CN113454458A - 用于评估iv期结直肠癌中免疫细胞浸润的方法和*** - Google Patents
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Abstract
本发明使用非连续评分函数针对IV期结直肠肿瘤组织样品计算免疫环境评分。针对一个或多个感兴趣区域计算至少一个免疫细胞标志物的特征度量,所述特征度量包括至少含有肿瘤核心的感兴趣区域中的人类CD8+细胞的密度以生成免疫环境评分。然后可以将所述免疫环境评分用作预测度量(例如对特定治疗过程有应答的可能性)。然后可以将所述免疫环境评分结合到诊断和/或治疗决策中。
Description
相关专利申请的交叉引用
本申请是要求2019年2月5日提交的美国临时专利申请第62/801,482号的权益的国际申请,该美国临时专利申请的内容全文以引用方式并入本文。
技术领域
本发明涉及检测、表征和计数(enumeration)肿瘤样品中的离散免疫细胞群,用于预测和治疗增殖性疾病,诸如结直肠癌。
背景技术
已知炎症反应的存在与否是许多不同的癌症类型中的预后因素,所述癌症类型包括结直肠癌、黑素瘤、乳腺癌、卵巢癌、非霍奇金氏淋巴瘤、头颈部癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、食管癌和尿路上皮癌等。参见Pagès等人(2010)。例如,在结直肠癌中,至少自1986年以来,免疫细胞浸润的相对量就被认为是结直肠癌的独立预后因素。参见Jass(1986)。
程序性死亡配体1(PD-L1)是一种免疫检查点蛋白,其通过结合程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)受体来调节免疫***。PD-L1在多种免疫细胞类型上表达,并且也在许多癌细胞类型(包括结直肠癌(CRC)细胞)中表达。PD-L1可以与激活的T细胞上的PD-1受体结合,从而抑制细胞毒性T细胞并实现癌症的免疫逃避。参见Zou等人(2016)。针对免疫检查点蛋白PD-1/PD-L1的抗体可以重新激活细胞毒性T细胞以攻击癌细胞,并且彻底改变了实体瘤的治疗。具有缺陷性DNA错配修复(dMMR)的CRC具有微卫星不稳定性(MSI),其导致突变特异性新肽的超突变和表达。参见Llosa等人(2015)。利用抗PD-1抗体派姆单抗治疗转移性CRC,在这些患者中产生频繁且持久的反应,这导致美国食品和药物管理局批准其在用氟嘧啶、奥沙利铂和伊立替康治疗后的进展之后用于该肿瘤亚组。然而,由于机制仍然未知,超过一半的dMMR mCRC患者表现出对PD-1阻断(blockade)的抗性。参见Le等人(2017)。迄今为止,尚不存在已确定预测对dMMR肿瘤内的PD-1阻断的有反应的生物标志物。
通过引用并入序列表
在此提交的名为“CRC_stage_IV_ST25”的序列表创建于2020年1月30日,文件大小为56,745字节,在此以引用方式并入。
发明内容
本公开总体上涉及评估IV期结直肠肿瘤中的免疫细胞,包括例如T淋巴细胞(对于CD3生物标志物和CD8生物标志物呈阳性的免疫细胞),使用评分函数来计算对于肿瘤样品的免疫环境评分(ICS)。
在一实施例中,以形态学方式(诸如在用苏木精和伊红染色的样品的图像中)和/或基于一种或多种免疫细胞标志物的细胞表达来检测一种或多种类型的免疫细胞。在一示例性实施例中,免疫环境评分用于预测用免疫检查点导向疗法治疗缺陷性DNA错配修复(dMMR)IV期结直肠癌的结果。
在各种实施例中,该方法包括从收集自IV期结直肠肿瘤的组织样品中获得免疫环境评分(ICS):识别所述组织样品中的肿瘤核心(CT)感兴趣区域(ROI);检测所述ROI的至少一部分中的CD8+细胞;以及获得所述ROI内的CD8+细胞密度以计算所述ICS;然后基于所述ICS为所述受试者选择治疗。所述方法进一步包括选择:包括完整疗程的辅助化疗和任选的检查点抑制剂导向疗法的治疗(如果所述CD8+细胞密度低);以及包括检查点抑制剂导向疗法和任选的疗程缩短的辅助化疗的治疗(如果所述CD8+细胞密度高)。
在另一个实施例中,提供了一种计算机实现方法,该方法包括使计算机处理器执行存储在存储器上的一组计算机可执行功能,所述一组计算机可执行功能包括:(A)获得IV期结直肠肿瘤的组织切片的数字图像,其中所述组织切片针对至少人类CD8进行组织化学染色;(B)在所述数字图像中标注一个或多个感兴趣区域(ROI),所述ROI包括肿瘤核心(CT);以及(C)对所述ROI应用评分函数,其中所述评分函数包括计算包含所述CT中的CD8+细胞的密度的特征向量以获得针对所述组织切片的免疫环境评分。在一些实施例中,CD8+密度作为总度量获得。在其他实施例中,所述CD8+密度作为所述ROI的多个对照区域的平均值或中值获得。在一些实施例中,通过将归一化因子应用于所述CD8+密度来归一化所述CD8+密度,所述归一化因子等于特征度量的预定上限或下限。在一实施例中,通过评估跨代表性样品群体的CD8+密度的分布、识别特征度量值的分布中的偏斜以及识别超出预定数量的样品的值(其中所述值被选为所述归一化因子)来获得所述归一化因子。
在另一具体实施例中,提供了一种方法,该方法包括:(a)在肿瘤组织切片的数字图像上标注一个或多个感兴趣区域(ROI),其中ROI中的至少一个包括CT区域的至少一部分;(b)检测和定量所述ROI中的表达人类CD8的细胞;(c)计算所述ROI内的CD8+细胞的密度,并且任选地将所述CD8+细胞密度或肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)细胞密度归一化至所述特征向量以获得针对所述肿瘤的免疫环境评分(ICS)。在一实施例中,所述密度是面积细胞密度或线性细胞密度。
本文还提供了用于对肿瘤组织样品的免疫环境进行评分的***,所述***包括至少计算机处理器和存储器,其中所述存储器存储有待由所述计算机处理器执行的一组计算机可执行指令,所述一组计算机可执行指令包括本文描述的任何过程和方法。在一些实施例中,所述***包括用于对所述肿瘤组织样品的切片进行组织化学标记的自动载玻片染色器,和/或用于生成组织化学染色的切片的数字图像的装置,诸如可操作地连接至数码相机或扫描仪***的显微镜。在进一步的实施例中,所述***可以进一步包括实验室信息***(LIS),用于跟踪和/或控制有待对所述样品、切片和数字图像执行的过程。
附图说明
图1示出了计算ROI的特征度量的两种不同的方法。图像中的虚线示出了ROI的边界。图像中的“X”表示图像中标记的感兴趣对象。图像中的圆圈是对照区域,可用于计算对照区域的全局度量。
图2示出了如本文公开的示例性免疫环境评分***。
图3A示出了在如本文公开的图像分析***上实现的示例性工作流程,其中在执行ROI生成器功能之前对整个图像执行对象识别功能。图3B示出了在如本文公开的图像分析***上实现的示例性工作流程,其中在执行ROI生成器功能之后仅对ROI执行对象识别功能。
图4示出了示例性计算***,其可以形成如本文公开的图像分析***的一部分。
图5描绘了(A)在有反应者(上图)和无反应者(下图)之中以及(B)在疾病控制持续时间超过12个月(上图)和少于12个月(下图)的患者之中,肿瘤核心(CT)和侵袭边缘(IM)处的CD8+和CD3+T细胞密度(评分0-100)的分布。每个T细胞亚型的中值密度由其密度分数所在圆圈的大小反映。有反应者代表具有完全和部分缓解的患者;无反应者代表疾病稳定和疾病进展的患者。
具体实施方式
I.定义
除非另有定义,否则本文所用的科学技术术语具有如本领域的普通技术人员通常理解的相同意义。参见,例如,Lackie,DICTIONARY OF CELL AND MOLECULAR BIOLOGY,Elsevier(第4版2007);Sambrook等人,MOLECULAR CLONING,A LABORATORY MANUAL,ColdSprings Harbor Press(Cold Springs Harbor,N.Y.1989)。术语“一个(a)”或“一个(an)”旨在表示“一个或多个”。术语“包括(comprise)”、“包括(comprises)”和“包括(comprising)”在叙述步骤或元件(元素)之前出现时旨在表示进一步的步骤或元件(元素)的添加是任选的且不被排除。
抗体:本文的术语“抗体”以最广泛的含义使用,并且包括各种抗体结构,包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如,双特异性抗体)和抗体片段,只要它们表现出所需的抗原结合活性即可。
抗体片段:“抗体片段”是指除了完整抗体以外的分子,其包含完整抗体的一部分且结合完整抗体结合的抗原。抗体片段的实例包括但不限于:Fv、Fab、Fab′、Fab′-SH、F(ab′)2;双体抗体;线性抗体;单链抗体分子(例如,scFv);以及由抗体片段形成的多特异性抗体。
生物标志物:如本文所用,术语“生物标志物”应指在生物样品中发现的可用于对生物样品或从其获得生物样品的受试者进行表征的任何分子或分子组。例如,生物标志物可以是分子或分子组,其存在、不存在或相对丰度是:
*特定细胞或组织类型或状态的特征;
*特定病理状况或状态的特征;或者
*对病理状况的严重性、病理状况进展或消退的可能性、和/或病理状况将对特定治疗产生反应的可能性的指示。
作为另一实例,生物标志物可以是细胞类型或微生物(诸如细菌、分枝杆菌、真菌、病毒等)或者其取代分子或分子组。
生物标志物特异性试剂:能够与细胞样品中的一种或多种生物标志物直接特异性结合的特异性检测试剂,诸如一级抗体。
细胞样品:如本文所用,术语“细胞样品”是指任何被获取用于病理学、组织学或细胞学解释的包含完整细胞的样品,诸如细胞培养物、体液样品或手术样本。
连续评分函数:“连续评分函数”是在其中输入一个或多个变量的实际大小(任选地受归一化因子的值和/或应用的上限和/或下限的约束)的一种数学公式。在一些实例中,输入到连续评分函数中的值是变量的实际大小。在其他实例中,输入到连续评分函数中的值是变量的高达(和/或低至,视情况而定)预确定截止值的绝对值,其中超过截止值的所有绝对值都被分配截止值。在其他实例中,输入到连续评分函数中的值是变量的归一化值。
完全缓解(CR):如本文所用,“完全缓解”是指在特定疗法后受试者中所有的目标病灶消失。
Cox比例风险模型:公式1的模型:
检测试剂:“检测试剂”是任何用于在细胞样品中的生物标志物特异性试剂附近沉积染色剂的试剂。非限制性实例包括生物标志物特异性试剂(诸如一级抗体)、二级检测试剂(诸如能够与一级抗体结合的二级抗体)、三级检测试剂(诸如能够与二级抗体结合的三级抗体)、与生物标志物特异性试剂直接或间接关联(associated,缔合)的酶、与此类酶可反应以影响荧光或显色染色剂的沉积的化学品、染色步骤之间所用的洗涤试剂等。
可检测部分:可以产生指示沉积在样品上的可检测部分的存在(即定性分析)和/或浓度(即定量分析)的可检测信号(诸如视觉、电子或其他方式)的分子或材料。可以通过任何已知的或尚待发现的机制生成可检测信号,所述机制包括光子(包括射频、微波频率、红外频率、可见光频率和紫外频率光子)的吸收、发射和/或散射。术语“可检测部分”包括:显色的、荧光的、磷光的和发光的分子和材料,将一种物质转换为另一种物质以提供可检测差异的催化剂(诸如酶)(诸如通过将无色物质转换为有色物质,反之亦然,或通过产生沉淀或增加样品浊度)。在一些实例中,可检测部分是荧光团,其属于几种常见的化学类别,包括香豆素类、荧光素类(或荧光素衍生物和类似物)、若丹明类、试卤灵类、发光团类和花青类。荧光分子的其他实例可参见:Molecular Probes Handbook-A Guide to FluorescentProbes and Labeling Technologies,Molecular Probes,Eugene,OR,ThermoFisherScientific,第11版。在其他实施例中,可检测部分是通过明场显微术可检测的分子,诸如染料,包括二氨基联苯胺(DAB)、4-(二甲氨基)偶氮苯-4′-磺酰胺(DABSYL)、四甲基若丹明(DISCOVERY紫色)、N,N’-双羧基戊基-5,5’-二磺基-吲哚-二羰花青(Cy5)和若丹明110(若丹明)。
