明显减弱。但是种子经制剂预处理再浸染黄曲霉的幼苗叶绿素a和b与直接染菌组相比提高了30％和26％。因此制剂处理对于叶片的叶绿素a提升更明显，可以促进光能的转化，而染菌对叶绿素b的抑制作用更强，直接减少了叶片对光能的吸收和传递。

表6不同处理组叶绿素a和b含量变化

不同处理组花生幼苗的POD、PPO和PAL活性变化结果如图13，表7所示。制剂组、染菌组以及预处理染菌组的POD、PPO和PAL的活性与对照组相比均有提高；制剂组的三种酶活性分别提高了8％、31％和27％。因为制剂中的COS是能够诱导花生具有获得性***抗性的激活子，它能够显著诱导出幼苗的防御酶活性，使防御酶活性普遍提高。染菌组的三种酶活性分别提高了14％、19％和94％，可能是花生感染黄曲霉后，黄曲霉作为病原菌可以诱导激活植物的主动防卫***，使幼苗体内的防御酶活性普遍升高。而经制剂预处理后再侵染黄曲霉的花生幼苗的三种酶活性分别提高了38％、15％以及26％，从花生幼苗的生长过程中可以明显看出经制剂预处理再染毒的花生幼苗的出苗情况和生长状况明显优于染菌组。这可能是因为制剂处理后制剂中的COS调控了TFs因子，从而使幼苗体内的防御酶酶基因激活，除此还可能是COS通过激活NADPH氧化酶而触发氧化爆发，从而产生H₂O₂，H₂O₂通过激活PAL酶来刺激苯丙烷途径，从而使幼苗体内酚类物质、醌类物质以及木质素等增加，这些物质可以直接杀死部分黄曲霉或者通过加固细胞壁等方式来减轻病原菌对幼苗的侵害。

表7不同处理组花生幼苗POD、PPO、PAL、Lipase和LOX活性

不同处理组花生幼苗的脂肪酶、脂氧合酶活性变化结果如图14所示。花生种子经黄曲霉侵染后其Lipase和LOX的活性都极大增强，分别增加了43％和57％，可见黄曲霉感染使花生幼苗的脂肪和脂肪酸代谢增强，调动了幼苗的防御反应以及增强了能量代谢，相比之下，制剂处理组的Lipase和LOX活性也出现增加，但增加量只是感染组的一半不到，可能是因为制剂处理后，诱导并激发了花生防御***，使防御相关酶活性以及能量消耗增加，但是由于并没有黄曲霉菌感染，幼苗不会处于应激状态，因此酶活性不会像感染组一样增高太多。经制剂处理后的种子再侵染黄曲霉，其幼苗的脂肪酶活性增加23％，脂氧合酶活性增加39％，可见经制剂处理后，制剂中COS直接抑杀了部分黄曲霉菌，导致黄曲霉侵染能力减弱，同时制剂中激活子也激活幼苗防御***，使幼苗的能量消耗和应激反应都较单独的染菌组低。

在植物对病原菌/微生物感染的反应中有两种关键的***抗性：***获得抗性(SAR)和诱导***抗性(ISR)。SAR是植物响应病原体感染而引起的，它可以保护未感染的组织免受随后的各种病原体的攻击。相反，ISR主要是被定居在根际的有益微生物增强，例如假单胞菌属，芽孢杆菌属和木霉属。在许多木霉属与植物的相互作用中，广泛观察到了ISR的激活。上述实验中可以看出黄曲霉侵染花生后、花生会表现为***获得性抗性，而制剂浸种处理后花生会主要变现为诱导***性抗性。花生种子在被黄曲霉菌侵染后，其萌发率和胚轴长度分别减少了24％和29％，出苗时间和出苗率也受到影响，在幼苗生长12天后叶绿素和各个生长指标也明显降低，可见被黄曲霉侵染的花生的萌发和生长明显受到抑制。而在制剂处理后，被黄曲霉侵染花生的萌发和生长状况明显获得改善，且叶绿素含量出现增加，从花生幼苗的防御酶分析中可以看出，在制剂作用后POD、PPO、PAL、LOX和Lipase等酶活性出现增加，这是因为制剂中含有的壳寡糖和几丁寡糖等激活子诱导了植物的ISR，使植物的各种防御酶活性增加，通过加固细胞壁以及形成一些对病原菌有毒害作用的醌类物质等一系列代谢物来减少黄曲霉菌对植物的侵染，除此，植物在制剂中诱导子如COS接触下，诱导子会启动植物的抗氧化机制来中和过氧化氢等活性氧，从而产生氧化应激。从而降低黄曲霉菌对花生萌发和生长的不良影响。因此使用本发明生防制剂对花生浸种能有效减少黄曲霉侵染给花生生长带来的抑制作用。

