CN113416714A - 一种表达埃博拉gp蛋白的重组病毒及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物工程技术领域。具体涉及一种表达埃博拉GP蛋白的重组病毒、该重组病毒的构建、制备方法及其在抗埃博拉病毒中的应用。所述的重组病毒为可以表达埃博拉GP蛋白的重组水泡型口炎病毒rVSVΔG‑Makona‑GP;该病毒含有Makona GP蛋白基因的重组全基因组克隆质粒pCI‑RzVSVΔG‑Makona‑GP。本发明的优点:(1)重组病毒易于增殖、致病性极低、无基因漂移风险、安全性更高。(2)重组病毒的构建方法简单,易行,易于大规模生产。(3)重组病毒对EBOV具有交叉保护能力。(4)疫苗一次免疫食蟹猴就可以快速激发体液免疫反应,产生特异性EBOV中和抗体。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域。具体涉及一种表达埃博拉GP蛋白的重组病毒、该重组病毒的构建、制备方法及其在抗埃博拉病毒中的应用。
背景技术
埃博拉病毒病(Ebola virus disease,EVD)是由埃博拉病毒(Ebola virus,EBOV)感染引起的急性,发热并伴有严重出血症状的烈性***共患病。EBOV是致死率最高的病原之一,感染后致死率最高可达90%。自1976年EHF在扎伊尔东北部和苏丹南部暴发以来,至今发生过多次疫情。至今已发现并分离多种抗原型的EBOV,分别为扎伊尔型(Zaire Ebolavirus,ZEBOV),苏丹型(Sudan ebola virus,SEBOV),莱斯顿型(Reston ebola virus,REBOV),本迪布焦型(Bundigbugyo ebola virus,BEBOV)和塔伊森林型(Forest ebolavirus,TAFV),而其中ZEBOV爆发次数最多、致死率最高。EVD病程短,感染1~4天就会死亡。
EBOV属于丝状病毒科(Filoviridae),EBOV属,具有囊膜,基因组为不分节段的单股负链RNA病毒。EBOV的基因组编码7种结构蛋白,从3’端到5’端依次为核蛋白(NP),VP35,VP40,糖蛋白(GP),VP30,VP24以及RNA依赖的RNA聚合酶蛋白(L),此外,EBOV还编码两种非结构蛋白:sGP和ssGP。EBOV的GP蛋白是病毒粒子表面唯一的跨膜蛋白,通过与宿主细胞表面的受体结合介导病毒与宿主细胞融合,使病毒吸附并进入细胞。成熟的GP蛋白以三聚体的形式呈现在病毒粒子表面,是诱导产生中和抗体的最关键蛋白,是保护动物免受病毒感染的最关键的免疫原性蛋白。
2014年在西非出现的疫情是继1976年首次发现EBOV以来发生的最严重且最复杂的EBOV疫情。此次疫情爆发流行的EBOV属于ZEBOV,但其为一个新变种,其GP蛋白与1976年的ZEBOV株相比,氨基酸同源性为97.6%。2014年西非流行株的抗原性与之前相比发生了一定的变化。研制能够快速激发免疫应答的疫苗对于紧急免疫、挽救病人生命,非常重要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种表达埃博拉GP蛋白的重组病毒和该重组病毒的构建方法,方法简单,易行,易于大规模生产。本发明还提供了该重组病毒的应用。
为实现上述目的,本发明采用的技术方案为:
一种表达埃博拉GP蛋白的重组病毒,所述的重组病毒为可以表达埃博拉GP蛋白的重组水泡型口炎病毒rVSVΔG-Makona-GP;
该病毒含有Makona GP蛋白基因的重组全基因组克隆质粒pCI-RzVSVΔG-Makona-GP。
进一步的,所述的Makona GP蛋白基因序列为合成基因序列,其以EBOV西非流行株Makona株(GeneBank:KP178538.1)的GP的基因序列按照哺乳动物密码子偏噬性对GP蛋白进行人工密码子优化并合成,并在在起始密码ATG前分别引入VSV基因起始、终止及Kozak序列;其3’→5’的顺序为:
TATGAAAAAAACTAACAGATATCACGACGCGTACAACC。
本发明还提供一种表达埃博拉GP蛋白的重组病毒的制备方法。
表达埃博拉GP蛋白的重组病毒的制备方法,其步骤如下:
(1)根据合成的Makona GP蛋白基因序列,以VSV病毒基因组质粒pCI-RzVSVΔG***位点Nhe I序列为同源臂,设计用于构建表达Makona GP基因的重组基因组全长cDNA质粒的同源重组引物F1-F和F1-R;
(2)用限制性内切酶Nhe I酶切、线性化VSV病毒基因组质粒pCI-RzVSVΔG,胶回收纯化线性载体;