特征度量:指示样品中生物标志物的表达水平的值。实例包括:表达强度(例如,以标度0+、1+、2+、3+计)、生物标志物阳性的细胞的数量、细胞密度(例如,在ROI的区域内的生物标志物阳性细胞的数量、在限定ROI的边缘的线性距离内的生物标志物阳性细胞的数量等)、像素密度(即在ROI的区域内的生物标志物阳性像素的数量、在限定ROI的边缘的线性距离内的生物标志物阳性像素的数量等)等。特征度量可以是总度量或全局度量。
组织化学检测:一种涉及用生物标志物特异性试剂和检测试剂标记组织样品中的生物标志物或其他结构的过程,其方式容许在组织样品的结构之间的横截面关系的环境中的生物标志物或其他结构的显微镜检测。实例包括免疫组织化学(IHC)、显色原位杂交(CISH)、荧光原位杂交(FISH)、银原位杂交(SISH)以及***固定石蜡包埋组织切片的苏木精和伊红(H&E)染色。
免疫检查点导向疗法:任何抑制免疫检查点分子激活的疗法。
免疫检查点分子:一种由免疫细胞表达的蛋白质,该免疫细胞的激活会下调细胞毒性T细胞反应。实例包括PD-1、TIM-3、LAG-4和CTLA-4。
免疫逃逸生物标志物:由肿瘤细胞表达的生物标志物,可帮助肿瘤避免T细胞介导的免疫反应。免疫逃逸生物标志物的实例包括PD-L1、PD-L2和IDO。
侵袭边缘(IM):侵袭性肿瘤组织和正常组织之间的界面。“IM”在ROI的上下文中使用时是指仅限于由专家读者识别为侵袭边缘的肿瘤区域的ROI。
单克隆抗体:从基本上同质的抗体群体获得的抗体,即,除了可能的变体抗体(例如,含有天然存在的突变或在单克隆抗体制剂的生产过程中产生,此类变体通常以少数的量存在)之外,构成该群体的各个抗体是相同的和/或结合相同的表位。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反,单克隆抗体制剂中的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。因此,修饰语“单克隆”表示抗体的特征是从基本上同质的抗体群体获得的,并且不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如,有待根据本发明进行使用的单克隆抗体可以通过多种技术来制备,包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法以及利用含有全部或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法、或这些方法的组合。
非线性连续评分函数:具有除f(x)=a+bx之外的任何其他一般结构的连续评分函数,其中x是变量,并且a和b是常数。因此,例如,“非线性连续评分函数”包括非线性代数函数(诸如非常数、非线性多项式函数;有理函数;以及第n根式函数)和超越函数(诸如指数函数、双曲线函数、对数函数和幂函数)。
非连续评分函数:“非连续评分函数”(在本文中也称为“二元评分函数”)是这样的一种评分函数,其中每个变量被分配给预确定的“箱(bin)”(例如,“高”、“中”、或“低”),并且相同的值被输入到相同箱的所有成员的数学函数中。例如,假设被评估的变量是CD8+T细胞的密度。在非连续或二元评分函数中,首先分析密度值以确定其落入“高密度”还是“低密度”箱中,并且将输入到非连续评分函数中的作为任何任意值的值分配给该箱的成员(例如,0代表低,1代表高)。因此,考虑两个样品,第一个具有500个CD8+细胞/mm2的密度,并且第二个具有700个CD8+细胞/mm2的密度。输入到非连续评分函数中的值将取决于该值落入的箱。如果“高箱”包括500个和700个细胞/mm2两者,则值1将被输入到每个样品的非连续评分函数中。如果“高”和“低”箱之间的截止值落在500个和700个细胞/mm2之间的某处,则值0将被输入到第一样品的非连续评分函数中,并且值1将被输入到第二样品的非连续评分函数中。如果“低箱”包括500个和700个细胞/mm2两者,则值0将被输入到每个样品的非连续评分函数中。
归一化:通过固定因子调整特征度量使不同的特征度量以相同的标度表达。
归一化因子:应用于特征度量以获得归一化特征度量的固定因子。
归一化特征度量:一种特征度量,其值已通过归一化因子进行调整。
客观缓解率:肿瘤负荷减少预确定量的受试者的比例。
部分缓解(PR):如本文所用,当目标病灶的最长直径(LD)的总和在以基线总和LD为参考的情况下存在至少30%的降低时,受试者被表征为在特定疗法后有“部分缓解”。
PD-1轴导向疗法:预防PD-1诱导的T细胞失能、衰竭和/或衰老的疗法。实例包括PD-1特异性抗体(诸如纳武单抗、派姆单抗、西米普利单抗、替雷利珠单抗、斯巴达珠单抗、MEDI0680(AstraZeneca)、JS001(Shanghai Junshi Biosciences)、IBI308(InnoventBiologics)、JNJ-63723283)、PD-L1特异性抗体(诸如阿特珠单抗、德瓦鲁单抗、阿维单抗)、PD-1配体片段和融合蛋白(诸如AMP-224(PD-L2的细胞外结构域与人类IgG1的Fc区域之间的融合体))以及小分子抑制剂(诸如CA-170(对PD-L1、PD-L2和VISTA具有结合特异性的小分子)以及BMS-1001和BMS-1166(被预测为使PD-L1二聚化的小分子,参见,例如,WO2015034820和WO2015160641))。
肿瘤周围(PT)区域:紧邻侵袭边缘的肿瘤区域,该区域也可能包括肿瘤外组织的一部分和肿瘤核心的一部分。
肿瘤周围(PT)ROI:包括IM区域的至少一部分并且任选地包括紧邻IM区域的肿瘤外组织和/或紧邻IM的肿瘤核心区域的一部分的ROI。例如,“PT ROI”可以包括肿瘤细胞和非肿瘤细胞之间的界面上的任何点的定义距离内的所有像素,或者它可以包括以肿瘤细胞和非肿瘤细胞之间的界面为中心的定义宽度的ROI,或者它可以包括多个定义形状,每个定义形状都以肿瘤细胞和非肿瘤细胞之间的界面上的一点为中心(诸如多个重叠的圆圈,每个圆圈都以肿瘤细胞和非肿瘤细胞之间的界面上的一离散点为中心)。
进行性疾病(PD):如本文所用,“进行性疾病”用于描述这样的受试者,在特定疗法后,在以自疗法开始或出现一个或多个新病灶以来记录的最小总和LD为参考的情况下,该受试者的目标病灶的最长直径(LD)的总和增加至少20%。
样品:如本文所用,术语“样品”应指从能够被测试生物标志物的存在或不存在的受试者获得的任何材料。
二级检测试剂:能够与生物标志物特异性试剂特异性结合的特异性检测试剂。
切片:用作名词时指适用于显微分析的组织样品的薄片,通常使用切片机切割而成。用作动词时指产生切片的过程。
连续切片:如本文所用,术语“连续切片”应指通过切片机从组织样品中依次切割而成的一系列切片中的任何一个切片。对于被认为是彼此的“连续切片”的两个切片,它们不一定需要是来自组织的连续切片,但它们通常应该在相同的空间关系中含有足够相似的组织结构,使得这些结构可以在组织学染色后彼此匹配。
特异性检测试剂:能够与细胞样品的环境中的目标化学结构特异性结合的任何物质组分(composition,组合物)。如本文所用,术语“特异性结合”、“特异性结合至”或“对……具有特异性”或其他类似迭代是指在存在分子(包括生物分子)的异质群体的情况下靶标与确定靶标的存在的特异性检测试剂之间可测量和可再现的相互作用。例如,与靶标特异性结合的抗体是与其结合其他靶标相比以更大亲和力、亲合力、更容易和/或以更长持续时间结合该靶标的抗体。在一个实施例中,特异性检测试剂与无关靶标的结合程度为该抗体与靶标的结合的小于约10%,例如,通过放射免疫分析(RIA)所测量。在某些实施例中,与靶标特异性结合的生物标志物特异性试剂的解离常数(Kd)为≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM或≤0.1nM。在另一个实施例中,特异性结合可以包括但不要求排他结合。示例性的特异性检测试剂包括:对特定核苷酸序列具有特异性的核酸探针;抗体及其抗原结合片段;以及工程化的特异性结合组分,包括ADNECTIN(基于第10FN3纤连蛋白的支架;Bristol-Myers-Squibb Co.)、AFFIBODY(基于来自金黄色葡萄球菌的蛋白A的Z结构域的支架;Affibody AB,Solna,Sweden)、AVIMER(基于结构域A/LDL受体的支架;Amgen,ThousandOaks,CA)、dAb(基于VH或VL抗体结构域的支架;GlaxoSmithKline PLC,Cambridge,UK)、DARPin(基于锚蛋白重复蛋白的支架;MolecularPartners AG,Z ü rich,CH)、ANTICALIN(基于脂质运载蛋白的支架;Pieris AG,Freising,DE)、NANOBODY(基于VHH的支架(骆驼Ig);Ablynx N/V,Ghent,BE)、TRANS-BODY(基于转铁蛋白的支架;Pfizer Inc.,New York,NY)、SMIP(Emergent Biosolutions,Inc.,Rockville,MD)以及TETRANECTIN(基于C型凝集素结构域的支架(CTLD),四连接素;Borean Pharma A/S,Aarhus,DK)。Wurch等人的《开发新型蛋白质支架作为全抗体的替代物用于成像和治疗:发现研究和临床验证的现状(Development of Novel Protein Scaffolds as Alternatives to Whole Antibodiesfor Imaging and Therapy:Status on Discovery Research and ClinicalValidation)》,《当今药物生物技术(Current Pharmaceutical Biotechnology)》,第9卷,第502-509页(2008)综述了此类工程化的特异性结合结构的描述,该文献的内容以引用方式并入本文。
稳定疾病(SD):如本文所用,在将自疗法开始以来的最小总和LD作为参考的情况下,当在特定疗法后既没有足够的收缩以符合部分缓解(PR)也没有足够的增加以符合进行性疾病(PD)时,受试者被表征为有“稳定疾病”。
染色剂/染色(stain):当用作名词时,术语“染色剂(stain)”应指任何可用于使用于显微分析(包括明场显微术、荧光显微术、电子显微术等)的细胞样品中的特定分子或结构可视化的物质。当用作动词时,术语“染色(stain)”应指任何引起染色剂沉积在细胞样品上的过程。
受试者:如本文所用,术语“受试者”或“个体”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养的动物(例如牛、绵羊、猫、犬和马)、灵长类动物(例如人和非人灵长类动物,诸如猴)、兔以及啮齿类动物(例如小鼠和大鼠)。在某些实施例中,该个体或受试者为人。
测试样品:从在获得样品时尚未知结果的受试者中获得的肿瘤样品。
组织样品:如本文所用,术语“组织样品”应指保留细胞之间的横截面空间关系(如它们存在于从其获得样品的受试者的体内那样)的细胞样品。
肿瘤核心(CT):侵袭性肿瘤病变的不是侵袭边缘的区域。在ROI的上下文中,“CT”是指全肿瘤区域的既不是IM也不是作为伪影从ROI中被排除的部分。
肿瘤样品:从肿瘤中获得的组织样品。
全肿瘤(WT)区域:组织切片的一部分,该部分被表征为一个或多个基本上完全由侵袭性肿瘤细胞组成的连续区域,包括CT和IM区域两者。
全肿瘤ROI:仅限于全肿瘤区域的ROI。
II.生物标志物描述
