CN113462613A - 降血糖植物乳杆菌zjuids04及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及食品微生物技术领域，本发明公开了一种植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)ZJUIDS04，保藏号为CGMCC NO.22609。该植物乳杆菌具有强降血糖功能、较强的胆盐水解酶活力；该菌株在耐酸耐胆盐方面比其他乳酸菌有明显的优势，适合肠胃环境并具有增殖能力；无抗生素耐性，具有抗菌活性；抗氧化活力强，显著优于常规的植物乳杆菌，因此本发明植物乳杆菌可广泛用于开发降血糖相关益生功能产品。

Description

降血糖植物乳杆菌ZJUIDS04及其应用
技术领域
本发明涉及食品微生物技术领域，具体涉及具有血糖功能的植物乳杆菌ZJUIDS04及其在食品、饲料及药品等领域的应用。
背景技术
目前，糖尿病已经成为中国及世界人口的数量最多的代谢性疾病。血清中高血糖含量被认为是糖尿病等代谢性疾病的主要因素。因此，降低血清血糖水平直接关系到人体的健康。迄今为止，已有大量实验证实了服用部分乳酸菌及其相关制品具有减少人体血清血糖含量，降低糖尿病引发的并发症功效。乳酸菌是人体肠道中重要的益生菌，其数量和组成对维持宿主的微生态平衡和提高免疫***功能起着至关重要的作用，研究发现乳酸菌具有体外降低α-葡萄糖苷酶活性和DPP-IV抑制率等功效，从而达到降血糖的效果。
植物乳杆菌与人类生活密切相关，是广泛应用于食品发酵、工业乳酸发酵及医疗保健领域的有益微生物之一。植物乳杆菌作为乳杆菌的一种，将其添加到食品中，可以改善食品的口感、质地和风味。植物乳杆菌也能够定植于人体内发挥益生作用，如调节肠道菌群、抑制肠道病原菌生长、降低动物体内血糖含量、增强机体免疫力、提高乳糖消化和抗肿瘤、抗氧化等。
CN105053202 A的《一种具有辅助降血糖功能的高品质发酵驼乳制备方法》告知了：利用植物乳杆菌Grx16(Lactobacillus plantarum Grx16)并组合其他菌株作为发酵剂，制备具有辅助降血糖功能的发酵驼乳。
CN111733111A的《一株植物乳杆菌NX-1及其在制备降血糖药物中的应用》公开了植物乳杆菌Lactobacillusplantarum NX-1，植物乳杆菌NX 1未灭活与灭活的发酵上清液、菌悬液、细胞破碎物上清液对α葡萄糖苷酶和α淀粉酶均具有较强的抑制作用；且均能显著降低斑马鱼高血糖模型体内的葡萄糖含量。
CN105105145A的《一株植物乳杆菌及其在制备降血糖血脂的功能性食品中的应用》公开了植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)Sc52，植物乳杆菌Sc52的主要功能为：降血糖和/或降血脂；促进肠道菌群中的益生菌生长和/或抑制肠道菌群中的致病菌生长。
CN110964659A的《降血糖功效的植物乳杆菌及其筛选方法和应用药剂及食品》提供一种植物乳杆菌，该植物乳杆菌的保藏编号为CCTCC M 2019591，拉丁文名称为Lactobacillus plantarum CT152；利用该植物乳杆菌制备具有降血糖功能的药剂。
CN108085285A的《一株植物乳杆菌DM-50株及其应用》提供了一株植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)DM 50株，植物乳杆菌DM 50通过促进胰高血糖肽1(GLP 1)分泌、修复胰岛素分泌功能、调节血脂代谢、降低慢性低度炎症、抑制二肽基肽酶4活性来发挥其降血糖作用。
CN106834196A的《植物乳杆菌CH126及其在制备降糖功能性食品中的应用》公开了植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CH126，植物乳杆菌CH126具有强的降低空腹血糖、降血脂作用，可用广泛用于食品、保健食品和医药健康领域。
CN112852662A的《一种降糖植物乳杆菌YZX21功效及应用》公开了植物乳杆菌YZX21，其具有优良的调节血糖效果，应用前景广阔，可用于制备酸奶。
CN106520609A的《来源于海洋褐藻的植物乳杆菌YYS 06及其应用》公开了植物乳杆菌，保藏编号为CCTCC NO.M 2016512。植物乳杆菌来源于海洋褐藻类植物海带，作为益生菌对人类健康极有好处，且风味较好；植物乳杆菌耐盐、耐酸、耐胆盐，摄入后体内存活率高；植物乳杆菌用于发酵果蔬不但有益生作用，且发酵液具有α葡萄糖苷酶抑制活性，具有降血糖效果。
CN109694834A的《胚芽乳酸杆菌及其排除体脂肪、降低肝肿大和抗发炎用途》公开了胚芽乳酸杆菌(Lactobacillus plantarum)GKM3，其具有耐酸、耐碱及/或细胞吸附能力，且能达到排除体脂肪、降血脂、降低肝肿大、降低肝功能指数、抗发炎、降尿酸、改善过敏的效果及/或降血糖。
