CN113476438B

CN113476438B - 含二氢桑色素的降血糖组合物及其应用

Info

Publication number: CN113476438B
Application number: CN202110962305.0A
Authority: CN
Inventors: 张强; 焦中高; 潘俊坤; 陈大磊; 刘杰超; 杨文博; 张春岭; 刘慧�; 吕真真
Original assignee: Zhengzhou Fruit Research Institute CAAS
Current assignee: Zhengzhou Fruit Research Institute CAAS
Priority date: 2021-08-20
Filing date: 2021-08-20
Publication date: 2022-09-09
Anticipated expiration: 2041-08-20
Also published as: CN113476438A

Abstract

本发明公开了含二氢桑色素的降血糖组合物及其应用，属于医药技术领域。本发明提供的含二氢桑色素的组合物，具有降血糖作用，是由化合物A和化合物B组成，其中，化合物A选自二氢桑色素，化合物B选自芫花素或科罗索酸。由二氢桑色素和芫花素组成的组合物，两者的质量比为15:80～20:35；由二氢桑色素和科罗索酸组成的组合物，两者的质量比为15:30～50:15。本发明所述组合物对α‑葡萄糖苷酶活性具有抑制作用，在降血糖方面表现出较好的应用价值。

Description

含二氢桑色素的降血糖组合物及其应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及含二氢桑色素的降血糖组合物及其应用。

背景技术

近年来，随着人们生活饮食及水平的改变，糖尿病患者的数量不断增加，已被WHO列为慢性病防治的重点之一。糖尿病主要是由于胰岛功能减退从而引起餐后血糖上升，而过高的血糖又会阻止胰腺分泌胰岛素，降低这种胰岛素调节外周细胞组织对葡萄糖的吸收能力，导致胰岛素的排除和作用的发挥存在缺陷，最终引起糖、水、蛋白质、脂肪和电解质等一系列代谢紊乱综合征。由于糖尿病带来的危害和引起的并发症给人们生理健康和生活造成了巨大的影响和负担，所以有效的降血糖药物开发受到了越来越多科学工作者的重视。α-葡萄糖苷酶能够水解低聚糖释放出葡萄糖，最终导致餐后高血糖，因此，抑制α-葡萄糖苷酶的活性，从源头上延缓葡萄糖的产生，降低餐后高血糖，这是治疗糖尿病的一种主要途径。目前，市场上已经用于临床实践降血糖的药物有阿卡波糖、伏格列波糖和米格列波糖，但持续使用会造成一些副作用。因此，从天然产物中发掘新的毒副作用小的α-葡萄糖苷酶抑制剂迫在眉睫。

活性分子联用的最终目的是为了提高效果、减小剂量、降低毒副作用以及避免或延缓抗性的产生。目前，针对α-葡萄糖苷酶抑制剂的研究大多集中在单一化合物，持续使用会产生一定副作用和耐受性，而活性分子间的协同增效作用报道尚少。因此，采用化合物联合用药抑制α-葡萄糖苷酶，对于改善人类血糖疾病具有重要意义。

发明内容

本发明提供的含二氢桑色素的组合物，具有降血糖作用，是由化合物A和化合物B组成，其中，化合物A选自二氢桑色素，化合物B选自芫花素或科罗索酸。由二氢桑色素和芫花素组成的组合物，两者的质量比为15:80～20:35；由二氢桑色素和科罗索酸组成的组合物，两者的质量比为15:30～50:15。

上述组合物对α-葡萄糖苷酶活性具有抑制作用，因此在降血糖方面表现出应用价值，其应用包括但不限于将该组合物制备成具有降血糖作用的药物和/或保健品。优选地，制备成的药物可以用于治疗糖尿病。

由上述组合物制备成的药物或保健品，包含与药学或食品中可接受的载体、溶剂、稀释剂、赋形剂或其他介质，并可以按需求的不同制备成相应的粉剂、颗粒剂、胶囊剂、注射剂、口服液或片剂。

上述组合物在抑制α-葡萄糖苷酶活性的过程中，化合物A和化合物B表现为协同增效；其中，二氢桑色素和芫花素在质量比为15:50～15:35时存在协同增效，二氢桑色素和科罗索酸在质量比为15:15时存在协同增效。

在一个具体实施方案中，二氢桑色素和芫花素的质量比选自15:35。

在一个具体实施方案中，二氢桑色素和科罗索酸的质量比选自15:15。

本发明的有益效果为：

本发明所述组合物能够抑制α-葡萄糖苷酶的活性，从而达到降血糖的效果。组合物中各成分之间存在协同增效作用。各成分之间的联合用药，能够大大降低各成分在单独用药时的剂量，提高了对α-葡萄糖苷酶的抑制活性。因此，在达到相应降血糖效果时，低剂量的联合用药，可以有效降低机体对耐药的发生。

