CN113391064A - 用于检测新型冠状病毒中和抗体的受体试剂及其应用 - Google Patents
用于检测新型冠状病毒中和抗体的受体试剂及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种用于检测新型冠状病毒中和抗体的受体试剂及其应用。所述受体试剂包含能够与活性氧反应产生可检测的化学发光信号受体微球,其中,所述受体微球的内部填充有化学发光剂,所述受体微球的表面连接有新型冠状病毒RBD蛋白。所述受体微球在受体试剂中的Zeta电位在‑5mV至‑60mV电位之间。与核酸检测以及ELISA检测相比,本发明所提供的含有所述受体微球的试剂盒具有良好的敏感性、特异性,检测结果符合度高,且检测速度快,30min以内报告结果;检测通量大,可达到200‑500测试/小时,适合于大规模样本检测。
Description
技术领域
本发明属于免疫检测技术领域,具体涉及一种用于检测新型冠状病毒中和抗体的受体试剂及其应用。
背景技术
SARS-CoV-2是冠状病毒科β病毒属的新型冠状病毒,与SARS-CoV类群在进化树上位置相邻。经研究发现,SARS-CoV-2有4种主要的结构蛋白:刺突蛋白(S)、核衣壳蛋白(N)、膜蛋白(M)和包膜蛋白(E)。
“核衣壳蛋白(N)”是冠状病毒中含量最丰富的蛋白。在病毒体组装过程中,N蛋白与病毒RNA结合并导致螺旋核衣壳的形成。核衣壳蛋白是一种高度免疫原性的磷蛋白,与病毒基因组复制和调节细胞信号通路有关。由于N蛋白的序列保守性(与SARS同源性94%)和强大的免疫原性,N蛋白常被作为冠状病毒诊断检测工具。“棘突蛋白(S)”,是冠状病毒最重要的表面膜蛋白,含有两个亚基(subunit),S1和S2。其中S1主要包含有受体结合区(receptorbinding domain,RBD),负责识别细胞表面受体血管紧张素转化酶2(ACE2)。S2含有膜融合过程所需的基本元件。S蛋白与SARS同源性约75%(S1同源性68%,S2同源性94%)。
新型冠状病毒抗体检测通常检测的抗体为IgG、IgM或总抗体,通常采用的方法为双抗原夹心法或间接法/捕获法。然而,IgG、IgM或总抗体中并不是所有抗体均对人体具有保护作用,对人体具有保护作用的抗体为中和抗体(Neutralizing Antibody),新型冠状病毒肺炎患者在染病的数天或约一周后血液内产生,其可以通过中和或抑制病毒的生物学活性来保护细胞免受侵害。已有研究表明,SARS-CoV-2刺突蛋白的S1受体结合域(RBD)与人ACE2能够相互作用,进而感染人的呼吸道上皮细胞,导致肺内部宿主细胞的内吞和病毒复制,是宿主中和抗体的重要作用位点以及疫苗设计的关键靶点,中和抗体中的很大部分为阻止RBD蛋白与ACE2结合的抗体。
目前,SARS-CoV-2病毒感染在世界范围尚未得到全面控制,核酸检测作为唯一的确认感染的金标准得到广泛的应用。然而,核酸检测采用聚合酶链式反应(PCR)技术,技术的复杂性远高于免疫学检测方法,核酸检测不易在一般实验室开展。
因此,目前临床实验室亟需要提供一种针对SARS-CoV-2中和抗体血清学检测的体外诊断试剂盒。
发明内容
本发明针对现有技术的不足,提供了一种用于检测新型冠状病毒中和抗体的受体试剂以及应用,采用含有所述受体试剂的试剂盒检测新型冠状病毒抗体时操作简便,灵敏度、特异性和准确度高,可用于新型冠状病毒中和抗体的批量、快速检测。
为此,本发明第一方面提供了一种用于检测新型冠状病毒中和抗体的受体试剂,其包括能够与活性氧反应产生可检测的化学发光信号的受体微球,所述受体微球的内部填充有化学发光剂,所述受体微球的表面连接有新型冠状病毒RBD蛋白。
在本发明的一些实施方式中,所述受体微球在受体试剂中的Zeta电位在-5mV至-60mV电位之间。
