CN113440513A - 一种小分子化合物金银花双黄酮Japoflavone D的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种NRF2蛋白抑制剂在制备治疗感染结核分枝杆菌而诱发的疾病的药物中的应用，以NRF2蛋白为靶点抑制巨噬细胞内结核分枝杆菌的生长。本发明公开了NRF2‑SOD2信号通路在巨噬细胞调控结核杆菌存活中的重要作用，本发明还提供了一种能够靶向调节该信号通路的小分子化合物JapoflavoneD，该化合物结构简单，安全性高，促进巨噬细胞内结核杆菌清除效果明显。

Description

一种小分子化合物金银花双黄酮Japoflavone D的应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，尤其涉及一种小分子化合物金银花双黄酮Japoflavone D的应用。
背景技术
结核病是由结核分枝杆菌感染引起的慢性传染病。全球每年结核病发病人数 超过1000万例，死亡超过160万例，多年来一直是全球十大死因之一。虽然现 有的结核病一线治疗药物如异烟肼、利福平、吡嗪酰胺等对由敏感结核菌导致的 结核病治疗成功率达到90％，但由于疗程长(6-9个月)，病人依从性和药物毒 副作用等原因，目前仍有大约3～9％的病例复发。更重要的是，现有药物对耐多 药结核(MDR-TB)治疗成功率不足50％，这部分病人正面临着“无药可治”的 严峻挑战。而且耐多药结核病病例从2009年的每年250,000例增加到2016年的 每年490,000例，大约增加了95％。因此，探索有效的治疗耐多药结核新方案是 临床上亟待解决的难题。
目前，MDR-TB抗结核治疗方案主要包括以下几个方面：一、现有抗结核 药物的重新组合使用。但是这种方法使患者治疗时间大大延长，治疗费用大幅提 高。二、新型抗结核药物的研发，如德拉马尼(Delamanid)、贝达喹啉(Bedaquiline) 等。但是由于具有较高的生物毒性，不能单独作为抗痨药物使用，使用条件较为 苛刻。而且，这些新的药物尽管作用机制不尽相同，但本质上都是直接作用于结 核菌本身，因此始终存在着交叉耐药的风险。三、细胞免疫疗法。虽然近年来有 报道称应用免疫制剂辅助治疗耐药结核病取得不错疗效，但总体来看免疫治疗疗 效不确切，花费高，临床大规模应用难度大。
由于现有的耐多药结核治疗方案仍存在诸多不足，结核病宿主定向治疗 (Host-directed therapy，HDT)越来越收到大家的关注。目前所有的抗结核药物 都是直接作用于结核菌本身，不仅存在的交叉耐药的风险，同时也忽略了宿主免 疫在抗结核中的作用。在所有结核菌感染人群中，90％以上的人并不发展为结核 病而成为潜伏感染者，这表明宿主免疫能够有效清除结核菌感染。HDT不仅是 在药物敏感的结核菌，更是在耐多药的结核菌的治疗中具有重要价值。因此，提 高宿主抗结核免疫是研发耐多药结核病治疗方案的重要思路。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种小分子化合物金银花双黄 酮Japoflavone D的应用。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
提供一种NRF2蛋白抑制剂在制备治疗感染结核分枝杆菌而诱发的疾病的 药物中的应用，以NRF2蛋白为靶点抑制巨噬细胞内结核分枝杆菌的生长。
优选地，所述NRF2蛋白抑制剂包括金银花双黄酮Japoflavone D或其药用 盐、其溶剂化物、其水合物、其前药中的一种或多种。
优选地，所述感染结核分枝杆菌而诱发的疾病包括肺结核、肠结核、结核性 腹膜炎、结核性脑膜炎。
优选地，所述药物为固体制剂或液体制剂。
优选地，所述固体制剂包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、滴丸剂、合剂、 散剂；所述液体制剂包括注射针剂、口服液剂、软胶囊剂、气雾剂。
本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
本发明公开了NRF2-SOD2信号通路在巨噬细胞调控结核杆菌存活中的重要 作用，本发明还提供了一种能够靶向调节该信号通路的小分子化合物Japoflavone D，该化合物结构简单，安全性高，促进巨噬细胞内结核杆菌清除效果明显。
附图说明
图1中(a)为Japoflavone D的化学结构；(b)为不同浓度的Japoflavone D 处理72小时对巨噬细胞活力的影响；(c)为不同浓度的Japoflavone D处理72 小时对结核杆菌体外生长的影响；(d)为不同浓度的Japoflavone D处理72小时 对巨噬细胞内结核杆菌生长的影响；(e)为不同浓度的Japoflavone D处理对巨 噬细胞吞噬结核杆菌的影响；