(3)采用PCR方法,以合成的Makona GP蛋白基因为模板,用引物F1-F和F1-R扩增Makona GP基因,胶回收纯化Makona GP基因;
(4)将Makona GP蛋白基因同源重组至载体pCI-RzVSVΔG的Nhe I位点,构成含有Makona GP蛋白基因的重组全基因组克隆质粒pCI-RzVSVΔG-Makona-GP;
(5)将重组质粒pCI-RzVSVΔG-Makona-GP及辅助质粒pCI-N、pCI-P和pCI-L,采用脂质体转染的方法共转染宿主细胞;
(6)培养步骤(5)所述的宿主细胞2~4代;
(7)收获步骤(6)所述细胞释放的病毒,即为表达Makona GP蛋白基因重组水疱性口炎病毒rVSVΔG-Makona-GP。
进一步的,所述的引物F1-F和F1-R序列如下,
进一步的,步骤所述的(5)中的宿主细胞为HEK293细胞。
进一步的,步骤所述的(6)中的培养宿主细胞方法为:
HEK293细胞共转染重组质粒pCI-RzVSVΔG-Makona-GP及辅助质粒pCI-N、pCI-P和pCI-L 48h后,更换培养基,5%CO2、37℃继续培养直至出现细胞圆缩病变,收获培养物上清;培养物上清10倍稀释后接种于单层Vero E6细胞,连续接种2~4代后,收获Vero E6细胞释放的病毒。
进一步的,所述的培养基为含10%胎牛血清的DMEM。
本发明还提供一种埃博拉病毒病疫苗。
一种埃博拉病毒病疫苗,其含有表达埃博拉GP蛋白的重组病毒和药学上可接受的载剂。
本发明还提供一种表达埃博拉GP蛋白的重组病毒的应用。
一种表达埃博拉GP蛋白的重组病毒的用途,重组病毒在埃博拉病毒抗血清制备中的应用;
重组病毒在制备抗埃博拉GP蛋白血清中的应用。
一种表达埃博拉GP蛋白的重组病毒的用途,用于制备药剂、试剂、检测板或试剂盒;所述试剂、检测板或试剂盒用于检测样品中埃博拉病毒GP蛋白;所述药剂用于治疗或预防埃博拉病毒感染。
本发明提供的一种表达埃博拉GP蛋白的重组病毒,利用水泡型口炎病毒(Vesicular Stomatitis Virus,VSV)作为表达埃博拉GP蛋白的重组病毒基因的疫苗载体,具有如下优势:易于在多种细胞系上增殖到高滴度;在活体内能引发很强的体液免疫和细胞免疫,并且能引发粘膜免疫和***性免疫;VSV在人群中阳性血清率极低,对人的致病性极低;VSV是单股负链RNA病毒,不会在人体内进行基因重排,无基因漂移风险;以VSV为疫苗载体且以外源病毒G蛋白将VSV G蛋白替换可以免防止被免疫个体产生针对载体的抗体,安全性更高,相同载体疫苗可以多次免疫;采用VSV病毒为载体构建的埃博拉病毒G蛋白嵌合型的重组VSV疫苗,一次低剂量免疫就能够快速形成完全的保护免疫,动物即使在埃博拉攻毒24小时后进行VSV嵌合病毒疫苗紧急免疫,也能够分别提供部分或100%的保护。
本发明提供的一种表达埃博拉GP蛋白的重组病毒,是具有传代能力的重组病毒。
本发明提供的表达埃博拉GP蛋白的重组病毒和该重组病毒的构建方法简单,易行,易于大规模生产。
可以从本发明提供的表达埃博拉GP蛋白的重组病毒基因组中扩增得到GP基因,所获PCR产物序列与预期目的片段相符,Makona GP基因成功***表达埃博拉GP蛋白的重组病毒的基因组。且重组病毒感染的细胞内EBOV GP能够正确表达。Western blotting检测重组病毒对Makona GP蛋白的表达结果显示,Makona GP蛋白在重组病毒感染的细胞中可以表达。通过实验,结果显示:(1)重组病毒免疫组小鼠体重的增长曲线与PBS对照组基本一致,表明重组病毒对小鼠具有良好的安全性;(2)重组病毒rVSVΔG-Makona-GP对小鼠具有免疫原性,可以诱导小鼠产生高水平的中和抗体;(3)以2014年EBOV西非流行株构建的重组病毒rVSVΔG-Makona-GP免疫的小鼠血清对1976年的EBOV毒株具有相同的中和作用,可以提供交叉保护;(4)在免疫后7天有一只食蟹猴血清转阳,免疫后14天三只食蟹猴血清均转阳,中和抗体最高为1:128。
本发明提供的重组病毒(重组水泡型口炎病毒rVSVΔG-Makona-GP)免疫的小鼠血清对基于1976年流行的EBOV GP蛋白构建的毒株rVSVΔG-eGFP-ZarieGP具有相同的保护效力,该疫苗候选株rVSVΔG-Makona-GP对EBOV具有交叉保护能力。本发明制备的rVSVΔG-Makona-GP疫苗一次免疫食蟹猴,就可以快速激发体液免疫反应,产生特异性EBOV中和抗体。
本发明提供的重组病毒可进一步大量制备对埃博拉GP蛋白是诱导产生中和抗体的最关键蛋白,是保护动物免受病毒感染的最关键的免疫原性蛋白,为抗血清和抗埃博拉病毒的疫苗研制提供原创性技术支撑,具有广泛的应用前景。
与现有技术相比,本发明提供的表达埃博拉GP蛋白的重组病毒及其制备方法和应用的优点:
(1)重组病毒易于增殖、致病性极低、无基因漂移风险、安全性更高。
(2)重组病毒的构建方法简单,易行,易于大规模生产。
(3)重组病毒对EBOV具有交叉保护能力。
(4)疫苗一次免疫食就可以快速激发体液免疫反应,产生特异性EBOV中和抗体。
附图说明
图1是本发明提供Makona GP蛋白嵌合型的重组VSV病毒基因组结构示意图。
图2是RT-PCR鉴定重组病毒的GP基因。
图3是IFA鉴定Makona GP蛋白在重组病毒感染细胞中的表达(A:未感染的Vero E6细胞;B:感染重组病毒rVSVΔG-Makona-GP的Vero E6细胞)。
图4是IFA Western bloting检测Makona GP蛋白在重组病毒感染细胞中的表达(M:Marker 1:Vero E6细胞2:rVSV-EGFP 3:rVSVΔG-eGFP-MakonaGP4:rVSVΔG-Makona-GP)。
图5是电镜观察重组病毒的形态特征照片(A:重组病毒rVSVΔG-Makona-GP电镜观察结果;B:重组病毒rVSVΔG-Makona-GP免疫电镜观察结果)。
图6是重组病毒的生长动力学曲线。
图7是重组病毒免疫组小鼠体重的增长曲线。
图8是重组病毒免疫小鼠血清中和抗体检测结果。
图9是重组病毒免疫小鼠血清中和抗体交叉保护性检测结果。
图10是Makona GP蛋白嵌合型的重组VSV病毒免疫食蟹猴中和抗体水平结果。
具体实施方式
为使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案,以下实施例对本发明的作进一步详细描述,以下实施例仅用于说明发明,但不用来限制本发明的范围。
一种表达埃博拉GP蛋白的重组病毒,所述的重组病毒为可以表达埃博拉GP蛋白的重组水泡型口炎病毒rVSVΔG-Makona-GP;
该病毒含有Makona GP蛋白基因的重组全基因组克隆质粒pCI-RzVSVΔG-Makona-GP。
进一步的,所述的Makona GP蛋白基因序列为合成基因序列,其以EBOV西非流行株Makona株(GeneBank:KP178538.1)的GP的基因序列按照哺乳动物密码子偏噬性对GP蛋白进行人工密码子优化并合成,并在在起始密码ATG前分别引入VSV基因起始、终止及Kozak序列;其3’→5’的顺序为:
TATGAAAAAAACTAACAGATATCACGACGCGTACAACC。
本发明还提供一种表达埃博拉GP蛋白的重组病毒的制备方法。
表达埃博拉GP蛋白的重组病毒的制备方法,其步骤如下:
(1)根据合成的Makona GP蛋白基因序列,以VSV病毒基因组质粒pCI-RzVSVΔG***位点Nhe I序列为同源臂,设计用于构建表达Makona GP基因的重组基因组全长cDNA质粒的同源重组引物F1-F和F1-R;
(2)用限制性内切酶Nhe I酶切、线性化VSV病毒基因组质粒pCI-RzVSVΔG,胶回收纯化线性载体;
(3)采用PCR方法,以合成的Makona GP蛋白基因为模板,用引物F1-F和F1-R扩增Makona GP基因,胶回收纯化Makona GP基因;
(4)将Makona GP蛋白基因同源重组至载体pCI-RzVSVΔG的Nhe I位点,构成含有Makona GP蛋白基因的重组全基因组克隆质粒pCI-RzVSVΔG-Makona-GP;
(5)将重组质粒pCI-RzVSVΔG-Makona-GP及辅助质粒pCI-N、pCI-P和pCI-L,采用脂质体转染的方法共转染宿主细胞;
(6)培养步骤(5)所述的宿主细胞2~4代;
(7)收获步骤(6)所述细胞释放的病毒,即为表达Makona GP蛋白基因重组水疱性口炎病毒rVSVΔG-Makona-GP。
进一步的,所述的引物F1-F和F1-R序列如下,
进一步的,步骤所述的(5)中的宿主细胞为HEK293细胞。
进一步的,步骤所述的(6)中的培养宿主细胞方法为:
HEK293细胞共转染重组质粒pCI-RzVSVΔG-Makona-GP及辅助质粒pCI-N、pCI-P和pCI-L 48h后,更换培养基,5%CO2、37℃继续培养直至出现细胞圆缩病变,收获培养物上清;培养物上清10倍稀释后接种于单层Vero E6细胞,连续接种2~4代后,收获Vero E6细胞释放的病毒。
进一步的,所述的培养基为含10%胎牛血清的DMEM。
本发明还提供一种埃博拉病毒病疫苗。
一种埃博拉病毒病疫苗,其含有表达埃博拉GP蛋白的重组病毒和药学上可接受的载剂。
本发明还提供一种表达埃博拉GP蛋白的重组病毒的应用。
一种表达埃博拉GP蛋白的重组病毒的用途,重组病毒在埃博拉病毒抗血清制备中的应用;
重组病毒在制备抗埃博拉GP蛋白血清中的应用。
