CN113444741A - 下调表达Bna-miR168a在改良油菜性状中应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种下调表达Bna‑miR168a在改良油菜性状中应用。本发明揭示了Bna‑miR168a与油菜的籽粒产量、生物产量、粒果比、收获指数、角果数、二次有效分支数形状密切相关，下调Bna‑miR168a的表达量可增加油菜的籽粒产量、生物产量、粒果比、收获指数、角果数、二次有效分支数等。因此，Bna‑miR168a或者调控Bna‑miR168a表达的物质和方法可应用于实现植物品种的改良。

Description

下调表达Bna-miR168a在改良油菜性状中应用
技术领域
本发明涉及植物基因工程领域，具体涉及下调表达Bna-miR168a在改良油菜性状中应用。
背景技术
作为世界上主要的三大油料作物之一，油菜是我国种植面积最大的油料作物。但是作为一种以收获籽粒为主的经济作物，相较于水稻和花生等具有50％以上收获指数的作物，油菜栽培品种的收获指数却只有20-30％，因此提高油菜收获指数对提高其产量显得尤为重要。在影响收获指数的“源、流、库”三因素中，油菜有充足的源和库，因此研究流-即光合同化物的转运和分配成为提高油菜收获指数的突破口。油菜青荚期的光合作用可为籽粒产量提供50％以上的光合产物，角果皮中蔗糖磷酸合酶等的活性影响淀粉和糖分的转换，改变角果皮向籽粒中物质传输的强度，影响粒果比最终形成高收获指数性状。
本发明在前期研究中，将粒果比(油菜籽粒干重占角果干重的比值)和千粒重(每千粒油菜籽粒的干重)作为反映油菜角果光合产物转化效率高低的目标性状，连续三年对588份重测序群体材料的粒果比和千粒重性状进行关联分析，结合极端材料的转录组和小RNA测序分析结果，共筛选出可能与油菜角果光合产物高效转运相关的12个候选基因和9个候选的差异表达miRNA，其中bna-miR168a在极端材料中存在极显著差异，综合考虑miR168的特殊性以及光合产物转运过程的复杂性，最终选择可能调控范围较大的bna-mi168a作为主要候选miRNA进行功能研究。目前有关miRNA的报道主要集中在拟南芥、毛果杨和水稻等模式植物上，在甘蓝型油菜中的研究很少，因此研究miRNA对甘蓝型油菜生长发育过程中的调控机理，尤其是针对油菜中复杂的数量性状的研究对油菜的遗传改良育种有非常重要的意义。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种下调表达Bna-miR168a在改良油菜性状中应用；本发明的目的之二在于提供一种提高油菜籽粒产量的方法。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
1、下调表达Bna-miR168a在改良油菜性状中应用，其特征在于：所述改良油菜性状为：提高籽粒产量；提高生物产量；提高粒果比；提高收获指数；增加角果数；降低一次有效分支高度；提高二次有效分支数。
本发明中优选的，所述下调表达Bna-miR168a是基于target mimicry技术构建Bna-miR168a的沉默体，特异性下调Bna-miR168a成熟序列的表达。
本发明中优选的，所述油菜为甘蓝型油菜。
2、一种提高油菜籽粒产量的方法，其特征在于，所述方法包括：下调油菜中Bna-miR168a成熟序列的表达。
本发明中优选的，所述下调油菜中Bna-miR168a成熟序列的表达为基于targetmimicry技术构建Bna-miR168a的沉默体。
本发明中优选的，所述基于target mimicry技术构建Bna-miR168a的沉默体包括：
(1)将mimicry Bna-miR168a序列置于IPS1基因序列中，获得MIM168a序列片段；
(2)将MIM168a序列片段转入油菜中，获得转基因油菜，其为性状改良的油菜。
本发明中优选的，步骤(1)中，所述MIM168a序列如SQE ID NO.11所示。
本发明中优选的，所述油菜为甘蓝型油菜。
本发明的有益效果在于：甘蓝型油菜中干扰表达bna-miR168a与受体ZS11相比，干扰表达植株长势旺盛，植株分枝较多，单株角果数较多，生物产量、籽粒产量、粒果比和收获指数等性状均显著较高。同时证实了BnAGO1的三个成员是bna-miR168a的靶基因，bna-miR168a负向调控BnAGO1的表达水平，bna-miR403、bna-miR164A、bna-miR156b和bna-miR396a也同样受到bna-miR168a不同程度的调控。bna-miR168a可通过靶向负调控AGO1，影响AGO1与其他miRNA结合形成RNA沉默诱导复合体(RNA-induced silencing complex,RISC)，“bnamiR168a-AGO1”的改变同时介导“bnamiR156b-SPL”、“bnamiR396a-GRF”及其它“bnamiRNAs-Targets”的表达量进而对植株的花期、分枝数和籽粒产量等性状产生影响，最终影响植株的粒果比和收获指数等产量性状。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为bna-miR168a目的片段的PCR检查图(A)及bna-miR168a连接到入门载体pENTR-D-TOPO后的菌液检测图(B)；
