CN113480590B - 雷公藤大戟酮(wilfordeuphone)及其制备方法和在药物上的应用 - Google Patents

雷公藤大戟酮(wilfordeuphone)及其制备方法和在药物上的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种大戟烷型三萜雷公藤大戟酮(wilfordeuphone)(式I化合物)，及从雷公藤(Tripterygium wilfordii)植物体中提取本发明化合物的方法，同时提供一种以式I化合物为活性成分的用于治疗和预防肿瘤的药物组合物，及该化合物及其药物组合物在制备治疗和预防肿瘤的药物方面的应用。

Description

雷公藤大戟酮(wilfordeuphone)及其制备方法和在药物上的 应用
技术领域
本发明属于药物化合物和药物学领域，具体地，涉及一种新的化合物雷公藤大戟酮 (wilfordeuphone)，其制备方法，以该化合物为活性成分的药物组合物，以及该化合物及其药物组合物在制备***的药物方面的应用。
背景技术
雷公藤(Tripterygium wilfordii)为卫矛科(Celastraceae)雷公藤属(Tripterygium)一年生藤本植物，植株高1～3米。产于我国 台湾、福建、江苏、浙江、安徽、湖北、湖南、广西等省。生长于山地林内阴湿处。雷公藤为我国传统医学中的一种常用中草药，具有抗炎、免疫抑制、抗生育、抗肿瘤、抗菌、消肿止痛等作用。
肿瘤是指细胞在致瘤因素作用下，基因发生改变，失去对细胞生长的正常调控，导致异常增生。肿瘤是导致人类死亡的首要疾病之一，目前，***主要有外科疗法(手术)、化学疗法(化疗)、放射治疗(放疗)，传统的中医药治疗，外加现代微创治疗及生物治疗方法。近年随着纳米分子医学和分子生物学技术的突飞猛进，肿瘤发生机制的阐述、抗肿瘤靶点的寻找、新型抗肿瘤药物的开发以及治疗手段的创新和综合运用都有了长足的进步，肿瘤患者生存时间明显延长。但是，严重威胁人类生命健康的占恶性肿瘤90％以上的实体瘤的治疗尚未达到满意的疗效，仍有大量肿瘤患者因对治疗无反应或耐药而最终导致治疗失败。因此，发现并开发新型抗肿瘤药物仍然是人们所要持续面对的问题。
现有技术中未见本发明所涉及的式(I)化合物雷公藤大戟酮(wilfordeuphone)及其作为有效成分在***方面的报道，以及该化合物具有抗肿瘤活性的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有药用价值的雷公藤大戟酮(wilfordeuphone)。
本发明的另一目的是提供一种从药用植物雷公藤中提取本发明化合物的方法。
本发明的进一步目的是提供一种以式I化合物为活性成分的用于治疗和预防肿瘤的药物组合物，及该化合物和组合物在制备***的药物方面的应用。
为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
用于***的药物，其中含有***有效量的式I化合物或其药学上可接受的盐、酯或立体异构体及可药用载体和/或赋形剂。
Figure BDA0003208820080000021
本发明化合物雷公藤大戟酮(wilfordeuphone)可以转化为药学上可接受的衍生物。如羟基可采用公知方法进行酰化(如甲酰化，乙酰化、苯甲酰化、磺酰化)、卤化、氧化等。
本发明化合物用作药物上时，可以直接使用，或者以药物组合物的形式使用。该药物组合物含有0.1％～99％，优选为0.5％～90％的本发明化合物，其余为药物学上可接受的盐，或对人和动物无毒和惰性的可药用载体和/或赋形剂。
所述的药用载体或赋形剂是一种或多种选自固体、半固体和液体稀释剂、填料以及药物制品辅剂。将所述的药物组合物以单位体重服用量的形式使用。本发明的药物可经口服和注射(静注、肌注)两种形式给药。
口服可用其固体或液体制剂，如粉剂、片剂、糖衣剂、胶囊、溶液、糖浆、滴丸剂等。
注射可用其固体或液体制剂，如粉针剂、溶液形注射剂等。
为了更好地理解本发明的实质，下面将用本发明的式I化合物的生物活性结果来说明它在医药领域中的应用。
MTS法检测细胞活性：
MTS为一种全新的MTT类似物，全称为 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxy-phenyl)-2-(4-sulfopheny)-2H-tetrazolium，是一种黄颜色的染料。活细胞线粒体中琥珀酸脱氢酶能够代谢还原MTS，生成可溶性的甲臜 (formazan)化合物，甲臜的含量可以用酶标仪在490nm处进行测定。在通常情况下，甲臜生成量与活细胞数成正比，因此可根据光密度OD值推测出活细胞的数目。
实验方法：
1.接种细胞：用含10％胎牛血清的培养液(DMEM或者RMPI1640)配成单个细胞悬液，以每孔3000～15000个细胞接种到96孔板，每孔体积100μL，贴壁细胞提前12～24小时接种培养。
2.加入待测化合物溶液(固定浓度40μM初筛，在该浓度对肿瘤细胞生长抑制在50％附近的化合物以40μM、8μM、1.6μM、0.32μM、0.064μM浓度梯度复筛)，每孔终体积200μL，每种处理均设3个复孔。
3.显色：37摄氏度培养48小时后，贴壁细胞弃孔内培养液，每孔加MTS溶液20μL和培养液100μL；悬浮细胞弃100μL培养上清液，每孔加20μL的MTS溶液；设3个空白复孔(MTS溶液20μL和培养液100μL的混合液)，继续孵育2～4小时，使反应充分进行后测定光吸收值。
4.比色：选择492nm波长，多功能酶标仪(MULTISKAN FC)读取各孔光吸收值，记录结果，数据处理后以浓度为横坐标，细胞存活率为纵坐标绘制细胞生长曲线，应用两点法(Reed andMuench法)计算化合物的IC50值。
5.阳性对照化合物：每次实验均设顺铂(DDP)为阳性化合物，以浓度为横坐标，细胞存活率为纵坐标绘制细胞生长曲线，应用两点法(Reed andMuench法)计算化合物的IC50值。
实验结果见表1：