实施例5制剂喷施对花生幼苗生长的影响

制剂制备：参见实施例2。

种子处理：挑取籽粒饱满程度一致的花生种子(粤油7号品种II)，用0.1％的升汞进行表面消毒，无菌水冲洗4到5次后，将种子放入制剂10倍稀释液中室温浸泡8h后，分别取11粒种子到铺有湿润滤纸的培养皿中，28℃光照培养箱中培养72h，以无菌水浸泡的作为空白对照组。

种子栽种：72h后，将萌发的花生种子载入灭菌的黑土花盆中，每盆载3粒花生种子，每个处理设3个重复；自然条件下培养，定时补水。待花生生长10天，进行叶面喷施，喷施叶面和叶背，剂量为欲滴为宜，喷施浓度分别为浸种浓度的0.5％、1％、2％、4％，每两天定时喷施，连续喷施10次，对照组喷施去离子水。

幼苗各生长指标测定：栽种30天后，将幼苗拨出，去除根上黑土，测量花生幼苗株高、根长、侧枝长并计数鲜重和侧枝数。

叶绿素含量测定：参见实施例4。

幼苗酶活性测定：参见实施例4。

数据处理：使用Excel 2010和SPSS(22.0版)处理和分析数据，并用Graphpad软件进行绘图。

2、结果

(1)不同浓度制剂溶液对花生幼苗性状的影响

不同喷施浓度组花生幼苗生长指标如下表8所示。从表中可以看出，花生叶面喷施制剂后除侧枝数无变化，其余生长指标均有不同程度的增加。不同浓度制剂喷施处理下，随着浓度增加，各生长指标也增加，到2％的浓度时达到最高，其株高、根长、侧枝长和鲜重相比对照组分别增加了18％、49％、11％和42％，且随着喷施浓度增加到4％，各生长指标均有一点程度减少，因此叶面喷施浓度为2％时对花生幼苗的生长效果最好，且叶面喷施对幼苗的根长和鲜重的促进效果最明显。

表8不同喷施浓度组对花生幼苗生长指标的作用效果

注：*、**分别表示同列数据中处理组与对照组间在0.05(P<0.05)和0.01(P<0.01)水平上差异显著

(2)不同浓度制剂溶液对花生幼苗叶绿素含量的影响

不同喷施浓度对花生幼苗叶绿素的影响情况如下表9所示。从表中可以看出，2％浓度下叶绿素最高，与对照比增加5.2％，其余组别叶绿素并无明显变化，但是随着喷施浓度升高，叶绿素b随之增加，到2％时达到最高，增加了6.76％，到4％时叶绿素b再无明显增加。且同组下叶绿素b的增加量大于叶绿素a的增加量，因此制剂的叶面喷施有利于花生幼苗的叶绿素b的增加，有益于幼苗增加蓝紫光的吸收。因此喷施浓度为2％时为最佳浓度。

表9不同喷施浓度组对花生幼苗叶绿素含量的影响

(3)不同浓度制剂溶液对花生幼苗苯丙氨酸解氨酶和脂氧合酶的影响

不同浓度制剂溶液对花生幼苗PAL和LOX的影响如图15所示。可以看出，在四种喷施浓度下，PAL活性在2％的浓度下有明显增加之外，其余组别均无明显变化。但随着喷施浓度的升高，LOX的活性呈先升高后降低的趋势。两种酶活性在2％时达到最高，且与对照相比均有显著增高，此时PAL和LOX活性分别增加了14.54％和19.63％。