图2为AtIPS1两个目的片段的PCR检测图(A)；拟南芥AtIPS1目的片段定向改造后检测图(B)；MIM168a连接到入门载体pENTR-D-TOPO后的菌液检测图(C)；
图3为重叠PCR构建MIM168a目的片段示意图；
图4为BnamiR168a(A、B)和MIM168a(C、D)目的片段连接到表达载体pEarleyGate101后的菌液PCR检测图；
图5为甘蓝型油菜中过表达bna-miR168a纯合阳性株系的筛选(A、B分别为Basta喷洒处理6天和12天后的植株；ZS11材料竖线左侧为未喷Basta的对照，竖线右侧为喷Basta的处理)；
图6为bna-miR168a(A)和bna-MIR168a(B)在转基因油菜与ZS11中的相对表达量；
图7为靶基因BnAGO1在转基因油菜植株与ZS11中的相对表达量；
图8为甘蓝型油菜ZS11材料和过表达bna-miR168a株系(A)及单株(B)移栽90天后的表型；
图9为中双11和bna-miR168a过表达植株花器官的扫描电子显微镜照片及其光学显微镜下花粉活力的检测(ZS11代表受体中双11材料，OE168a代表过表达植株，A为体式显微镜下的照片，B-E为扫描电子显微镜下的照片，e为光学显微镜下花粉活力检测照片。A为去除花瓣和萼片的花器官，B为40倍下的雌蕊，C为90倍下的雌蕊柱头，D为花药，E为花粉，e为亚历山大染液处理后的花粉)；
图10为甘蓝型油菜ZS11材料和过表达、干扰表达bna-miR168a株系(A)和单株(B)移栽110天后的表型及其表型统计(C、D、E)；
图11为甘蓝型油菜ZS11材料和过表达、干扰表达bna-miR168a植株(A)收获期的表型及其表型统计(B单株籽粒产量、C生物产量、D粒果比、E收获指数)；
图12为Bna-miR164A(A)、Bna-miR403(B)、Bna-miR156b(C)和Bna-miR396a(D)在bna-mi168a转基因油菜和ZS11植株中的相对表达量；
图13为拟南芥中异源过表达和干扰表bna-miR168a纯合阳性株系的筛选；
图14为bna-miR168a(A)和bna-MIR168a(B)在转基因植株与野生型中的相对表达量；
图15为靶基因AtAGO1在转基因拟南芥与野生型中的相对表达量；
图16为种子点播18(A)、23(B)、26(C)天后的转基因和野生型拟南芥的表型；
图17为种子点播32(A)和40(C)天后的转基因和野生型植株的表型及其抽薹(B)和开花时间(D)统计；
图18为转基因和野生型拟南芥荚果发育(A)、起始胚胎数(B)和每角果粒数(C)的表型观察；
图19为成熟期转基因和野生型拟南芥植株的角果长度(A)及统计分析(B)；
图20为收获期转基因植株与野生型拟南芥的表型(A)及其统计分析(B)；
图21为种子点播34天后转基因和野生型拟南芥叶片中叶绿素(A)和生长素(B)含量；
图22为异源过表达bna-miR168a和野生型拟南芥花器官各个部位的扫描电子显微镜照片及其光学显微镜下花粉活力的检测(WT代表野生型拟南芥植株，OE168a代表拟南芥中异源过表达植株，A-E为扫描电子显微镜下的照片，c和d为光学显微镜下花粉活力检测照片。A为去除花瓣和萼片的花器官，B为100倍下的雌蕊，C为200倍下的雌蕊柱头，D为花药，E为花粉，c、d分别为亚历山大染液处理后的柱头和花药)；
图23为bna-miR164A(A)、bna-miR403(B)、bna-miR156b(C)、bna-miR369a(D)在转基因和野生型拟南芥植株中的相对表达量。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例1、甘蓝型油菜bna-miR168a茎环序列的克隆
miRBase(http://www.mirbase.org/)数据库中搜索miRNA的茎环序列，根据其茎环序列(茎环序序列中的U替换为T)设计引物BnamiR168a-F(SEQ ID NO.1)、BnamiR168a-R(SEQ ID NO.2)，前引物的5’端加上CACC四个碱基。
以YC24材料的根、茎、叶、花、蕾及不同时期的角果皮和籽粒的混合cDNA作为模板，以引物BnamiR168a-F、BnamiR168a-R克隆bna-miR168a茎环序列的目的片段，琼脂糖凝胶电泳检测结果显示获得450bp大小左右的条带，与miRBase数据库中bna-miR168a茎环序列的大小基本一致(450bp)(图1，A)，将目的条带连接到pENTR-D-TOPO后转化大肠杆菌，进行单克隆菌液的PCR检测(图1，B)，检测引物为M13-F+M13-R(SEQ ID NO.3，SEQ ID NO.4)，然后测序得到bna-miR168a片段(SEQ ID NO.5)。
实施例2、甘蓝型油菜MIM168a片段的获得