一种表达埃博拉GP蛋白的重组病毒的用途,用于制备药剂、试剂、检测板或试剂盒;所述试剂、检测板或试剂盒用于检测样品中埃博拉病毒GP蛋白;所述药剂用于治疗或预防埃博拉病毒感染。
实施例1
一种表达埃博拉GP蛋白的重组病毒,所述的重组病毒为可以表达埃博拉GP蛋白的重组水泡型口炎病毒rVSVΔG-Makona-GP;该病毒含有Makona GP蛋白基因的重组全基因组克隆质粒pCI-RzVSVΔG-Makona-GP。
所述的Makona GP蛋白基因序列为合成基因序列,其以EBOV西非流行株Makona株(GeneBank:KP178538.1)的GP的基因序列按照哺乳动物密码子偏噬性对GP蛋白进行人工密码子优化并合成,并在在起始密码ATG前分别引入VSV基因起始、终止及Kozak序列;其3’→5’的顺序为:
TATGAAAAAAACTAACAGATATCACGACGCGTACAACC。
实施例2
表达埃博拉GP蛋白的重组病毒的制备方法,其步骤如下:
(1)根据合成的Makona GP蛋白基因序列,以VSV病毒基因组质粒pCI-RzVSVΔG***位点Nhe I序列为同源臂,设计用于构建表达Makona GP基因的重组基因组全长cDNA质粒的同源重组引物F1-F和F1-R;
(2)用限制性内切酶Nhe I酶切、线性化VSV病毒基因组质粒pCI-RzVSVΔG,胶回收纯化线性载体;
(3)采用PCR方法,以合成的Makona GP蛋白基因为模板,用引物F1-F和F1-R扩增Makona GP基因,胶回收纯化Makona GP基因;
(4)将Makona GP蛋白基因同源重组至载体pCI-RzVSVΔG的Nhe I位点,构成含有Makona GP蛋白基因的重组全基因组克隆质粒pCI-RzVSVΔG-Makona-GP;
(5)将重组质粒pCI-RzVSVΔG-Makona-GP及辅助质粒pCI-N、pCI-P和pCI-L,采用脂质体转染的方法共转染宿主细胞;
(6)培养步骤(5)所述的宿主细胞2~4代;
(7)收获步骤(6)所述细胞释放的病毒,即为表达Makona GP蛋白基因重组水疱性口炎病毒rVSVΔG-Makona-GP。
所述的引物F1-F和F1-R序列如下,
步骤所述的(5)中的宿主细胞为HEK293细胞。
步骤所述的(6)中的培养宿主细胞方法为:HEK293细胞共转染重组质粒pCI-RzVSVΔG-Makona-GP及辅助质粒pCI-N、pCI-P和pCI-L 48h后,更换培养基,5%CO2、37℃继续培养直至出现细胞圆缩病变,收获培养物上清;培养物上清10倍稀释后接种于单层Vero E6细胞,连续接种2~4代后,收获Vero E6细胞释放的病毒。所述的培养基为含10%胎牛血清的DMEM。
实施例3
一种表达埃博拉GP蛋白的重组病毒的用途,重组病毒在埃博拉病毒抗血清制备中的应用;重组病毒在制备抗埃博拉GP蛋白血清中的应用。
实施例4
一种表达埃博拉GP蛋白的重组病毒的用途,用于制备药剂、试剂、检测板或试剂盒;所述试剂、检测板或试剂盒用于检测样品中埃博拉病毒GP蛋白;所述药剂用于治疗或预防埃博拉病毒感染。
实施例5
表达埃博拉GP蛋白的重组病毒的制备方法
1.材料与方法
1.1质粒和毒株
水疱性口炎病毒(VSV)全长cDNA重组质粒pCI-Rz-VSV-FL和辅助蛋白表达质粒pCI-N、pCI-P和pCI-L由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所重要***共患病与烈性外来病创新团队构建、保存。表达绿色荧光蛋白的VSV重组EBOV扎伊尔型糖蛋白嵌合型重组病毒(rVSVΔG-eGFP-ZarieGP)、表达绿色荧光蛋白的VSV重组EBOV Makona株糖蛋白嵌合型重组病毒(rVSVΔG-eGFP-MakonaGP)以及rVSVΔG-eGFP-ZarieGP免疫小鼠血清由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所重要***共患病与烈性外来病创新团队建立并保存。选择EBOV西非流行株Makona株(GeneBank:KP178538.1)的GP的基因序列按照哺乳动物密码子偏噬性对GP蛋白进行人工密码子优化并合成,同时在起始密码ATG前分别引入VSV基因起始、终止及Kozak序列(TATGAAAAAAACTAACAGATATCACGACGCGTACAACC)。
1.2细胞与试剂
