CN113416251B - 抗cd123人源化单链抗体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因工程领域，具体涉及一种抗CD123人源化单链抗体及其应用。本发明的识别CD123抗原的单链抗体的轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:7所示，所述单链抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:8所示。本发明提供了稳定适合的抗CD123人源化单链抗体(scFv)，其用于制备CAR结构，既保留了scFv的结合特异性和亲和力，又保证了CAR‑T在体内的的稳定性和安全性。在免疫细胞中表达后，不仅可以有效的清除表达CD123抗原的肿瘤靶细胞，而对阴性抗原(不表达CD123)的肿瘤细胞没有毒性作用；并且能够维持靶向CD123的CAR在病人细胞培养过程中的阳性率，在靶抗原刺激后能够长时间的进行增殖，能够用于肿瘤的靶向治疗。
Description
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体涉及一种抗CD123人源化单链抗体及其应用。
背景技术
CD123又称白介素3受体α链(IL-3Rα)高表达于白血病干细胞或白血病幼稚细胞，在正常造血干细胞不表达或者低表达，是白血病相关抗原也是急性髓性白血病的特异性抗原。急性髓性白血病(Acute myeloid leukemia，AML)是髓系造血干/祖细胞恶性疾病，以骨髓与外周血中原始和幼稚髓性细胞异常增生为主要特征多数病例病情急重，预后凶险，如不及时治疗常可危及生命；常规的诱导化疗虽然能够缓解AML但是最终并不能阻止AML的复发以及复发患者高的死亡率。然而AML的常规治疗已经50年未有改变，急需寻找新的改变。
CD123靶标的出现是AML治疗的新突破；由于CD123在AML高表达，理论上以CD123为靶标的免疫治疗具有更安全有效的治疗效果，国外也已经在进行以CD123为靶标的靶向药物的临床试验，但是功效均很有限并且仍有安全性问题的发生；因此筛选适合的靶向CD123的单链抗体是很有必要的。
单链抗体作为嵌合抗原受体(CAR)结构中重要的组成部分，其选择对CAR-T疗效起到至关重要的作用，目前用于治疗AML的CAR-T研究相对较少，CAR的稳定性和安全性仍需进一步改造研究，因此，筛选适合于组合CAR的靶向CD123的单链抗体也很有必要。
传统的鼠源抗体，因为鼠抗的异质性会引起人抗鼠抗体反应(Human anti-mouseantibody reaction，HAMA)，不管是单独应用，还是组合作为CAR的抗原识别区应用，均会在循环***中被很快清除，失去疗效。因此，治疗用鼠源单抗需要进行人源化修饰以提高抗体的人源化程度、减弱HAMA。但是抗体的改造通常会导致抗体失去原有抗原结合活性，因此需要对影响抗原抗体结合的关键残基进行反复修改，而后通过大量抗原抗体结合特异性、亲和力检测，从而筛选得到具有活性的抗体序列。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种识别CD123抗原的人源化单链抗体，其可以有效地降低免疫原性，增强单链抗体或含单链抗体的药物组合或CAR-T细胞在体内的持续和安全性。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
设计一种识别CD123的人源化单链抗体，其特征在于，所述单链抗体的轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:7所示，所述单链抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:8所示。
所述单链抗体的连接方式为VL-Linker-VH或VH-Linker-VL，其中Linker氨基酸序列为GSTSGSGKPGSGEGSTKG或GGGGSGGGGSGGGGS。
进一步，所述抗CD123单链抗体氨基酸序列如：SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:10，SEQID NO:11，SEQ ID NO:12所示。
单链抗体(Single-chain variable fragment(scFv))是由抗体的可变区(VH和VL区)通过15-20个氨基酸的短肽(Linker)连接而成，scFv能较好地保留其对抗原的亲和活性，并具有分子量小、穿透力强和抗原性弱等特点，scFv的稳定性与Linker的选择密切相关。目前主要的连接方式为VH-Linker-VL，其Linker主要是由氨酸(Gly)和丝氨酸(Ser)连接形成的一个或多个GGGGS单位组成。在有些实施例中也采用氨基酸序列为RGSTSGSGKPGSGEGSTKG的Linker连接scFv的重链和轻链。
使用非人单克隆抗体(例如，鼠单克隆抗体)一方面鼠源抗体通常不能介导补体依赖性溶解或通过抗体依赖性细胞毒性或Fc受体介导的吞噬作用而溶解人靶细胞。一方面，人宿主会将非人单克隆抗体识别为外源性蛋白质诱发引起有害过敏反应的免疫应答：人抗小鼠抗体(HAMA)反应；另一方面，人源化程度越高的scFv可以有效地降低CAR的免疫原性，增强CAR-T在体内的持续和安全性。
然而，并非所有改造的抗CD123 scFv均能获得成功。一方面，由于不同鼠源骨架区对抗体功能的影响不同，简单的进行人源框架的替换可能会导致改造的scFv丧失活性或者获得的人源化scFv虽然有亲和力但在体内功能性差；另一方面，人源化改造势必降低scFv的亲和力，不同的亲和力对CAR-T功能影响也有不同；因此，本发明的目的之一在于提供人源化的单链抗体。