CN105132318A的《植物乳杆菌Grx16及其应用》公开了植物乳杆菌Grx16(Lactobacillus plantarum Grx16)，其具有耐酸及耐胆盐特性，具有体外抗氧化能力，可用于制备具有抑制α-葡萄糖苷酶活性能力的发酵乳。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种发酵食物来源的降血糖植物乳杆菌ZJUIDS04及其应用。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)ZJUIDS04：其保藏号为CGMCC NO.22609。
作为本发明的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ZJUIDS04的改进：植物乳杆菌ZJUIDS04的16S rDNA全序列为SEQ ID No：1所示。
本发明还同时提供了上述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ZJUIDS04在制备具有降低血糖功能的产品中的应用；所述具有降低血糖功能的产品例如为具有降低血糖功能的食品、药物、保健品、饲料及宠物食品。
具有降低血糖功能的食品包括具有降低血糖功能的发酵果蔬汁(例如为发酵南瓜火龙果汁)；具有低血糖功能性发酵酸肉；具有低血糖功能性酸奶；
具有降低血糖功能的药物包括具有降低血糖功能的活菌制剂，该活菌制剂中植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ZJUIDS04的活菌数为1.0×1011～1×1012CFU/g；
本发明的植物乳杆菌ZJUIDS04单独或与其他菌株混合发酵用于制备具有降低血糖功能的青贮饲料，以及宠物奶粉产品。
本发明的植物乳杆菌ZJUIDS04，保藏名称：植物乳杆菌Lactobacillusplantarum；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号：CGMCC NO.22609，保藏时间2021年05月26日。
本发明从内蒙古传统发酵乳制品中筛选出一株植物乳杆菌ZJUIDS04(Lactobacillus plantarum ZJUIDS04)，通过细菌形态学、生理学和培养特征，结合16SrDNA测序等对该菌进行了鉴定。
本发明所提供的植物乳杆菌ZJUIDS04(Lactobacillus plantarum ZJUIDS04)的菌落形态学特征为：在MRS琼脂培养基上形成明显的菌落，菌落大小0.3～1.5mm。菌落呈现圆形，边缘整齐，白色，表面湿润光滑。其菌体形态特性为：革兰氏染色呈阳性，不产芽孢，圆端直杆菌，单个、成对或短链状。
本发明所提供的植物乳杆菌ZJUIDS04(Lactobacillus plantarum ZJUIDS04)的降血糖能力达到35.1～48.6％。本发明除了依据α-葡萄糖苷酶活性证明该菌株有降血糖功效，还从另一个机制(DPP-IV抑制率角度)证明了该菌有降血糖功效。
本发明的植物乳杆菌ZJUIDS04(Lactobacillus plantarum ZJUIDS04)，还具有以下能力：
1、具有较强的抗氧化活力，显著高于现有的同类菌株。
2、能耐受酸和胆盐，并且具有一定的增殖能力；对常见的抗生素敏感；具有抗菌活性；即，能耐受胃肠道环境、无抗生素耐性、能抑制肠内有害的病原菌。
综上所述，本发明从内蒙古传统发酵乳制品分离获得的益生菌中筛选出来具有强降血糖功能的植物乳杆菌。该菌株具有较强的胆盐水解酶活力。该菌株在耐酸耐胆盐方面比其他乳酸菌有明显的优势，适合肠胃环境并具有增殖能力。无抗生素耐性，具有抗菌活性。抗氧化活力强，显著优于常规的植物乳杆菌，因此本发明植物乳杆菌可广泛用于开发降血糖相关益生功能产品。
附图说明
图1为植物乳杆菌ZJUIDS04的菌落形态图。
图2为植物乳杆菌ZJUIDS04革兰氏染色的菌体形态图。
图3为植物乳杆菌ZJUIDS04的16S rDNA的电泳鉴定图；
右侧第一条带为Maker，第二条带为ZJUIDS04的电泳条带。
图4为植物乳杆菌ZJUIDS04对抗生素敏感性的平板示例。
从左至右依次为复方新诺明和庆大霉素、头孢唑林和丁胺卡那、氨苄青霉素和环丙沙星、青霉素G和红霉素、氯霉素和氟哌酸；
图5为植物乳杆菌ZJUIDS04抗菌活性的平板示例；
图5中，S表示菌的上清液；P表示空白；J表示菌液；
从左至右依次分别代表植物乳杆菌ZJUIDS04对金黄色葡萄球菌、单增李斯特氏菌、大肠杆菌、肠炎沙门氏菌的抑菌圈。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1、植物乳杆菌ZJUIDS04的筛选及鉴定：
1.乳酸菌的筛选
1.1样品来源
本发明以下案例使用的菌株均从内蒙古牧民家自制的酸马奶、奶酪、奶皮子、奶疙瘩等发酵乳制品(作为样品)中分离获得。样品共采集30多份用于后续的分离纯化及鉴定。
1.2菌株的分离纯化