HEK293细胞和Vero E6细胞由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所重要***共患病与烈性外来病创新团队保存、培养。HEK293细胞和Vero E6细胞培养液为含10%胎牛血清的DMEM。高保真DNA聚合酶(Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase)、快速克隆试剂盒(ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit)购自南京诺维赞生物科技股份有限公司。X-tremeGENETM9 DNA转染试剂购自Merck公司。抗EBOV GP蛋白单克隆抗体由购自北京义翘神州科技股份有限公司。罗丹明(TRITC)标记的山羊抗兔IgG、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司。胎牛血清购自赛默飞世尔科技有限公司。DMEM培养液购自西格玛奥德里奇贸易有限公司。
1.3引物设计与合成
根据合成的Makona GP蛋白基因序列,以VSV病毒基因组质粒pCI-RzVSVΔG***位点Nhe I序列为同源臂,设计了用于构建表达Makona GP基因的重组基因组全长cDNA质粒的同源重组引物(表1)。
表1表达Makona GP基因重组基因组全长cDNA质粒所用引物
1.4表达Makona GP基因的重组VSV病毒基因组全长质粒的构建与拯救
用限制性内切酶Nhe I酶切、线性化pCI-RzVSVΔG,胶回收纯化线性载体。采用PCR方法,以合成的Makona GP蛋白基因为模板,用引物F1-F和F1-R扩增Makona GP基因,胶回收纯化Makona GP基因。利用快速克隆试剂盒,将Makona GP蛋白基因同源重组至载体pCI-RzVSVΔG的Nhe I位点,构成含有Makona GP蛋白基因的重组全基因组克隆质粒pCI-RzVSVΔG-Makona-GP。
HEK293细胞接种于35mm六孔板中,待过夜生长至80%~90%单层时,将重组质粒pCI-RzVSVΔG-Makona-GP及辅助质粒pCI-N、pCI-P和pCI-L,采用脂质体转染的方法共转染HEK293细胞。转染48h后,换成新鲜的完全培养基,5%CO2、37℃环境继续培养直至出现细胞圆缩病变,收获培养物上清,10倍稀释后接种于单层Vero E6细胞,连续接种3代后,经PCR鉴定正确后,表达Makona GP蛋白基因重组水疱性口炎病毒命名为rVSVΔG-Makona-GP。
1.5间接免疫荧光法(IFA)检测重组病毒中外源蛋白的表达
Vero E6细胞接种于细胞培养皿中,待生长至80%~90%单层时,将重组病毒rVSVΔG-Makona-GP感染Vero E6细胞,48h后,弃去培养上清,PBS洗涤细胞2次,预冷的3%多聚甲醛室温固定30min。以1:200倍稀释抗EBOV GP蛋白多克隆抗体为一抗,作用1h。PBST洗涤后加入1:200倍稀释TRITC标记的山羊抗兔IgG为二抗,作用30min,PBST洗涤后荧光显微镜观察结果。
1.6Western blotting法检测重组病毒中Makona GP蛋白基因的表达
Vero E6细胞接种于6孔板中,待生长至80%~90%单层时,将重组病毒rVSVΔG-Makona-GP按MOI为0.01感染细胞,于5%CO2、37℃培养,48~72h后,弃去培养上清,PBS洗涤细胞2次,按每孔100μL体积加入细胞裂解液,收集裂解细胞,10,000×g离心10min,加入蛋白上样buffer后煮沸10min,进行SDS-PAGE电泳,后将蛋白转印到NC膜上,以抗EBOV GP蛋白多克隆抗体为一抗,辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG为二抗,通过化学发光成像***成像并分析重组Makona GP蛋白表达情况。
1.7重组病毒的形态特征
Vero E6细胞接种于6孔板中,待生长至80%~90%单层时,将重组病毒rVSVΔG-Makona-GP按MOI为0.01感染细胞,于5%CO2、37℃培养,72h后,收获病毒感染细胞上清,3000rpm/min,离心15min,取上清10000rpm/min,离心15min,采用磷钨酸负染法将上清制备成样品,在电子显微镜下观察病毒粒子的形态。为观察嵌合病毒的囊膜纤突,将样品用抗EBOV GP蛋白多克隆抗体进行标记,以金颗粒标记的山羊抗兔二抗进行标记,将制备好的样品在电子显微镜下观察Makona GP蛋白在病毒粒子表面的分布情况。
1.8重组病毒的生长动力学
将重组病毒rVSVΔG-Makona-GP按MOI为0.01感染Vero E6细胞,于5%CO2、37℃培养,在感染后的12h、24h、36h、48h、60h、72hh、84和96h分别收集细胞上清,测定上清中病毒的TCID50。