因此本发明通过对内源性Target mimicry中的IPS1(Induced By PhosphateStarvation 1)基因进行定向改造，构造了miR168a的沉默体。人工改造后的mimicry Bna-miR168a序列(MIM168a)，对内源miR168a的表达起到负调控的作用，可用以研究干扰表达bna-miR168后对作物表型的影响。
根据拟南芥AtIPS1基因(At3G09922)CDS序列两端设计引物AtIPS1-F(SEQ IDNO.6)和AtIPS1-R(SEQ ID NO.7)，在前引物的5’端加CACC4个碱基，以拟南芥的DNA为模板进行克隆，胶回收产物经PCR检测和测序后，得到AtIPS1基因序列(SEQ ID NO.8)。
miRBase(http://www.mirbase.org/)在线数据库中搜索bna-miR168a的成熟序列，根据其成熟序列(成熟序序列中的U替换为T)设计引物BnMIM168a-F(SEQ ID NO.9)和BnMIM168a-R(SEQ ID NO.10)；然后分别以AtIPS1-F和BnMIM168a-R，BnMIM168a-F和AtIPS1-R为两对引物，以AtIPS1基因为扩增模板，分段进行克隆后获得两个片段，琼脂糖凝胶电泳结果显示条带大小与参考序列大小(234bp和268bp)基本一致(图2，A)。进行胶回收；最后将上一步获得的两个胶回收产物按照等摩尔量混合后作为新模板，以AtIPS1-F和AtIPS1-R为引物进行重叠PCR扩增获得MIM168a片段后，琼脂糖凝胶电泳显示改造片段大小为500bp左右，与目标片段大小(478bp)基本一致(图2，B)。将目的条带连接到pENTR-D-TOPO后转化大肠杆菌，进行单克隆菌液的PCR检测(图2，C)，引物为M13-F+M13-R，然后测序得到BnaMIM168a目的片段(SEQ ID NO.11)。重叠PCR构建BnaMIM168a目的片段示意图如图3所示。
实施例3、bna-miR168a过表达载体和干扰表达载体的构建
通过LR反应分别将bnamiR168a和BnaMIM168a两个目的片段分别连接到表达载体pEarleyGate101上，转化大肠杆菌后，分别以引物对F35S3ND(SEQ ID NO.12)+BnamiR168a-R、BnamiR168a-F+RPA3ND(SEQ ID NO.13)和F35S3ND+AtIPS1-R、AtIPS1-F+RPA3ND进行PCR检测(图4)，将测序正确的菌液提取质粒后转化农杆菌GV3101。
实施例4、甘蓝型油菜的遗传转化及阳性鉴定
将构建完成并测序正确的菌液和质粒送往武汉伯远生物技术公司进行转基因油菜的转染实验，转染受体为中双11材料(ZS11)。将公司返还的转基因幼苗移至1/4的霍格兰营养液中进行培养，一周以后转移至1/2的霍格兰营养液中培养，半个月左右转移至1倍的霍格兰营养液中培养，以后每周更换一次营养液，直至长出4-5片子叶，将其移栽至土中生长。并在长势正常的油菜叶片上涂抹500mg/L浓度的Basta溶液，用Marker笔做标记。一周后观察叶片表型，长势正常、深绿色叶片的植株初步鉴定为阳性植株；叶片衰老、发黄的植株为阴性植株。对阳性单株油菜的叶片进行DNA提取，采用PCR法进行阳性鉴定；选取阳性植株进一步进行qRT-PCR验证，以ZS11为对照，选取转基因植株表达量与ZS11达到差异显著水平的单株继续种植，收获期进行单株收种。
对T0代Basta筛选、阳性鉴定和qRT-PCR鉴定均为阳性的植株进行单株收种，然后按照转基因播种要求在10月份进行苗床育苗，幼苗长出3-4片子叶时喷500mg/L的Basta溶液进行复筛，长势正常、植株嫩绿的植株为阳性植株；叶片发黄、长势较弱的为阴性植株。11月中旬将阳性单株进行移栽。直至筛选到喷洒Basta后所有幼苗均显示为阳性，证明筛选到纯合的阳性转基因株系，分别获得了三个甘蓝型油菜过表达bna-miR168a的阳性单株OE#1,OE#4,OE#5和三个干扰表达bna-miR168a(即表达BnaMIMR168)的阳性单株MIM#6,MIM#7和MIM#8。
实施例5、转基因甘蓝型油菜中目的基因表达量
过表达植株的纯合阳性株系筛选结果显示三个过表达株系的阳性植株占比接近播种的100％(图5)，由于干扰表达植株的世代较低，暂未进行纯合阳性株系的筛选工作；进一步的qRT-PCR结果显示，过表达和干扰株系的成熟序列bna-miR168a表达量分别是ZS11的11、39、33倍和0.25、0.41、0.51倍，且均达到了差异极显著水平(图6，A)；过表达株系中，前体bna-MIR168a的表达量分别是野生型ZS11的3.3、3.5和3.3倍，均达到了差异极显著水平，但是3个干扰表达bna-miR168a单株的前体bna-MIR168a表达量与ZS11相比并无显著差异(图6，B)。
实施例6、转基因甘蓝型油菜中bna-miR168a的靶基因检测