取大约5g样品用无菌管收集，立即送至实验室进行菌株分离。取1g样品放入9mL的MRS液体培养基中，涡旋混匀后于37℃下富集培养48h；然后在超净台中吸取富集液1mL，用无菌生理盐水进行十倍梯度稀释，选取10-6、10-7、10-8三个稀释梯度，每个梯度取菌液100μL涂于MRS琼脂培养基上，于37℃培养48h。培养结束后，从琼脂培养基中选择生长有50～150个单菌落的平板，挑取典型菌落，在MRS琼脂平板上多次划线纯化，直至整个平板上的菌落形态一致，挑取单菌落到MRS液体培养基增菌培养。得到的菌株均在含40％甘油的MRS液体培养基中于-80℃冷冻保存。
挑选获得一株满足生长良好且遗传稳定性良好的菌株，命名为ZJUIDS04。
2.植物乳杆菌ZJUIDS04的鉴定
2.1菌落特征
植物乳杆菌ZJUIDS04在MRS琼脂培养基培养48h后，直径在0.3～1.5mm之间，菌落圆形，边缘整齐，白色，表面湿润光滑，见图1。
2.2显微镜下形态：
植物乳杆菌ZJUIDS04菌落涂片：革兰氏染色呈阳性，不产芽孢，圆端直杆菌，单个、成对或短链状，见图2。
2.3 16S rDNA鉴定
用Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒提取目标菌株基因组DNA，将提取的乳酸菌基因组DNA作为PCR扩增的模板，采用细菌通用引物27F和1492R进行16S rDNA的PCR实验，PCR反应扩增结束后，取PCR产物进行琼脂糖凝胶检测拍照，扩增片段长度为1.5kb左右，见图3。将PCR产物送至北京六合华大基因(武汉)有限公司进行测序，结果如SEQ ID NO：1所示，在NCBI网站上进行BLAST序列比对，结果显示该序列与植物乳杆菌的16SrDNA序列同源性超过99％。
将菌株ZJUIDS04的序列比对结果和生理生化结果相结合，确定筛选的乳酸菌ZJUIDS04为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。
菌株ZJUIDS04保藏信息如下：保藏名称：植物乳杆菌Lactobacillus plantarum；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号：CGMCC NO.22609，保藏时间2021年05月26日。
实施例2、植物乳杆菌ZJUIDS04降血糖能力的确认
1.α-葡萄糖苷酶抑制率
菌株发酵液的制备
将于甘油管中保存的菌株先在MRS琼脂平板上划线活化2～3次，然后挑取单菌落在MRS液体培养基中37℃扩大培养18h，菌液的浓度达到107CFU/mL左右，作为菌悬液。将菌悬液以2％(体积％)的接种量接种于葡萄糖(水溶性)浓度为100μg/mL的MRS液体培养基中，于37℃培养48h后得到菌株发酵液。上述培养均在4000r/min的转速下进行。
菌株发酵液通过12000rpm下离心20min得到上清液和菌体，部分菌体通过细胞破碎仪破碎后(破碎仪的功率为40％，破碎时间为8分钟)，12000r/min下离心10min后所取的上清液为内容物。
设置总体积205μL的体系，该体系由以下成分组成：在50μL的PBS缓冲溶液(浓度0.1mol/L，pH＝6.8)中，加入50μL浓度为20mmol/L的对硝基苯酚-α-D-吡喃葡葡糖苷(PNPG)溶液及25μl待测样(上清/菌体/内容物)，将混合物于37℃孵化10min，加入30μLα-葡萄糖苷酶溶液(20U/mL)继续反应20min，加入50μL浓度为1mol/L Na2CO3作为反应终止液。
将所得的反应液于405nm处测其吸光值，吸光值与对硝基苯酚PNP的游离量成正比，反应体系中采用pH值为6.8浓度为0.1mol/L的PBS溶液作为α-葡萄糖苷酶溶液及待测样品的空白对照，进行反应后计算乳酸菌对α-葡萄糖苷酶抑制性。
其抑制率计算公式为：
α-葡萄糖苷酶抑制率＝[1-(A-B)/(C-D)]*100％；
式中
A为含有α-葡萄糖苷酶溶液及待测样品的测定吸光值；
B为不含α-葡萄糖苷酶溶液但含待测样品的测定吸光值；
C为含有α-葡萄糖苷酶溶液但不含样品的测定吸光值；
D为不含α-葡萄糖苷酶溶液及待测样品的测定吸光值；
即，
A对应的是上述体系；
将30μLα-葡萄糖苷酶溶液改成30μLPBS缓冲溶液，所得体系为B；
将25μl待测样改成25μl PBS缓冲溶液，所得体系为C；
将30μLα-葡萄糖苷酶溶液改成30μL PBS缓冲溶液，且将25μl待测样改成25μl PBS缓冲溶液，所得体系为D。
每个菌种做3个平行，每组实验重复3次，同时以MRS液体培养基作阴性对照(α-葡萄糖苷酶抑制率基本为0)，以鼠李糖乳杆菌ATCC53103作阳性对照菌株。
表1、菌株ZJUIDS04的α-葡萄糖苷酶抑制率(％)
Figure BDA0003195068680000061
*代表差异显著，P<0.05
如表1所示，本发明筛得植物乳杆菌ZJUIDS04的上清液、菌体和破碎内容物的α-葡萄糖苷酶抑制率上显著高于标准菌株鼠李糖乳杆菌ATCC53103。这表明植物乳杆菌ZJUIDS04菌体具有优良的α-葡萄糖苷酶抑制能力。
2.DPP-IV抑制率
发酵上清液、菌体及菌体内容物的制备同上。
测定方法如下：在96孔微孔板中，加入25μl甘氨酸-对硝基苯胺(0.2mM)和25μl细菌样品(上清、菌悬液、内容物、PBS为对照)，37℃下预孵育10分钟。之后，加入50μl DPP-IV(0.01U/ml)并在37℃下孵育60分钟；再加入100μl乙酸钠缓冲液(1M，pH 4.0)终止反应，在405nm测定样品的吸光度。