在本发明的一些优选的实施方式中,所述受体微球在受体试剂中的Zeta电位在-5.1mV至-49.4mV电位之间。
在本发明的一些更优选的实施方式中,所述受体微球在受体试剂中的Zeta电位在-25.4mV至-49.4mV电位之间。
在本发明的一些最优选的实施方式中,所述受体微球在受体试剂中的Zeta电位在-32.7mV至-49.4mV电位之间。
在本发明的一些实施方式中,所述受体微球的表面包被有多糖,所述新型冠状病毒RBD蛋白与多糖相连,且每毫克所述受体微球的总糖含量不低于25微克;优选地,每毫克所述受体微球的总糖含量不低于30微克;进一步优选地,每毫克所述受体微球的总糖含量不低于35微克。
在本发明的另一些实施方式中,所述糖含量是通过蒽酮法检测的。
在本发明的一些优选的实施方式中,所述糖选自含有三个或更多个未修饰或修饰的单糖单元的碳水化合物,优选选自葡聚糖、淀粉、糖原、菊粉、果聚糖、甘露聚糖、琼脂糖、半乳聚糖、羧基葡聚糖和氨基葡聚糖;更优选选自葡聚糖、淀粉、糖原和聚核糖。
在本发明的一些实施方式中,所述受体微球与新型冠状病毒RBD蛋白的质量比为10:(0.3~0.6);优选为10:(0.4~0.5)。
在本发明的另一些实施方式中,所述受体试剂中受体微球-新型冠状病毒RBD蛋白的浓度为40-60μg/mL;优选为45~50μg/mL。
本发明第二方面提供了一种用于检测新型冠状病毒中和抗体的试剂盒,其包括:
试剂1,其为如本发明第一方面所述受体试剂;
试剂2,其包含与特异性配对成员中的一员结合的人ACE2蛋白。
在本发明的一些实施方式中,所述试剂2中特异性配对成员中的一员-人ACE2蛋白的浓度为0.3~0.6μg/mL;优选为0.4~0.5μg/mL。
在本发明的一些优选的实施方式中,所述特异性配对成员选自抗体、抗体片段、配体、寡核苷酸、寡核苷酸结合蛋白、凝集素、半抗原、抗原、免疫球蛋白结合蛋白、抗生物素蛋白、亲和素或生物素组成的一对物质;优选地,所述特异性配对成员为生物素-亲和素。
在本发明的一些具体实施方式中,所述生物素选自带有不同活化基团的生物素,优选选自能与氨基反应的带NHS活化基团的生物素,更优选为NHS-LC-LC-生物素。
本发明第三方面提供了一种利用如本发明第二方面所述的试剂盒检测样本中新型冠状病毒中和抗体的方法,其包括:通过使待测样本中的新型冠状病毒中和抗体与受体微球-新型冠状病毒RBD蛋白结合,进而阻止受体微球-新型冠状病毒RBD蛋白与特异性配对成员中的一员-人ACE2蛋白结合,使得受体微球-新型冠状病毒RBD蛋白-人ACE2蛋白-供体微球的复合物减少,进而使得反应生成可检测的化学发光信号值降低,根据化学发光信号值的抑制率,判断待测样本中是否存在新型冠状病毒中和抗体。
在本发明的一些实施方式中,当化学发光信号值的抑制率≥50%时,结果判定为阳性;当化学发光信号值的抑制率<50%时,结果判定为阴性。
本发明的有益效果为:本发明通过模拟RBD蛋白进入细胞过程,采用竞争法原理,进行中和抗体检测。人ACE2为构象依赖型蛋白,其与RBD蛋白结合位点为构象表位,常规包被或标记易使其构象发生改变而无活性。本发明采用纳米光激化学发光法,通过将新型冠状病毒的RBD蛋白包被在受体微球上,人ACE2蛋白生物素化,使得人ACE2蛋白保持在液相中,并赋予其合适的液相环境,使其尽可能维持其天然构象,从而保证其活性。与核酸检测以及ELISA检测相比,本发明所提供的所述受体微球的试剂盒具有良好的敏感性、特异性,检测结果符合度高,且检测速度快,30min以内报告结果;检测通量大,可达到200-500测试/小时,适合于大规模样本检测。
附图说明
为使本发明容易理解,下面结合附图来说明本发明。
图1为糖含量测定的标准曲线。
图2为120例核酸阳性样本的光激化学发光法与ELISA信号比较图。
图3为不同时期样本不同稀释度抑制率测试结果图,显示了光激化学发光法和ELISA的趋势对比。
具体实施方式