改造单链抗体的方法，是通过检索人源框架库获得与鼠源框架相似度较高的框架序列，将鼠源CDR(可变区)植入人源框架的可变区形成人源化抗体，再通过多位或单位定点突变的方式对人源化FR区(恒定区)甚至是CDR区进行突变以恢复抗体的稳定性和抗原识别活性。方法的结果存在随机性，只有在配置得当的情况下，该人源化抗体结构才能保持稳定，其亲和力和有效性才能获得应用。
本发明的目的之二在于提供一种核苷酸片段，其编码目的一的识别CD123抗原的人源化单链抗体。
优选的，编码所述识别CD123抗原的单链抗体核苷酸序列如SEQ ID NO:13，SEQ IDNO:14，SEQ ID NO:15，SEQ ID NO:16所示。
本发明的目的之三在于提供一种上述的核苷酸片段在制备抗CD123抗原的多肽的应用。
由于不同scFv的特异性、亲和力、稳定性以及与不同铰链区的连接均有可能导致构建的CAR转导的CAR-T细胞不能有效的靶向肿瘤细胞甚至发生脱靶；CD123在造血干细胞表达，如果使用强亲和力的scFv作为CAR识别区，转导的CAR-T细胞在体内可能会引起较大的副作用，但是scFv亲和力太弱又会导致不能识别靶抗原进而不能激活CAR-T细胞，因此需要进行大量的筛选和研究寻找更稳定有效的识别CD123的scFv。
进一步，本发明的目的还在于提供一种抗CD123抗原的嵌合抗原受体，其包含识别CD123抗原的多肽，所述多肽的氨基酸序列含有上述SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ IDNO:11或SEQ ID NO:12所述的人源化单链抗体。
本发明的目的还在于提供一种表达所述抗CD123抗原的抗体的重组载体。
作为优选的方案，上述表达所述抗CD123抗原的抗体的重组载体为慢病毒载体或重组质粒。
本发明的目的还在于提供一种所述的重组载体感染的细胞。
优选的，所述细胞为T细胞。
本发明的目的还在于提供一种所述的细胞在用于制备治疗恶性血液病的药物中的应用。
进一步，所述恶性血液病的细胞或组织能够表达CD123。
进一步，所述恶性血液病为表达CD123的急性粒细胞白血病、急性淋巴细胞白血病以及B细胞慢性淋巴细胞增殖性疾病。
本发明的目的还在于提供一种治疗恶性血液病的药物，其特征在于，所述药物包含目的一的单链抗体以及赋予它的药学上可接受的载体。
本发明的目的还在于提供一种目的一的单链抗体在用于制备治疗恶性血液病的药物中的应用。
进一步，所述的恶性血液病的细胞能够表达CD123。
另外，回到发明的起源端，本发明的目的还在于提供一种上述抗CD123人源化单链抗体在用于制备精准捕获能够表达CD123恶性血液病细胞的载体中的应用。
优选的，本发明的目的还在于提供一种上述所示的抗CD123人源化单链抗体在制备CAR-T骨架中的抗原识别域的应用。
总的来说，本发明提供了稳定适合的抗CD123人源化单链抗体(scFv)，其用于制备CAR结构，既保留了scFv的结合特异性和亲和力，又保证了CAR-T在体内的稳定性和安全性。在免疫细胞中表达后，不仅可以有效的清除表达CD123抗原的肿瘤靶细胞，而对阴性抗原(不表达CD123)的肿瘤细胞没有毒性作用；并且能够维持靶向CD123的CAR在病人细胞培养过程中的阳性率，在靶抗原刺激后能够长时间的进行增殖，能够用于肿瘤的靶向治疗。
本发明的有益效果在于：
1)本发明提供的抗CD123人源化单链抗体人源化程度高，稳定性好。
2)本发明提供的抗CD123人源化单链抗体，用于制备嵌合抗原受体(CAR)可以有效地降低CAR的免疫原性，增强CAR-T在体内的持续和安全性。
3)本发明提供的抗CD123人源化单链抗体制备的嵌合抗原受体识别抗人CD123抗原，能够更稳定的表达于T淋巴细胞，具有更好的清除肿瘤细胞的能力，不仅可以维持靶向CD123的嵌合抗原受体在病人细胞培养过程中的阳性率并且能够加强CAR-T的增殖和杀伤肿瘤的能力，对抗原阴性的细胞无毒副作用，能够用于肿瘤的靶向治疗。
附图说明
图1为不同的CD123-CAR表达。
图2为不同的CD123-CAR杀伤效率。
图3人源化scFv立体结构图。
图4人源化scFv纯化。
图5人源化抗CD123 scFv亲和力检测。
图6为靶向人CD123抗原的嵌合抗原受体(CAR)的结构示意图。
图7为靶向人CD123抗原的嵌合抗原受体(CAR)表达检测。
图8为表达靶向CD123嵌合抗原受体的T细胞体外对CD123阳性和阴性肿瘤细胞的杀伤情况。
具体实施方式
以下将(参照附图)对本发明的优选实施例进行详细描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例1：设计抗人CD123抗原的人源化单克隆抗体
(1)将鼠抗人CD123抗原的单克隆抗体轻、重链的6段FR区氨基酸序列经过IMGT/BLAST数据库经序列分析及比对，选择同源性最高人抗体序列作为改造模板。获得3个人源化scFv，命名为12-1h1,12-1h2和12-1h3，氨基酸序列如下表所示：
表1：获得人源化scFv序列
经验证人源化后的scFv构建的CAR虽然能够正常表达于T细胞表面但均不能正常工作，而鼠源未改造的scFv组合的CAR能够正常工作，识别并杀伤表达CD123的肿瘤细胞；因此，人源化改造的scFv在功能上存有缺陷，结果如图1和图2所示。
(2)重新设计人源化改造策略：对人源化改造的序列进行PCR定点突变，进行定点突变后获得4个新的改造scFv，命名为123-ZX-01，123-ZX-02，123-ZX-03和123-ZX-04。突变获得的scFv轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:7所示，所述单链抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:6,SEQ IDNO:8所示；scFv氨基酸序列如SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:10，SEQ ID NO:11，SEQ ID NO:12所示。scFv的立体结构图如图3所示。