反应体系中采用pH6.8、0.1mol/L的PBS溶液作为DPP-IV溶液及待测样品的空白对照；
DPP-IV抑制率＝[1-(A-B)/(C-D)]*100％
其中：
A为含有DPP-IV溶液及待测样品的测定吸光值；
B为不含DPP-IV溶液但含待测样品的测定吸光值；
C为含有DPP-IV溶液但不含样品的测定吸光值；
D为不含DPP-IV溶液及待测样品的测定吸光值。
每个菌种做3个平行，每组实验重复3次，同时以MRS液体培养基作阴性对照，以鼠李糖乳杆菌ATCC53103作阳性对照菌株。
表2、菌株的DPP-IV抑制率(％)
Figure BDA0003195068680000071
*代表差异显著，P<0.05
如表2所示，本发明筛得植物乳杆菌ZJUIDS04在菌体抑制率、上清抑制率及内容物抑制率等方面均显著优于标准菌株鼠李糖乳杆菌ATCC53103。表明植物乳杆菌ZJUIDS04具有优异的DPP-IV抑制效果，可用于降血糖标准菌株的筛选。
上述两个试验表明植物乳杆菌ZJUIDS04在DPP-IV和α-葡萄糖苷酶抑制方面均有良好的效果，对比标准菌株鼠李糖乳杆菌ATCC53103有明显的优势，可用于后期的研究及产品开发。
实施例3、植物乳杆菌ZJUIDS04的抗氧化能力的确认
1、总抗氧化能力(FRAP法)
总抗氧化能力的测定方法按照Giuberti等的方法略作修改。向酶标板中加入150μL TPTZ工作液(0.3M醋酸-醋酸钠缓冲液、20mM氯化铁溶液、10mM TPTZ缓冲液，以V:V:V＝10:1:1混合，现用现配)和20μL的样品，振荡混匀，37℃反应10min，测定溶液在593nm处的吸光度。将样品测得的吸光度代入硫酸亚铁标准曲线，样品抗氧化能力以硫酸亚铁当量表示(μmol FeSO4/mL样品)。每个样品重复3次，求平均值。
硫酸亚铁标准曲线：配制不同质量浓度(0μM、50μM、100μM、200μM、400μM、600μM、800μM)的硫酸亚铁溶液，将不同摩尔浓度的硫酸亚铁溶液、10mM TPTZ缓冲液、0.3M醋酸盐缓冲液以V:V:V＝1:1:10混合，取170μL混合液加入酶标板，37℃反应10min，测定溶液在593nm处的吸光度。以吸光度为纵坐标，硫酸亚铁质量浓度为横坐标绘制标准曲线并进行测定。
2、还原能力
还原能力的测定参考Lin等的方法并略做一些修改。取1mL样品于离心管中，加入0.2M，pH 6.6的PBS缓冲溶液及1％(w/v)铁***溶液各1mL，混匀。50℃水浴20min，冰浴冷却。再加入10％三氯乙酸1mL，6000r/min离心5min，取上清液1mL，加入0.1％(w/v)三氯化铁1mL、蒸馏水1mL，混匀，静置反应10min，于700nm处测定吸光度。用PBS缓冲液或MRS肉汤培养基代替样品为空白组。每个样品重复3次，求平均值。
还原能力(％)＝[(As-Ab)/Ab]*100
式中：As——样品组吸光度；
Ab——空白组吸光度；
3、DPPH自由基清除能力
DPPH自由基清除能力的测定方法参考Shimada等的方法并略作一些修改。配制VC标准溶液1000mg/ml，稀释成不同浓度梯度(0-30μg/ml)。向酶标板中加入100μL待测样品(或VC标准溶液)和100μL 0.2mM DPPH乙醇溶液(无水乙醇配制，4℃避光保存，现配现用)，摇匀后于室温下避光30min，测定溶液在517nm处的吸光度；用100μL无水乙醇代替100μLDPPH乙醇溶液为空白组；用100μL PBS缓冲液(0.2M，pH6.6的PBS或MRS肉汤培养基)代替100μL待测样品为对照组，并以100μLPBS缓冲液(或MRS肉汤培养基)和无水乙醇混合液空白调零。每个样品重复3次，求平均值。
DPPH自由基清除能力(％)＝[1-(As-Ab)/Ac]*100
式中：As——样品组吸光度；
表3、植物乳杆菌ZJUIDS04的抗氧化活力
Figure BDA0003195068680000091
Ab——空白组吸光度；
Ac——对照组吸光度；
*代表差异显著，P<0.05；**代表差异显著，P<0.01。
如表3所示，本发明筛得的植物乳杆菌ZJUIDS04发酵上清液的总抗氧化能力、还原能力以及DPPH自由基均显著高于标准菌株ATCC53103。从而说明植物乳杆菌ZJUIDS04发酵上清液和菌悬液具有高效的抗氧化能力。
实施例4、植物乳杆菌ZJUIDS04的胆盐水解酶活力的确认
1、植物乳杆菌ZJUIDS04产胆盐水解酶定性测定
在新鲜配制的MRS琼脂培养基中添加0.3％(m/v，即，3g/1000ml)脱氧牛磺胆酸钠、0.2％(m/v)巯基乙酸钠、0.37g/L CaCl2，将其完全溶解。于121℃灭菌15min，倾倒入无菌平板中，待凝固后把无菌滤纸片均匀放入平板中，在滤纸片上滴加10μL植物乳杆菌ZJUIDS04菌悬液(约108CFU/mL)，以滴加10μL的无菌磷酸盐缓冲液为空白对照。将平板于厌氧罐(OXOID)中37℃厌氧培养72h。若滤纸片周围有白色沉淀物则认为有胆盐水解酶活性。