1.9 BALB/c小鼠免疫试验
为了评估重组病毒rVSVΔG-Makona-GP的安全性和对小鼠的免疫原性,随机将6周龄雌性BALB/c小鼠分为3组,每组10只。分别以1×106TCID50/100μL/只、1×105TCID50/100μL/只和PBS/100μL/只的剂量经肌肉注射途径免疫小鼠,间隔3周加强免疫。各组小鼠随机选取5只于免疫前、初次免疫后第3周和第5周经眶下静脉丛采血,分离血清,在56℃水浴灭活30min,用于EBOV中和抗体检测。
1.10食蟹猴免疫试验
为了评估重组病毒rVSVΔG-Makona-GP对非人灵长类动物的免疫原性,随机将6只食蟹猴分为2组,每组3只。分别以1×107TCID50/1mL/只和PBS/1mL/只的剂量经肌肉注射途径免疫食蟹猴。各组食蟹猴于免疫前、免疫后第7天和第14周经静脉采血,分离血清,在56℃水浴灭活补体30min,灭活后的血清用于EBOV中和抗体检测。
1.11中和试验
检测血清中EBOV中和抗体的中和试验在96孔板上进行,步骤如下:首先将血清样品置于56℃水浴30min进行灭活,再将血清样品分别以不完全DMEM连续倍比稀释,每稀释度体积为25μL,与25μL约含200TCID50的EBOV rVSVΔG-eGFP-MakonaGP或rVSVΔG-eGFP-ZarieGP病毒液混合,37℃感作1h后,加入提前铺好长为单层的Vero E6细胞,每孔30μL,5%CO2、37℃培养48h后,置于荧光显微镜下观察rVSVΔG-eGFP-MakonaGP或rVSVΔG-eGFP-ZarieGP病毒感染形成的蚀斑情况。每个血清稀释度做8个重复。血清中EBOV中和抗体滴度被定义为能抑制50%蚀斑产生的最高血清稀释倍数。
实施例6
实施例5结果,结合图1~10所示。
2结果
2.1表达Makona GP蛋白基因重组VSV病毒的构建与拯救
根据合成基因Makona GP序列信息,利用引物在Makona GP基因末端引入酶切位点。用同源重组引物扩增并纯化回收合成基因片段,与同样经Nhe I处理的载体pCI-RzVSVΔG进行同源重组克隆,获得表达Makona GP基因重组VSV病毒全长cDNA克隆pCI-RzVSVΔG-Makona-GP,如图1所示。
将重组质粒pCI-RzVSVΔG-Makona-GP及辅助质粒pCI-N、pCI-P和pCI-L,采用脂质体转染的方法共转染HEK293细胞。将出现细胞病变的细胞培养上清收集,继续传代。将救获的重组病毒在Vero-E6细胞中连续传代5次后,提取病毒RNA,利用GP特异性引物进行RT-PCR鉴定并测序。结果显示,重组病毒基因组中扩增得到GP基因,所获PCR产物序列与预期目的片段相符。证明Makona GP基因成功***重组病毒基因组,如图2所示。
2.2 Makona GP蛋白在重组病毒感染细胞中的表达
将重组病毒rVSVΔG-Makona-GP以MOI为0.01感染Vero E6细胞,48h后以抗EBOVGP蛋白多克隆抗体为一抗,以TRITC标记的山羊抗兔IgG为二抗,DAPI对细胞核染色后进行IFA检测。结果显示,重组病毒感染的细胞内EBOV GP能够正确表达,如图3所示。
2.3 Western blotting检测重组病毒对Makona GP蛋白的表达
将重组病毒rVSVΔG-Makona-GP感染的细胞裂解后,样品经SDS-PAGE电泳后将蛋白转印到NC膜上,以抗EBOV GP蛋白多克隆抗体为一抗,辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG为二抗进行Western blot鉴定,通过化学发光成像***成像,结果显示Makona GP蛋白在重组病毒感染的细胞中可以表达,如图4所示。
2.4电镜观察重组病毒的形态特征
采用磷钨酸负染法将收获的重组病毒制备样品,病毒样品以EBOV GP特异性抗体进行标记,经金颗粒标记的山羊抗兔二抗进行染色,制备电镜样品观察病毒粒子形态。结果如图5A显示,表达Makona GP蛋白的嵌合型VSV病毒粒子rVSVΔG-Makona-GP呈子弹状形态,能够观察到病毒粒子及其表面的糖蛋白纤突。免疫电镜负染结果如图5B显示,重组病毒表面纤突能够被特异性胶体金颗粒附着。
2.5重组病毒的生长动力学
将重组病毒rVSVΔG-Makona-GP感染Vero E6细胞,于感染后的不同时间点取样并测定样品的TCID50。结果显示,重组病毒在感染Vero E6细胞的84h病毒滴度达到峰值,rVSVΔG-Makona-GP的滴度可达到1×106.19TCID50/mL,如图6所示。
2.6重组病毒对小鼠和食蟹猴的免疫结果
2.6.1重组病毒免疫小鼠的安全性