对于LOX，当叶面喷施浓度大于1％时即可到达显著提高效果，在1％和4％时，酶活性分别增加了12.53％和18.38％。综合两种酶活性来看，叶面喷施制剂能增加苯丙氨酸解氨酶和脂氧合酶活性，且在喷施浓度为2％时，两种酶活性最高。

(4)不同浓度制剂溶液对花生幼苗碳代谢酶活性影响

不同喷施浓度下花生幼苗叶片核酮糖-1,5二磷酸羧化酶(加氧酶)(RuBisCO)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)及蔗糖磷酸合成酶(SPS)等植物碳代谢相关酶活性变化如图16所示。可以看出，氮代谢酶中RuBisCO、PEPC和GAPDH的酶活性均随着喷施浓度的增加先升高后降低，且酶活性均高于对照组，可见制剂喷施叶片能够提高碳代谢中RuBisCO、PEPC和GAPDH这三种酶活性，使花生幼苗叶片的碳代谢水平升高，从而促进花生生长。

RuBisCO中0％组与对照相比酶活性显著提高了9.14％(P<0.05)，因此使用制剂浸泡花生种子可以提高幼苗期RuBisCO活性。叶面喷施浓度为0.5％、1％、2％及4％的组RuBisCO活性分别提高了10.84％、11.25％、28.24％和27.98％，其中2％组活性提高最大，且在PEPC和GAPDH中该浓度的酶活性也为最高，分别增加了11.94％和17.34％。因此最佳喷施浓度为2％，此时RuBisCO、PEPC和GAPDH这三种酶活性可达到最高。除此，SPS在这四种喷施浓度下，酶活性均无明显变化，可见，该浓度区间下的制剂喷施对花生叶片的SPS活性无明显影响。

在植物碳代谢中，Rubisco主要固定CO₂，是卡尔文循环中的关键酶。PEPC催化PEP产生草酰乙酸为三羧酸循环提供底物。GAPDH是介导甘油醛-3-磷酸转化为1，3-二磷酸甘油酯，产生NADH，或与磷酸甘油酸激酶(PGK)结合，生成ATP。上述实验中，在施用制剂后花生幼苗的RuBisCO、PEPC及GAPDH三种植物碳代谢酶活性均出现不同程度的升高。因此，该制剂喷施能使促进幼苗的CO₂固定、三羧酸循环以及NADH和ATP的生成，使幼苗碳代谢水平升高，从而促进植物的生长。

(5)不同浓度制剂溶液对花生幼苗氮代谢酶活性影响

不同喷施浓度下花生幼苗叶片谷氨酰胺合成酶(GS)、硝酸还原酶(NR)等植物氮代谢酶活性变化如图17所示。可以看出，随着喷施浓度的升高，两种酶活性均存在先增加后减少的趋势。在0％时两种酶活性分别较对照提高了15.44％和13.25％，因此制剂浸泡种子能够增加幼苗期的氮代谢酶活性。GS和NR活性均在2％浓度下达到最高值，此时酶活性分别提高了30.79％和24.08％。浓度在4％时酶活性开始降低。这表明，在喷施浓度为2％时，幼苗叶片的GS、NR的活性能够达到最大，此浓度为最佳喷施浓度。

氮是植物生长所需的最重要的必需营养元素之一，是与作物叶片颜色、生长状态和产量密切相关的叶绿素和蛋白质的主要成分。上述实验中，GS和NR的酶活性在四种浓度制剂使用后均出现增加。因此，制剂使用后能够增加植物谷氨酰胺和谷氨酸循环，从而促进无机氮的代谢和体内氨基酸含量增加。