说明：将实施例2所得的ZJUIDS04菌体利用PBS缓冲液(0.2M,pH 7.0)进行重悬，从而获得ZJUIDS04菌悬液(约108CFU/mL)。
2、.植物乳杆菌ZJUIDS04胆盐水解酶活力的定量测定
菌体和菌悬液等的制备参考实例2，取0.1mL植物乳杆菌ZJUIDS04的菌体破碎上清溶液，向其中加入1.8mL 0.1mol/L的PBS缓冲溶液(0.2M,pH 7.0)和0.1mL的6mmol/L牛磺胆酸钠。这些混合物在37℃培养30min，之后加入0.5mL 15％的三氯乙酸终止酶促反应。将其进行离心，取0.5mL上清液加入1mL的茚三酮显色液。将其旋涡震荡混匀，煮沸35min。冷却后测定其在570nm处的吸光度值。一个胆盐水解酶活力单位定义为每分钟从底物释放1μmoL牛磺酸所需要的酶的量。
3、以鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)ATCC53103作为阳性对照，进行上述胆盐水解酶活力的测定。蛋白质浓度的测定采用牛血清蛋白作为标准品，所有实验重复3次。
4、表4为两株菌的胆盐水解酶活性定量测定结果。从表4中可以看出，这两株菌的胆盐水解酶活力均在1.0U/mg以上。实验结果表明，植物乳杆菌ZJUIDS04具有较高的胆盐水解酶活力。
表4、菌株的胆盐水解酶测定结果
Figure BDA0003195068680000101
注：+表示产生沉淀圈，-表示不产生沉淀圈。
5、胆盐水解酶可将体内结合型胆盐水解为游离型胆盐，而游离型胆盐不参与肝肠循环，随粪便排出体外，因而胆盐水解酶活性是降低体内血糖的关键因素。本发明所提供的植物乳杆菌ZJUIDS04具有较强的胆盐水解酶活力。
实施例5、植物乳杆菌ZJUIDS04的耐酸性及耐胆盐性的确认
1、耐酸实验
挑取植物乳杆菌ZJUIDS04单菌落在MRS液体培养基中37℃扩大培养18h，将扩大后菌悬液以1％的量接种到MRS液体培养基，37℃培养18h后。将培养液于4℃经8000r/min离心5min收集菌体，用PBS缓冲液(pH 6.8，0.1mol/L)洗涤2次后。菌体悬浮于已事先调节pH为3.0的MRS液体培养基中，将初始活菌数校正至大约108CFU/mL，37℃培养3h。采用倾注平板法对0h和3h样品中的活菌进行计数，倾注后的平板于37℃培养48h，测定其存活率，存活率计算公式如下：
Figure BDA0003195068680000102
上式中，N0为测试菌株0h的活菌数(CFU/mL)；Nt为测试菌株3h的活菌数(CFU/mL)。
2、耐胆盐实验
将活化扩大后的植物乳杆菌ZJUIDS04菌悬液以1％的量接种到MRS液体培养基中，于37℃培养18h后，漩涡混匀，将初始活菌数校正至大约109CFU/mL。以10％的量接种到含0.3％(m/v)牛胆盐的MRS液体培养基(对照为不含牛胆盐的MRS液体培养基)，于37℃培养3h。然后采用倾注平板法对样品中的活菌数进行计数。倾注后的平板于37℃培养48h。菌株的胆盐耐受能力以3h时每毫升含胆盐培养基中活菌数与不含胆盐培养基中活菌数的差值的对数来表示(log CFU/mL)。
3、以鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)ATCC53103作为对照，进行上述耐酸、耐胆盐性能测定。
4、如表5所示，植物乳杆菌ZJUIDS04的耐酸耐胆盐性能明显优于对照菌株ATCC53103。其在pH为3.0的MRS培养基中的存活率高达101.51％。在含有0.3％的牛胆盐的环境中活菌数仍达到4*106CFU/mL以上，说明其具有较好的胆盐耐受性。实验证明，植物乳杆菌ZJUIDS04具备较高的胃肠道生存能力。
表5、菌株对酸和胆盐耐受性结果
菌株 耐酸性(％) 胆盐耐受能力(ΔLog CFU/mL)
植物乳杆菌ZJUIDS04 101.51±0.41 4.28±0.15
鼠李糖乳杆菌ATCC53103 62.12±0.18 1.03±0.23
5、益生菌必须能够耐受胃肠道中胃酸和胆汁等一系列不良环境而活着才能发挥其益生作用。本发明提供的植物乳杆菌ZJUIDS04在pH 3.0的条件下能够生长增殖，其能顺利通过胃中的酸性环境到达小肠。同时，植物乳杆菌ZJUIDS04能耐受胆盐，其能在肠道内存活，进而能有效地改善肠道菌群进而发挥降血糖作用。
实施例6、植物乳杆菌ZJUIDS04疏水能力的确认
1.疏水性的测量
用干净的PBS缓冲液(0.1mol/L，pH 6.8)洗涤乳酸菌体沉淀两次，重悬使OD610的吸光度约为0.5左右，得乳酸菌悬液。
取2ml乳酸菌悬液和2ml二甲苯彻底混合，37℃水浴充分震荡5min后，并于0h、2h后分别测量水相的OD610吸光值。
Figure BDA0003195068680000111
A0＝0h的吸光值，At＝th的吸光值。
所得结果如下表6所示。
表6、不同菌株的表面疏水性(％)
Figure BDA0003195068680000112
Figure BDA0003195068680000121
2、结果分析