图2中(a-b)为Japoflavone D处理24小时对结核杆菌感染的巨噬细胞凋亡 的影响；(c)为Japoflavone D处理24小时对结核杆菌感染的巨噬细胞内 caspase3/7/8活性的影响；(d)为Western blot检测Japoflavone D处理24小时对 结核杆菌感染的巨噬细胞内caspase3剪切的影响；(e)为Western blot检测 Japoflavone D处理24小时对结核杆菌感染的巨噬细胞内线粒体膜电位的影响； (f)为zVAD处理24小时对Japoflavone D促进巨噬细胞清除结核杆菌的影响；
图3中(a)为Western blot检测Japoflavone D处理24小时对结核杆菌感染 的巨噬细胞内AKT/mTOR信号通路的影响；(b)为Western blot检测Japoflavone D处理24小时对结核杆菌感染的巨噬细胞内MAPK信号通路的影响；(c)为 Dor处理24小时对Japoflavone D诱导的结核杆菌感染的巨噬细胞内caspase3剪 切的影响；(d)为Dor处理24小时对Japoflavone D诱导的结核杆菌感染的巨噬 细胞凋亡的影响；(e)为Dor处理24小时对Japoflavone D促进巨噬细胞清除结 核杆菌的影响；
图4中(a-b)为Japoflavone D处理6小时对结核杆菌感染的巨噬细胞内ROS 水平的影响；(c-d)为Japoflavone D处理24小时对结核杆菌感染的巨噬细胞内 ROS水平的影响；(e)为NAC处理24小时对Japoflavone D诱导的结核杆菌感 染的巨噬细胞内caspase3剪切的影响；(f)为NAC处理24小时对Japoflavone D 诱导的结核杆菌感染的巨噬细胞凋亡的影响；(g)为NAC处理24小时对 Japoflavone D促进巨噬细胞清除结核杆菌的影响；
图5中(a)为qPCR检测Japoflavone D处理24小时对结核杆菌诱导的SOD2 表达升高的影响；(b)为Western blot检测Japoflavone D处理24小时对结核杆 菌诱导的SOD2表达升高的影响；(c)为免疫荧光检测Japoflavone D处理24小 时对结核杆菌诱导的SOD2表达升高的影响；(d)为Japoflavone D对SOD2蛋 白稳定性的影响；(e)为Japoflavone D对SOD2蛋白降解的影响；(f)为MTO 处理24小时对JapoflavoneD促进巨噬细胞清除结核杆菌的影响；
图6中(a)为qPCR检测Japoflavone D处理24小时对转录因子表达水平 的影响；(b)为Western blot检测Japoflavone D处理24小时对转录因子表达水 平的影响；(c)为Western blot检测对转录因子入核的影响；(d)为免疫荧光检 测Japoflavone D处理24小时对NRF2入核的影响；(e)为Japoflavone D处理 24小时对NRF2与SOD2启动子区域结合的影响；(f)为qPCR检测Lut处理24 小时对结核杆菌诱导的SOD2表达升高的影响；(g)为Western blot检测Lut处 理24小时对结核杆菌诱导的SOD2表达升高的影响；(h)为不同浓度的 Japoflavone D处理72小时对巨噬细胞内结核杆菌生长的影响；
图7为分子对接预测Japoflavone D与NRF2/KEAP1蛋白的结合；
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清 楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全 部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳 动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
需要说明的是，下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法； 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从公开商业途径获得； 在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为本发明的限 定。
实施例：研究Japoflavone D体内外抗结核活性，并阐明其作用机制。
①实验方法
1)细菌菌株和培养条件