上述实验结果表明，本发明提供的生防菌剂具有促进幼苗生长及提高防御病原菌侵染的能力，在花生幼苗期喷施该制剂可以提高体内PAL和LOX等防御酶以及RuBisCO、PEPC、GAPDH、GS和NR等代谢酶活性，在调节碳代谢和氮代谢中起着重要作用，从而促进幼苗的生长，且喷施浓度为2％时促生长效果最好。

实施例6制剂不同施用方式对被黄曲霉侵染花生幼苗的作用

制剂制备：参见实施例2。

种子处理：挑取籽粒饱满程度一致的花生种子(粤油7号品种II)，用0.1％的升汞进行表面消毒，无菌水冲洗4到5次置于无菌的烧杯中待用。实验共设5个处理组，分别是水浸种+黄曲霉侵染+幼苗喷施水、水浸种+黄曲霉侵染+幼苗2％制剂喷施、制剂浸种+黄曲霉侵染+幼苗喷施水、制剂浸种+黄曲霉侵染+幼苗2％制剂喷施、制剂浸种+不染菌+幼苗2％制剂喷施。种子先分为两部分，一部分用制剂10倍稀释液浸种，另一部分用无菌水浸种，浸种8h后，将需要侵染黄曲霉组的种子单独放入1×10⁷cfu/mL的黄曲霉孢子悬浮液中浸泡5秒。最后将各处理的种子沥出移入装有被灭菌水浸润滤纸的培养皿中，每皿放入11粒花生种子，每个处理设3个重复，置于光照培养箱中于28℃下恒温培养。

种子栽种：72h后，将萌发的花生种子载入灭菌的黑土花盆中，每盆载3粒花生种子，每个处理设3个重复；自然条件下培养，定时补水。待花生出苗后用2％浓度的制剂进行叶面喷施，喷施叶面和叶背，剂量为欲滴为宜。每两天定时喷施，连续喷施6次，对照组喷施去离子水。

幼苗各生长指标测定：参见实施例4。

叶绿素含量测定参：见实施例4。

幼苗酶活性测定：参见实施例4

数据处理：参见实施例5。

2、结果

(1)不同处理组对花生幼苗性状的影响

不同施用方式下花生幼苗的生长状况如图18所示。从图中可以看出在长到22天时，经制剂处理的四组幼苗长势明显好于单独的黄曲霉组。从时间上看，整个栽培期，黄曲霉组的幼苗生长明显受到病原菌侵染的影响，出苗时间推迟，长势也较差。而在经过制剂浸种或喷施处理后，幼苗长势有明显改善，其中单独喷施处理中，由于种子未经制剂处理，在第22天仍有种子未出苗，可见浸种处理至关重要，能促进种子前期萌发和出苗。喷施和浸种联用的染菌组和未染菌组，两者长势非常接近，因此联用能完全逆转黄曲霉侵染对花生生长的影响，且具有促进效果。

不同处理组对花生幼苗生长指标的测量如下表10所示。从表中可以看出，无论是制剂浸种、喷施或者二者联合使用，对幼苗的株高、根长、侧枝数、侧枝长和鲜重菌均表现出促进作用，其中浸种和喷施联合使用的促进效果明显，在P<0.05的水平下各生长指标均差异显著。联合使用后其株高和根长增加最大，分别增加了28％、21％。可以看出该表与图示幼苗生长状况相一致。因此，可以推测出该制剂浸种和叶片喷施联合使用对花生生长的促进效果最明显，能有效减轻黄曲霉侵染对花生生长带来的抑制影响。

表10不同处理组对花生幼苗生长指标的作用效果

注：*表示同列数据中处理组与黄曲霉组间在0.05(P<0.05)水平上差异显著

(2)不同处理组对花生幼苗叶绿素的影响

不同处理组幼苗的叶绿素含量变化如下表11所示。从表中可以看出未受黄曲霉侵染幼苗的浸种和喷施联合处理下，其叶绿素含量是最高的，增加了27％，而有黄曲霉侵染组的花生叶绿素出现降低，光合作用减弱，其叶面颜色也较浅。但是在制剂浸种或喷施后叶绿素含量有所增加，分别增加了4％和7％。在制剂和喷施联合使用下，叶绿素含量增加16％，明显高于二者单独使用，其中叶绿素a增加效果明显，达到了19％，可见联合使用能有效增加幼苗对蓝绿光的吸收以及光能转化效率。因此使用制剂对花生种子侵泡及幼苗期喷施能有效促进染菌花生的光合作用，增加叶片对光的吸收和转换。