为使本发明容易理解,下面将详细说明本发明。但在详细描述本发明前,应当理解本发明不限于描述的具体实施方式。还应当理解,本文中使用的术语仅为了描述具体实施方式,而并不表示限制性的。
在提供了数值范围的情况下,应当理解所述范围的上限和下限和所述规定范围中的任何其他规定或居间数值之间的每个居间数值均涵盖在本发明内。这些较小范围的上限和下限可以独立包括在较小的范围中,并且也涵盖在本发明内,服从规定范围中任何明确排除的限度。在规定的范围包含一个或两个限度的情况下,排除那些包括的限度之任一或两者的范围也包含在本发明中。
除非另有定义,本文中使用的所有术语与本发明所属领域的普通技术人员的通常理解具有相同的意义。虽然与本文中描述的方法和材料类似或等同的任何方法和材料也可以在本发明的实施或测试中使用,但是现在描述了优选的方法和材料。
本发明包含所述受体试剂的试剂盒,其模拟RBD蛋白进入细胞过程,采用竞争法原理,通过均相化学发光法检测新型冠状病毒中和抗体。光激化学发光属于均相化学发光,其是由光激发诱导的一个连续的化学反应和发光反应过程,供体微球和受体微球之间可借助能够特异性结合的物质的结合而相互靠近,为能量传递创造条件,在激光照射情况下产生光信号。相反,如未发生物质间的特异性结合,供体微球和受体微球之间将存在一定距离,受体微球不满足接受能量诱导发光的条件,故不产生光信号。因此,在不分离洗涤的情况下,直接检测光信号,光信号强度与物质间特异性结合呈正相关。光激化学发光分析是一种均相发光免疫分析,基于光激化学发光和物质间特异性结合的原理而建立的微量物质定量分析技术。全程无分离洗涤过程,简单快速,特点是采用“双球”和“双标”独特方式,固相微球的悬浮性能好,更利于微球均匀扩散,以及微球表面抗原分子与待检抗体或受体蛋白的相互碰撞结合。
在本发明的试剂盒中,首先选择RBD蛋白和人ACE2蛋白分别包被受体微球(FG-Ag)和生物素(Bio-Ag)(特异性配对成员中的一员),分别为受体试剂(试剂1)和捕获试剂(试剂2);用亲和素(特异性配对成员中的另一员)包被供体微球,作为通用溶液(供体试剂)。其次,于微孔内分别加入试剂1和试剂2,以及待检样品和质控品,启动第一阶段温浴后,于受体微球表面形成受体微球-新型冠状病毒RBD蛋白-人ACE2蛋白-生物素复合物;无需洗涤直接加入通用溶液,启动第二阶段温浴,生物素结合亲和素,两种微球相互靠近;此时,用激光束激发,诱导光激化学发光反应产生光信号。当加入待测样本后,若待测样本中含有新型冠状病毒中和抗体,待测样本中的新型冠状病毒中和抗体会与受体微球-新型冠状病毒RBD蛋白结合,进而阻止受体微球-新型冠状病毒RBD蛋白与生物素-人ACE2蛋白结合,使得受体微球-新型冠状病毒RBD蛋白-人ACE2蛋白-供体微球的复合物减少,进而导致反应生成可检测的化学发光信号值较阴性样本有所降低。
因此,本发明第一方面所涉及的用于检测新型冠状病毒中和抗体的受体试剂,其包括能够与活性氧反应产生可检测的化学发光信号的受体微球,其中,所述受体微球的内部填充有化学发光剂,所述受体微球的表面连接有新型冠状病毒RBD蛋白(也即受体微球-新型冠状病毒RBD蛋白)。
本发明所述用语“中和抗体”具有识别新型冠状病毒表面的棘突蛋白S的受体结合域RBD、阻断其与细胞表面血管紧张素转化酶2(ACE2)结合的功能。
本发明所述用语“受体微球”是指含有能够与活性氧反应可以产生可检测信号的化合物的微球。供体微球被能量或者活性化合物诱导激活并释放高能态的活性氧,该高能态的活性氧被近距离的受体颗粒俘获,从而传递能量以激活所述受体微球。所述受体微球可以带有不同官能团,如醛基、羧基、氨基等,优选可以和蛋白质游离氨基偶联的醛基受体微球和羧基受体微球,更优选醛基受体微球。