CD3:CD3是一种细胞表面受体复合物,经常用作具有T细胞谱系的细胞的定义生物标志物。CD3复合物由4条不同的多肽链组成:CD3-γ链、CD3-δ链、CD3ε链和CD3-ζ链。CD3-γ和CD3-δ各自与CD3-ε形成异二聚体(εγ-同二聚体和εδ-异二聚体),而CD3-ζ形成同二聚体(ζζ-同二聚体)。在功能上,εγ-同二聚体、εδ-异二聚体和ζζ-同二聚体与T细胞受体复合物形成信号复合物。人类CD3-γ链、CD3-δ链、CD3ε链和CD3-ζ链(及其异构体和变体)的示例性序列分别可见于Uniprot Accesion第P09693号(其规范氨基酸序列在本文中在SEO ID NO:1公开)、第P04234号(其规范氨基酸序列在本文中在SEQ ID NO:2公开)、第P07766号(其规范氨基酸序列在本文中在SEQ ID NO:3公开)以及第P20963号(其规范氨基酸序列在本文中在SEQ ID NO:4公开)。如本文所用,术语“人类CD3蛋白生物标志物”包括:具有规范人序列及其维持规范序列的功能的天然变体的任何CD3-γ链、CD3-δ链、CD3ε链和CD3-ζ链多肽;包括具有规范人序列及其维持规范序列的功能的天然变体的CD3-γ链、CD3-δ链、CD3ε链和CD3-ζ链多肽中的一种或多种的εγ-同二聚体、εδ-异二聚体和ζζ-同二聚体;以及包括上述CD3同二聚体或异二聚体中的一种或多种的任何信号复合物。在一些实施例中,人类CD3蛋白生物标志物特异性试剂包括与CD3-γ链多肽(诸如SEQ ID NO:1处的多肽)、CD3-δ链多肽(诸如SEQ ID NO:2处的多肽)、CD3ε链多肽(诸如SEQ ID NO:3处的多肽)或CD3-ζ链多肽(诸如SEQ ID NO:4处的多肽)内的结构(诸如表位)特异性结合或者与位于εγ-同二聚体、εδ-异二聚体或ζζ-同二聚体内的结构(诸如表位)结合的任何生物标志物特异性试剂。
CD8:CD8是一种异二聚体、二硫化物连接的跨膜糖蛋白,其见于细胞毒性抑制因子T细胞亚群、胸腺细胞、某些自然杀伤细胞和骨髓细胞亚群中。CD8受体的人类α-和β-链(及其异构体和变体)的示例性序列分别可见于Uniprot Accession第P01732号(其规范氨基酸序列在本文中在SEQ ID NO:5公开)以及第P10966号(其规范氨基酸序列在本文中在SEQ IDNO:6公开)。如本文所用,术语“人类CD8蛋白生物标志物”包括具有规范人序列及其维持规范序列的功能的天然变体的任何CD8-α链多肽;具有规范人序列及其维持规范序列的功能的天然变体的任何CD8-β链多肽;包括具有规范人序列及其维持规范序列的功能的天然变体的CD8-α链多肽和/或具有规范人序列及其维持规范序列的功能的天然变体的CD8-β链多肽的任何二聚体。在一些实施例中,人类CD8蛋白生物标志物特异性试剂包括与CD8-α链多肽(诸如SEQ ID NO:5处的多肽)、CD8-β链多肽(诸如SEQ ID NO:6处的多肽)内的结构(诸如表位)特异性结合或者与位于CD8二聚体内的结构(诸如表位)结合的任何生物标志物特异性试剂。
CTLA-4:CTLA-4(也称为CD152)是一种免疫检查点蛋白,由人类2号染色体上的CTLA4基因表达。人类CTLA-4蛋白(及其异构体和变体)的示例性序列可见于UniprotAccesion第P16410号(其规范氨基酸序列在本文中在SEQ ID NO:7公开)。
PD-1:程序性死亡-1(PD-1)是CD28受体家族的成员,由2号染色体上的PDCD1基因编码。人类PD-1蛋白(及其异构体和变体)的示例性序列可见于Uniprot Accesion第Q15116号(其规范氨基酸序列在本文中在SEQ ID NO:8公开)。在一些实施例中,人类PD-1蛋白生物标志物特异性试剂包括与人类PD-1多肽(诸如SEQ ID NO:8处的多肽)内的结构(诸如表位)特异性结合的任何生物标志物特异性试剂。
PD-L1:程序性死亡配体1(PD-L1)是一种1型跨膜蛋白,由9号染色体上的CD274基因编码。PD-L1作为PD-1和CD80的配体。人类PD-L1蛋白(及其异构体和变体)的示例性序列可见于Uniprot Accesion第Q9NZQ7号(其规范氨基酸序列在本文中公开为SEQ ID NO:9)。在一些实施例中,人类PD-L1蛋白生物标志物特异性试剂包括任何与人类PD-L1多肽(诸如SEQ ID NO:9处的多肽)内的结构(诸如表位)特异性结合的生物标志物特异性试剂。
PD-L2:程序性死亡配体2(PD-L2)是一种跨膜蛋白,由9号染色体上的PDCD1LG2基因编码。PD-L2作为PD-1的配体。人类PD-L2蛋白(及其异构体和变体)的示例性序列可见于Uniprot Accesion第Q9BQ51号(其规范氨基酸序列在本文中公开为SEQ ID NO:10)。在一些实施例中,人类PD-L2蛋白生物标志物特异性试剂包括与人类PD-L2多肽(诸如SEQ ID NO:10处的多肽)内的结构(诸如表位)特异性结合的任何生物标志物特异性试剂。
III.评分函数
本发明的方法和***的评分函数应用于来自患有具有缺陷性DNA错配修复的IV期结直肠癌患者的肿瘤样品。选择一组要测试的生物标志物,针对生物标志物对样品进行染色,并且从一个或多个ROI计算生物标志物的特征度量(这些特征度量任选地可以被归一化和/或受上限或下限的约束)。
本发明的评分函数基于位于肿瘤核心(CT)内的CD8+细胞的密度。额外的生物标志物可以被包括在评分函数(例如,CD3+密度)中和/或来自不同的组织区室(例如,侵袭边缘),只要它们不会显著降低评分函数预测受试者对特定治疗过程的反应的能力即可。
在一个实施例中,本文所述的评分函数是非连续评分函数,其中每个区室(例如,CT)内的CD3+和CD8+T细胞的密度是通过将细胞计数除以肿瘤区室的面积(mm2)来计算的。密度值用于计算每个T细胞亚型和区室(CD3+IM、CD3+CT、CD8+IM、CD8+CT)的范围为0到100的密度评分,并确定阈值以区分“高”和“低”ICS。在一示例性实施例中,阈值通过接收者操作特征(ROC)曲线分析来确定。
在另一个实施例中,本文所述的评分函数是连续评分函数,其至少包括CT中的CD8+T细胞密度,其中CT区域中的CD8+T细胞密度具有在连续评分函数中的变量的最高权重。可用于本发明的示例性连续评分函数模型包括Cox比例风险模型和逻辑回归模型。在一实施例中,提供了多变量连续评分模型,其包括CT区域中的CD8+T细胞密度作为在模型中具有最高权重的变量。
III.A.样品和样品制备
对从IV期结直肠肿瘤获得的组织切片的图像执行非连续评分函数。样品通常是经过以与组织化学染色相容的方式处理的组织样品,所述方式包括例如固定(诸如利用基于***的固定剂)、包埋在蜡基质(诸如石蜡)中以及切片(诸如利用切片机)。本公开不需要特定的处理步骤,只要获得的样品与样品的针对感兴趣生物标志物的组织化学染色相容即可。在一具体实施例中,样品是IV期结直肠癌肿瘤的***固定石蜡包埋(FFPE)组织样品的切片机切片。
III.B.生物标志物组
在一实施例中,用人类CD8蛋白生物标志物特异性试剂与适当的检测试剂组合来标记IV期结直肠样品的至少一个组织切片,并评估CD8+细胞的密度。此外,可以根据错配修复和/或微卫星稳定性状态对肿瘤进行分类。
错配修复状态(也称为“MMR”)通常涉及对参与错配修复的四种基因的表达和/或甲基化状态进行评估:hPMS2、hMLHl、hMSH2和hMSH6。规范蛋白序列分别在SEQ ID NO:11-14公开。具有这四种基因中的任何一种的缺陷性表达的肿瘤被确定为具有缺陷性错配修复(称为“dMMR”),而在这些基因中的任何一种的表达中无缺陷的肿瘤被确定为具有完善的MMR(称为“pMMR”)。可以例如通过基于蛋白质的测定(诸如通过免疫测定,诸如固相酶免疫测定(例如,ELISA)或免疫组织化学测定)或聚合酶链反应(PCR)测定(诸如实时逆转录酶PCR测定)来确定MMR状态。
微卫星不稳定性(“MSI”)是由MMR缺陷引起的。结果,微卫星基因座长度的改变开始累积。用于评估MSI状态的测定是本领域公知的。参见,例如,Murphy等人,J.Mol.Diagn.,第8卷,第3期,第305-11页(2006年7月);Esemuede等人,Ann.Surg.Oncol.,第17卷,第12期,第3370-78页(2010年12月);Mukherjee等人,Hereditary Cancer in Clinical Practice,第8卷,第9期(2010);MSI分析***(Promega)(评估MSI高表型的七个标志物,包括五个几乎单态的单核苷酸重复标志物(BAT-25、BAT-26、MONO-27、NR-21和NR-24)和两个高度多态的五核苷酸重复标志物(Penta C和Penta D))。
III.C.样品的组织化学染色
通过将一种或多种生物标志物特异性试剂与一组适当的检测试剂组合应用来对样品的切片进行染色以产生生物标志物被染色的切片。生物标志物染色通常通过在促进生物标志物与生物标志物特异性试剂之间的特异性结合的条件下将样品的切片与生物标志物特异性试剂接触来完成。然后将样品与一组检测试剂接触,所述一组检测试剂与生物标志物特异性试剂相互作用以促进可检测部分在生物标志物附近的沉积,从而产生定位于生物标志物的可检测信号。通常,洗涤步骤在不同试剂的应用之间进行,以防止组织出现不需要的非特异性染色。
生物标志物特异性试剂通过介导可检测部分在生物标志物特异性试剂附近的沉积来促进生物标志物的检测。
在一些实施例中,可检测部分与生物标志物特异性试剂直接缀合,因此在生物标志物特异性试剂与其标靶结合时沉积在样品上(通常称为直接标记方法)。直接标记方法通常可以更直接地量化,但往往缺乏敏感性。在其他实施例中,可检测部分的沉积通过使用与生物标志物特异性试剂相关联的检测试剂来实现(通常称为间接标记方法)。间接标记方法增加了可沉积在生物标志物特异性试剂附近的可检测部分的数量,因此通常比直接标记方法更敏感,特别是在与染料组合使用时。
在一些实施例中,使用间接方法,其中通过定位于生物标志物特异性试剂的酶促反应来沉积可检测部分。用于此类反应的合适的酶是众所周知的,并且包括但不限于氧化还原酶、水解酶和过氧化物酶。明确包括的特定酶有辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)、酸性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖醛酸酶和β-内酰胺酶。酶可以与生物标志物特异性试剂直接缀合,或者可以通过标记缀合物而与生物标志物特异性试剂间接关联。如本文所用,“标记缀合物”包括:
(a)特异性检测试剂;和
(b)与特异性检测试剂缀合的酶,其中该酶在适当的反应条件下与显色底物、信号缀合物或酶反应性染料可反应,以实现染料的原位生成和/或染料在组织样品上的沉积。
在非限制性实例中,标记缀合物的特异性检测试剂可以是二级检测试剂(诸如与一级抗体结合的物种特异性二级抗体、与半抗原缀合的一级抗体结合的抗半抗原抗体或与生物素化一级抗体结合的生物素结合蛋白)、三级检测试剂(诸如与二级抗体结合的物种特异性三级抗体、与半抗原缀合的二级抗体结合的抗半抗原抗体或与生物素化二级抗体结合的生物素结合蛋白)或其他此类布置。如此定位于样品结合生物标志物特异性试剂的酶然后可用于多种方案以沉积可检测部分。
在某些情况下,酶会与显色化合物/底物反应。显色化合物/底物的特定非限制性实例包括:4-硝基苯基磷酸盐(pNPP)、固红、溴氯吲哚磷酸盐(BCIP)、硝基蓝四唑(NBT)、BCIP/NBT、固红、AP橙、AP蓝、四甲基联苯胺(TMB)、2,2’-联氮-二-[3-乙基苯并噻唑啉磺酸盐](ABTS)、邻联茴香胺、4-氯萘酚(4-CN)、硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)、邻苯二胺(OPD)、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖苷(X-Gal)、甲基伞形酮-β-D-吡喃半乳糖苷(MU-Gal)、对硝基苯基-d-D-吡喃半乳糖苷(PNP)、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-Gluc)、3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)、洋红、碘硝基四唑(INT)、四唑蓝或四唑紫。
在一些实施例中,酶可用于金相检测方案。金相检测方法包括使用酶(诸如碱性磷酸酶)与水溶性金属离子和酶的无氧化还原活性底物的组合。在一些实施例中,底物被酶转换为氧化还原活性剂,并且氧化还原活性剂还原金属离子,使其形成可检测的沉淀物。(参见,例如,于2004年12月20日提交的美国专利申请号11/015,646、PCT公开号2005/003777和美国专利申请号2004/0265922;它们中各自的全文以引用方式并入本文)。金相检测方法包括使用氧化还原酶(诸如辣根过氧化物酶)以及水溶性金属离子、氧化剂和还原剂,再次形成可检测的沉淀物。(参见,例如,美国专利号6,670,113,该专利的全文以引用方式并入本文)。