表11不同处理组花生幼苗叶绿素含量变化

(3)不同处理组对花生幼苗防御酶活性的影响

不同处理组花生幼苗的POD、PPO以及PAL活性的变化如图19所示。与单独的黄曲霉组相比其余四种处理组的三种酶活性均有上升，未受黄曲霉菌侵染的浸种+喷施组的三种酶活性增加最高，POD、PPO、PAL分别增加了13％、16％和21％，其中PAL的活性增加最大。花生侵染黄曲霉后，制剂叶片喷施处理比浸种处理的POD和PPO活性明显增加更多，而PAL的活性两种处理无明显差别，可见叶片喷施更能促进POD和PPO活性增加。当浸种和喷施联合处理时，三种酶活性分别增加了12％、14％、9％。POD联合使用的酶活性与单独的喷施处理无差别，但是PPO和PAL活性在联合处理下比单独的使用更高，因此，COS制剂浸种和叶片喷施联合处理更有利于花生幼苗抵抗黄曲霉侵染。

LOX和Lipase的酶活性变化如图20所示。浸种和喷施这两种单独处理的LOX活性分别是13％和14％，无明显差别，但是二者联合处理后酶活性提升，达到23％，因此使用制剂对花生浸种和叶片喷施能对LOX活性有叠加效果，比单独使用酶活性更高，因此两种处理联合使用能有效提高幼苗LOX活性，增强植物脂肪酸代谢。从图中可以看出Lipase活性中，浸种+喷施组的酶活性最高，增加了37％，而有黄曲霉菌侵染增加量较低，分别增加11％、14％和16％，仍为浸种和喷施联合应用的Lipase活性较高。

(4)不同处理组对花生幼苗碳代谢酶活性的影响

幼苗碳代谢中核酮糖-1,5二磷酸羧化酶(RuBisCO)、植物磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)、植物甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)以及植物磷酸甘油酸激酶(PGK)这五种酶活性如图21和表12所示。从图中可以看出GADPH和PGK这两种酶的增加比例较高，在喷施和浸种进行单独处理时，这四种酶活性均是浸种处理高于喷施处理，当两种联合处理时RuBisCO和GAPDH的酶活性均是高于单独处理，而PEPC和PGK是低于单独处理。RuBisCO在两种联合处理时黄曲霉菌是否侵染对酶活性无明显影响，均是24％，而两者单独处理时酶活性增加较低，因此黄曲霉菌侵染下RuBisCO酶活性会下降，当喷施或浸种处理时，酶活性会出现增加，且当二者联合使用时，其酶活性不再受到黄曲霉菌侵染的影响。PEPC的酶活性在浸种和喷施单独处理时活性较高，而在联合使用后酶活性反而降低，可见制剂联合使用不会增加PEPC活性。GAPDH在单独处理时酶活性分别增加15％和17％，在联合使用下酶活性增加量是单独的两倍多，因此联合使用会使GAPDH的酶活性大幅度增加。在联合使用下PGK的酶活性与单独的喷施处理相差不大，而在单独的浸种处理下酶活性增加较高，增加了41％，与无黄曲霉菌侵染的浸种和喷施联合处理接近，可见浸种处理对幼苗的PGK酶活性增加更大。总体上，黄曲霉菌侵染后，使用制剂进行不同处理均会有效增加幼苗碳代谢酶活性，使幼苗碳代谢增加，减少黄曲霉菌侵染对幼苗生长的影响。