本研究中使用的结核分枝杆菌菌株H37Ra，H37Rv和GFP标记的H37Ra在 添加10％油酸-白蛋白-葡萄糖-过氧化氢酶(OADC；Becton，Dickinson)，0.05％ Tween80和0.2％甘油的Middlebrook 7H9肉汤(BBL Microbiology Systems)中 培养。于37℃振荡培养5至7天后，将细菌重悬于无血清RPMI培养基中并进 行超声处理，以获得单细胞悬液然后再使用。
2)细胞培养及细胞活力检测
人单核细胞系THP-1购自中国科学院细胞研究所(中国上海)。在补充有10％ 胎牛血清(FBS，Hyclone，Logan，美国)的RPMI 1640(Corning，纽约，美国) 培养基中于37℃和5％CO2培养THP-1细胞。将THP-1细胞以2×105细胞/mL的 浓度接种在24孔板中，并以40ng/mL的佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA， Sigma-Aldrich)分化24h，然后更换新鲜培养基继续孵育12小时备用。使用WST-1 试剂测定Japoflavone D对细胞活力的影响。将细胞以1×104每孔的密度接种到 96孔板中，分化后加入不同浓度的Japoflavone D，对照孔加入等量的DMSO溶 剂作为对照，继续培养24小时。处理结束后，除去培养基，加入含10％WST-1溶液的培养基，再孵育2-4小时后，测定450nm处测量吸光度。
3)Western blot检测蛋白水平
用含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的裂解液裂解药物处理后的细胞。细胞的核质 分离采用商业化的试剂盒按说明书进行。在8-15％的SDS-PAGE凝胶上分离不同 分子量的蛋白质，然后将蛋白质用湿转的方法转移到PVDF膜上。将膜用5％的 脱脂牛奶封闭1小时后，在室温下用特定的一抗溶液孵育1小时或在4℃下孵育 过夜，之后清洗3次除去未结合的一抗。然后将膜用HRP偶联的二抗孵育1小 时，再次清洗三次除去未结合的二抗。用免疫印迹化学发光试剂检测靶蛋白含量。
4)qPCR检测基因表达水平
用商业化的试剂盒提取细胞的RNA，并通过逆转录试剂盒将等量的RNA逆 转成为cDNA。针对不同的基因设计特定的引物，采用商业化的qPCR预混液进 行荧光定量PCR分析。基因表达水平的计算用内参基因Gapdh进行标准化处理 (2-ΔΔCT分析方法)。
5)H37Ra的CFU测定和吞噬作用评估
PMA分化的THP-1巨噬细胞(2×105个细胞)用H37Ra或H37Rv在37℃， 5％CO2的感染复数(MOI)为10的条件下感染6小时。然后，将细胞用预热的 PBS洗涤3次以除去细胞外细菌。此后，将感染的THP-1细胞用所示的药物处 理另外72小时。细胞用PBS洗涤3次，然后用500μL含有0.1％SDS的PBS裂 解。将每种处理的三组实验组铺在补充有10％OADC的7H10琼脂上。在37℃ 下孵育2周后，对菌落计数。为了评估H37Ra的吞噬作用，使用GFP标记的H37Ra以10的感染复数(MOI)感染THP-1细胞6小时。然后，将细胞用预热 的PBS洗涤3次，胰酶消化细胞后用BD FACSAria II流式细胞仪进行定量，并 使用FlowJo_V10软件进行分析。
6)凋亡测定
根据制造商的协议，使用FITC Annexin V细胞凋亡检测试剂盒(C1062L，Beyotime)进行凋亡细胞的检测。简而言之，处理后收获细胞，用冰冷的磷酸盐 缓冲盐水(PBS)洗涤两次，然后用碘化丙啶(PI)和偶联有FITC的Annexin V 在黑暗中孵育15分钟。然后通过BD FACSAria II流式细胞术确定染色的细胞的 数目，并使用FlowJo_V10软件进行分析。
7)测量Caspase-3，-7和-8活性
根据制造商的说明，使用Caspase-Glo 3/7或8检测试剂盒(Promega)测定Caspases-3，-7和-8的活性。简而言之，将1.0×104个细胞接种在96孔板中。处 理后，将等体积的Caspase-Glo 3/7或8试剂添加到已平衡至室温1小时的细胞 培养基中，振摇细胞5分钟，并在室温下孵育30分钟。用Synergy H1酶标仪 (Bioteck)进行发光记录。
8)RNA干扰
根据制造商的协议，使用Lipofectamine RNAiMAX(ThermoFisher，美国沃 尔瑟姆)，使用SOD2 siRNA(RiboBio，中国广州)转染PMA分化的THP-1巨 噬细胞(2×105细胞/孔)。转染48小时后，裂解前用PBS洗涤细胞一次，并通过 实时定量PCR和Western印迹法测定沉默效率。为了进行CFU计数，将THP-1 细胞在转染48小时后用H37Ra(MOI为10:1)感染6h。其余程序与上述相同。