在一些实施例中,酶促作用发生在酶和染料本身之间,其中反应将染料从非结合性物种转换为沉积在样品上的物种。例如,DAB与过氧化物酶(诸如辣根过氧化物酶)的反应会氧化DAB,使其沉淀。
在其他实施例中,可检测部分通过包括潜在反应性部分的信号缀合物来沉积,所述潜在反应性部分被配置成与酶反应以形成可与样品或其它检测组分结合的反应性物种。这些反应性物种能够在它们产生的附近(即酶附近)与样品反应,但迅速转换为非反应性物种,使得信号缀合物不会沉积在远离酶沉积位点的位点。潜在反应性部分的实例包括:醌甲基化物(QM)类似物,诸如WO2015124703A1中描述的那些,以及酪酰胺缀合物,诸如WO2012003476A2中描述的那些,上述文献各自的全文以引用方式并入本文。在一些实例中,潜在反应性部分与染料直接缀合,所述染料诸如N,N′-双羧基戊基-5,5′-二磺基-吲哚-二羰花青(Cy5)、4-(二甲氨基)偶氮苯-4′-磺酰胺(DABSYL)、四甲基若丹明(DISCO紫)和若丹明110(若丹明)。在其他实例中,潜在反应性部分与特异性结合对的一个成员缀合,并且染料与特异性结合对的另一个成员连接。在其他实例中,潜在反应性部分与特异性结合对的一个成员连接,并且酶与特异性结合对的另一个成员连接,其中酶(a)与显色底物可反应以影响染料的产生,或(b)与染料可反应以影响染料(诸如DAB)的沉积。特异性结合对的实例包括:
(1)与潜在反应性部分连接的生物素或生物素衍生物(诸如脱硫生物素),以及与染料或者与显色底物可反应或与染料可反应的酶连接的生物素结合实体(诸如亲合素、链霉亲合素、去糖基化的亲合素(诸如NEUTRAVIDIN),或在其生物素结合位点具有硝化酪氨酸的生物素结合蛋白(诸如CAPTAVIDIN))(例如,当染料为DAB时,与生物素结合蛋白连接的过氧化物酶);以及
(2)与潜在反应性部分连接的半抗原,以及与染料或者与显色底物可反应或与染料可反应的酶连接的抗半抗原抗体(例如,当染料为DAB时,与生物素结合蛋白连接的过氧化物酶)。
具体包括表1中列出的生物标志物特异性试剂和检测试剂组合的非限制性实例。
表1
在一具体实施例中,表1中列出的生物标志物特异性试剂和特异性检测试剂是抗体。如本领域普通技术人员将理解的,针对每种生物标志物特异性试剂的检测方案可以相同,也可以不同。
市售的检测试剂或包含适用于本发明方法的检测试剂的试剂盒的非限制性实例包括:VENTANA ultraView检测***(与酶缀合的二级抗体,所述酶包括HRP和AP);VENTANAiVIEW检测***(生物素化的抗物种二级抗体和链霉亲和素缀合的酶);VENTANA OptiView检测***(OptiView)(与半抗原缀合的抗物种二级抗体和与酶多聚体缀合的抗半抗原三级抗体);VENTANA扩增试剂盒(未缀合的二级抗体,该未缀合的二级抗体可与前述VENTANA检测***中的任何一种一起使用,以扩增沉积在一级抗体结合位点处的酶的数量);VENTANAOptiView扩增***(与半抗原缀合的抗物种二级抗体、与酶多聚体缀合的抗半抗原三级抗体以及与相同半抗原缀合的酪酰胺。在使用中,将二级抗体与样品接触,以实现与一级抗体的结合。然后使用抗半抗原抗体孵育样品,以实现酶与二级抗体的缔合。然后使用酪酰胺孵育样品,以实现额外的半抗原分子的沉积。然后使用抗半抗原抗体再次孵育样品,以实现额外的酶分子的沉积。然后使用可检测部分孵育样品以实现染料沉积);VENTANA DISCOVERY、DISCOVERY OmniMap、DISCOVERY UltraMap抗半抗原抗体、二级抗体、色原、荧光团和染料试剂盒,上述产品中的每种均可从Ventana Medical Systems,Inc.(Tucson,Arizona)获得;PowerVision和PowerVision+IHC检测***(直接与HRP或AP聚合成携带高比例的酶比抗体的紧凑型聚合物的二级抗体);以及DAKO EnVisionTM+***(与二级抗体缀合的酶标记聚合物)。
III.D复染
如果需要,可以对生物标志物染色的载玻片进行复染,以帮助识别形态学相关区域以手动或自动识别ROI。复染剂的实例包括:显色核复染剂,诸如苏木精(染色从蓝色到紫色)、亚甲蓝(染色蓝色)、甲苯胺蓝(染色细胞核深蓝色和多糖粉红色到红色)、核固红(也称为Kernechtrot染料,染色红色)以及甲基绿(染色绿色);非核显色染色剂,诸如伊红(染色粉红色);荧光核染色剂,包括4′,6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI,染色蓝色)、碘化丙啶(染色红色),Hoechst染色剂(染色蓝色)、核绿DCS1(染色绿色)、核黄(Hoechst S769121,在中性pH下呈染色黄色,而在酸性pH下染色蓝色)、DRAQ5(染色红色)、DRAQ7(染色红色);荧光非核染色剂,诸如荧光团标记的鬼笔环肽(染色丝状肌动蛋白,颜色取决于缀合荧光团)。
III.E.样品的形态学染色
在某些实施例中,还可能希望对生物标志物染色切片的连续切片进行形态学染色。该切片可用于识别从中进行评分的ROI。基本的形态学染色技术通常依赖于用第一种染料染色核结构并且用第二种染料染色细胞质结构。许多形态学染色剂是已知的,包括但不限于苏木精和伊红(H&E)染色剂以及李氏染色剂(亚甲蓝和碱性品红)。在一具体实施例中,每个生物标志物染色的载玻片的至少一个连续切片是H&E染色的。可以使用任何施加H&E染色剂的方法,包括手动和自动方法。在一实施例中,样品的至少一个切片是在自动染色***上染色的H&E染色的样品。用于执行H&E染色的自动化***通常按照以下两种染色原理之一运行:批量染色(也称为“浸泡”)或单独载玻片染色。批量染色器通常使用在其中同时浸入许多载玻片的桶或槽。另一方面,单独载玻片染色器直接将试剂施加至每个载玻片,并且没有两个载玻片共享相同等分的试剂。市售的H&E染色器的实例包括:来自罗氏公司的VENTANA SYMPHONY(单独载玻片染色器)和VENTANA HE600(单独载玻片染色器)系列H&E染色器;来自Agilent Technologies的Dako CoverStainer(批量染色器);来自LeicaBiosystems Nussloch GmbH的Leica ST4020小型线性染色器(批量染色器)、Leica ST5020多级染色器(批量染色器)和Leica ST5010自动染色器XL系列(批量染色器)H&E染色器。
III.F.ROI选择和特征度量计算
在一实施例中,将评分函数应用于源自肿瘤的一个或多个切片的数字图像的特征向量,其中特征向量包括肿瘤切片的肿瘤核心(CT)区域中CD8+细胞的密度。
在一些实施例中,ROI可以由受过训练的读者手动识别,其划定对应于CT区域的区域,然后可以将划定的区域用作用于计算CD8+细胞密度的ROI。在其他实施例中,计算机实现***可以帮助用户标注ROI(称为“半自动ROI标注”)。例如,用户可以在数字图像中标记全肿瘤区域。计算机实现***然后可以自动定义在由受过训练的用户划定的肿瘤区域内部的区域,然后将其用作ROI(在这种情况下称为肿瘤核心(CT)ROI)。参见Yoon等人(2019)。在其他实施例中,计算机实现***可以自动定义一区域,该区域从由受过训练的用户划定的肿瘤区域边缘延伸出预定义距离(例如,0.5mm、1mm或1.5mm),将其用作IM。在该段落中阐述的每个实施例中,可以直接在生物标志物染色的切片中识别ROI,或者可以在生物标志物染色的切片的连续切片中识别ROI。
通过将ROI的度量应用于ROI内的CD8+表达数据来计算特征度量。可用于特征度量计算的ROI度量的实例包括,例如,ROI的面积或限定ROI的边缘的长度(诸如围绕其限定CT区域的全肿瘤区域的边缘的长度)。特征度量的具体实例包括:
(a)ROI内CD8+细胞的面积密度(ROI区域内的阳性细胞的数量),以及
(b)CD8+细胞的线性密度(在限定ROI的边缘的线性长度上,在ROI内表达生物标志物的细胞的总数,诸如表示围绕其计算CT区域的肿瘤区域的线),
特征度量可以直接基于ROI中的原始计数(以下称为“总度量”),或基于ROI内多个对照区域的平均或中值特征度量(以下称为“全局度量”)。这两种方法如图1所示。在这两种情况下都会提供IHC载玻片的图像,其中标注了ROI(表示为虚线内的区域)和识别的感兴趣对象(例如,CD8+细胞)。对于总度量方法,通过量化ROI内所有标记特征的相关度量(“ROI对象度量”)并将ROI对象度量(诸如总标记对象或标记生物标志物表达的总面积等)除以ROI度量(诸如ROI的面积、ROI内的总细胞数等)来计算特征度量(步骤A1)。对于全局度量方法,多个对照区域(由空心圆圈表示)覆盖在ROI上(步骤B1)。通过量化对照区域的相关度量(“CR对象度量”)(诸如对照区域内的总标记对象或对照区域内的标记生物标志物表达的总面积等)并将其除以对照区域ROI度量(“CR ROI度量”)(诸如对照区域的面积、对照区域内的总细胞数等)来计算对照区域度量(“CR度量”)(步骤B2)。针对每个对照区域计算单独的CR度量。通过计算所有CR度量的平均值或中值来获得全局度量(步骤B3)。
在使用对照区域的情况下,可以使用任何覆盖对照区域以进行度量处理的方法。在一具体实施例中,可以将ROI划分为多个网格空间(其可以是大小相等、大小随机或不同大小的一些组合),每个网格空间构成一个对照区域。可替代地,具有已知大小(其可以相同或不同)的多个对照区域可以彼此相邻或彼此重叠放置以基本上覆盖整个ROI。也可以使用其他方法和布置,只要输出是可以跨不同样品进行比较的ROI的特征度量即可。
如果需要,计算出的特征度量可以任选地转换为归一化的特征向量。
在典型实例中,绘制了针对来自受试者的样品计算的特征度量,并评估分布以识别任何向右或向左的偏斜。识别具有生物学意义的截止值(右偏分布的最大截止值,和/或左偏分布的最小截止值),并为每个具有超出截止值(在右偏分布的情况下高于截止值,或在左偏分布的情况下低于截止值)的值的样品分配等于截止值的特征度量。然后将截止值(以下称为“归一化因子”)应用于每个特征度量。在右偏分布的情况下,将特征度量除以归一化因子得到归一化的特征度量,在这种情况下,以最大标度表达特征度量(即归一化度量的值不会超过预确定的最大值,诸如1、10、100等)。类似地,在左偏分布的情况下,将特征度量除以归一化因子得到归一化的特征度量,在这种情况下,以最小标度表达特征度量(即归一化度量的值不会低于预确定的最小值,诸如1、10、100等)。如果需要,也可以将归一化的特征度量乘以或除以预确定的常数值以获得所需的标度(例如,对于右偏分布,乘以100以获得归一化因子的百分比而不是归一化因子的分数)。可以通过将为建模而识别的归一化因子和/或最大和/或最小截止值应用于为测试样品计算的特征度量来计算测试样品的归一化的特征度量。
III.G.对连续评分函数建模
为了生成连续评分函数,对来自一群患者的特征度量针对其预测相对肿瘤预后、进展风险和/或对特定治疗过程做出反应的可能性的能力进行建模。在一实施例中,使用“事件发生时间”模型。这些模型测试每个变量预测在任何给定时间点发生的定义事件的相对风险的能力。这种情况下的“事件”通常是总生存期、无病生存期和无进展生存期。在一个实例中,“事件发生时间”模型是总生存期、无病生存期或无进展生存期的Cox比例风险模型。Cox比例风险模型可以写成公式1:
ICScox=exp(b1X1+b2X2+…bpXp) 公式1
在每种情况下,其中X1、X2、..Xp是一个或多个特征度量的值(任选地其可能受到最大和/或最小截止值和/或归一化的约束),b1、b2…bp是从模型中针对每个特征度量外推的常数。对于测试群中的每个患者样品,获得关于被跟踪结果(死亡时间、复发时间或进展时间)和被分析的每个生物标志物的特征度量的数据。通过将群中的每个个体的特征度量数据和生存数据输入计算机统计分析软件套件(诸如用于统计计算的R项目(可在https://www.r-project.org/访问)、SAS、MATLAB等)来生成候选Cox比例模型。使用一致性指数(诸如C指数)测试每个候选模型的预测能力。在使用选定的一致性指数的情况下具有最高一致性分数的模型被选为连续评分函数。