对bna-miR168a在甘蓝型油菜中预测到的6个靶基因进行初步的qRT-PCR验证，结果显示只有BnaC08g46720D、BnaA08g03260D和BnaA05g17460与bna-miR168a存在负向调控的表达模式。BnaC08g46720D、BnaA08g03260D和BnaA05g17460在过表达株系中的表达量分别是ZS11的0.75、0.12、0.15倍，0.69、0.11、0.09倍和0.71、0.14、0.11倍；在干扰植株中的表达量分别达到了中双11的11、16、12倍，15、15、10倍和7、8、5倍(图7)，而这3个基因正是bna-miR168a的靶基因BnAGO1的三个成员。
以上结果均证明我们在甘蓝型油菜中过表达bna-miR168a纯合阳性株系筛选的准确性，以及干扰表达bna-miR168a阳性植株筛选的可靠性，可以进行下一步的表型鉴定工作。
实施例7、甘蓝型油菜中干扰、过表达bna-miR168a阳性株系的表型统计
甘蓝型油菜中干扰、过表达bna-miR168a植株的整体表型显示，过表达bna-miR168a对甘蓝型油菜具有明显的抑制生长作用，而干扰表达植株具有显著的促进生长作用。苗期阶段，过表达株系的植株长势较为弱小，当ZS11材料达到盛花期时，过表达株系的植株主花序刚开始开花，花期整体比ZS11材料要晚15天左右(图8)。而干扰表达的初步观察发现，花期比ZS11材料较早，苗期整体长势旺盛。
生殖生长阶段，干扰表达的油菜长势旺盛，但是过表达的油菜株系普遍出现角果发育不正常的败育现象。将ZS11材料和过表达株系植株的花器官分为两个阶段：未露花瓣的花蕾为第一阶段，花蕾下已开的第一朵花为第二阶段，分别对其进行扫描电子显微镜观察发现，两个阶段的过表达株系均表现出柱头较小(图9，B；图9，C)的表型，并且同时期花药的开裂程度显著低于ZS11材料(图9，D)，柱头上粘连的花粉较少(图9，B)。进一步对ZS11和过表达株系的花粉活力进行检测，结果显示二者的花粉活力均正常(图9，e)。
生长发育后期阶段，转基因植株的分枝数、一次有效分枝高度、单株角果数等性状与ZS11相比均达到显著或极显著差异(图10)。ZS11材料与过表达、干扰植株的分枝数目，尤其是二次有效分枝数目差异显著，ZS11平均为4个，三个过表达株系和干扰植株分别为1个、2个、2个和19个、23个、24个，均达到了差异极显著水平(图10，C)；干扰植株分枝多，株型较为分散，一次有效分枝高度平均为27cm，极显著低于ZS11的70cm，过表达植株的分枝较少，一次有效分枝较高，平均为85cm(图10，D)；影响产量三因素之一的单株角果数在转基因植株与ZS11之间同样具有较大的差异，过表达株系及干扰表达植株的单株角果数目分别为181个、206个、244个和882个、920个、956个，与ZS11的329个相比，均达到了差异显著或者极显著水平(图10，E)。
收获期，转基因植株的籽粒产量、生物产量、粒果比和收获指数等产量性状与ZS11相比均达到显著或极显著差异(图11)。ZS11材料的籽粒产量平均为7.54g，过表达和干扰表达株系的分别为5.56g、5.64g、5.2g和29.3g、31.1g、39.9g(图11，B)，而ZS11材料的生物产量平均为42.78g，过表达和干扰表达株系的分别为45.24g、46.1g、42.98g和120.5g、119g、146.6g(图11，C)，虽然过表达株系的籽粒产量和生物产量与ZS11相比并未达到差异显著性，但是干扰表达株系的籽粒产量和生物产量均极显著高于ZS11材料；反映光合产物转运效率的粒果比性状在转基因和ZS11材料间的差异更显著，相较于ZS11材料39.99％的粒果比性状，过表达和干扰表达株系的粒果比性状分别为27.03％、24.18％、25.49％和59.09％、64.24％、62.45％，均达到了差异极显著水平(图11，D)；最终，ZS11材料的收获指数为17.59％，三个过表达株系的收获指数性状分别为12.46％、12.04％和12.09％，均显著低于ZS11，三个干扰表达株系的收获指数性状分别24.31％、26.13％和27.21％，均显著高于ZS11材料(图11，E)。
实施例6、甘蓝型油菜中干扰、过表达bna-miR168a株系中其他miRNA的表达量
为了验证甘蓝型油菜过表达和干扰表达bna-miR168a转基因株系中其它miRNA的表达量是否受到影响，我们对甘蓝型油菜过表达和干扰表达bna-miR168a阳性株系中bna-miR164A、bna-miR403、bna-miR156b和bna-miR396a的表达量进行了检测，结果显示bna-miR164A在三个过表达株系中被下调表达，在干扰株系中被上调表达，分别达到ZS11材料的0.75、0.52、0.24倍和1.6、1.45和1.3倍(图12，A)。bna-miR403在过表达和干扰株系中均被下调表达，表达量分别是ZS11的0.09、0.25、0.13倍和0.2、0.35、0.31倍(图12，B)。bna-miR156b和bna-miR396a在三个过表达株系中都呈现出上调表达的趋势，分别是ZS11材料的1.44、1.86、3.41倍和4.81、17.89、22倍，在干扰株系中都被下调表达，分别达到了ZS11材料的0.32、0.52、0.4倍和0.06、0.25、0.2倍(图12，C，图12，D)。