实施例2、靶向CD123人源化单克隆抗体表达纯化
将载有单克隆抗体的质粒构建慢病毒表达***，利用病毒感染的方式感染CHO表达细胞，筛选高表达scFv的单克隆细胞株，每三天收集细胞表达上清。表达的scFv携带His标签，利用His标签蛋白进行纯化。收集的细胞上清利用AKTA Prime仪器进行纯化，纯化分为NTA-Ni+亲和层析和凝胶层析两步进行，具体实验步骤参考AKTA Prime使用手册。纯化的蛋白通过Western blot验证scFv的活性和纯度，如图4所示，改造的4个scFv均具有活性和高纯度。
实施例2、靶向CD123人源化单克隆抗体亲和力测定
优选的单克隆抗体scFv标记有His标签后克隆进质粒载体并转染HEK293细胞，纯化scFv-His，scFv-His和阴性对照用PBS稀释6个梯度，分别孵育CD123表达阳性的THP-1细胞，流式检测浓度梯度下THP-1CD123检测的阳性率，进行流式阳性率及MFI(平均荧光强度)统计，对不同scFv于CD123的亲和力进行分析。实验进行了三个独立重复，结果如图5所示，其中Kd(nM)越大亲和力越小。
实施例3、表达靶向人CD123抗原的嵌合抗原受体的慢病毒制备
(1)制备靶向人CD123抗原的嵌合抗原受体的基因序列
合成依次含前导肽(又称信号肽)、抗人CD123抗原的单链抗体ScFv，hFc铰链区、跨膜区和胞内信号段的嵌合抗原受体序列，其结构如图6所示。前导肽的核苷酸序列为atgggatggagctgtatcatcctcttcctggtagcaacagctacaggcgtgcacagt；抗人CD123抗原的人源化单链抗体核苷酸序列如SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16所示；hFc铰链区的核苷酸序列为氨基酸序列如SEQ ID NO.17或SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:19或SEQID NO:20所对应的氨基酸序列；跨膜区为CD8TM或CD28TM来源的氨基酸序列；胞内信号段为CD28或CD137及CD3来源的核苷酸序列。
(2)构建表达嵌合抗原受体的慢病毒载体
根据装载ScFv和跨膜结构以及胞内信号的不同，将嵌合抗原受体表达载体分别命名为CAR12301、CAR12302、CAR12303、CAR12304、CAR12305、CAR12306、CAR12307、CAR12308，CAR12309、CAR12310、CAR12311，CAR12300慢病毒载体。其中CAR12300为鼠源对照。
酶切反应按说明书进行。酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分离后用琼脂糖凝胶DNA片段回收试剂盒进行DNA片段回收，然后将目的片段和载体片段通过T4连接酶(购自Promega公司)进行连接，获得表达嵌合抗原受体的慢病毒载体，结构如图6所示3种CAR结构与4种人源化抗体组合共计12种组合。质粒抽提试剂盒(Invitrogen公司)抽提质粒，具体方法见说明书。
实施例6、CD123抗原的嵌合抗原受体修饰T细胞的制备
(1)慢病毒的包装
本实施例包装慢病毒采用磷酸钙法，具体步骤见分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著)。
(2)慢病毒的纯化
收集病毒上清，离心过滤后转移至新的离心管；根据病毒上清量，利用终浓度为8.5％的PEG6000、终浓度为0.3M的NaCl进行病毒纯化，纯化后的病毒用200μL含10％FBS的DMEM培养基重悬，1.5mL EP管分装，-80℃保存备用。
(3)慢病毒滴度测定
病毒感染293T细胞，感染72h后利用QIAamp DNA Blood Mini Kit(购于Qiagen公司，货号511004)基因组抽提试剂盒抽提基因组。按试剂盒说明书操作。qRT-PCR测定病毒滴度用分析软件分析数据，根据标准曲线计算病毒滴度，结果用TU/mL表示。滴度如下表2所示，均大于1*108TU/ml。
表2慢病毒滴度
| 病毒名称 | 病毒滴度病毒滴度 |
| CAR12301 | 1.00E+08 |
| CAR12302 | 2.63E+08 |
| CAR12303 | 1.64E+08 |
| CAR12304 | 4.58E+08 |
| CAR12305 | 3.86E+08 |
| CAR12306 | 2.40E+08 |
| CAR12309 | 1.40E+08 |
| CAR12310 | 2.14E+08 |
| CAR12311 | 2.00E+08 |
(4)慢病毒感染T细胞
1)人外周血单核细胞的分离
用加有抗凝剂的采血管采集外周血约60ml，加入羟乙基淀粉稀释后室温(18～25℃)自然沉降约30min，利用梯度离心法进行淋巴细胞分离，获得人外周血单核细胞。
2)慢病毒载体感染T淋巴细胞
用完全培养基培养新制备的单个核细胞PBMC，抗CD3单克隆抗体活化后进行慢病毒感染；分别加入慢病毒载体，未感染的外周血淋巴细胞(PBMC)作为空白对照；24h后将培养基更换为含有500IU/mL重组人IL-2的RPMI 1640完全培养基，继续培养10-20天。感染CAR12301、CAR12302、CAR12303、CAR12304、CAR12305、CAR12306、CAR12307、CAR12308、CAR12309、CAR12310、CAR12311，CAR12300慢病毒载体获得的嵌合抗原受体T细胞以病毒名称命名即：CAR12301、CAR12302、CAR12303,，CAR12304、CAR12305、CAR12306，CAR12307、CAR12308，CAR12309、CAR12310、CAR12311，CAR12300。