此外,可以根据对免疫检查点导向疗法无反应的相对风险(诸如“高风险”和“低风险”、四分位数、十分位数等)来选择一个或多个分层(stratification)截止值来将患者分到“风险箱”中。在一个实例中,使用接收者操作特征(ROC)曲线选择分层截止值。ROC曲线允许用户平衡模型的敏感性(即优先捕获尽可能多的“阳性”或“有反应者”候选者)与模型的特异性(即最小化“无反应者”的假阳性)。在一实施例中,选择有反应者和无反应者箱之间的总生存期、无病生存期或无进展生存期的截止值,所选的截止值具有平衡的敏感性和特异性。
IV.免疫环境评分
针对一种或多种与评分函数相关的生物标志物(例如,人类CD8蛋白)对来自dMMRIV期癌症患者的一个或多个测试样品进行染色,并计算相关特征度量,如果使用它们,则将一个或多个归一化因子和/或最大和/或最小截止值应用于特征度量以获得归一化的特征度量(即,免疫环境评分)。然后,临床医生可以将免疫环境评分整合到诊断和/或治疗决策中。
IV.A.某些免疫环境评分的临床应用
IV期结直肠癌是已经扩散到远处器官和组织的癌症。针对IV期结直肠癌开发了本发明,以用于确定某些类型的疗法是否适用于特定受试者。
在肿瘤计数低的情况下,当前的治疗方案通常包括手术切除肿瘤和附近***以及手术切除远处转移瘤,以及在手术切除之前和/或之后进行辅助化疗。对于不适合手术的IV期结肠癌,通常将化疗作为主要治疗进行施用,任选地在适用时与靶向疗法相组合。一些最常用的方案包括:FOLFOX:亚叶酸、氟尿嘧啶(5-FU)和奥沙利铂(Eloxatin);FOLFIRI:亚叶酸、5-FU和伊立替康(Camptosar);CAPEOX或CAPOX:卡培他滨(Xeloda)和奥沙利铂;FOLFOXIRI:亚叶酸、5-FU、奥沙利铂和伊立替康;上述组合之一加上靶向VEGF的药物(贝伐单抗[Avastin]、阿柏西普[Zaltrap]或雷莫芦单抗[Cyramza]),或靶向EGFR的药物(西妥昔单抗[Erbitux]或帕尼单抗[Vectibix]);5-FU和亚叶酸,其具有或没有靶向药物;卡培他滨,其具有或没有靶向药物;伊立替康,其具有或没有靶向药物;单独使用的西妥昔单抗;单独使用的帕尼单抗;单独使用的瑞戈非尼(Stivarga);曲氟尿苷和替吡嘧啶(Lonsurf)。
在本发明中,评分函数用于基于肿瘤核心内的CD8+细胞密度来识别适合免疫检查点导向疗法的dMMR IV期结直肠癌患者。
在一个实施例中,评分函数使用包含肿瘤核心的ROI中的CD8+细胞密度(该密度可以被归一化和/或受最大和/或最小截止值的约束)。在一实施例中,该密度是面积密度或线性密度。在一实施例中,每个密度源自总度量或全局度量。
在一实施例中,评分函数使用如下:
(a)对于患有免疫环境评分(ICS)低的dMMR IV期结直肠癌受试者,施用标准治疗过程;或者
(b)对于患有ICS高的dMMR IV期结直肠癌受试者,施用包括免疫检查点导向疗法的治疗过程。
在一些实施例中,ICS基于CD8+细胞密度。在各种实施例中,在肿瘤核心中测量细胞密度。
在一些实施例中,对于患有ICS低的dMMR IV期结直肠癌受试者,省略免疫检查点导向疗法。在另一个实施例中,化疗的标准治疗过程进一步包括用不是检查点导向疗法的免疫疗法进行的治疗。
在一些实施例中,对于患有ICS高的dMMR IV期结直肠癌受试者,将过程缩减的化疗与免疫检查点导向疗法组合。过程“缩减的”化疗可以包括缩减所用的不同化疗剂的数量、缩减一种或多种化疗剂的剂量和/或缩短利用一种或多种化疗剂进行治疗的持续时间。过程缩减的化疗还可以包括选择相对于其他化疗剂具有较低毒性特征的化疗剂用于治疗CRC。
示例性的免疫检查点导向疗法包括:靶向PD-1的检查点抑制剂(诸如纳武单抗、派姆单抗、西米普利单抗、替雷利珠单抗、斯巴达珠单抗、MEDI0680(AstraZeneca)、JS001(Shanghai Junshi Biosciences)、IBI308(Innovent Biologics)、JNJ-63723283)、PD-L1(诸如阿特珠单抗、德瓦鲁单抗、阿维单抗)、PD-L1(诸如阿特珠单抗、阿维单抗或德瓦鲁单抗)、CTLA-4(诸如伊匹木单抗)、IDO抑制剂(诸如NLG919)等。在一实施例中,免疫检查点导向疗法是一种PD-1轴导向疗法。在各种实施例中,PD-1轴导向疗法是PD-1或PD-L1导向疗法。
IV.B.免疫环境评分***
在一实施例中,如本文所述的评分函数由免疫环境评分***实现。示例性免疫环境评分***如图2所示。
免疫环境评分***包括图像分析***100。图像分析***100可以包括一个或多个计算设备,诸如台式计算机、膝上型计算机(笔记本电脑)、平板电脑、智能手机、服务器、专用计算设备或任何能够执行本文描述的技术和操作的其他一种或多种类型的一个或多个电子设备。在一些实施例中,图像分析***100可以实现为单个设备。在其他实施例中,图像分析***100可以实现为一起实现本文讨论的各种功能的两个或更多个设备的组合。例如,图像分析***100可以包括通过一个或多个局域网和/或广域网(诸如因特网)彼此通信耦合的一台或多台服务器计算机和一台或多台客户端计算机。
如图2所示,图像分析***100可以包括存储器116、处理器117和显示器118。存储器116可以包括任何类型的易失性或非易失性存储器(诸如随机存取存储器(RAM)、只读存储器诸如电可擦除可编程只读存储器(EEPROM)、闪存、硬盘驱动器、固态驱动器、光盘等)的任何组合。为简洁起见,存储器116在图2中被描绘为单个设备,但是应当理解,存储器116也可以分布在两个或更多个设备上。
处理器117可以包括任何类型的一个或多个处理器,诸如中央处理单元(CPU)、图形处理单元(GPU)、专用信号或图像处理器、现场可编程门阵列(FPGA)、张量处理单元(TPU)等。为简洁起见,处理器117在图2中被描绘为单个设备,但是应当理解,处理器117也可以分布在任何数量的设备上。
显示器118可以使用任何合适的技术来实现,诸如LCD、LED、OLED、TFT、等离子等。在一些实现方案中,显示器118可以是触敏显示器(触摸屏)。
如图2所示,图像分析***100还可以包括对象识别器110、感兴趣区域(ROI)生成器111、用户接口模块112和评分引擎114。虽然这些模块在图2中被描绘为独立的模块,但对于本领域的普通技术人员来说显而易见的是,每个模块可以替代地被实现为多个子模块,并且在一些实施例中,任何两个或更多个模块都可以组合成单一模块。此外,在一些实施例中,***100可以包括为简洁起见未在图2中描绘的附加引擎和模块(例如,输入设备、网络和通信模块等)。此外,在一些实施例中,图2中描绘的一些块可以被禁用或省略。如下文将更详细地讨论的,***100的一些或所有模块的功能可以以硬件、软件、固件或它们的任何组合来实现。可用于实现如本文所公开的模块的示例性市售软件包包括:VENTANAVIRTUOSO;Definiens TISSUE STUDIO、DEVELOPER XD和IMAGE MINER;以及VisopharmBIOTOPIX、ONCOTOPIX和STEREOTOPIX软件包。
在获取图像之后,图像分析***100可以将图像传递给对象识别器110,该对象识别器用于识别和标记图像内稍后将用于评分的相关对象和其他特征。对象识别器110可以从每个图像中提取(或为每个图像生成)表征图像中各种对象的多个图像特征以及表示一个或多个生物标志物的表达的像素。提取的图像特征例如可以包括纹理特征,诸如Haralick特征、词袋特征等。多个图像特征的值可以组合成高维向量,以下称为表征生物标志物的表达的“特征向量”。例如,如果为每个对象和/或像素提取M个特征,则每个对象和/或像素可以由M维特征向量表征。对象识别器110的输出实际上是标注感兴趣的对象和像素的位置并将那些对象和像素与描述对象或像素的特征向量相关联的图像的映射。由对象识别器110提取的特征至少包括足以区分用人类CD3生物标志物特异性试剂组织化学染色的图像中的CD3+细胞和CD3-细胞的特征或特征向量。
图像分析***100还可以将图像传递给ROI生成器111。ROI生成器111用于识别将从其计算免疫环境评分的图像的一个ROI或多个ROI。在没有将对象识别器110应用于整个图像的情况下,由ROI生成器111生成的一个ROI或多个ROI也可以用于定义在其上执行对象识别器110的图像的子集。
在一个实施例中,可以通过用户接口模块112访问ROI生成器111。在用户接口模块112的图形用户界面上显示生物标志物染色样品(或生物标志物染色样品的形态学染色的连续切片)的图像,并且用户对图像中被认为是ROI的一个或多个区域进行标注。在该实例中,ROI标注可以采用多种形式。例如,用户可以手动定义ROI(以下称为“手动ROI标注”)。在其他实例中,ROI生成器111可以帮助用户标注ROI(称为“半自动ROI标注”),如上文III.F部分中所述。
在一些实施例中,ROI生成器111还可以包括配准功能,由此在一组连续切片的一个切片中标注的ROI被自动转移到该组连续切片的其他切片。在分析多个生物标志物时,或者当H&E染色的连续切片与生物标志物标记的切片被一起提供时,该功能特别有用。
对象识别器110和ROI生成器111可以以任何顺序实现。例如,对象识别器110可以首先应用于整个图像。然后,当ROI生成器111被实现时,可以存储和在之后调用被识别对象的位置和特征。在这种布置中,ROI一经生成,评分引擎113可以立即生成评分。这种工作流程如图3A所示。从图3A中可以看出,获得的图像具有不同的对象(由黑色椭圆和黑色菱形表示)的混合。执行对象识别任务之后,图像中的所有菱形都被识别出来(用空心菱形表示)。当将ROI附加到图像时(由虚线表示),只有位于ROI区域中的菱形才会被包括在针对ROI的度量计算中。然后计算特征向量,包括非连续评分函数所使用的特征度量和任何附加度量,如下所述。可替代地,可以首先实现ROI生成器111。在该工作流程中,对象识别器110可以只在ROI上被实现(这将计算时间最小化),或者它仍然可以在整个图像上被实现(这将允许在不重新运行对象识别器110的情况下进行动态调整)。这种工作流程如图3B所示。从图3B中可以看出,获得的图像具有不同的对象(由黑色椭圆和黑色菱形表示)的混合。将ROI附加到图像(由虚线表示),但尚未标记任何对象。在ROI上实施对象识别任务之后,ROI中的所有菱形都被识别出来(由空心菱形表示)并被包括在针对ROI的特征度量计算中。然后计算特征向量,包括非连续评分函数所使用的一个或多个特征度量和任何附加度量。还可以同时实现对象识别器110和ROI生成器111。
在实现对象识别器110和ROI生成器111两者之后,评分引擎112被实现。评分引擎112从至少一个ROI度量(诸如ROI面积或ROI边缘的线性长度)、ROI中的对象的相关度量(诸如ROI中的CD8+细胞数)以及(如果在使用)预确定的最大和/或最小截止值和/或归一化因子计算ROI的一个或多个特征度量。在特征度量是全局度量的情况下,评分引擎112还可以包括覆盖ROI中的多个对照区域以用于计算CR度量的函数。
如图2所示,在一些实施例中,图像分析***100可以通信耦合到图像采集***120。图像采集***120可以获得样品的图像并将这些图像提供给图像分析***100以供分析和呈现给用户。
如图4所示,图像分析***可以包括用于实现各种功能的计算***400,计算***400包括处理资源410和非暂时性计算机可读介质420。非暂时性计算机可读介质420包括例如执行以下一个或多个功能的指令:获得生物样本图像422;识别图像中的相关对象424;在图像中生成ROI426;计算ROI的ROI度量426;基于ROI中的相关对象、ROI度量以及在使用的其他任选因子(诸如归一化因子和/或最大和/或最小特征值)来生成特征度量428;生成包括样品的特征度量和至少一个其他特征度量(例如,其可以是不同生物标志物的附加特征度量)的特征向量430;基于特征向量计算免疫环境评分432;以及生成包括免疫环境评分的报告434。
图像采集***120还可以包括扫描平台125,诸如能够以20x、40x或其他放大倍率扫描染色载玻片以产生高分辨率全载玻片数字图像的载玻片扫描仪,包括例如上文在IV部分讨论的载玻片扫描仪。在基本层面上,典型的载玻片扫描仪包括至少:(1)带透镜物镜的显微镜,(2)光源(诸如卤素、发光二极管、白光和/或多光谱光源,具体取决于染料),(3)可四处移动载玻片(或在载玻片周围移动光学器件)的自动装置,(4)一个或多个用于图像捕获的数码相机,(5)可控制自动装置并操纵、管理和查看数字载玻片的计算机和关联软件。载玻片上多个不同X-Y位置处(以及在某些情况下,在多个Z平面处)的数字数据由相机的电荷耦合器件(CCD)捕获,并将图像结合在一起形成整个扫描表面的合成图像。实现这一点的常用方法包括:
(1)基于平铺的扫描,其中载玻片台或光学器件以非常小的增量移动以捕获方形图像帧,这些方形图像帧与相邻的方块有轻微程度的重叠。然后将捕获的方块自动相互匹配以构建合成图像;以及
(2)基于线的扫描,其中载玻片台在采集期间沿单轴移动,以捕获多个合成图像“条”。然后可以将图像条相互匹配以形成更大的合成图像。
各种扫描仪(荧光和明场两者)的详细概述可见于Farahani等人,Whole slideimaging in pathology:advantages,limitations,and emerging perspectives,Pathology and Laboratory Medicine Int’l,第7卷,第23-33页(2015年6月),该文献的内容全文以引用方式并入本文。市售载玻片扫描仪的示例包括:3DHistech PANNORAMIC SCANII;DigiPath PATHSCOPE;Hamamatsu NANOZOOMER RS、HT和XR;Huron TISSUESCOPE 4000、4000XT和HS;Leica SCANSCOPE AT、AT2、CS、FL和SCN400;Mikroscan D2;Olympus VS120-SL;Omnyx VL4和VL120;PerkinElmer LAMINA;Philips ULTRA-FAST SCANNER;SakuraFinetek VISIONTEK;Unic PRECICE 500和PRECICE 600x;VENTANA ISCAN COREO和ISCANHt;以及Zeiss AXIO SCAN.Z1。其他示例性***和特征可见于例如WO2011-049608或于2011年9月9日提交的题为“IMAGING SYSTEMS,CASSETTES,AND METHODS OF USING THE SAME”美国专利申请号61/533,114,上述文献的内容全文以引用方式并入本文。
由扫描平台125生成的图像可以传递到图像分析***100或图像分析***100可访问的服务器或数据库。在一些实施例中,图像可以通过一个或多个局域网和/或广域网自动传递。在一些实施例中,图像分析***100可以与扫描平台125和/或图像采集***120的其他模块集成或包括在其中,在这种情况下,可以将图像传递到图像分析***,例如,通过平台125和***120两者均可访问的存储器传递。在一些实施例中,图像采集***120可能不与图像分析***100通信耦合,在这种情况下,图像可以存储在任何类型的非易失性存储介质(例如,闪存驱动器)上并从该介质下载到图像分析***100或下载到与其通信耦合的服务器或数据库。在以上实例中的任一个实例中,图像分析***100可以获得生物样品的图像,其中样品可能已经被固定到载玻片并被组织化学染色平台123染色,并且其中载玻片可能已经被载玻片扫描仪或其他类型的扫描平台125扫描。然而,应当理解,在其他实施例中,以下描述的技术也可以应用于通过其他方式获取和/或染色的生物样品的图像。
图像采集***120还可以包括自动组织化学染色平台123,诸如自动IHC/ISH载玻片染色器。自动IHC/ISH载玻片染色器通常至少包括:染色方案中使用的各种试剂的储器、与一个或多个储器流体连通的用于将试剂分配到载玻片上的试剂分配单元、用于从载玻片上去除使用的试剂或其他废物的废物移除***,以及用于协调试剂分配单元和废物清除***的动作的控制***。除了执行染色步骤外,许多自动载玻片染色器还可以执行染色辅助步骤(或与执行此类辅助步骤的单独***兼容),包括:载玻片烘烤(用于将样品粘附到载玻片上)、脱蜡(也称为脱石蜡)、抗原修复、复染、脱水和清除以及盖玻。全文以引用方式并入本文的Prichard,Overview of Automated Immunohistochemistry,Arch Pathol LabMed.,第138卷,第1578-1582页(2014)描述了自动IHC/ISH载玻片染色器的几个具体实例及其各种特征,包括intelliPATH(Biocare Medical)、WAVE(Celerus Diagnostics)、DAKOOMNIS和DAKO AUTOSTAINER LINK 48(Agilent Technologies)、BENCHMARK(VentanaMedical Systems,Inc.)、Leica BOND和Lab Vision Autostainer(Thermo Scientific)自动载玻片染色器。此外,Ventana Medical Systems,Inc.是公开用于执行自动分析的***和方法的多项美国专利的受让人,包括美国专利号:5,650,327、5,654,200、6,296,809、6,352,861、6,827,901和6,943,029,以及美国公开专利申请号:20030211630和20040052685,它们中各自的全文以引用方式并入本文。市售染色装置通常按照以下原理之一运行:(1)打开单个载玻片染色,其中载玻片水平放置,并且试剂作为包含组织样品的载玻片表面上的潭(puddle)分配(诸如在DAKO AUTOSTAINER Link 48(Agilent Technologies)和intelliPATH(Biocare Medical)染色器上实现);(2)液体覆盖技术,其中试剂被沉积在样品上的惰性流体层覆盖或通过沉积在样品上的惰性流体层分配(诸如在VENTANABenchMark和DISCOVERY染色器上实现);(3)毛细间隙染色,其中将载玻片表面放置靠近另一个表面(其可能是另一个载玻片或盖板)以形成狭窄的间隙,毛细管力通过该间隙吸引液体试剂并使液体试剂与样品接触(诸如DAKO TECHMATE、Leica BOND和DAKO OMNIS染色器所使用的染色原理)。毛细管间隙染色的一些迭代不会将间隙中的流体混合(诸如,在DAKOTECHMATE和Leica BOND上)。在称为动态间隙染色的毛细管间隙染色的变体中,使用毛细管力将样品施加到载玻片上,然后将平行表面彼此相对平移以在孵育期间搅动试剂以实现试剂混合(诸如,在DAKO OMNIS载玻片染色器(Agilent)上实施的染色原理)。在平移间隙染色中,可平移头部位于载玻片上。该头部的下表面与载玻片间隔开足够小的第一间隙,以允许在载玻片平移期间由载玻片上的液体形成液体弯液面。横向尺寸小于载玻片宽度的混合延伸部从可平移头部的下表面延伸以在混合延伸部和载玻片之间限定小于第一间隙的第二间隙。在头部平移期间,混合延伸部的横向尺寸足以在载玻片上的液体中产生沿基本上从第二间隙延伸到第一间隙的方向的横向运动。参见WO 2011-139978 A1。最近有提议使用喷墨技术在载玻片上沉积试剂。参见WO 2016-170008 A1。染色技术列表并不旨在全面,并且可以将用于执行生物标记物染色的任何全自动或半自动***整合到组织化学染色平台123中。
图像采集***120还可以包括自动H&E染色平台124。用于执行H&E染色的自动化***通常按照以下两种染色原理之一运行:批量染色(也称为“浸泡”)或单独载玻片染色。批量染色器通常使用在其中同时浸入许多载玻片的桶或槽。另一方面,单独载玻片染色器直接将试剂施加至每个载玻片,并且没有两个载玻片共享相同等分的试剂。市售的H&E染色器的实例包括:来自罗氏公司的VENTANA SYMPHONY(单独载玻片染色器)和VENTANA HE 600(单独载玻片染色器)系列H&E染色器;来自Agilent Technologies的Dako CoverStainer(批量染色器);来自Leica Biosystems Nussloch GmbH的Leica ST4020小型线性染色器(批量染色器)、Leica ST5020多级染色器(批量染色器)和Leica ST5010自动染色器XL系列(批量染色器)H&E染色器。H&E染色平台124通常用于需要一个或多个生物标志物染色切片的形态学染色连续切片的工作流程中。
免疫环境评分***可进一步包括实验室信息***(LIS)130。LIS 130通常执行选自以下的一个或多个功能:记录和跟踪对样品和源自样品的载玻片和图像执行的过程,指示免疫环境评分***的不同部件对样品、载玻片和/或图像执行特定过程,以及跟踪有关应用于样品和/或载玻片的特定试剂的信息(诸如批号、失效日期、分配的体积等)。LIS 130通常至少包括:包含有关样品的信息的数据库;与样品、载玻片和/或图像文件相关联的标签(诸如条形码(包括1维条形码和2维条形码)、射频识别(RFID)标签、贴在样品上的字母数字代码等);以及读取样品或载玻片上的标签和/或在LIS 130和免疫环境评分***的其他部件之间传送关于载玻片的信息的通信设备。因此,例如,通信设备可以放置在样品处理工位、自动组织化学染色器123、H&E染色平台124和扫描平台125中的每一个处。当样品最初被处理成切片时,有关样品的信息(诸如患者ID、样品类型、要在一个或多个切片上执行的过程)可以输入到通信设备中,并为每个从样品中产生的切片创建标签。在每个后续工位处,将标签输入通信设备中(诸如通过扫描条形码或RFID标签或通过手动输入字母数字代码),并且工位与数据库进行电子通信以例如指示工位或工位操作者对切片执行特定过程和/或记录对切片执行的过程。在扫描平台125处,扫描平台125还可以用计算机可读标签或代码对每个图像进行编码,所述计算机可读标签或代码与从其得出图像的切片或样品相关联,使得当图像被发送到图像分析***100时,要执行的图像处理步骤可以从LIS 130的数据库发送到图像分析***和/或由图像分析***100对图像执行的图像处理步骤由LIS 130的数据库记录。可用于本发明的方法和***的市售LIS***包括例如VENTANA VantageWorkflow***(Roche)。
V.综上所述,特别地设想如下实施例
实施例1.一种治疗患有IV期结直肠癌的受试者的方法,所述方法包括:
(a)通过以下方式从收集自所述受试者的结直肠肿瘤的组织样品中获得免疫环境评分(ICS):
(i)识别来自所述受试者的肿瘤的测试样品的肿瘤核心(CT)感兴趣区域(ROI);
(ii)检测所述ROI的至少一部分中的CD8+细胞;以及
(iii)获得所述ROI内的CD8+细胞密度以计算所述ICS;以及
(b)基于所述ICS为所述受试者选择治疗。
实施例2.根据实施例1所述的方法,其中所述IV期结直肠癌已被诊断为具有缺陷性DNA错配修复和/或微卫星不稳定性(MSI)。
实施例3.根据实施例1或2所述的方法,其中:
(b1)如果所述ICS低,则选择包括完全过程的辅助化疗和任选的检查点抑制剂导向疗法的治疗;并且
(b2)如果所述ICS高,则选择包括检查点抑制剂导向疗法和任选的过程缩减的辅助化疗的治疗。
实施例4.根据实施例3所述的方法,其中(b2)不包括辅助化疗。
实施例5.根据实施例3所述的方法,其中(b2)的所述任选的辅助化疗相对于不存在检查点抑制剂导向疗法的化疗方案在持续时间、剂量或毒性方面缩减。
实施例6.根据实施例3所述的方法,其中所述检查点抑制剂导向疗法包括PD-1轴导向疗法。
实施例7.根据实施例3中任一项所述的方法,其中所述检查点抑制剂导向疗法包括PD-1或PD-L1导向疗法。
实施例8.根据实施例6或7所述的方法,其中所述检查点抑制剂导向疗法选自纳武单抗、派姆单抗、西米普利单抗、替雷利珠单抗、斯巴达珠单抗、MEDI0680、JS001、IBI308、JNJ-63723283、阿特珠单抗、德瓦鲁单抗和阿维单抗。
实施例9.根据实施例1所述的方法,其中所述CD8+细胞密度为通过将所述ROI中检测到的细胞数量除以所述ROI的面积得到的面积细胞密度。
实施例10.根据实施例1所述的方法,其中所述CD8+细胞密度源自所述ROI的多个对照区域的平均值或中值面积细胞密度。
实施例11.根据实施例1至10中任一项所述的方法,其中步骤(a)(ii)进一步包括检测所述ROI的至少一部分中的CD3+细胞,并且其中基于所述CD8+细胞密度和所述CD3+细胞密度的组合计算所述ICS。