经测量，植物乳杆菌ZJUIDS04的疏水性在33.97％，显著高于对照标准菌株。表明该菌株具有较强的粘附能力，可粘附到人的肠道，改善肠道菌群的健康。
实施例7、植物乳杆菌ZJUIDS04的抗生素感受性的确认
将培养18h的浓度约为107CFU/mL植物乳杆菌ZJUIDS04菌悬液按1％的量加入已冷却至45℃左右的灭过菌的MRS琼脂培养基中，充分混合，定量加入15mL/皿。待凝固后，用镊子取药敏纸片放于培养基上。将培养皿正面朝上放于37℃培养箱中培养24h。以无抗生素的纸片为空白对照。测量抑菌圈直径。每个重复三次。图4为植物乳杆菌ZJUIDS04抗生素敏感性的平板示例。
植物乳杆菌ZJUIDS04对抗生素感受性抑菌圈直径如表7所示。参考CLSI(2017)药敏试验标准可得，植物乳杆菌ZJUIDS04对青霉素G、氨苄青霉素、头孢唑林、丁胺卡那、庆大霉素、红霉素、复方新诺明和氯霉素呈现敏感性。对于环丙沙星、氟哌酸呈现中介。实验结果表明，植物乳杆菌ZJUIDS04对常见的抗生素敏感。
表7、植物乳杆菌ZJUIDS04对抗生素敏感性结果
Figure BDA0003195068680000122
注：S，敏感；I，中介；R，耐药
随着抗生素在临床治疗的广泛应用，乳酸菌的耐药性也越来越严重，长期摄入耐药性的乳酸菌会给临床治疗带来很大的困难。本发明所提供的植物乳杆菌ZJUIDS04对常见的抗生素敏感，不会对人体健康造成危害。
实施例8、植物乳杆菌ZJUIDS04的病原菌抑制能力的确认
采用国际通用琼脂扩散法测定乳酸菌抗菌活性。将10mL LB琼脂培养基倒入无菌培养皿中，冷却后做为下层培养基。将培养18h菌浓度约为107CFU/mL指示菌菌悬液按1％的量加入冷却至45℃左右的灭过菌的LB琼脂培养基中，充分混合，定量加入10ml/皿。在上面摆放灭过菌的的牛津杯。待上层培养基冷凝后，轻轻拔掉牛津杯。定量以100μL/孔加入植物乳杆菌ZJUIDS04发酵上清液样品，并且以PBS缓冲液(0.1mol/L，pH 6.8)作为对照。挑选出小孔周围有明显抑菌圈的菌株，测量抑菌圈直径，每个重复三次。图5为植物乳杆菌ZJUIDS04对四种致病菌抑制作用的平板示例。
如表8所示，植物乳杆菌ZJUIDS04的代谢产物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肠炎沙门氏菌以及单增李斯特等致病菌均有一定的抑制作用，并优于ATCC53103的抑菌效果。可见这株菌的代谢产物具有抑菌特性。
表8、菌株对病原菌抑制能力的结果
Figure BDA0003195068680000131
金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌，一些大肠杆菌可引起严重腹泻和败血症，一些沙门氏菌种也会引起人类食物中毒。乳酸菌代谢产生的细菌素、有机酸、过氧化氢等抑菌物质均能单独或共同地抑制这些致病菌的生长。本发明所提供的植物乳杆菌ZJUIDS04的代谢产物对这三种致病菌具有一定的拮抗作用，这对其维持肠道微生态平衡发挥重要作用，并起到健康促进效果。
对比例1、将下表9所述的本发明过程中获得的其余植物乳杆菌(植物乳杆菌01～04)参照上述实施例进行检测，降血糖能力、耐酸性能、胆盐耐受性与本发明的对比如下表9所述。
表9、不同植物乳杆菌的益生特性比较
Figure BDA0003195068680000132
Figure BDA0003195068680000141
对比例2、将表9所述的植物乳杆菌以及背景技术中告知的具有降血糖能力的植物乳杆菌参照上述实施例3进行测定，胆盐水解酶活均为≤1U/mg。
对比例3、将背景技术中告知的具有降血糖能力的植物乳杆菌参照上述实施例2进行测定，以发酵上清液为例，α-葡萄糖苷酶抑制率和DPP-IV抑制率能力均显著小于本发明的ZJUIDS04。
对比例4、将表9所述的植物乳杆菌以及背景技术中告知的具有降血糖能力的植物乳杆菌参照上述实施例3的方法进行检测，以发酵上清液为例，总抗氧化能力均显著小于本发明的ZJUIDS04。
实施例9、利用植物乳杆菌ZJUIDS04制备功能性发酵酸奶
1、酸奶的加工工艺流程：
原料→预热→均质→调配→杀菌→冷却→制备接种→发酵→后熟→冷藏
2、操作要点
(1)原料：2L全脂UHT灭菌乳或鲜牛乳；
(2)预热：放入容器中加热至63℃；
(3)均质：倒入均质机中均质，压力为15-25MPa)，混合液倒入铁罐中，同时加入100g白糖，于90℃水浴环境杀菌10min；
(4)调配：牛乳中加入配料，并溶解；
(5)杀菌：加糖牛乳在90℃水浴里杀菌10min；
(6)冷却：杀菌后的牛乳，冷却至40-50℃备用；
(7)制备发酵剂：植物乳杆菌ZJUIDS04菌种在无菌环境下，接种于装有灭菌脱脂乳(12％,w/v)的试管中，于37℃条件下培养20小时。每次传代接种量为2-4％(v/v)，传代2～3次以恢复活力，放置于4℃冰箱中保存；
(8)接种、发酵：在无菌条件下，接入活化好的植物乳杆菌ZJUIDS04，接种量为2-4％(v/v)。在42℃条件下恒温发酵6-10h；
(9)后熟：发酵结束后，放入4℃冰箱中后熟12-24h；