3)靶向人CD123抗原的嵌合抗原受体(CAR)表达检测
在培养过程中对培养至第5天和11天的已感染病毒的T细胞进行CAR阳性率检测。利用流式细胞术检测Protein-L阳性率，检测结果即表示不同结构CAR在T淋巴细胞表达阳性率。结果如表3和图7所示不同病毒感染T细胞后CAR阳性率，其中CAR12303、CAR12311以及CAR12302感染效率较低，CAR12301随着培养时间的持续CAR表达率下降，其它结构CAR阳性率和稳定性均较好。
表3 CAR在T淋巴细胞表达阳性率
实施例7、表达靶向CD123的嵌合抗原受体的T淋巴细胞抗肿瘤效果验证
以稳定表达萤火虫荧光素酶的CD123阳性THP-1细胞(简称为Raji-luc)以及阴性细胞Raji作为靶细胞，按照1:1效靶比铺效应细胞。使用Steady-
Luciferase AssaySystem(Promega Cat.#E2520)试剂盒提供的标准方法检测杀伤效果，杀伤率用下列公式计算：
杀伤结果如图8所示，结果表明CAR12301、CAR12302，CAR12305、CAR12304，CAR12310、CAR12309，均具有较好的体外杀伤效果和特异性。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
<110> 重庆精准生物技术有限公司
<120>抗CD123人源化单链抗体及其应用
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Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Lys Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
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<213> Artificial
<220>
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1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 123-ZX-04-VL
<400> 7
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Asp
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Leu Ala Trp Tyr Gln Glu Lys Pro Gly Lys Thr Asn Lys Leu Leu Ile
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Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223>123-ZX-04-VH
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1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr
100 105 110
Val Ser Ser
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 123-ZX-01
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35 40 45
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<213> Artificial
<220>
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195 200 205
Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly
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Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
225 230 235 240
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
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<400>11
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Leu Ala Trp Tyr Gln Glu Lys Pro Gly Lys Thr Asn Lys Leu Leu Ile
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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly
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Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Gln Val Gln
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Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly
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Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