实施例12.根据实施例1至10中任一项所述的方法,其中:
将所述ROI标注在所述样品的第一个连续切片的数字图像上,所述第一个连续切片用苏木精和伊红(H&E)染色;并且
(a)的计算包括:
将第一个ROI配准到所述样品的第二个连续切片的数字图像,将所述第二个连续切片针对人类CD8进行组织化学染色;以及
从配准到所述第二个连续切片的数字图像的所述ROI计算人类CD8+细胞的密度。
实施例13.根据实施例12所述的方法,其中(a)的计算进一步包括:
将所述第一个ROI配准到所述样品的第三个连续切片的数字图像,将所述第三个连续切片针对人类CD3进行组织化学染色;以及
从配准到所述第三个连续切片的数字图像的ROI计算人类CD3+细胞的密度。
实施例14.根据实施例12或13所述的方法,其中标注多个ROI,其中至少一个ROI包括CT区域的一部分并且单独的ROI包括所述IM区域的一部分。
实施例15.一种计算机实现方法,其包括使计算机处理器执行存储在存储器上的一组计算机可执行功能,所述一组计算机可执行功能包括:
(a)获得IV期结直肠肿瘤的至少一个组织切片的数字图像;以及
(b)对所述数字图像执行根据实施例1至14中任一项所述的方法。
实施例16.一种用于对组织样品的免疫环境进行评分的***,所述***包括:
(a)处理器;和
(b)耦合到所述处理器的存储器,所述存储器存储计算机可执行指令,当所述计算机可执行指令由所述处理器执行时使所述处理器进行包括根据实施例1至14中任一项所述的方法的操作。
实施例17.根据实施例16所述的***,进一步包括扫描仪或显微镜,所述扫描仪或所述显微镜适于捕获所述组织样品的切片的数字图像并将所述图像传送至计算机设备。
实施例18.根据实施例16或17所述的***,进一步包括自动载玻片染色器,所述自动载玻片染色器编程为针对所述CD8和所述CD3标志物对所述组织样品的一个或多个切片进行组织化学染色。
实施例19.根据实施例18所述的***,进一步包括自动苏木精和伊红染色器,所述自动苏木精和伊红染色器编程为对由所述自动载玻片染色器染色的切片中的一个或多个连续切片染色。
实施例20.根据实施例16至19中任一项所述的***,进一步包括用于跟踪样品和图像工作流程的实验室信息***(LIS),所述LIS包括中央数据库,所述中央数据库被配置成接收和存储与所述组织样品相关的信息,所述信息包括以下中的至少一项:
(a)要对所述肿瘤组织样品实施的处理步骤,
(b)要对所述肿瘤组织样品的切片的数字图像实施的处理步骤,以及
(c)所述肿瘤组织样品和数字图像的处理历史记录。
实施例21.一种用于存储由处理器执行以进行操作的计算机可执行指令的非暂时性计算机可读存储介质,所述操作包括根据实施例1至14中任一项所述的方法。
实施例22.一种用于从收集自IV期结直肠肿瘤的组织样品中获得免疫环境评分(ICS)的方法,所述方法包括
(i)识别所述组织样品的肿瘤核心(CT)感兴趣区域(ROI);
(ii)检测所述ROI的至少一部分中的CD8+细胞;以及
(iii)获得所述ROI内的CD8+细胞的密度以计算所述ICS。
实施例23.一种计算机实现方法,其包括使计算机处理器执行存储在存储器上的一组计算机可执行功能,所述一组计算机可执行功能包括:
(A)获得IV期结直肠肿瘤的组织切片的数字图像,其中所述组织切片针对至少人类CD8进行组织化学染色;
(B)在所述数字图像中标注一个或多个感兴趣区域(ROI),所述ROI包括肿瘤核心(CT);以及
(C)对所述ROI应用评分函数,其中所述评分函数包括计算包含所述CT中的CD8+细胞的密度的特征向量以获得针对所述组织切片的免疫环境评分。
实施例24.一种方法,其包括:
(a)在肿瘤组织切片的数字图像上标注一个或多个感兴趣区域(ROI),其中所述ROI中的至少一个包括肿瘤核心(CT)区域的至少一部分;
(b)检测和定量所述ROI中的表达人类CD8的细胞;
(c)计算所述ROI内的CD8+细胞的密度,并且任选地将所述CD8+细胞密度或肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)细胞密度归一化至所述特征向量以获得针对所述肿瘤的免疫环境评分(ICS)。
实施例25.根据实施例22至24中任一项所述的方法,其中在步骤(i)之前用人类CD8蛋白生物标志物特异性试剂与适当的检测试剂组合来标记对所述组织样品的组织切片。
实施例26.一种用于从收集自IV期结直肠肿瘤的人类组织样品中获得免疫环境评分(ICS)的方法,所述方法包括
(i)用人类CD8蛋白生物标志物特异性试剂组合适当的检测试剂来标记所述组织样品的组织切片;
(ii)识别所述组织样品的肿瘤核心(CT)感兴趣区域(ROI);
(iii)检测所述ROI的至少一部分中的CD8+细胞;以及
(iv)获得所述ROI内的CD8+细胞的密度以计算所述ICS。
实施例27.根据实施例22至26中任一项所述的方法,其中所述CD8+细胞的密度是面积密度或线性密度。
实施例28.根据实施例22至27中任一项所述的方法,其中所述ICS在一实施例中对应于所述ROI内的归一化CD8+细胞密度,在一实施例中对应于在应用一个或多个归一化因子、最大截止值和/或最小截止值之后所述ROI内的所述归一化CD8+细胞密度。
实施例29.根据实施例22至28中任一项所述的方法,其中所述ICS用于确定免疫检查点导向疗法是否适用。
实施例30.根据实施例22至29中任一项所述的方法,其中所述方法进一步包括检测CD3+细胞并获得所述ROI内的CD3+细胞密度,并且其中任选地,基于所述CD8+细胞密度和所述CD3+细胞密度的组合计算所述ICS。
实施例31.根据实施例22至30中任一项所述的方法,其中所述方法进一步包括确定DNA错配修复(MMR)状态。
实施例32.根据实施例22至31中任一项所述的方法,其中所述确定MMR状态包括确定hPMS2基因、hMLH1基因、hMSH2基因和hMSH6基因的表达和/或甲基化状态。
实施例33.根据实施例31或32所述的方法,其中具有根据实施例32中指定的基因中的任一种基因的缺陷性表达的组织样品被确定为具有缺陷性MMR。
实施例34.根据实施例31至33中任一项所述的方法,其中所述确定MMR状态包括通过基于蛋白质的测定法、在一实施例中通过免疫测定法、在又一实施例中通过固相酶免疫测定法或免疫组织化学测定法来确定表达;或者通过聚合酶链反应(PCR)测定法、在一实施例中通过实时逆转录酶PCR测定法来确定表达。
实施例35.根据实施例22至35中任一项所述的方法,其中所述方法进一步包括确定微卫星不稳定性(MSI)。
实施例36.根据实施例22至35中任一项所述的方法,其中手动、半自动或自动地识别所述ROI,在一实施例中自动地识别所述ROI。
实施例37.一种用于确定免疫检查点导向疗法是否适用于患有具有缺陷性错配修复(dMMR)的IV期结直肠癌的患者的方法,包括根据实施例22至36中任一项所述的方法获得免疫环境评分(ICS),以及在确定高ICS的情况下确定免疫检查点导向疗法适用。
实施例38.一种在治疗患有缺陷性DNA错配修复(dMMR)IV期结直肠癌的受试者中所使用的检查点抑制剂,其中在根据实施例22至36中任一项所述的方法确定的实施例中,所述受试者具有高免疫环境评分(ICS)。
实施例39.根据实施例38所使用的检查点抑制剂,其中所述治疗方案包括与所述免疫检查点导向疗法组合的过程缩减的化疗。
实施例40.根据实施例39所使用的检查点抑制剂,其中所述过程缩减的化疗是缩减所用的不同化疗剂的数量、缩减一种或多种化疗剂的剂量和/或缩短用所述一种或多种化疗剂进行治疗的持续时间;和/或包括选择相对于其他化疗剂具有较低毒性特征的化疗剂以用于治疗IV期结直肠癌。
实施例41.根据实施例37至40中任一项所述的主题,其中所述检查点抑制剂是靶向PD-1、PD-L1、CTLA-4或IDO的检查点抑制剂,在一实施例中是靶向PD-1或PD-L1的检查点抑制剂。
实施例42.根据实施例37至41中任一项所述的主题,其中所述检查点抑制剂是派姆单抗、纳武单抗、西米普利单抗、替雷利珠单抗、斯巴达珠单抗、MEDI0680、JS001、IBI308、JNJ-63723283、阿特珠单抗、德瓦鲁单抗、阿维单抗、伊匹木单抗或NLG919,在一实施例中是派姆单抗、纳武单抗、西米普利单抗、替雷利珠单抗、斯巴达珠单抗、MEDI0680、JS001、IBI308、JNJ-63723283、阿特珠单抗、德瓦鲁单抗或阿鲁单抗,在又一实施例中是派姆单抗。
实施例43.一种用于对肿瘤组织样品的免疫环境进行评分的***,所述***包括至少计算机处理器和存储器,其中所述存储器存储将由所述计算机处理器执行的一组计算机可执行指令,所述一组计算机可执行指令包括根据提及方法的前述实施例中任一项所述的方法。
VI.实验例
VI.A.患者和方法
识别了十二名患有dMMR转移性结直肠癌(mCRC)的患者,他们接受了派姆单抗(每3周静脉注射10mg/Kg的剂量)治疗。审查电子病历以获得有关患者和肿瘤特征、MMR检测结果、KRAS和BRAF状态、先前治疗方案和派姆单抗治疗反应数据(最佳反应、最佳反应时间、周期数、疾病控制持续时间)的信息。使用国家癌症研究所实体瘤反应评估标准(RECIST)1.1版标准评估肿瘤反应。参见Eisenhauer等人(2009)。
如前所述,已经通过针对MMR蛋白(MLH1、MSH2、MSH6、PMS2)的免疫组织化学(IHC)或使用针对微卫星不稳定性(MSI)的基于PCR的测定法分析了肿瘤组织中的DNA错配修复(MMR)状态。参见Sinicrope等人(2013)。在***固定和石蜡包埋的肿瘤组织中,通过免疫组织化学分析(VENTANA BenchMark ULTRA自动染色器;Ventana Medical Svstems,Inc.)执行CD3+和CD8+T淋巴细胞染色。
简而言之,扫描H&E染色的切片以及免疫染色的载玻片。独立病理学家使用全肿瘤切片方法手动标注H&E切片,以勾勒出包含侵袭性癌症的全肿瘤区域的轮廓(即,肿瘤核心;CT)。他们通过指示侵袭过程中涉及的肿瘤轮廓的切片,在不了解临床特征或结果的情况下进一步划定了侵袭边缘(IM)。配准算法(Sarkar等人2014)自动将来自病理学家的标注从H&E转移到相邻的CD3和CD8 IHC图像上。
根据IM划定,算法自动生成IM区域,即延伸到肿瘤核心中0.5mm并超出肿瘤1.0mm。全自动计算机视觉和细胞分类(Lorsakul等人2018)在CT和IM区域中捕获CD3阳性和CD8阳性细胞,其中算法参数固定用于研究中的所有载玻片。采用多个质量步骤来确保组织载玻片、数字图像、配准和细胞检测的保真度。数字图像分析报告了两个观察到的区室中检测到的T细胞的组织面积和数量。通过图像分析量化并归一化IM和CT处的CD3+和CD8+TIL密度以建立半连续密度评分(0-100标度)。
在对患者结果不知情的情况下执行TIL分析。半连续密度评分(0-100标度)的计算在肿瘤核心和侵袭边缘处确定CD3和CD8计数。通过将计数除以其肿瘤区室的面积来计算每个标志物(CD3+IM、CD3+CT、CD8+IM、CD8+CT)的密度。鉴于密度分布的潜在右偏,通过截断大密度来建立具有生物学意义的最大值,如下所示:(i),密度值从零开始以250个细胞/mm2的增量步长进行分类;(ii),识别出具有最高密度值的患者(“边缘效应”组);(iii),识别出代表“边缘效应”组的截止值的密度值;(iV),将与“边缘效应”截止值对应的增量步长建立为截断值。大于该截断值的密度被分配截断值。然后将密度值标准化以生成范围为从0到100的密度评分:
如前所述,当IHC结果不确定时,通过免疫组织化学分析(IHC)或通过MSI测试来确定MMR肿瘤状态(Sinicrope等人2013)。具有dMMR表型的肿瘤被定义为通过IHC显示出1个或多个MMR蛋白的表达缺失或在通过聚合酶链反应(PCR)进行的MSI测试中表现出高水平的肿瘤DNA MSI。使用QIAamp DNA Mini Kit(Qiagen)从***固定石蜡包埋的其中包含超过50%的肿瘤细胞的组织样本中提取肿瘤DNA。