综上结果说明甘蓝型油菜中过表达和干扰表达bna-miR168a与受体ZS11相比，过表达株系中植株整体花期延迟，长势弱小，收获期的二次有效分枝较少，单株角果数目较少，生物产量、籽粒产量、粒果比和收获指数等性状均显著较低；干扰表达植株长势旺盛，植株分枝较多，单株角果数较多，生物产量、籽粒产量、粒果比和收获指数等性状均显著较高。同时证实了BnAGO1的三个成员是bna-miR168a的靶基因，bna-miR168a负向调控AGO1的表达水平，而bna-miR403、bna-miR164A、bna-miR156b和bna-miR396a同样受到bna-miR168a不同程度的调控。bna-miR168a可通过靶向负调控AGO1，影响AGO1与其他miRNA结合形成RNA沉默诱导复合体(RNA-induced silencing complex,RISC)，“bnamiR168a-AGO1”的改变同时介导“bnamiR156b-SPL”、“bnamiR396a-GRF”及其它“bnamiRNAs-Targets”的表达量进而对植株的花期、分枝数和籽粒产量等性状产生影响，最终影响植株的粒果比和收获指数等产量性状。
对照实施例：
拟南芥bna-miR168a、BnaMIMR168的遗传转化及阳性鉴定
将bna-miR168a和BnaMIMR168两个阳性重组表达载体的菌液进行拟南芥的浸染实验，成熟后混合收种，种子消毒后点播在含有Basta的培养基中，将长势正常、叶片为绿色的阳性植株编号后移栽到土里。拟南芥长出4-5片子叶后，剪取叶片提取DNA，做阳性鉴定，获得四个拟南芥中异源过表达bna-miR168a的阳性单株OE#10,OE#11,OE#12，OE#14和四个拟南芥中异源干扰表达bna-miR168a的阳性单株MIM#1,MIM#2,MIM#3和MIM#5。
拟南芥中异源表达bna-miR168a纯合阳性株系的获得与表型鉴定
经过前期多世代阳性株系的Basta筛选、阳性鉴定及qRT-PCR复筛，最终在拟南芥中获得了四个异源过表达bna-miR168a的纯合阳性株系和四个干扰表达的阳性株系，结果均显示八个株系的阳性植株占比接近点播种子的100％(图13)。
进一步的qRT-PCR结果显示，四个过表达和干扰表达株系成熟序列bna-miR168a的表达量分别是野生型的97、242、89、244倍和0.35、0.62、0.06、0.59倍(图14，A)。过表达株系中前体bna-MIR168a的表达量分别是野生型的42393、58113、37998和83763倍，但是干扰株系前体的表达量与野生型相比并无稳定的趋势(图14，B)，这可能是因为干扰表达载体的构建是不经过其前体，直接作用于其成熟序列的。
对拟南芥中预测的bna-miR168a的4个靶基因进行初步的qRT-PCR验证，结果显示只有AtAGO1的表达量与bna-miR168a存在负调控的模式。AtAGO1在过表达和干扰表达株系中的表达量分别是野生型的0.68、0.60、0.53、0.37倍和6、11、14、7倍(图15)。以上结果均证明了我们在拟南芥中异源表达bna-miR168a纯合阳性株系筛选的准确性，可以进行下一步的表型鉴定工作。
对野生型和转基因拟南芥植株进行表型统计分析，发现过表达株系的植株生长明显受到抑制，产量显著降低，干扰株系的植株花期较早，分枝较多，产量提升。具体的表型特征如下：营养生长的苗期阶段，过表达株系表现出长势弱小，发育较晚，叶片细小且锯齿状明显的现象,干扰株系相较于野生型拟南芥，表现出明显的长势较快，叶片肥大的特征(图16)。
营养生长向生殖生长转换过程中，植株的抽薹和开花时间都有显著的差异，野生型植株的抽薹和开花时间平均为17和32天，干扰株系的抽薹和开花时间均显著较早，分别为25、25、24、24天和27、30、28、29天；而过表达株系的抽薹和开花时间分别为32、36、36、33天和35、38、38、36天，均显著较晚(图17)。
生殖生长阶段，干扰植株与野生型拟南芥相比并无明显的差别，但是过表达植株表现出极为明显的角果败育现象(图18，A)。起始胚胎数的统计结果表明：无论过表达株系还是干扰株系，与野生型相比，起始胚胎数并没有显著的差别(图18，B)，但是收获期每角果籽粒数却存在较大的差异，过表达植株的每角果籽粒数目平均为14个，与野生型的57个相比也达到了差异极显著水平(图18，C)，干扰株系的角果长度与野生型相比，并没有明显的差异，但是四个过表达株系的角果长度分别为0.9cm，1cm，0.8cm和0.9cm，与野生型的1.5cm相比达到了差异极显著水平(图19)。