以肌肉注射途径免疫6周龄雌性BALB/c小鼠(详见1.9),对小鼠进行连续观察14天,称量体重。结果表明,在观察期内,免疫的小鼠全部存活,无症状,重组病毒免疫组小鼠体重的增长曲线与PBS对照组基本一致,初步表明重组病毒对小鼠具有良好的安全性,如图7所示。
2.6.2重组病毒免疫小鼠的中和抗体
为了评估重组病毒rVSVΔG-Makona-GP对小鼠的免疫原性,用重组病毒rVSVΔG-Makona-GP经肌肉免疫途径各免疫小鼠10只,所有小鼠间隔3周进行加强免疫。结果显示:初次免疫后3周,所有rVSVΔG-Makona-GP免疫小鼠检测血清中均有中和抗体,1×106TCID50免疫组(28.4)的抗体平均水平略高于1×105TCID50免疫组(27.8)。加强免疫后,小鼠血清中平均中和抗体水平均上升,1×106TCID50免疫组(210.6)的抗体平均水平略高于1×105TCID50免疫组(28.0)。而免疫对照小鼠血清中则检测不到EBOV中和抗体。结果表明,重组病毒rVSVΔG-Makona-GP对小鼠具有免疫原性,可以诱导小鼠产生高水平的中和抗体,如图8所示。
2.6.3重组病毒的交叉保护性
为了评估重组病毒rVSVΔG-Makona-GP的交叉保护能力,分别随机选择三份rVSVΔG-Makona-GP和rVSVΔG-Zarie-GP免疫的小鼠血清,分别用rVSVΔG-eGFP-MakonaGP与rVSVΔG-eGFP-ZarieGP病毒液测定其中和抗体,比较重组病毒rVSVΔG-Makona-GP和rVSVΔG-Zarie-GP免疫的小鼠血清对两种重组病毒的保护能力。结果如图9所示,rVSVΔG-Makona-GP免疫的小鼠血清对两种重组荧光病毒中和抗体相同,而以rVSVΔG-Zarie-GP免疫的小鼠血清对重组病毒rVSVΔG-eGFP-ZarieGP的中和抗体比对重组病毒rVSVΔG-eGFP-MakonaGP高2倍。这一结果提示以2014年EBOV西非流行株构建的重组病毒rVSVΔG-Makona-GP免疫的小鼠血清对1976年的EBOV毒株具有相同的中和作用,可以提供交叉保护,而以1976年EBOV毒株构建的rVSVΔG-Zarie-GP免疫的小鼠血清对2014年EBOV西非流行株的保护作用要弱于对1976年EBOV毒株的保护作用。
2.6.4重组病毒免疫食蟹猴的中和抗体
将重组病毒rVSVΔG-Makona-GP按107TICD50/mL/只肌肉注射免疫食蟹猴3只,同时设置PBS对照组,1mL/只肌肉注射免疫食蟹猴3只。食蟹猴免疫7天和14天采血,分离血清。以200TCID50的rVSVΔG-eGFP-MakonaGP测定血清中中和抗体效价,结果显示,在免疫后7天有一只食蟹猴血清转阳,免疫后14天三只食蟹猴血清均转阳,中和抗体最高为1:128,如图10所示。
自1976年埃博拉病毒病首次出现至今,仍未有获批的特异性治疗药物。大多数病毒感染的爆发可以追溯至EBOV通过不明宿主以未知的方式“溢出”到人群。随后,通常病毒通过直接接触(非气溶胶)、人际接触传播、或由感染过的组织、体液或污染物传播。预防埃博拉病毒感染可以采取感染防控措施进行自我保护,比如避免接触疑似或确诊感染埃博拉者的体液、疑似或确诊死于埃博拉者的尸体,接种疫苗也可以有效预防埃博拉病毒感染。
近年来,多种策略构建的针对EBOV疫苗相继问世,其中包括载体重组疫苗,如甲病毒复制子、人腺病毒载体,猩猩腺病毒载体,人副流感病毒载体,巨细胞病毒载体,狂犬病病毒载体,改良安卡拉痘苗病毒等,或病毒样颗粒,复制缺陷型的EBOV病毒,其中一些进入不同的临床试验阶段。重组载体疫苗中,进展最快的是以水泡性口炎病毒为载体重组扎伊尔型埃博拉病毒GP蛋白的rVSV-ZEBOV疫苗,在几内亚进行的临床试验证明,rVSV-ZEBOV疫苗具有很强的保护作用,并且具有良好的安全性。2019年12月,FDA批准了重组EBOV GP蛋白VSV载体疫苗在18岁以上人群接种。2019年10月,欧洲药品管理局获得了rVSV-ZEBOV疫苗的附条件销售授权,此后不久,欧洲委员会和美国食品药品监督管理局宣布批准该疫苗用于预防EVD,经过欧洲的认可委托,该疫苗已获准用于属于欧盟的国家。这充分证明了以VSV为载体的EBOV GP蛋白疫苗的安全性和有效性。rVSV-ZEBOV疫苗针对1976年出现的EBOV GP蛋白设计,近年来,埃博拉疫情不时在西非爆发,当前病毒流行株的抗原性与1976年的毒株相比发生了一定的变化,而发明制备的rVSVΔG-Makona-GP免疫的小鼠血清对基于1976年流行的EBOV GP蛋白构建的毒株rVSVΔG-eGFP-ZarieGP具有相同的保护效力,说明该疫苗候选株rVSVΔG-Makona-GP对EBOV具有交叉保护能力。本发明制备的rVSVΔG-Makona-GP疫苗一次免疫食蟹猴,就可以快速激发体液免疫反应,产生特异性EBOV中和抗体。