附图说明

图1为二氢桑色素和芫花素(15:35)组合物对α-葡萄糖苷酶的抑制曲线图；

图2为二氢桑色素和芫花素(15:35)组合物抑制α-葡萄糖苷酶的Fa-CI趋势图；

图3为二氢桑色素和科罗索酸(15:15)组合物对α-葡萄糖苷酶的抑制曲线图；

图4为二氢桑色素和科罗索酸(15:15)组合物抑制α-葡萄糖苷酶的Fa-CI趋势图。

具体实施方式

在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

二氢桑色素(Dihydromorin)，分子式为C₁₅H₁₂O₇；分子量：304.25；CAS登录号：18422-83-8，结构式：

芫花素(Genkwanin)，分子式为C₁₆H₁₂O₅；分子量：284.26；CAS登录号：437-64-9，结构式为：

科罗索酸(Corosolic acid)，分子式为C₃₀H₄₈O₄；分子量：471.71；CAS登录号：4547-24-4，结构式为：

下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本发明。以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

实施例1

α-葡萄糖苷酶活性的体外抑制试验，步骤如下：

将试验对象溶于二甲基亚砜(DMSO)，配置成10mg/mL的母液。用PBS对母液进行稀释(稀释后，DMSO含量小于5％)，设置浓度梯度。从各梯度中取100μL作为待测样品。向待测样品中加入40μL的α-葡萄糖苷酶(0.25U/mL)，在37℃下反应10min；然后加入60μL 5mmol/mL底物对硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)，放置37℃下反应15min后，在酶标仪405nm波长处进行测定，获取OD值。根据OD值计算各梯度下的α-葡萄糖苷酶活性抑制率，抑制率＝[1-(OD_样品–OD_样品空白)/(OD_阴性对照-OD_空白)]×100％。根据各梯度下的α-葡萄糖苷酶活性抑制率，计算试验对象的半抑制浓度(IC₅₀值)，计算和统计过程采用SPSS 20.0。

上述操作步骤中，具体地，各组表示为，样品组：100μL待测样品+40μL酶+60μLpNPG；样品空白组：100μL样品溶液+40μL PBS+60μL pNPG；阳性对照组：100μL阿卡波糖+40μL酶+60μL pNPG；阴性对照组：2μL DMSO+98μL PBS+40μL酶+60μL pNPG；空白组：2μL DMSO+98μL PBS+40μL PBS+60μL pNPG。

试验对象包括二氢桑色素、芫花素、科罗索酸、由二氢桑色素和芫花素以不同质量比组成的组合物，以及，由二氢桑色素和科罗索酸以不同质量比组成的组合物。

实验仪器与试剂有：α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase,Sigma,750U)，4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG,TOKYO Chemica Industry Co.,LTD)，阿卡波糖(Acarbose，TOKYOChemica Industry Co.,LTD)，二氢桑色素，芫花素，科罗索酸(北京索莱宝)，MilliporeSimplicity水纯化***(Millipore，法国)，磷酸钠盐缓冲液(pH 6.8,0.1mol L^-1)，酶标仪TECAN infinite M200 PRO(Teacan Group Ltd.,Swizerland)。

具体地，以二氢桑色素、芫花素、科罗索酸以及阿卡波糖为试验对象，采用上述方法测试各试验对象对α-葡萄糖苷酶的抑制活性，以半抑制浓度IC₅₀值表示。

各试验对象的浓度梯度设置，如下：二氢桑色素：50μg/mL、25μg/mL、12.5μg/mL、6.25μg/mL；芫花素：50μg/mL、25μg/mL、12.5μg/mL、6.25μg/mL；科罗索酸：20μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、2.5μg/mL；阿卡波糖：500μg/mL、250μg/mL、125μg/mL、62.5μg/mL。

试验结果如表1所示。

表1

数据源自三次独立实验的结果，表示为“平均值±标准差”。

实施例2

以二氢桑色素和芫花素的组合物为试验对象，采用实施例1中的方法测试各试验对象对α-葡萄糖苷酶的抑制活性，以半抑制浓度IC₅₀值表示。

各试验对象具体为：二氢桑色素和芫花素(15:35)、二氢桑色素和芫花素(15:50)、二氢桑色素和芫花素(15:80)以及二氢桑色素和芫花素(20:35)，上述比例均为质量比。