表12不同处理组碳氮代谢酶活性

(5)不同处理组对花生幼苗谷氨酰胺合成酶和硝酸还原酶的影响

幼苗氮代谢中谷氨酰胺合成酶(GS)和硝酸还原酶(NR)的酶活性变化如图22所示。由图可知，GS的酶活性在无黄曲霉菌侵染的制剂联合处理组中最高为23％，有黄曲霉菌侵染的次之，在单独处理中较低，其中单独喷施组的最低，其增加率只有最高组的一半，为12％，因此黄曲霉菌侵染会导致GS活性降低，但制剂施用后会不同程度增加其活性，在浸种和喷施联合处理后其活性增加率最大。在氮代谢中NR在黄曲霉菌侵染后，单独的喷施处理组的酶活性最高为16％，浸种较低，但两者联合处理后，酶活性比浸种有所增加，增加了14％，可见对于NR，单独的喷施处理最佳。在制剂对花生进行不同处理后，氮代谢的GS和NR活性出现增加，可增加幼苗的氮代谢水平。

通过浸种、喷施、浸种+喷施三种不同使用方式对黄曲霉菌侵染花生的生长影响研究，经过对花生的各个生长指标、叶绿素、防御酶以及碳氮代谢酶的测定和分析，确定了使用本发明制剂侵泡花生种子以及在出苗后用2％浓度的COS制剂进行叶片喷施，能最大限度的促进幼苗的生长以及减少黄曲霉侵染花生后带来的不良影响。在浸种和喷施联用的情况下，被黄曲霉侵染幼苗的各个生长指标与未受侵染的无明显差距，叶绿素的含量也较两者单独使用时高，联合使用有效提高光合作用，增加ATP的生成速度和还原力(NADPH)在卡尔文循环利用，从而进一步促进幼苗的碳代谢。在黄曲霉侵染组中，防御酶中除POD活性在两者联用时与单独喷施无差异，其余酶活性均是浸种和喷施联用下较高，因此在使用制剂浸种和喷施可以进一步提高幼苗防御酶活性，两者的联合使用具有累积效应。在碳代谢酶中RuBisCO和GAPDH的酶活性在两者联合使用下能累积增加，但PEPC和PGK的酶活性在单独的浸种处理下较高，这可能是因为PEPC主要帮助植物避免和耐受非生物胁迫(如盐度、干旱、高温)，而在本实验中的花生幼苗主要受到病原菌等生物胁迫，且在联合使用下幼苗的防御酶增加，有效防控了病原菌对幼苗的侵害，因此在联合使用下PEPC没有出现较大幅度升高。其中GAPDH联合使用下增高幅度非常大，这可能是因为高等植物中GAPDH是糖酵解、糖异生和卡尔文循环过程中的关键酶，能催化甘油醛-3-磷酸形成1,3-二磷酸甘油酸的可逆反应，这是糖酵解(糖异生)中唯一的氧化(还原)反应。在氮代谢酶中GS的酶活联合处理较高，而NR活性在单独喷施中较高，在联合处理后有轻微降低，但仍较单独浸种处理高，因此在浸种后再叶面喷施能增加NR和GS的酶活性。因此制剂在调节C和N代谢中起着重要作用。

总之，无论是从幼苗萌发率还是生长状况来说，制剂浸种和叶面喷施联用都是效果最好的，使用浸种能在种子萌发和幼苗生长初期都有一定的促进效果，减少黄曲霉菌对花生初生长的抑制，而在幼苗期，通过叶面喷施直接让制剂中的壳寡糖等激活子与叶片接触，更加有效地促进幼苗生长。

除此之外，在比较品种II与品种I的防御酶活性中可以发现，品种II的防御酶活性增加率普遍显著低于品种I，由此可见品种II抗性显著高于品种I，因此品种II生长过程中应消耗更少的ATP，其长势也相应优于品种I。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (11)