(10)灌装、冷藏：后熟完成后，灌装到250mL的灭菌玻璃瓶中，送至冷库冷藏。
实施例10、利用植物乳杆菌ZJUIDS04制备功能性发酵果蔬汁
1.发酵果蔬汁的加工工艺流程
原料→清洗→闪蒸→打浆→调配→均质→灭菌→冷却→接种→密闭发酵→后熟→灌装→冷藏
2.操作要点
(1)原料：选取新鲜的南瓜和火龙果。
(2)清洗切块：清洗、去皮(南瓜去瓤)、切成小块。
(3)闪蒸：采用闪蒸的方法灭酶，0.5～1min，121℃处理，迅速排气。
(4)打浆：按照南瓜∶水(重量比)＝1∶1的比例，将南瓜和水适量的逐渐放入胶体磨中研磨，进行粗磨和细磨各一次。将火龙果用打浆机打浆至果肉均匀无块状。
(5)调配、均质：按南瓜汁15％，火龙果汁30％，再用蔗糖调节可溶性固形物含量至10°Brix，加入0.2％的稳定剂CMC混合均匀，采用两段均质法，先低压(15MPa)，后高压(25MPa)，使瓜肉颗粒直径粒径为2～3μm。
(6)灭菌、冷却：调配好的复合果蔬汁在100℃下保温10min，冷却至40℃左右。
(7)接种、发酵：在无菌条件下，接入活化好的植物乳杆菌ZJUIDS04，初始菌数控制在107CFU/mL。在37℃条件下恒温发酵24h。
(8)后熟：发酵结束后，放入4℃冰箱中3h。
(9)灌装、冷藏：后熟完成后，灌装到250mL的灭菌玻璃瓶中，送至冷库冷藏。
实施例11、利用植物乳杆菌ZJUIDS04制备功能性发酵酸肉
1、发酵酸肉的加工工艺流程：
原料→切片→拌糯米粉→接种→发酵→腌制→包装→成品
2、操作要点
(1)切片：将市售新鲜五花肉，切成3cm见方薄片。
(2)拌糯米粉：1000g原料肉与250g糯米粉混匀，加入葡萄糖1％。
(3)接种、发酵：在无菌条件下，接入活化好的植物乳杆菌ZJUIDS04，初始菌数控制在107CFU/mL。在37℃条件下恒温发酵18h。
(4)腌制：加入2％的盐，于25℃下腌制20d。
实施例12、利用植物乳杆菌ZJUIDS04制备降血糖菌粉
1.植物乳杆菌ZJUIDS04菌泥的制备
挑取植物乳杆菌ZJUIDS04单菌落接种于50mL MRS液体培养基中，放置37℃培养箱中培养18h。再次按5％的接种量于250mL MRS液体培养基中活化，放置37℃培养箱中培养24h。最后将活化好的植物乳杆菌ZJUIDS04以5％接种量于10L发酵罐中进行高密度厌氧培养，于37℃、pH 6.8的条件下培养18h。之后在8000r/min、4℃条件下离心15min，弃去上清液，收集菌体沉淀，用无菌磷酸盐缓冲液(pH 7.0)漂洗菌体2次。即可得到植物乳杆菌ZJUIDS04菌泥。
2.保护剂的制备
冻干保护剂含有15％的脱脂乳粉，5％的海藻糖，3％的谷氨酸钠，1％的甘油，0.5％的半胱氨酸盐酸盐。水作为溶剂。于110℃灭菌备用。
3.植物乳杆菌ZJUIDS04菌粉的制备
将上述制备的植物乳杆菌ZJUIDS04菌体沉淀按1:5的比例与保护剂溶液充分混匀。于-40℃条件下预冻5h，使其均匀冻结在容器内壁上，然后进行真空冷冻干燥，干燥18～20h后，即可得到植物乳杆菌ZJUIDS04菌粉。用生理盐水复水后，洗涤两次，测得植物乳杆菌ZJUIDS04菌粉中活菌数为1.0×1011～1×1012CFU/g。
实施例13、利用植物乳杆菌ZJUIDS04制备青贮饲料
植物乳杆菌ZJUIDS04制备苜蓿青贮饲料的步骤如下：
(1)原料准备：苜蓿草收割后，保证清洁，无腐败变质，将其切断至1～2cm。
(2)青贮的调制：苜蓿草青贮时水分含量控制在60～65％，称取200g苜蓿草原料装入真空包装袋，将植物乳杆菌ZJUIDS04菌粉按0.02‰接种量接种到原料中，采用真空包装机真空包装后，至于储藏室进行发酵。
(3)储藏条件：温度为15～45℃，时间为30～60d。
实施例14、利用植物乳杆菌ZJUIDS04制备宠物益生菌奶粉
1.植物乳杆菌ZJUIDS04菌粉的制备
参照上述案例制备植物乳杆菌ZJUIDS04菌粉冻干菌粉，菌粉中活菌数为1.0×1011～1×1012CFU/g。
2.宠物配方粉的制备
原料初选：奶粉、鱼粉、骨粉、谷物、植物油，添加剂：维生素、微量元素、功能因子、其他；
自动配料：按照配方将得到的物料原料投入物料仓；
粉碎：将称量好的物料通过粉碎机粉碎；
混合：粉碎的物料再添加植物油和微量元素，加入到混合机混合均匀；
膨化：混合好的物料通过膨化机制成颗粒物料；
烘干：混合好的物料通过烘干机烘干，温度控制在65-70度；
分级筛选：将物流通过分级筛，颗粒控制在2.5-5毫米。
3.宠物益生菌配方粉的制备
将1制备的菌粉和2制备的宠物饲料按照1：100的比例混合均匀，最终产品中的出厂的活菌在108CFU/g以上。产品灌装后，入库保存销售。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
序列表
<110> 浙江大学
<120> 降血糖植物乳杆菌ZJUIDS04及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1248
<212> DNA
<213> 植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)