成熟期后，野生型与转基因植株相比，株高、有效二次分枝数、单株角果数、角果长度、每角果籽粒数、籽粒产量、粒果比和收获指数等性状均有显著差异。野生型植株的有效二次分枝为4.9个，过表达和干扰株系则分别为7.8、9、9、9.1个和17.8、13.8、14、11个，均达到了差异极显著水平(图20，A；图20，B-a)。野生型拟南芥的单株角果数平均为162个，过表达和干扰株系分别为232、230、225、234个和327、262、255、232个，均达到了差异极显著水平(图20，A；图20，B-b)。野生型植株的生物产量平均为0.54g，四个过表达株系中只有OE#11株系的0.63g与野生型达到了差异显著性，而四个干扰株系中，除了MIM#5外的另外三个株系分别为0.77g、0.65g和0.64g，达到了差异极显著性(图20，A；图20，B-c)。单株籽粒产量方面，过表达和干扰株系分别为0.09g、0.08g、0.07g、0.08g和0.25g、0.21g、0.20g、0.15g，而野生型的单株籽粒产量平均为0.13g，均达到了差异显著或极显著水平(图20，A；图20，B-d)。千粒重方面，干扰株系与野生型植株均为0.0130g左右，并无显著差异，但是过表达株系分别为0.01g、0.007g、0.008g和0.009g，与野生型相比均达到了差异显著水平(图20，A；图20，B-e)。野生型植株的粒果比平均为59％，过表达和干扰株系分别为43.98％、30.13％、31.75％、36.8％和67.56％、65.65％、64.73％、61.66％，同样除了MIM#5株系，另外7个株系均与野生型达到了差异极显著水平(图20，A；图20，B-f)。最终过表达和干扰株系的收获指数性状与野生型的24.85％相比都达到了差异极显著水平，分别为18.26％、12.90％、12.9％、15.74和32.9％、33.13％、30.63％、31.03％(图20，A；图20，B-g)。
综合上述，可以看出异源过表达bna-miR168a后，拟南芥植株表现出明显的抑制生长现象，产量相关性状均显著下降，而拟南芥中异源干扰表达bna-miR168a后，植株从苗期便可以表现出极其显著的利于植株生长发育的现象。
转基因植株叶片发育异常、锯齿明显等现象可能是影响植株产量的原因之一，我们通过测定转基因和野生型拟南芥播种34天后叶片中叶绿素和生长素的含量发现，叶绿素a在转基因与野生型植株中并无差别，叶绿素b在过表达和干扰表达株系中均比野生型中的低，干扰表达株系的叶绿素总量为1.67mg/g，与野生型的1.74mg/g并未达到差异显著性，过表达株系的叶绿体总量平均为1.59mg/g，与野生型植株达到了差异极显著水平(图21，A)；与野生型拟南芥相比，IAA在过表达和干扰表达株系中均显著较低，过表达植株与野生型拟南芥中的IBA含量并无差别，干扰植株中的IBA含量比野生型的显著较高，而野生型的生长素总量为3.8ng/g，过表达和干扰表达株系中的生长素总量分别为3.1ng/g和2.9ng/g，均比野生型显著降低(图21，B)。我们推测过表达植株叶片中的低叶绿素和低生长素含量直接影响叶片的生长发育，而与野生型植株相比，干扰表达植株中的低生长素含量可能是由于干扰植株与野生型拟南芥生长速率不同导致的。
为了探究过表达植株生殖生长阶段出现的严重败育现象，我们将拟南芥荚果前期的生殖生长阶段主要分为三个时期：花苞还未露白的早期阶段(图22，Stage 1)，四片花瓣完全伸展开来的中期阶段(图22，Stage 2)，以及萼片、花瓣脱落的后期阶段(图22，Stage3)。分别对过表达和野生型植株三个时期的雌蕊、雄蕊、柱头、花药以及花粉粒进行了扫描电子显微镜的观察，结果显示，过表达植株的花药可以产生花粉(图22，D；图22，E)，但是相比于野生型拟南芥，过表达植株的花药产生花粉的时期较为滞后，与雌蕊柱头的生长不同步(图22，A；图22，B)。另外我们也观察到过表达植株的柱头与野生型的相比具有显著膨大的特征，柱头上的表皮细胞延伸成的绒毛体更长(图22，C)。而在拟南芥荚果发育的中期和后期，野生型植株柱头上粘连了较多的花粉粒，但是过表达植株柱头粘连的花粉粒却很少(图22，B；图22，C)。
为了进一步明确野生型和过表达植株二者之间的花粉粒活性问题，我们对三个时期的花药、柱头等器官进行了花粉活性检测。结果显示，过表达植株的花粉活力正常(图22，d)。动态时期的观察，仍然可以证明过表达植株花药散发花粉粒的时间较为滞后，整个荚果发育过程中柱头上粘连到有活性的花粉粒很少(图22，c)。
鉴于miR168靶向AGO1的特殊性，我们在异源表达bna-miR168a的阳性株系中对bna-miR164A、bna-miR403、bna-miR156b和bna-miR396a的表达量进行了检测，结果显示：在四个过表达株系中，bna-miR164A、bna-miR403、bna-miR156b和bna-miR396a都呈现出不同程度的下调表达趋势，其表达量分别达到了野生型植株的0.44、0.49、0.25和0.46倍，0.18、0.17、0.04和0.15倍，0.74、0.65、0.33和0.76倍，0.69、0.60、0.15和0.47倍；而在四个干扰表达株系中，bna-miR164A、bna-miR403、bna-miR156b和bna-miR396a都呈现出不同程度的上调表达趋势，其表达量分别达到了野生型植株的1.19、1.73、1.42和1.82倍，1.18、2.60、3和2.33倍，1.36、3.3、6.16和5倍，1.73、3.18、7.16和6.37倍(图23)，且均达到了差异显著或者极显著水平。