在本发明的另一些实施方式中,所述受体微球在受体试剂中的Zeta电位在-5mV至-60mV电位之间。在本发明的一些具体实施方式中,所述受体微球在受体试剂中的Zeta电位可以为-5mV、-5.1mV、-10mV、-15mV、-20mV、-25.4mV、-30mV、-32.7mV、-40mV、-49.4mV、-50mV或-60mV等。在本发明的一些优选的实施方式中,所述受体微球在受体试剂中的Zeta电位在-5.1mV至-49.4mV电位之间。在本发明的一些更优选的实施方式中,所述受体微球在受体试剂中的Zeta电位在-25.4mV至-49.4mV电位之间。在本发明的一些最优选的实施方式中,所述受体微球在受体试剂中的Zeta电位在-32.7mV至-49.4mV电位之间。本申请的发明人发现,精确控制受体微球在受体试剂中的Zeta电位在合适范围内,能够使试剂盒具有抗干扰能力强、测试性能佳的优点。
本发明所述的Zeta电位值是指受体微球在PH为6~9的分散体系中的电位值。微球的Zeta电位(Zeta potential)是指微球在剪切面处的电位;即连续相与附着在微球上的流体稳定层之间的电势差。由于分散粒子表面带有电荷而吸引周围的反号离子,这些反号离子在两相界面呈扩散状态分布而形成扩散双电层。根据Stern双电层理论可将双电层分为两部分,即Stern层和扩散层。Stern层定义为吸附在电极表面的一层离子(IHP or OHP)电荷中心组成的一个平面层,此平面层相对远离界面的流体中的某点的电位称为Stern电位。稳定层(Stationary layer)(包括Stern层和滑动面slipping plane以内的部分扩散层)与扩散层内分散介质(dispersion medium)发生相对移动时的界面是滑动面(slippingplane),该处对远离界面的流体中的某点的电位称为Zeta电位或电动电位(ζ-电位),即Zeta电位是连续相与附着在分散粒子上的流体稳定层之间的电势差。它可以通过电动现象直接测定。目前测量Zeta电位的方法主要有电泳法、电渗法、流动电位法以及超声波法,其中以电泳法应用最广。
本发明所述用语“活性氧”是指机体内或者自然环境中由氧组成,含氧并且性质活泼的物质的总称,主要为一种激发态的氧分子,包括氧的一电子还原产物超氧阴离子(O2·-)、二电子还原产物过氧化氢(H2O2)、三电子还原产物羟基自由基(·OH)以及一氧化氮和单线态氧(1O2)等。在本发明的一些具体实施方式中,所述活性氧可以为单线态氧。
在本发明的一些实施方式中,所述受体微球表面带有官能团;优选地,所述官能团选自醛基、羧基和氨基中的至少一种;进一步优选为醛基和/或羧基;更进一步优选为醛基。
在本发明的另一些实施方式中,所述受体微球的表面包被有多糖,所述新型冠状病毒RBD蛋白与多糖相连,且每毫克所述受体微球的总糖含量不低于25微克。
在本发明的一些优选的实施方式中,每毫克所述受体微球的总糖含量不低于30微克;优选地,每毫克所述受体微球的总糖含量不低于35微克。
在本发明的一些具体实施方式中,每毫克所述受体微球的总糖含量可以为25微克、30微克、35微克、40微克、49微克、50微克、80微克、100微克、150微克或200微克等。
在本发明的一些实施方式中,所述糖含量是通过蒽酮法检测的。
在本发明的一些优选的实施方式中,所述糖选自含有三个或更多个未修饰或修饰的单糖单元的碳水化合物,优选选自葡聚糖、淀粉、糖原、菊粉、果聚糖、甘露聚糖、琼脂糖、半乳聚糖、羧基葡聚糖和氨基葡聚糖;更优选选自葡聚糖、淀粉、糖原和聚核糖。
在本发明的一些实施方式中,所述受体微球与新型冠状病毒RBD蛋白的质量比为10:(0.3~0.6);优选为10:(0.4~0.5);更优选为10:0.4。
在本发明的一些具体实施方式中,所述受体试剂还包括缓冲液,所述受体微球悬浮于所述缓冲液中。
在本发明的一些实施方式中,所述受体试剂中受体微球-新型冠状病毒RBD蛋白的浓度为40-60μg/mL;优选为45~50μg/mL;更优选为50μg/mL。