各试验对象的浓度梯度设置，如下：二氢桑色素和芫花素(15:35)：(15+35)μg/mL、(7.5+17.5)μg/mL、(3.75+8.75)μg/mL、(1.825+4.375)μg/mL；二氢桑色素和芫花素(15:50)：(15+50)μg/mL、(7.5+25)μg/mL、(3.75+12.5)μg/mL、(1.825+6.25)μg/mL；二氢桑色素和芫花素(15:80)：(15+80)μg/mL、(7.5+40)μg/mL、(3.75+20)μg/mL、(1.825+10)μg/mL；二氢桑色素和芫花素(20:35)：(20+35)μg/mL、(10+17.5)μg/mL、(5+8.75)μg/mL、(2.5+4.375)μg/mL。

浓度梯度设置原则：以二氢桑色素和芫花素(15:35)为例，将组合物初始浓度设置为50μg/mL，即，组合物样品溶液中，二氢桑色素的初始浓度为15μg/mL，芫花素的初始浓度为35μg/mL。在初始浓度50μg/mL的基础上，对组合物样品溶液依次进行2倍稀释，依次为50μg/mL、25μg/mL、12.5μg/mL、6.25μg/mL。同理，在二氢桑色素和芫花素(15:50)的组合物中，组合物初始浓度设置为65μg/mL，依次稀释2倍形成浓度梯度。其它组合物亦遵循这一原则。

试验结果如表2所示。

表2

由表1和表2可知：二氢桑色素和芫花素的联合使用，在两者的质量比为15:35和15:50时，能够显著降低各成分在单独用药时的剂量，提高对α-葡萄糖苷酶的抑制活性；而在两者的质量比为15:80和20:35时，并没有显著降低α-葡萄糖苷酶抑制活性的IC₅₀值。

实施例3

以二氢桑色素和科罗索酸的组合物为试验对象，采用实施例1中的方法测试各试验对象对α-葡萄糖苷酶的抑制活性，以半抑制浓度IC₅₀值表示。

各试验对象具体为：二氢桑色素和科罗索酸(15:15)、二氢桑色素和科罗索酸(15:30)、二氢桑色素和科罗索酸(30:15)以及二氢桑色素和科罗索酸(50:15)，上述比例均为质量比。

各试验对象的浓度梯度设置，如下：二氢桑色素和科罗索酸(15:15)：(15+15)μg/mL、(7.5+7.5)μg/mL、(3.75+3.75)μg/mL、(1.875+1.875)μg/mL；二氢桑色素和科罗索酸(15:30)：(15+30)μg/mL、(7.5+15)μg/mL、(3.75+7.5)μg/mL、(1.875+3.75)μg/mL；二氢桑色素和科罗索酸(30:15)：(30+15)μg/mL、(15+7.5)μg/mL、(7.5+3.75)μg/mL、(3.75+1.875)μg/mL；二氢桑色素和科罗索酸(50:15)：(50+15)μg/mL、(25+7.5)μg/mL、(12.5+3.75)μg/mL、(6.25+1.875)μg/mL。浓度梯度设置原则，参考实施例2。

试验结果如表3所示。

表3

由表1和表3可知：二氢桑色素和科罗索酸的联合使用，在质量比为15:15时，能够显著降低各成分在单独用药时的剂量，提高了对α-葡萄糖苷酶的抑制活性；而在两者的质量比为15:30、30:15以及50:15时，并没有显著降低α-葡萄糖苷酶抑制活性的IC₅₀值。

联合用药系数的测定

对实施例2和实施例3中组合物的联合用药系数(CI)进行测定，根据软件CompuSyn计算出CI值，并对药物间的协同作用做出评价。

组合物的联合用药系数依赖于组合物在不同浓度梯度下的抑制率，以及组合物中各单体化合物在不同浓度梯度下的抑制率，因此，在测定组合物联合用药系数时，需要对组合物中各单体化合物进行浓度梯度设置，以获取相应的抑制率。

以实施例2中的二氢桑色素和芫花素(15:35)为例，组合物初始浓度设置为50μg/mL，二氢桑色素的初始浓度为15μg/mL，芫花素的初始浓度为35μg/mL；因此，二氢桑色素的梯度浓度设置，是在初始浓度15μg/mL的基础上，依次进行2倍稀释，依次为15μg/mL、7.5μg/mL、3.75μg/mL、1.875μg/mL；芫花素的梯度浓度设置，是在初始浓度35μg/mL的基础上，依次进行2倍稀释，依次为35μg/mL、17.5μg/mL、8.75μg/mL、4.375μg/mL。将二氢桑色素、芫花素、二氢桑色素和芫花素(15:35)在不同浓度梯度下的抑制率进行统计，如图1所示。二氢桑色素在浓度梯度下的抑制率依次为3.12±1.1％、10.25±1.5％、15.25±2.1％、25.7±4.7％(由低浓度到高浓度)，芫花素在浓度梯度下的抑制率依次为11.23±2.5％、20.12±3.2％、35.12±4.3％、70.12±5.5％(由低浓度到高浓度)，二氢桑色素和芫花素(15:35)在浓度梯度下的抑制率依次为16.52±3.6％、28.45±5.6％、60.21±4.2％、93.21±7.2％(由低浓度到高浓度)。采用CompuSyn软件对图1中的数据进行处理，获得二氢桑色素和芫花素(15:35)组合物中二氢桑色素与芫花素的CI值，如表4所示。从而可以得出二氢桑色素和芫花素(15:35)组合物抑制α-葡萄糖苷酶的Fa-CI趋势，如图2所示。