表1.雷公藤大戟酮(wilfordeuphone)对肿瘤细胞株的半数生长抑制浓度IC50(μM)
Figure BDA0003208820080000031
上述试验结果表明，雷公藤大戟酮(wilfordeuphone)对多种肿瘤细胞株的生长均有明显的抑制作用，其抗癌活性与临床抗肿瘤药物顺铂相当。
附图说明
图1为本发明的化合物雷公藤大戟酮(wilfordeuphone)的X-ray单晶衍射测定的晶体结构。
具体实施方式
下面结合实施例进一步对本发明的实质内容进行说明，但本发明的内容并不局限于此。
实施例1：
本实施例提出了一种从雷公藤中提取的大戟烷三萜类化合物，该化合物为白色晶体，分子量为456，分子式为C30H48O3，具体结构式如下：
Figure BDA0003208820080000032
该化合物是从雷公藤干燥根中分离提纯而得到的，具体提取步骤如下：
1)以14.0kg雷公藤干燥根为原料，粉碎后用其重量6倍的体积分数为95％的乙醇水溶液进行加热回流提取3次，再经减压浓缩至无醇后得到浸膏650g。
2)将浸膏用氯仿和甲醇的混合溶剂(1:1)进行溶解，溶解后用2倍硅胶用量(1300g) 拌样，用4倍硅胶用量(2600g)进行分离，依次采用石油醚/丙酮溶剂(20:1、10:1、6:1、4:1、 2:1、1:1、0:1)体系进行梯度洗脱，TLC点板合并，收集获得7个部分的洗脱液，依次命名为 Fr.1～Fr.7，其中在石油醚/丙酮4:1和2:1梯度洗脱段，得到目标流份Fr.3。
正相硅胶柱材料：80～100目，青岛康业鑫药用硅胶干燥剂有限公司；
洗脱液的流速为10mL/min；
3)得到Fr.3(20g)，对所述Fr.3进行正相硅胶柱色谱分离，用20倍硅胶用量(400g)进一步洗脱分离，收集5个部分的洗脱液，依次命名为Fr.3-1～Fr.3-5。
正相硅胶柱材料：200～300目，青岛康业鑫药用硅胶干燥剂有限公司；
洗脱剂：石油醚/丙酮＝10:1
洗脱液的流速为10mL/min；
4)得到Fr.3-2(2g)后，对所述Fr.3-2进行中压制备液相柱色谱分离，采用C18反相硅胶柱色谱进行分离，用体积分数为60％的甲醇水溶液进行洗脱，收集获得5个部分的洗脱液，依次命名为Fr.3-2-1～Fr.3-2-5。
反相硅胶材料：Chromatorex C18(40～75μm,Fuji Silysia Chemical Ltd.,Japan)；
洗脱液的流速为10mL/min；
5)得到Fr.3-2-4(0.2g)后，采用Sephadex LH-20凝胶柱层析对所述Fr.3-2-4进行分离浓缩；每5mL收集一份层析液，TLC点板合并检测目标物流份后将含有目标物的流份放置室温，24小时后析出晶体，最终得到雷公藤大戟酮纯品118mg。
凝胶材料Sephadex LH-20：40～70μm(GE Healthcare Bio-Sciences AB,Uppsala,Sweden)；
洗脱液的流速为2mL/min；
洗脱液为氯仿/甲醇＝1:1；
经上述分离流程得到的雷公藤大戟酮(wilfordeuphone)结构数据如下：
白色针晶(氯仿-甲醇)；分子式C30H48O3；
Figure BDA0003208820080000041
(c 0.10,MeOH)；ESIMS(pos.):m/z 479 [M+Na]+；HRESIMS:m/z 479.3496[M+Na]+(479.3496calcd for C30H48O3Na)；IR(KBr)νmax: 3430,2968,2948,1708,1630,1452,1386,1005,cm–1；核磁共振波谱数据见表2。该化合物的立体结构通过ROESY进行初步指认，并最终通过X-单晶衍射技术，对其立体构型进行了确认。
表2.雷公藤大戟酮(wilfordeuphone)的核磁共振波谱数据(CDCl3中测定)
Figure BDA0003208820080000051
结晶条件：采用乙腈溶液，将15mg样品溶解在10mL安剖瓶中，瓶口用塑料膜覆盖，并在膜上扎2个小眼，室温挥发，得到针状晶体(单晶结构见说明书附图)。X-ray单晶衍射其数据如下:
Crystal data for wilfordeuphone:C30H48O3,M＝456.68,
Figure BDA0003208820080000052
Figure BDA0003208820080000053
α＝90°,β＝126.803(5)°,γ＝90°,
Figure BDA0003208820080000054
T＝100.(2)K,space group C121, Z＝4,μ(Cu Kα)＝0.560mm-1,12938reflections measured,4574independent reflections(Rint＝0.3557).The finalR1 values were 0.1738(I>2σ(I)).The final wR(F2)values were 0.4337(I> 2σ(I)).The final R1 values were 0.2734(all data).The final wR(F2)values were 0.5023(all data). The goodness offit onF2 was 1.503.Flackparameter＝-0.4(9).
实施例2：
片剂：实施例1所得化合物10mg，乳糖180mg，淀粉55mg，硬脂酸镁5mg；
制备方法：将化合物、乳糖、淀粉混合，用水均匀湿润，把湿润后的混合物过筛并干燥，再过筛，加入硬脂酸镁，然后将混合物压片，每片重250mg，其中化合物含量10mg。
实施例3：
胶囊剂：实施例1所得化合物100mg，淀粉100mg，硬脂酸镁适量；
制备方法：将化合物与助剂混合，过筛，在合适的容器中均匀混合，将所得混合物装入硬明胶胶囊。
实施例4：
安瓿剂：实施例1所得化合物2mg，氯化钠10mg；
制备方法：将化合物和氯化钠溶解于适量的注射用水中，过滤，所得溶液在无菌条件下装入安瓿瓶中。