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<212> PRT
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<220>
<223>123-ZX-04
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Asp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Glu Lys Pro Gly Lys Thr Asn Lys Leu Leu Ile
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Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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<212> DNA
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<223> 123-ZX-01
<400>13
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gagaagcctg gcaagaccaa taagctgctg atctattctg gcagcacact gcagagcggc 240
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ctgcagccag aggatttcgc catgtactat tgccagcagc acaacaagta cccctatacc 360
tttggcggcg gcacaaagct ggagatcaag ggatccacct ctggaagcgg caagcctgga 420
tctggagagg gaagcacaaa gggacaggtg cagctggtgc agcctggagc agagctggtg 480
aggccaggag cctccgtgaa ggtgtcttgt aaggccagcg gctacacctt cacatcctat 540
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ccttacgatt ctgagaccca ctataatcag aagtttaagg acaaggccat cctgacagcc 660
gataagtcca cctctacagc ctacatggag ctgtctagcc tgacctccga ggatacagcc 720
gtgtactatt gtgccagagg caattgggac gattattggg gccagggcac cacactgacc 780
gtgtcctctc tcgag 795
<210>14
<211> 795
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 123-ZX-02
<400>14
gctagcatgg cactgccagt gaccgccctg ctgctgcctc tggccctgct gctgcacgca 60
gcaaggccag acatccagat gacacagagc ccaagctccc tgtctgccag cccaggcgac 120
agggtgacca tcacatgcag agcctccaag tctatcagca aggatctggc ctggtaccag 180
gagaagcctg gcaagaccaa caagctgctg atctattccg gctctacact gcagtctgga 240
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ctgcagccag aggatttcgc cacatactat tgccagcagc acaataagta cccctatacc 360
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ccttacgatt ccgagaccca ctataatcag aagtttaagg accgggtgac catcacagcc 660
gataagagca cctccacagc ctacatggag ctgtcctctc tgaggtccga ggataccgcc 720
gtgtactatt gtgccagagg caactgggac gattattggg gccagggcac cacactgacc 780
gtgagctccc tcgag 795
<210>15
<211> 795
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223>123-ZX-03
<400>15
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gtgtctagcc tcgag 795
<210>16
<211> 795
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223>123-ZX-04
<400> 16
gctagcatgg cactgccagt gaccgccctg ctgctgcctc tggccctgct gctgcacgca 60
gcaaggccag acatccagat gacacagagc ccaagctccc tgtctgccag cccaggcgac 120
agggtgacca tcacatgcag agcctccaag tctatcagca aggatctggc ctggtaccag 180