<400> 1
aacctgccca gaagcggggg ataacacctg gaaacagatg ctaataccgc ataacaactt 60
ggaccgcatg gtccgagttt gaaagatggc ttcggctatc acttttggat ggtcccgcgg 120
cgtattagct agatggtggg gtaacggctc accatggcaa tgatacgtag ccgacctgag 180
agggtaatcg gccacattgg gactgagaca cggcccaaac tcctacggga ggcagcagta 240
gggaatcttc cacaatggac gaaagtctga tggagcaacg ccgcgtgagt gaagaagggt 300
ttcggctcgt aaaactctgt tgttaaagaa gaacatatct gagagtaact gttcaggtat 360
tgacggtatt taaccagaaa gccacggcta actacgtgcc agcagccgcg gtaatacgta 420
ggtggcaagc gttgtccgga tttattgggc gtaaagcgag cgcaggcggt tttttaagtc 480
tgatgtgaaa gccttcggct caaccgaaga agtgcatcgg aaactgggaa acttgagtgc 540
agaagaggac agtggaactc catgtgtagc ggtgaaatgc gtagatatat ggaagaacac 600
cagtggcgaa ggcggctgtc tggtctgtaa ctgacgctga ggctcgaaag tatgggtagc 660
aaacaggatt agataccctg gtagtccata ccgtaaacga tgaatgctaa gtgttggagg 720
gtttccgccc ttcagtgctg cagctaacgc attaagcatt ccgcctgggg agtacggccg 780
caaggctgaa actcaaagga attgacgggg gcccgcacaa gcggtggagc atgtggttta 840
attcgaagct acgcgaagaa ccttaccagg tcttgacata ctatgcaaat ctaagagatt 900
agacgttccc ttcggggaca tggatacagg tggtgcatgg ttgtcgtcag ctcgtgtcgt 960
gagatgttgg gttaagtccc gcaacgagcg caacccttat tatcagttgc cagcattaag 1020
ttgggcactc tggtgagact gccggtgaca aaccggagga aggtggggat gacgtcaaat 1080
catcatgccc cttatgacct gggctacaca cgtgctacaa tggatggtac aacgagttgc 1140
gaactcgcga gagtaagcta atctcttaaa gccattctca gttcggattg taggctgcaa 1200
ctcgcctaca tgaagtcgga atcgctagta atcgcggatc agcatgcc 1248

Claims (5)

1.植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ZJUIDS04，其特征是：保藏号为CGMCCNO.22609。
2.根据权利要求1所述的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ZJUIDS04，其特征是：植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ZJUIDS04的16S rDNA全序列如SEQ ID No：1所示。
3.如权利要求1或2所述的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ZJUIDS04在制备具有降血糖功能的产品中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征是：具有降血糖功能的产品中包含植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ZJUIDS04的活菌制剂。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征是：活菌制剂中，植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)ZJUIDS04的活菌数为1.0×1011～1×1012CFU/g。
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