本发明第二方面提供了一种用于检测新型冠状病毒中和抗体的试剂盒,其包括:
试剂1,其为如本发明第一方面所述受体试剂;
试剂2,其包含与特异性配对成员中的一员结合的人ACE2蛋白(也即特异性配对成员中的一员-人ACE2蛋白)。
在本发明的一些具体实施方式中,所述试剂2中还包含缓冲液,所述与特异性配对成员中的一员结合的人ACE2蛋白分散于缓冲液中。
在本发明的一些实施方式中,所述试剂2中特异性配对成员中的一员-人ACE2蛋白的浓度为0.3~0.6μg/mL;优选为0.4~0.5μg/mL;更优选为0.5μg/mL。
在本发明的一些具体的实施方式中,所述试剂盒还可以包括供体试剂,所述供体试剂包括供体微球,所述供体微球能够在激发状态下生成活性氧;优选地,所述供体试剂与特异性配对成员中的另一员结合。
本发明所述用语“供体微球”是指含有通过能量或者活性化合物的激活后能够产生与受体微球反应的诸如活性氧的活性中间体的敏化剂的微球。供体微球可以是光活化的(如染料和芳香化合物)或者化学活化的(如酶、金属盐等)。在本发明一些具体实施例中,所述供体微球为填充有光敏剂的高分子微球,所述光敏剂可以是本领域已知的光敏剂,优选相对光稳定且不与单线态氧有效反应的化合物,其非限定性的例子包括例如美国专利US5709994(该专利文献在此全文引为参考)公开的亚甲基蓝、玫瑰红、卟啉、酞菁和叶绿素等化合物,以及这些化合物的具有1-50个原子取代基的衍生物,所述取代基用于使得这些化合物更具有亲脂性或更具有亲水性、和/或作为连接至特异性结合配对成员的连接基团。本领域技术人员已知的其他光敏剂的例子也可以在本发明中使用,例如美国专利US6406913中记载的内容,该专利文献并入本文以供参考。
本发明所述用语“特异性配对成员”是指能够相互特异性结合的一对物质。本发明所述用语“特异性结合”,是指两种物质之间的相互辨别和选择性结合反应,从立体结构角度上说就是相应的反应物之间构象的对应性。
在本发明的一些具体实施方式中,所述特异性配对成员选自抗体、抗体片段、配体、寡核苷酸、寡核苷酸结合蛋白、凝集素、半抗原、抗原、免疫球蛋白结合蛋白、抗生物素蛋白、亲和素或生物素组成的一对物质;优选地,所述特异性配对成员为生物素-亲和素。
本发明所述用语“生物素”广泛存在于动植物组织中,其分子上有两个环状结构,分别为咪唑酮环和噻吩环,其中咪唑酮环是与链霉亲和素结合的主要部位。活化的生物素可以在蛋白质交联剂的介导下,与已知的几乎所有生物大分子偶联,包括蛋白质、核酸、多糖和脂类等。“亲和素”分子由4条相同的肽链组成,其中每条肽链都能结合一个生物素。因此每个抗原或抗体可同时偶联多个生物素分子,从而产生“触手效应”提高分析灵敏度。
在本发明的一些具体实施方式中,所述生物素选自带有不同活化基团的生物素,优选选自能与氨基反应的带NHS活化基团的生物素,更优选为NHS-LC-LC-生物素。
本发明第三方面提供了一种利用如本发明第二方面所述的试剂盒检测样本中新型冠状病毒中和抗体的方法,其包括:通过使待测样本中的新型冠状病毒中和抗体与受体微球-新型冠状病毒RBD蛋白结合,进而阻止受体微球-新型冠状病毒RBD蛋白与特异性配对成员中的一员-人ACE2蛋白结合,使得受体微球-新型冠状病毒RBD蛋白-人ACE2蛋白-供体微球的复合物减少,进而使得反应生成可检测的化学发光信号值较阴性对照样本的化学发光信号值降低,根据化学发光信号值的抑制率,判断待测样本中是否存在新型冠状病毒中和抗体。
在本发明的一些实施方式中,所述方法具体包括以下步骤:
S1,将待测样本、试剂1和试剂2混合,得到第一混合物;
S2,将供体试剂与第一混合物混合,得到第二混合物;
S3,用能量或者活性化合物处理第二混合物,激发供体微球产生活性氧,受体与活性氧反应生成可检测的化学发光信号;
S4,根据化学发光信号值的抑制率,判断待测样本中是否存在新型冠状病毒中和抗体。