gagaagcctg gcaagaccaa caagctgctg atctattccg gctctacact gcagtctgga 240
gtgccaagcc gcttcagcgg atccggatct ggaaccgact ttaccctgac aatctctagc 300
ctgcagccag aggatttcgc cacatactat tgccagcagc acaataagta cccctatacc 360
tttggcggcg gcacaaagct ggagatcaag ggaagcacct ccggatctgg caagcctgga 420
tccggagagg gctctacaaa gggacaggtg cagctggtgc agcctggagc agaggtgaag 480
aagccaggag ccagcgtgaa ggtgtcctgt aaggcctctg gctacacctt cacaagctat 540
tggatgaact gggtgcggca ggcaccagga cagggactgg agtggatggg cagaatcgac 600
ccttacgatt ccgagaccca ctataatcag aagtttaagg accgggtgac catcacagcc 660
gataagagca cctccacagc ctacatggag ctgtcctctc tgaggtccga ggataccgcc 720
gtgtactatt gtgccagagg caactgggac gattattggg gccagggcac cacactgacc 780
gtgagctccc tcgag 795
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<211> 47
<212> PRT
<213>
<220>
<223> CD8h铰链
<400>17
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1 5 10 15
Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala
20 25 30
Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
35 40 45
<210>18
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<212> PRT
<213>
<220>
<223> 7h铰链
<400>18
Ala Pro Pro Arg Ala Ser Ala Leu Pro Ala Pro Pro Thr Gly Ser Ala
1 5 10 15
Leu Pro Asp Pro Gln Thr Ala Ser Ala Leu Pro Asp Pro Pro Ala Ala
20 25 30
Ser Ala Leu Pro
35
<210>19
<211> 45
<212> PRT
<213>
<220>
<223> 8h(dc)铰链
<400>19
Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr
1 5 10 15
Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Arg Pro Ala Ala
20 25 30
Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Asp
35 40 45
<210>20
<211> 229
<212> PRT
<213>
<220>
<223> IgG4h铰链
<400>20
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1 5 10 15
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130 135 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Gly Lys
225
Claims (10)
1.识别CD123抗原的人源化单链抗体，其特征在于，所述单链抗体氨基酸序列如SEQ IDNO:10所示。
2.核苷酸片段，其特征在于，所述核苷酸序列编码权利要求1所述的识别CD123抗原的单链抗体。
3.权利要求2 所述的核苷酸片段在用于制备抗CD123抗原的多肽的应用。
4.表达权利要求1 所述抗体的重组载体。
5.权利要求4所述的重组载体感染的细胞。
6.权利要求5所述的细胞在用于制备治疗恶性血液病的药物中的应用，其特征在于，所述恶性血液病的细胞或组织能够表达 CD123。
7.权利要求1所述的单链抗体在用于制备治疗恶性血液病的药物中的应用，其特征在于，所述的恶性血液病的细胞能够表达 CD123。
8.一种治疗恶性血液病的药物，其特征在于，所述的药物包含权利要求1所述的单链抗体以及药学上可接受的载体。
9.权利要求1所述的单链抗体在制备精准捕获能够表达CD123恶性血液病细胞的载体中的应用。
10.权利要求1所述的单链抗体在制备CAR-T骨架的抗原识别域中的应用。
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Soluble Expression and Characterization of a New scFv Directed to Human CD123;Shima Moradi-Kalbolandi等;《Applied Biochemistry and Biotechnology》;20160109;第178卷;第1390-1406页 * |
Also Published As
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