以实施例3中的二氢桑色素和科罗索酸(15:15)为例，组合物初始浓度设置为30μg/mL，二氢桑色素的初始浓度为15μg/mL，科罗索酸的初始浓度为15μg/mL；因此，二氢桑色素的梯度浓度设置，是在初始浓度15μg/mL的基础上，依次进行2倍稀释，依次为15μg/mL、7.5μg/mL、3.75μg/mL、1.875μg/mL；科罗索酸的梯度浓度设置，是在初始浓度15μg/mL的基础上，依次进行2倍稀释，依次为15μg/mL、7.5μg/mL、3.75μg/mL、1.875μg/mL。将二氢桑色素、科罗索酸、二氢桑色素和科罗索酸(15:15)在不同浓度梯度下的抑制率进行统计，如图3所示。二氢桑色素在浓度梯度下的抑制率依次为3.12±1.1％、10.25±1.5％、15.25±2.1％、25.7±4.7％(由低浓度到高浓度)，科罗索酸在浓度梯度下的抑制率依次为11.12±1.2％、21.23±3.5％、30.25±5.1％、50.12±3.3％(由低浓度到高浓度)，二氢桑色素和科罗索酸(15:15)在浓度梯度下的抑制率依次为11.21±5.4％、35.42±4.6％、58.65±3.8％、91.2±8.7％(由低浓度到高浓度)。采用CompuSyn软件对图3中的数据进行处理，获得二氢桑色素和科罗索酸(15:15)组合物中二氢桑色素与科罗索酸的CI值，如表4所示。从而可以得出二氢桑色素和科罗索酸(15:15)组合物抑制α-葡萄糖苷酶的Fa-CI趋势，如图4所示。

同理，其它组合物，包括二氢桑色素和芫花素(15:50)、二氢桑色素和芫花素(15:80)、二氢桑色素和芫花素(20:35)、二氢桑色素和科罗索酸(15:30)、二氢桑色素和科罗索酸(30:15)以及二氢桑色素和科罗索酸(50:15)，各单体化合物的浓度梯度设置以及CI值的计算等，均以上述原则为标准。

测定结果如表4所示：

表4

由表4可知：(1)二氢桑色素和芫花素的联合使用，在两者的质量比为15:35时，其联合用药系数CI小于1，表现出了协同作用，其中，GI₇₅和GI₉₀均小于0.60，说明两者在质量比为15:35时表现出强协同作用，联合用药指数均值(CI_avg)为0.48。在两者的质量比为15:50时，其联合用药系数CI小于1，表现出了协同作用，其中GI₇₅和GI₉₀均小于0.90，表现出弱协同作用，联合用药指数均值(CI_avg)为0.83。在两者的质量比为15:80和20:35时，其联合用药系数CI均大于1.0，表现出了拮抗作用。(2)二氢桑色素和科罗索酸的联合使用，在两者的质量比为15:15时，其联合用药系数小于1.0，表现出了协同作用，联合用药指数均值(CI_avg)为0.77。在两者的质量比为15:30、30:15以及50:15时，两者的联合用药系数CI均大于1.0，表现出了拮抗作用。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims

1.含二氢桑色素的协同降血糖组合物，其特征在于，由化合物A和化合物B组成；其中，化合物A选自二氢桑色素，化合物B选自芫花素或科罗索酸；在由二氢桑色素和芫花素组成的组合物中，二氢桑色素和芫花素的质量比为15:35；在由二氢桑色素和科罗索酸组成的组合物中，二氢桑色素和科罗索酸的质量比为15:15。

2.权利要求1所述组合物在制备具有协同降血糖作用的药物和/或辅助降血糖的保健品中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述药物和/或保健品包含药学或食品中可接受的载体、溶剂、赋形剂或其他介质。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述药物和/或保健品的剂型选自粉剂、颗粒剂、胶囊剂、注射剂、口服液或片剂。

5.一种协同降血糖药物，其特征在于，药效成分为二氢桑色素和芫花素，二氢桑色素和芫花素的质量比为15:35。

6.一种协同降血糖药物，其特征在于，药效成分为二氢桑色素和科罗索酸，二氢桑色素和科罗索酸的质量比为15:15。