Claims (6)

1.雷公藤大戟酮，其特征在于，所述雷公藤大戟酮为下述结构式I化合物：
Figure FDA0003958801700000011
。
2.权利要求1所述的雷公藤大戟酮化合物的制备方法，该方法包括以下步骤：
14.0kg雷公藤干燥根粉碎后用醇提取，合并提取液，减压浓缩，得到粗提物浸膏650g，所得浸膏再经正相硅胶柱层析分离，以石油醚/丙酮溶剂20:1、10:1、6:1、4:1、2:1、1:1、0:1体系进行梯度洗脱，在石油醚/丙酮4:1和2:1洗脱段，点板合并流份，得到目标流份，该流份进一步经硅胶，以 石油醚/丙酮10:1洗脱、中压制备，以 甲醇/水60％洗脱、Sephadex LH-20，以 氯仿/甲醇1:1洗脱以及氯仿-甲醇溶剂重结晶，得到雷公藤大戟酮(wilfordeuphone)纯品118mg(式I化合物)。
3.药物组合物，其中含有治疗有效量的权利要求1所述的雷公藤大戟酮或其药学上可接受的盐。
4.根据权利要求3所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物中雷公藤大戟酮或其药学上可接受的盐的质量分数为0.1％～99％。
5.权利要求1所述的雷公藤大戟酮在制备治疗和预防肿瘤的药物中的应用。
6.根据权利要求3所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包括药学上可接受药用的辅料。
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