1.一种抗黄曲霉促作物生长的无孢子木霉制剂的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

S1、在培养基中接入哈茨木霉菌（Trichoderma harzianum）H-13L孢子与黄曲霉GIM3.493孢子，至哈茨木霉菌H-13L的孢子浓度为（0.8～1.2）×10² cfu/mL，黄曲霉GIM3.493的孢子浓度为10²～10⁶ cfu/mL，培养，得到发酵液；

S2、将步骤（1）所得发酵液过滤，即得所述的无孢子木霉制剂。

2.根据权利要求1所述的抗黄曲霉促作物生长的无孢子木霉制剂的制备方法，其特征在于：

所述的黄曲霉GIM3.493的孢子浓度为10⁴～10⁶ cfu/mL。

3.根据权利要求1所述的抗黄曲霉促作物生长的无孢子木霉制剂的制备方法，其特征在于：

所述的黄曲霉GIM3.493的孢子浓度为（0.8～1.2）×10⁵ cfu/mL。

4.根据权利要求1所述的抗黄曲霉促作物生长的无孢子木霉制剂的制备方法，其特征在于：

步骤S1中，所述的培养的条件为温度26℃～30℃，转速140～160 r/min，时间8～10 d；

步骤S2中，所述的过滤是指将发酵液先采用100 μm的细胞滤网过滤，之后再经过0.22μm针式滤器过滤。

5.根据权利要求1所述的抗黄曲霉促作物生长的无孢子木霉制剂的制备方法，其特征在于：

所述的培养基为含0.1%吐温20的PDB培养基；

以体积1L计，所述的PDB培养基配方为：20%马铃薯汁1 L、葡萄糖 16.80～20.54 g、KH₂PO₄ 3.6～4.4 g、MgSO₄ •7H₂O 1.17～1.43 g、Vitanib B1 7.2～8.8 mg，pH 自然；

以体积1L计，所述的20%马铃薯汁的配制方法为：取去皮马铃薯200 g，切成小块，加水1000 mL煮沸20 min，滤去马铃薯块，将滤液补足1000 mL。

6.一种抗黄曲霉促作物生长的无孢子木霉制剂，其特征在于：通过权利要求1～5任一项所述的制备方法得到。

7.权利要求6所述的抗黄曲霉促作物生长的无孢子木霉制剂的应用，其特征在于：所述的应用为如下应用中的至少一种：

1）在抑杀黄曲霉菌中的应用；

2）在抑制黄曲霉毒素分泌中的应用；

3）在诱导作物抗性中的应用；

4）在促进作物生长发育中的应用；

5）在促进作物的碳代谢中的应用；

6）在促进作物的氮代谢中的应用；

7）在逆转黄曲霉对作物生长发育的抑制作用中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：

所述的诱导作物抗性是指提高作物抗黄曲霉侵染的抗性机制相关防御酶活性，所述的黄曲霉防御相关酶包括过氧化物酶、多酚氧化酶、苯丙氨酸解氨酶、脂肪酶和脂氧合酶；

所述的促进作物生长发育包括促进种子萌发、促进胚轴伸长、促进幼苗鲜重、株高、主根长、侧枝数和侧枝长和促进叶绿素合成；

所述的促进作物的碳代谢是指提高作物碳代谢相关酶的活性，所述的碳代谢相关酶包括核酮糖-1,5二磷酸羧化酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和甘油醛-3-磷酸脱氢酶；

所述的促进作物的氮代谢是指提高作物氮代谢相关酶的活性，所述的氮代谢相关酶包括谷氨酰胺合成酶和硝酸还原酶。

9.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于：

所述的无孢子木霉制剂的施用方法为种子浸种、叶面喷施或两者相结合。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：

所述的种子浸种中所用的浸种液为所述的无孢子木霉制剂的10倍稀释液，浸种的时间为7～9 h；

所述的叶面喷施中所用的喷施液为所述的无孢子木霉制剂的500倍稀释液，方式为喷施叶面和叶背，剂量为欲滴为宜，每两天定时喷施，连续喷施10次。

11.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于：

所述的作物包括玉米、花生、豆类、棉籽、大米、坚果和茶叶。

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