9)ROS和线粒体膜电位的测量
用H37Ra(有或没有JFD的情况)将PMA分化的THP-1巨噬细胞(2×105细胞/孔)感染24小时(MOI为10:1)持续6或24小时。通过用预热的PBS洗 涤3次来去除细胞外细菌。用CM-H2DCF-DA(Invitrogen，Carlsbad，USA)， MitoSOX红色线粒体超氧化物指示剂(Invitrogen，Carlsbad，USA)和Mitotrack 红(Invitrogen，美国卡尔斯巴德，分别按照制造商的说明。用BD FACSAria II 流式细胞仪测量细胞的荧光强度，并用FlowJo_V10软件分析。
10)免疫荧光染色
按指示处理后，将盖玻片上培养的细胞用PBS冲洗并用4％多聚甲醛固定10 分钟。然后将细胞与含有0.25％Triton X-100的PBS一起温育以进行膜透化，然 后用5％BSA封闭1小时。之后，将细胞与特异性一抗在4℃下孵育过夜。然后 将盖玻片用PBS洗涤3次，然后在黑暗中与荧光二抗孵育1小时。然后，用Hoechst 染色10分钟，并用荧光显微镜拍照。
11)染色质免疫沉淀分析
通过遵循Upstate Biotechnology染色质免疫沉淀(ChIP)分析试剂盒规程 (17-10085)进行ChIP分析。简而言之，按照制造商的建议，使用抗NRF2抗 体(16396-1-AP，Proteintech)对中断的染色质进行免疫沉淀。兔IgG用作阴性 对照。从免疫沉淀和免疫沉淀前样品中纯化的DNA均按1:100稀释，并使用以 下SOD2启动子区域引物进行PCR扩增：正向5'-tgctccccgcgctttcttaag-3'；反向 5'-gctgccgaagccaccacag-3'。
②实验结果
1)JFD促进THP-1细胞中结核分枝杆菌的清除
我们发现，Japoflavone D(JFD，图1a)可以剂量依赖的方式显著降低THP-1 细胞中H37Ra的存活，而对细胞活力及H37Ra本身的生长没有显著影响(图 1b-c)。在H37Rv(一种结核分枝杆菌的强毒株)感染的THP-1细胞中观察到了 类似的效果(图1c)。同时，JFD既不影响H37Ra在7H9培养基中的生长(图 1d)，也不影响巨噬细胞对H37Ra的吞噬作用(图1e)。
2)JFD诱导H37Ra感染的THP-1细胞发生凋亡
为了研究JFD的抗结核活性的潜在机制，我们检测了JFD治疗对H37Ra感 染的THP-1细胞的影响。结果表明，JFD处理24小时会在感染H37Ra的THP-1 细胞中诱导更多的细胞凋亡(图2a-b)。我们观察到JFD处理24小时H37Ra感 染的THP-1细胞后促凋亡的半胱天冬酶3/7/8活性增加(图2c)。此外，通过免 疫印迹H37Ra感染的THP-1细胞证实了胱天蛋白酶3和PARP1的切割诱导(图 2d)。流式细胞仪分析表明，JFD处理后，H37Ra感染的THP-1细胞的线粒体膜 电位下降(图2e)。这些数据表明，JFD处理可在H37Ra感染的THP-1细胞中 诱导细胞发生凋亡。为了验证JFD诱导的细胞凋亡是否有是其抗结核活性所必 须的，我们使用了caspase抑制剂fmk-zvad抑制JFD诱导的凋亡，然后检测JFD 处理组与对照组THP-1细胞中H37Ra的量。如图2f，用fmk-zvad阻断凋亡可以 部分消除JFD的抗结核作用，这表明凋亡的诱导有助于JFD的抗结核活性。
3)JFD通过p38信号激活诱导细胞凋亡
凋亡由复杂的信号网络调节。其中，AKT-mTOR信号通路和MAPK信号级 联起着至关重要的作用。因此，我们检测JFD这两个途径是否被激活。如图3a 和b所示，JFD治疗特异性地激活了p38 MAPK信号传导，而AKT-mTOR信号 传导，JNK和ERK信号传导不受影响。为了验证JFD诱导的H37Ra感染的THP-1 细胞中JFD诱导的凋亡是否需要p38 MAPK激活，我们在强效的p38 MAPK抑 制剂多拉哌莫德的存在下，检查了JFD处理后H37Ra感染的THP-1细胞中caspase-3的剪切。正如我们的预期，多拉吡莫德治疗显著消除了JFD诱导的 caspase 3的剪切(图3c)。流式细胞仪分析也证实多拉吡莫德治疗抑制了JFD诱 导的H37Ra感染的THP-1细胞的凋亡(图3d)。此外，多拉吡莫德处理部分逆 转了由JFD诱导的巨噬细胞内H37Ra的清除(图3e)。
4)JFD促进ROS在H37Ra感染的THP-1细胞中积累