综上所述，通过对转基因拟南芥多世代间的表型观察，发现拟南芥中异源过表达和干扰表达bna-miR168a阳性纯合株系的植株，均具有较为稳定且十分显著的异于野生型拟南芥的表型性状，过表达植株在整个生长发育阶段均表现出反向的抑制作用，相反，干扰株系的植株生长发育具有显著的促进作用。
本研究中，bna-miR168a在拟南芥植株中的转基因表型：过表达株系抽薹时间比野生型晚了8天左右，开花时间也是推迟了接近5天，但相比于野生型植株，干扰株系具有显著早抽薹和早花的特征；植株成熟期产量相关性状的考种数据显示，与野生型相比，过表达植株株型较为分散，收获期的粒果比和收获指数均不足野生型植株的3/5，尤其是影响植株产量的三因素中的每角果籽粒数和千粒重都显著降低，导致过表达植株的籽粒产量有38％的降低；而干扰株系的有效二次分枝数目接近野生型的2-3倍，粒果比和收获指数分别有10％和30％的提高，而单株籽粒产量与野生型相比提高了55％。
分子层面的检测发现AtAGO1在过表达和干扰植株中具有与bna-miR168a负向的表达趋势。鉴于所有miRNA均需与RISC复合体结合后才能参与调控靶基因的表达，而miR168是调控RISC复合体核心元件AGO1的特殊miRNA，因此我们初步检测发现bna-miR403、Bna-miR164A、Bna-miR156b和Bna-miR396a四个miRNA在bna-miR168a转基因植株中的表达量均不同程度的受bna-miR168a调控，印证了前人关于miR168可以与miR403共同调节AGO1和AGO2的表达量，而Osa-miR168和靶基因AGO1组成的“miR168-AGO1”调控信号的变化将会导致多个其他“miRNA-Targets”调控信号的改变。
本研究还发现苗期过表达植株表现出极为显著的叶片发育迟缓、锯齿状等特征，而且生殖生长阶段出现明显的角果败育现象。针对叶片异常现象，本研究通过对种子点播35天后转基因和野生型拟南芥叶片生长素和叶绿素的检测发现，干扰株系的叶绿素总量与野生型并无差别，但是过表达株系的叶绿素含量达到了极显著较低的水平；而过表达和干扰株系的生长素总量与野生型相比，都显著降低，推测可能是“miR168-AGO1”调控信号的变化导致了miR164、miR160、miR167等参与生长素调控miRNA表达量发生了改变。针对过表达植株角果严重败育的情况，研究发现转基因植株与野生型拟南芥之间角果的起始胚胎数目并没有差别，花粉活力检测也显示过表达植株的花粉活力正常，但对花药、花粉和柱头等花器官的整个发育动态过程进行扫描电子显微镜观察发现，过表达植株的花药散发花粉的时间较为滞后，导致柱头过度生长，错失与花粉粘连的时机，推测可能是“miR168-AGO1”调控信号的变化影响了miR164等miRNA，进而靶向介导NAC转录因子对CUC等基因进行调控，最终对植株花器官的数量及发育产生较大的影响。
综合上述，推测拟南芥中AtAGO1是bna-miR168a真正的靶标基因，而bna-miR168a通过负向调控AtAGO1的表达影响如bna-miR403、bna-miR164A、bna-miR156b、bna-miR396a等其他miRNA与AtAGO1结合形成RISC复合体，进一步对其它miRNA的靶标基因起调控作用，最终影响植株的生长发育和产量性状。拟南芥异源过表达bna-miR168a的株系中出现叶片锯齿状的性状，很有可能是“bnamiR168a-AGO1”的改变，影响了其他“bnamiRNA-AGO1”的结合，对下游调控生长素运输的基因起到调控作用，使叶片中的生长素分布不均匀，出现显著的锯齿状，影响叶片中的叶绿素含量，导致最终的植株产量形成显著差异。而在起始胚胎数并没有发生显著差异、花粉活性没有受到影响的基础上，过表达株系中出现明显的败育现象，我们初步推断可能是花粉等花器官发育过程中的糖转运基因的下调表达，使得养分供给不足，导致花药、花粉等器官与柱头的不同步生长，致使柱头上粘连较少的花粉，最终导致严重的败育现象降低植株的总产量。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
序列表
<110> 西南大学
<120> 下调表达Bna-miR168a在改良油菜性状中应用
<160> 13
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcatgaatgg tctgttattc tc 22
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcatagccat taatcatcat gcg 23
<210> 3
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gtaaaacgac ggccagt 17
<210> 4
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
caggaaacag ctatgac 17
<210> 5
<211> 450
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜(Brassica napus L.)