在本发明的一些实施方式中,当化学发光信号值的抑制率≥50%时,结果判定为阳性,即检测结果为所述待测样本中含有新型冠状病毒中和抗体;当化学发光信号值的抑制率<50%时,结果判定为阴性,即检测结果为所述待测样本中不含有新型冠状病毒中和抗体。
本发明中,化学发光信号值的抑制率=(阴性对照信号–待测样本信号)/阴性对照信号。
本发明所述方法中,所述试剂混合后均可以根据需要进行温育。具体地,所述温育的温度可以是35-40℃,时间可以是10-20min;优选地,所述温育的温度可以选自36℃、37℃、38℃、39℃或40℃;温育的时间可以选自10min、12min、15min、18min或20min;更优选的所述温育的温度为37℃,步骤S1的温育时间为15min,步骤S2的温育时间为10min。
本发明中,所述待测样本、受体试剂和捕获试剂的加样量各自独立地为15-35uL;优选地,所述待测样本、受体试剂和捕获试剂的加样量各自独立地为15uL、18uL、20uL、22uL、25uL、28uL、30uL或35uL。更优选地,所述待测样本、受体试剂和捕获试剂的加样量均为25uL。
实施例
为使本发明更加容易理解,下面将结合实施例来进一步详细说明本发明,这些实施例仅起说明性作用,并不局限于本发明的应用范围。本发明中所使用的原料或组分若无特殊说明均可以通过商业途径或常规方法制得。
实施例1:受体微球的制备
1.1醛基聚苯乙烯乳胶微球的合成
准备100ml的三口烧瓶,加入40mmol苯乙烯、5mmol丙烯醛、10ml水,搅拌10min后通N2 30min;
1)称取0.11g过硫酸铵和0.2g氯化钠,溶于40ml水中配置成水溶液。将该水溶液加入到步骤1)的反应体系中,继续通N2 30min;
2)将反应体系升温至70℃,反应15小时;
3)将反应完成后的乳液冷却至室温,用合适的滤布过滤。得到的乳液用去离子水多次离心沉降清洗,直至离心初的上清液的电导率接近去离子水,然后用水稀释,以乳液形式保存。
1.2.发光组合物的填埋过程及表征
1)准备25ml的圆底烧瓶,加入0.1g二甲基噻吩衍生物和0.1g铕(Ⅲ)配合物(MTTA-EU3+),10ml 95%乙醇,磁力搅拌,水浴升温至70℃,获得配合物溶液;
2)准备100ml的三口烧瓶,加入10ml 95%乙醇、10ml水和10ml浓度为10%、步骤1.1中获得的醛基聚苯乙烯乳胶微球,磁力搅拌,水浴升温至70℃;
3)将步骤1)中的配合物溶液缓慢滴加至步骤2)中的三口烧瓶中,70℃反应2小时后停止搅拌,自然冷却;
4)将上述乳液离心1小时,30000G,离心后弃去上清液,得到填充有化学发光剂的醛基聚苯乙烯微球。
1.3受体颗粒的表面包被葡聚糖
1)取50mg氨基葡聚糖固体于20mL圆底烧瓶中,加入5mL 50mM/pH=10碳酸盐缓冲液,30℃避光搅拌溶解;
2)取100mg已制备好的填埋有发光组合物的醛基聚苯乙烯微球,加入到氨基葡聚糖溶液中搅拌2h;
3)将10mg硼氢化钠溶于0.5mL 50mM/pH=10碳酸盐缓冲液后滴加到上述反应液中,30℃避光反应过夜;
4)将反应后的混合液30000G离心后弃去上清液,加入50mM/pH=10碳酸盐缓冲液超声分散。重复离心清洗三次后用50mM/pH=10碳酸盐缓冲液定容,使其终浓度为20mg/mL;
5)取100mg醛基葡聚糖固体于20mL圆底烧瓶中,加入5mL 50mM/pH=10碳酸盐缓冲液,30℃避光搅拌溶解;
6)将上述微球加入到醛基葡聚糖溶液中搅拌2h;
7)将15mg硼氢化钠溶于0.5mL 50mM/pH=10碳酸盐缓冲液后滴加到上述反应液中,30℃避光反应过夜;
8)将反应后的混合液30000G离心后弃去上清液,加入50mM/pH=10碳酸盐缓冲液超声分散。重复离心清洗三次后用50mM/pH=10碳酸盐缓冲液定容,使其终浓度为20mg/mL。