以上详细描述了本发明的优选实施方式,但是,本发明并不限于上述实施方式中的具体细节,在本发明的技术构思范围内,可以对本发明的技术方案进行多种变换,这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是,在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征和步骤,在不矛盾的情况下,可以通过任何合适的方式进行组合,为了避免不必要的重复,本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外,本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合,只要其不违背本发明的思想,其同样应当视为本发明所公开的内容。
Claims (10)
1.一种表达埃博拉GP蛋白的重组病毒,其特征在于,所述的重组病毒为可以表达埃博拉GP蛋白的重组水泡型口炎病毒rVSVΔG-Makona-GP;
该病毒含有Makona GP蛋白基因的重组全基因组克隆质粒pCI-RzVSVΔG-Makona-GP。
2.根据权利要求1所述的一种表达埃博拉GP蛋白的重组病毒,其特征在于:所述的Makona GP蛋白基因序列为合成基因序列,其以EBOV西非流行株Makona株(GeneBank:KP178538.1)的GP的基因序列按照哺乳动物密码子偏噬性对GP蛋白进行人工密码子优化并合成,并在在起始密码ATG前分别引入VSV基因起始、终止及Kozak序列;其3’→5’的顺序为:
TATGAAAAAAACTAACAGATATCACGACGCGTACAACC。
3.权利要求1所述的表达埃博拉GP蛋白的重组病毒的制备方法,其步骤如下:
(1)根据合成的Makona GP蛋白基因序列,以VSV病毒基因组质粒pCI-RzVSVΔG***位点Nhe I序列为同源臂,设计用于构建表达Makona GP基因的重组基因组全长cDNA质粒的同源重组引物F1-F和F1-R;
(2)用限制性内切酶Nhe I酶切、线性化VSV病毒基因组质粒pCI-RzVSVΔG,胶回收纯化线性载体;
(3)采用PCR方法,以合成的Makona GP蛋白基因为模板,用引物F1-F和F1-R扩增MakonaGP基因,胶回收纯化Makona GP基因;
(4)将Makona GP蛋白基因同源重组至载体pCI-RzVSVΔG的Nhe I位点,构成含有Makona GP蛋白基因的重组全基因组克隆质粒pCI-RzVSVΔG-Makona-GP;
(5)将重组质粒pCI-RzVSVΔG-Makona-GP及辅助质粒pCI-N、pCI-P和pCI-L,采用脂质体转染的方法共转染宿主细胞;
(6)培养步骤(5)所述的宿主细胞2~4代;
(7)收获步骤(6)所述细胞释放的病毒,即为表达Makona GP蛋白基因重组水疱性口炎病毒rVSVΔG-Makona-GP。
5.根据权利要求3或4所述的表达埃博拉GP蛋白的重组病毒的制备方法,其特征在于:步骤所述的(5)中的宿主细胞为HEK293细胞。
6.根据权利要求3或4或5任意一项所述的表达埃博拉GP蛋白的重组病毒的制备方法,其特征在于:步骤所述的(6)中的培养宿主细胞方法为:
HEK293细胞共转染重组质粒pCI-RzVSVΔG-Makona-GP及辅助质粒pCI-N、pCI-P和pCI-L 48h后,更换培养基,5%CO2、37℃继续培养直至出现细胞圆缩病变,收获培养物上清;培养物上清10倍稀释后接种于单层Vero E6细胞,连续接种2~4代后,收获Vero E6细胞释放的病毒。
7.根据权利要求3或4或5任意一项所述的表达埃博拉GP蛋白的重组病毒的制备方法,其特征在于:所述的培养基为含10%胎牛血清的DMEM。
8.一种埃博拉病毒病疫苗,其含有根据权利要求1~3中任一项所述的病毒和药学上可接受的载剂。
9.根据权利要求1~3中任一项所述的重组病毒的用途,其特征在于:重组病毒在埃博拉病毒抗血清制备中的应用;
重组病毒在制备抗埃博拉GP蛋白血清中的应用。
10.根据权利要求1~3中任一项所述的重组病毒的用途,用于制备药剂、试剂、检测板或试剂盒;
所述试剂、检测板或试剂盒用于检测样品中埃博拉病毒GP蛋白;
所述药剂用于治疗或预防埃博拉病毒感染。
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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