对于基线特征的比较,用χ2检验分析分类因子,并且用Wilcoxon秩和检验比较连续因子。对于每个T细胞亚型,使用中值成对差异(Wilcoxon Sign Rank检验)比较肿瘤区室之间的密度。Cox回归模型用于估计风险比(HR)和95%置信区间(CI)并计算P值。分别在每个MMR组中进行分析。在单变量和多变量分析中,将每个免疫变量(CD3+IM、CD3+CT、CD8+IM和CD8+CT)作为关于总生存期(OS)的连续变量进行分析。协变量被预先指定为T3或T4(对比T1-2)、N2(对比N1)、高级别(对比低级别)、肿瘤左侧(对比右侧)、曾经吸烟(对比从不吸烟)和每5年增加一次的年龄。在任一MMR组中的OS上的任何两个免疫标志物之间的调整分析中均未观察到相互作用。然后将在调整常见临床病理学特征的P<0.10时证明与OS相关联的任何个体免疫变量包括在后向选择模型中。对于后向选择后与OS具有统计学意义关联性的免疫变量,使用Cox模型风险比和Wald P值方法识别出区分OS的最佳截止点。OS被定义为随机化和任何原因引起的死亡之间的时间。复发时间(TTR;即,随机化与局部或转移性肿瘤复发之间的时间)被分析为二级终点。报告了两侧P值;P<0.05被认为具有统计学意义。使用SAS软件(v9.4,SAS Institute Inc.)进行分析。
VI.B.结果
表1总结了患者和肿瘤特征、先前治疗的详细信息以及派姆单抗反应数据。先前接受的化疗方案的中位数为1(范围位1到4,7名患者中为一,3名患者中为2,并且2名患者中为4)。自派姆单抗开始以来,研究群中的中值随访时间为19.5个月(范围为9到41)。通过RECIST 1.1版确定的患者放射学反应数据如下:2个完全缓解(CR)、5个部分缓解(PR)、4个稳定疾病(SD)和1个进行性疾病(PD)。客观缓解率为58.3%(7/12)。在具有CR或PR的经派姆单抗治疗的患者(n=7)之中,中值反应时间为12周(范围为9到20)。
表1.dMMR转移性结直肠癌患者中的患者特征、治疗和反应数据
缩写:M,男性;F,女性;dMMR,缺陷性DNA错配修复;PR,部分缓解;CR,完全缓解;PD,进行性疾病;SD,稳定疾病;WT,野生型;MT,突变体;抗PD-1(派姆单抗)每3周以10mg/Kg的剂量给药。UNK,未知。
a派姆单抗治疗6个月后切除了原发转移瘤和肝转移瘤。肝脏中有病理性CR。
b在治疗2年后停药派姆单抗。
c12周后PR,40周时转换为CR。在治疗2年后停药派姆单抗。
d肝脏中有病理性CR在派姆单抗治疗1年后切除肝转移瘤。
*通过基于PCR的测试确定
为了检查T细胞密度评分与治疗反应之间的关系,将患者分为对派姆单抗有反应者(CR和PR,n=7)和无反应者(SD和PD,n=5)。每个反应类别中侵袭边缘(CD3+IM、CD8+IM)和肿瘤核心(CD3+CT、CD8+CT)的CD3+和CD8+T细胞密度评分的中值和范围如图5A和表2所示。有反应者(R)的所有中值T细胞密度评分均高于无反应者(NR),其中CD3+CT(74对52)和CD8+CT(88对37)的差异最大,如图5A所示。通过将患者分为两组进行基于疾病控制持续时间的分析:大于12个月的疾病控制组;以及小于12个月的疾病控制组。基于疾病控制的持续时间的T细胞标志物的密度评分的中值数和范围如图5B和表2所示。在实现疾病控制大于12个月的患者组中,所有中值T细胞密度评分均较高,其中CD8+CT的差异最大(88对36)(图5B)。
表2:有反应者和无反应者的侵袭边缘(IM)和肿瘤核心(CT)处的CD3+和CD8+密度评分以及疾病控制的持续时间
在有反应者和无反应者之中,肿瘤细胞上的中值PD-L1表达分别为2%(范围,1到40)和1%(范围,0到60)。肿瘤内免疫细胞中的中值PD-L1表达在有反应者(范围,2到25)和无反应者(范围1到10)之中相似,为5%。
总之,与无反应者相比,作为对派姆单抗有反应者的患有mCRC的患者的dMMR肿瘤中CD3+和CD8+T细胞密度更高。这些数据表明了二分法T细胞标志物密度与肿瘤反应性的潜在关联性,这可以部分地解释dMMR mCRC中对抗PD-1抗体的不同反应性。
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Claims (27)
1.一种用于从收集自IV期结直肠肿瘤的人类组织样品中获得免疫环境评分(ICS)的方法,所述方法包括
(i)用人类CD8蛋白生物标志物特异性试剂组合适当的检测试剂来标记所述组织样品的组织切片;
(ii)识别所述组织样品的肿瘤核心(CT)感兴趣区域(ROI);
(iii)检测所述ROI的至少一部分中的CD8+细胞;以及
(iv)获得所述ROI内的CD8+细胞的密度以计算所述ICS。
2.根据权利要求1所述的方法,其中所述ICS对应于,在一实施方案中是所述ROI内的归一化CD8+细胞密度,在一实施方案中是在应用一个或多个归一化因子、最大截止值和/或最小截止值之后所述ROI内的所述归一化CD8+细胞密度。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其中所述ICS用于确定是否显示需要免疫检查点导向疗法作为治疗。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法,其中所述方法进一步包括检测CD3+细胞并获得所述ROI内的CD3+细胞密度,并且其中任选地,基于所述CD8+细胞密度和所述CD3+细胞密度的组合计算所述ICS。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法,其中所述方法进一步包括确定DNA错配修复(MMR)状态。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法,其中所述确定MMR状态包括确定hPMS2基因、hMLH1基因、hMSH2基因和hMSH6基因的表达和/或甲基化状态。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法,其中所述方法进一步包括确定微卫星不稳定性(MSI)。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法,其中手动、半自动或自动地识别所述ROI,在一实施方案中自动地识别所述ROI。
9.一种用于确定对于患有具有缺陷性错配修复(dMMR)的IV期结直肠癌的患者是否显示需要免疫检查点导向疗法作为治疗的方法,所述方法包括依据根据权利要求1至8中任一项所述的方法获得免疫环境评分(ICS),以及在确定高ICS的情况下确定显示需要免疫检查点导向疗法作为治疗。
10.一种在治疗患有缺陷性DNA错配修复(dMMR)IV期结直肠癌的受试者中所使用的检查点抑制剂,其中所述受试者具有高免疫环境评分(ICS),一个实施方案中依据根据权利要求1至8中任一项所述的方法确定的。
11.根据权利要求10所使用的检查点抑制剂,其中所述治疗包括与所述免疫检查点导向疗法组合的过程缩减的化疗。
12.根据权利要求11所使用的检查点抑制剂,其中所述过程缩减的化疗是缩减所用的不同化疗剂的数量、缩减一种或多种化疗剂的剂量和/或缩短用所述一种或多种化疗剂进行治疗的持续时间;和/或包括选择相对于其他化疗剂具有较低毒性特征的化疗剂以用于治疗IV期结直肠癌。
13.根据权利要求9至12中任一项所述的主题,其中所述检查点抑制剂是靶向PD-1、PD-L1、CTLA-4或1DO的检查点抑制剂,在一实施方案中是靶向PD-1或PD-L1的检查点抑制剂。
14.根据权利要求9至13中任一项所述的主题,其中所述检查点抑制剂是派姆单抗、纳武单抗、西米普利单抗、替雷利珠单抗、斯巴达珠单抗、MEDI0680、JS001、IBI308、JNJ-63723283、阿特珠单抗、德瓦鲁单抗、阿维单抗、伊匹木单抗或NLG919,在一实施方案中是派姆单抗、纳武单抗、西米普利单抗、替雷利珠单抗、斯巴达珠单抗、MEDI0680、JS001、IBI308、JNJ-63723283、阿特珠单抗、德瓦鲁单抗或阿维单抗,在又一实施方案中是派姆单抗。
15.一种用于对肿瘤组织样品的免疫环境进行评分的***,所述***包括至少计算机处理器和存储器,其中所述存储器存储将由所述计算机处理器执行的一组计算机可执行指令,所述一组计算机可执行指令包括根据权利要求1至9中任一项所述的方法。
16.一种用于从收集自IV期结直肠肿瘤的组织样品中获得免疫环境评分(ICS)的方法,所述方法包括
(i)识别所述组织样品的肿瘤核心(CT)感兴趣区域(ROI);
(ii)检测所述ROI的至少一部分中的CD8+细胞;以及
(iii)获得所述ROI内的CD8+细胞的密度以计算所述ICS。
17.一种计算机实现方法,其包括使计算机处理器执行存储在存储器上的一组计算机可执行功能,所述一组计算机可执行功能包括:
(A)获得IV期结直肠肿瘤的组织切片的数字图像,其中所述组织切片针对至少人类CD8进行组织化学染色;
(B)在所述数字图像中标注一个或多个感兴趣区域(ROI),所述ROI包括肿瘤核心(CT);以及
(C)对所述ROI应用评分函数,其中所述评分函数包括计算包含所述CT中的CD8+细胞的密度的特征向量以获得针对所述组织切片的免疫环境评分。
18.一种方法,其包括:
(a)在肿瘤组织切片的数字图像上标注一个或多个感兴趣区域(ROI),其中所述ROI中的至少一个包括肿瘤核心(CT)区域的至少一部分;
(b)检测和定量所述ROI中的表达人类CD8的细胞;
(c)计算所述ROI内的CD8+细胞的密度,并且任选地将所述CD8+细胞密度或肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)细胞密度归一化至所述特征向量以获得针对所述肿瘤的免疫环境评分(ICS)。
19.一种治疗患有IV期结直肠癌的受试者的方法,所述方法包括:
(a)通过以下方式从收集自所述受试者的结直肠肿瘤的组织样品中获得免疫环境评分(ICS):
(i)识别来自所述受试者的肿瘤的测试样品的肿瘤核心(CT)感兴趣区域(ROI);
(ii)检测所述ROI的至少一部分中的CD8+细胞;以及
(iii)获得所述ROI内的CD8+细胞密度以计算所述ICS;以及
(b)基于所述ICS为所述受试者选择治疗。
20.根据权利要求19所述的方法,其中所述IV期结直肠癌已被诊断为具有缺陷性DNA错配修复和/或微卫星不稳定性(MSI)。
21.一种计算机实现方法,其包括使计算机处理器执行存储在存储器上的一组计算机可执行功能,所述一组计算机可执行功能包括:
(a)获得IV期结直肠肿瘤的至少一个组织切片的数字图像;以及
(b)对所述数字图像执行根据权利要求1至9和16至18中任一项所述的方法。
22.一种用于对组织样品的免疫环境进行评分的***,所述***包括:
处理器;和
耦合到所述处理器的存储器,所述存储器存储计算机可执行指令,
当所述计算机可执行指令由所述处理器执行时使所述处理器进行包括根据权利要求1至9和16至18中任一项所述的方法的操作。
23.根据权利要求22所述的***,其进一步包括扫描仪或显微镜,所述扫描仪或所述显微镜适于捕获所述组织样品的切片的数字图像并将所述图像传送至计算机设备。
24.根据权利要求22或23所述的***,其进一步包括自动载玻片染色器,所述自动载玻片染色器编程为针对CD8和CD3标志物对所述组织样品的一个或多个切片进行组织化学染色。
25.根据权利要求24所述的***,其进一步包括自动苏木精和伊红染色器,所述自动苏木精和伊红染色器编程为对由所述自动载玻片染色器染色的所述切片中的一个或多个连续切片染色。
26.根据权利要求22至25中任一项所述的***,其进一步包括用于跟踪样品和图像工作流程的实验室信息***(LIS),所述LIS包括中央数据库,所述中央数据库配置成接收和存储与所述组织样品相关的信息,所述信息包括以下中的至少一项:
(a)要对所述肿瘤组织样品实施的处理步骤,
(b)要对所述肿瘤组织样品的切片的数字图像实施的处理步骤,以及
(c)所述肿瘤组织样品和数字图像的处理历史记录。
27.一种用于存储由处理器执行以进行操作的计算机可执行指令的非暂时性计算机可读存储介质,所述操作包括根据权利要求1至9和16至18中任一项所述的方法。
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Legal Events
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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