9)由纳米粒度仪测得此时微球粒径的Gaussian分布平均粒径为241.6nm,变异系数(C.V)=12.90%。
实施例2:受体微球-新型冠状病毒RBD蛋白的制备
1)预处理:将待透析的新型冠状病毒RBD蛋白加入透析袋(3.5KD)中,夹紧透析袋,放入透析缓冲液中进行透析,2~8℃磁力搅拌不少于4小时,中间至少换液2次,每次透析液不少于100倍待透析物体积。
2)蛋白浓度测定:将透析好的蛋白吸出转移至干净离心管中,使用BCA蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度。
包被过程:
1)清洗:根据计划所需生产量量取实施例1制备的空白受体微球于离心管中,补入包被缓冲液(每10mg受体微球补包被缓冲液1mL)。放置高速冷冻离心机2~8℃,8000rpm,离心20分钟,弃上清。向离心管中加入包被缓冲液(每10mg受体微球补包被缓冲液1mL),超声至无可见固体悬浊颗粒。重复上述步骤(离心、去上清)1次。
2)包被:将处理好的受体微球及处理后的新型冠状病毒RBD蛋白混合(受体微球与新型冠状病毒RBD蛋白的质量比为10:0.4,用包被缓冲液定容至20mg/mL(受体微球浓度),超声分散后放入恒温培养箱内的多管可调式旋转混合器上,室温,25~40rpm,混匀14~18小时。
3)还原:迅速加入现配制的还原剂溶液(每10mg受体微球加入20μL),于多管可调式旋转混合器2~8℃,25~40rpm,反应2小时。
4)封闭:量取封闭剂溶液(每10mg受体微球加入160μL),加入反应液中,于多管可调式旋转混合器2~8℃,25~40rpm,反应1小时。
5)清洗:将包被好的受体微球补入发光清洗液(每10mg受体微球补1mL发光清洗液),离心管放置高速冷冻离心机2~8℃,8000rpm,离心20分钟,弃上清。向离心管中加入发光清洗液,超声至无可见固体悬浊颗粒。重复上述步骤(离心、弃上清)1次。向每支离心管中加入发光试剂缓冲液I(每10mg受体微球补1mL液体),超声分散。离心管放置高速冷冻离心机2~8℃,8000rpm,离心20分钟,弃上清。
7)定容:向每支离心管中加入发光试剂缓冲液I,将受体微球稀释至10mg/mL,超声分散至无可见悬浊颗粒。
8)保存:将定容后液体转移至棕色塑料瓶中,分装、标识,2~8℃保存备用,获得受体微球-新型冠状病毒RBD蛋白。
实施例3:生物素-人ACE2的制备
1)人ACE2透析:将待透析的人ACE2加入透析袋(3.5KD)中,夹紧透析袋,放入生物素标记缓冲液中进行透析,2~8℃磁力搅拌不少于4小时,中间至少换液2次,每次透析液不少于100倍待透析物体积。
2)蛋白浓度测定:将透析好的蛋白吸出转移至干净离心管中,使用BCA蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度。
3)标记反应:称取生物素使用DMSO溶解,浓度为5mg/mL。取处理好的人ACE2与配制好的生物素溶液,二者按照比例(每1mg人ACE2加入18μL浓度为5mg/mL生物素溶液)进行混合,迅速混匀。2~8℃旋混,25~40rpm反应14~18小时。
4)透析:将上述反应液加入透析袋(3.5KD)中,夹紧透析袋,放入生物素标记透析缓冲液中进行透析,2~8℃磁力搅拌不少于4小时,中间至少换液2次,每次透析液不少于100倍待透析物体积。
5)蛋白浓度测定:将透析好的蛋白吸出转移至干净离心管中,使用BCA蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度。
6)保存:加等体积甘油≤-15℃保存,分装、标识,获得生物素-人ACE2。
实施例4:试剂盒的制备
试剂1:使用稀释液稀释受体微球-新型冠状病毒RBD蛋白至50μg/mL,得试剂1;