<400> 5
gcatgaatgg tctgttattc tcattaaata cacatcaatg gaggctaacc tatccacgat 60
atttagattt agagagaaca aaactttgcc agatatggta actgttctct ctctctctat 120
ctctccttct tctttctatc ttttcaattg agagagagag aagagaaggt ccgaggagga 180
ggactaaaaa gatgttacgg cggcctctga ctcgcttggt gcaggtcggg aactgattgg 240
ctgacaccgc cacgtggctt tccatggttg gcttgtgagc agggatcgga tcccgccttg 300
tatcaagtga atccgagtcc gacgtgaaaa aaaaaaaaaa gtccacagct ttcagatctg 360
acacactcat caaatatctt gtaattgggg atttattctt ctttgttaat cttttattta 420
gttttgacgc atgatgatta atggctatgc 450
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atggccatcc cctagctagg 20
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
catgcactgg tctgactatt c 21
<210> 8
<211> 401
<212> DNA
<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)
<400> 8
gcctaaatac aaaatgaaaa ctctctagtt aagtggtttt gtgttcatgt aaggaaagcg 60
ttttaagata tggagcaatg aagactgcag aaggctgatt cagactgcga gttttgttta 120
tctccctcta gaaattgctc acttctatct tctgtcaagc ttcggttccc ctcggaatca 180
gcagattatg tatctttaat tttgtaatac tctctctctt ctctatgctt tgtttttctt 240
cattatgttt gggttgtacc cactcccgcg cgttgtgtgt tctttgtgtg aggaataaaa 300
aaatattcgg atttgagaac taaaactaga gtagttttat tgatattctt gtttttcatt 360
tagtatctaa taagtttgga gaatagtcag accagtgcat g 401
<210> 9
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ttcccgacct gctacaccaa gcgaagcttc ggttcccctc ggaatc 46
<210> 10
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tcgcttggtg tagcaggtcg ggaatttcta gagggagata aac 43
<210> 11
<211> 478
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜(Brassica napus L.)
<400> 11
atggccatcc cctagctagg tgaagaagaa tgaaaacctc taatttatct agaggttatt 60
catcttttag gggatggcct aaatacaaaa tgaaaactct ctagttaagt ggttttgtgt 120
tcatgtaagg aaagcgtttt aagatatgga gcaatgaaga ctgcagaagg ctgattcaga 180
ctgcgagttt tgtttatctc cctctagaaa ttcccgacct gctacaccaa gcgaagcttc 240
ggttcccctc ggaatcagca gattatgtat ctttaatttt gtaatactct ctctcttctc 300
tatgctttgt ttttcttcat tatgtttggg ttgtacccac tcccgcgcgt tgtgtgttct 360
ttgtgtgagg aataaaaaaa tattcggatt tgagaactaa aactagagta gttttattga 420
tattcttgtt tttcatttag tatctaataa gtttggagaa tagtcagacc agtgcatg 478
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ggaagttcat ttcatttgga gag 23
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gctgcataat tctcggggca gca 23

Claims (8)

1.下调表达Bna-miR168a在改良油菜性状中应用，其特征在于：所述改良油菜性状为：提高籽粒产量；提高生物产量；提高粒果比；提高收获指数；增加角果数；降低一次有效分支高度；提高二次有效分支数。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述下调表达Bna-miR168a是基于targetmimicry技术构建Bna-miR168a的沉默体，特异性下调Bna-miR168a成熟序列的表达。
3.根据权利要求1～3所述的应用，其特征在于：所述油菜为甘蓝型油菜。
4.一种提高油菜籽粒产量的方法，其特征在于，所述方法包括：下调油菜中Bna-miR168a成熟序列的表达。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述下调油菜中Bna-miR168a成熟序列的表达为基于target mimicry技术构建Bna-miR168a的沉默体。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述基于target mimicry技术构建Bna-miR168a的沉默体包括：
(1)将mimicry Bna-miR168a序列置于IPS1基因序列中，获得MIM168a序列片段；
(2)将MIM168a序列片段转入油菜中，获得转基因油菜，其为性状改良的油菜。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述MIM168a序列如SQE IDNO.11所示。
8.根据权利要求4～7所述的方法，其特征在于：所述油菜为甘蓝型油菜。
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