由于凋亡抑制剂fmk-zVAD不能完全阻断抗结核活性，而ROS是抗结核免 疫的另一个重要介质，因此我们也检查了JFD处理后H37Ra感染的THP-1细胞 中活性氧(ROS)的产生。如图4a-d所示，JFD处理6小时后或24小时后在H37Ra 感染的THP-1细胞中显著促进ROS的积累。这些数据表明，JFD处理显著提高 了H37Ra感染的THP-1细胞中ROS积累，这可能有助于其抗结核活性。为了进 一步证实这一假设，我们使用了ROS清除剂NAC来清除JFD诱导的ROS。如 预期的那样，NAC可以剂量依赖性逆转JFD的抗结核作用(图4e)。许多研究 小组报道ROS可以激活p38 MAPK信号传导，因此我们进一步验证了NAC是 否可以阻断JFD诱导的H37Ra感染的THP-1细胞中p38的激活和凋亡。结果与 其他报告是一致的(图4f-g)。
5)JFD通过抑制SOD2转录促进mROS积累
考虑到SOD2在H37Ra感染过程中调节氧化应激中的重要作用，我们检查 了JFD处理对SOD2表达水平的影响。结果表明，JFD处理抑制了H37Ra感染 诱导的SOD2表达(图5a-b)，免疫荧光实验也进一步证实了这一结果(图5c)。 为了证实SOD2介导的ROS调节在JFD诱导的H37Ra清除促进中的作用，我们 确认了MTO的处理是否可以逆转JFD的抗结核作用。如图5d所示，MTO可以 剂量依赖性的逆转JFD的抗结核作用。为了验证JFD处理对SOD2稳定性的影 响，我们使用环己酰亚胺来阻断蛋白质合成。如图5e所示，JFD处理不会影响 SOD2的稳定性。此外，蛋白酶体抑制剂mg132和溶酶体抑制剂CHQ和BAF 不能逆转JFD诱导的SOD2表达抑制(图5f)。综上所述，JFD处理可抑制H37Ra 感染诱导的SOD2转录。
6)JFD通过抑制NRF2的核定位来抑制SOD2转录
为了揭示JFD抑制SOD2转录的潜在机制，我们检查了NRF2，Foxo3a，SP1 和SP3的表达水平，它们是已报道的调控SOD2转录的转录因子。令人惊讶的是， JFD处理并没有影响这些转录因子的表达(图6a-b)。进一步，我们检测到JFD 处理对这些转录因子的核定位的影响。如图6c所示，JFD抑制H37Ra感染引起 的NRF2核定位，而JFD完全不影响Foxo3a，SP1和SP3的定位。免疫荧光进 一步证实了这些结果(图6d)。此外，染色质免疫沉淀分析表明，JFD处理可阻 断NRF2与SOD2转录起始位点的相互作用(图6e)。更重要的是，木犀草素， 一种NRF2抑制剂，可以剂量依赖性地抑制H37Ra感染诱导的SOD2转录(图 6f-g)并促进巨噬细胞内H37Ra的清除(图6h)。总之，这些观察结果表明，JFD 处理通过抑制NRF2的核定位来降低H37Ra感染诱导的SOD2转录。
③药效总结
在本专利中，我们公开了一种新型的黄酮类化合物JapoflavoneD(JFD)，它 可以促进THP-1细胞中的结核分枝杆菌消除。JFD可以抑制NRF2转移到细胞核 中，从而降低了H37Ra感染导致的SOD2转录。SOD2诱导减弱导致H37Ra感 染的THP-1细胞中活性氧(ROS)积累。过多的ROS可以直接导致更多的M. tuberculosis杀伤，同时可以通过激活p38 MAPK信号传导诱导凋亡。总之， Japoflavone D可通过抑制NRF2介导的SOD2转录来促进结核分枝杆菌的清除， 并可用于针对结核分枝杆菌感染的宿主定向治疗。
以上所述仅为本发明较佳的实施例，并非因此限制本发明的实施方式及保护 范围，对于本领域技术人员而言，应当能够意识到凡运用本发明说明书及图示内 容所作出的等同替换和显而易见的变化所得到的方案，均应当包含在本发明的保 护范围内。

Claims (5)

1.一种NRF2蛋白抑制剂在制备治疗感染结核分枝杆菌而诱发的疾病的药物中的应用，其特征在于，以NRF2蛋白为靶点抑制巨噬细胞内结核分枝杆菌的生长。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述NRF2蛋白抑制剂包括金银花双黄酮Japoflavone D或其药用盐、其溶剂化物、其水合物、其前药中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述感染结核分枝杆菌而诱发的疾病包括肺结核、肠结核、结核性腹膜炎、结核性脑膜炎。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物为固体制剂或液体制剂。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述固体制剂包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、滴丸剂、合剂、散剂；所述液体制剂包括注射针剂、口服液剂、软胶囊剂、气雾剂。
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