试剂2:使用稀释液稀释生物素-人ACE2蛋白至0.5μg/mL,得试剂2。
实施例5:检测受体微球的糖含量
1)受体微球样品预处理:
分别取实施例4中含有1mg受体微球-新型冠状病毒RBD蛋白的试剂1,20000G离心40min,倒去上层清液后用纯化水超声分散,重复离心分散三次后用纯化水定容至1mg/mL,获得待测样品。
2)葡萄糖标准溶液的配制:
用纯化水将1mg/mL葡萄糖储备液配制成0mg/mL、0.025mg/mL、0.05mg/mL、0.075mg/mL、0.10mg/mL、0.15mg/mL的标准溶液。
3)蒽酮溶液的配制:用80%硫酸溶液配制成2mg/mL(此溶液室温下24h内稳定,现用现配)。
4)向离心管分别加入0.1mL各浓度的葡萄糖标准溶液及待测样品,每管各加1mL蒽酮试液。
5)85℃孵育30min。
6)将样品反应管15000G离心40min,移液器枪头从管底吸取澄清液体进行吸光度的测定,避免将上部悬浮物吸出。
7)恢复至室温,测量620nm的吸光度(测量最好在2h内进行)。
8)标准溶液的糖含量浓度与吸光度关系如表1所示,以标准溶液糖含量浓度为X值,吸光度为Y值,进行一次直线回归,获得如图1所示糖含量测定标准曲线,并以此为基础测定待测样品的糖含量浓度。
表1
序号 | 浓度mg/mL | 吸光度A | 吸光度B | 吸光度均值 |
1 | 0.15 | 0.415 | 0.411 | 0.4130 |
2 | 0.1 | 0.293 | 0.302 | 0.2975 |
3 | 0.075 | 0.214 | 0.227 | 0.2205 |
4 | 0.05 | 0.146 | 0.153 | 0.1495 |
5 | 0.025 | 0.101 | 0.098 | 0.0995 |
6 | 0 | 0.032 | 0.031 | 0.0315 |
检测结果为:受体微球的糖含量为49μg/mg微球。
实施例6:本发明所述试剂盒的使用方法
1)向微孔板中分别加入25uL待测样本,25uL试剂1和25uL试剂2,37℃
温育15min;
实施例7:试剂1中受体微球的Zeta电位的测定
利用NICOMP 380Z3000仪器,先经标准品标定后,对试剂1进行Zeta电位的测定,制备一系列不同Zeta电位的试剂1,然后利用实施例6中所示方法检测各试剂盒针对同一批样本,在博阳生物科技(上海)有限公司生产的HT光激化学发光仪器上比较信号水平,结果如表2所示。
表2
结果显示,所述受体微球在试剂1中的Zeta电位在-5mV至-60mV电位之间时上机检测信号平均水平较高,并且Zeta电位在-25mV至-50mV电位之间时上机检测信号平均水平更高。
实施例8:真实样本检测
以新型冠状病毒核酸阳性作为标准,用本试剂盒检测120例新型冠状病毒核酸阳性样本(检测结果判断标准是信号值的抑制率≥50%判定为阳性,<50%判定为阴性)。结果检出112例样本阳性,8例样本阴性,敏感性为93.3%,检测结果见表3;检测100例阴性样本,结果检出0例样本阳性,100例样本阴性,特异性99%,检测结果见表4。
用本试剂盒与金斯瑞ELISA试剂盒同时检测120例新型冠状病毒核酸阳性样本,对检测结果进行比对(见表3)(金斯瑞ELISA结果判断标准是OD值的抑制率≥20%判定为阳性,<20%判定为阳性);统计检测结果阳性符合率和阴性符合率均为100%(见表5)。以金斯瑞ELISA的OD值为横坐标、信号值为纵坐标作图,得出信号值与金斯瑞ELISA的OD值相关系数(R)为0.973(见图2)。
表3:120例核酸阳性样本检测结果
表4:100例核酸阴性样本检测结果
从阳性样本中选取不同样本留取时期的各一份,分别进行0、10、100、1000倍稀释,用本试剂盒与金斯瑞ELISA试剂盒同时对各样本进行检测,检测结果见表6;以稀释倍数的Log值为横坐标、抑制率为纵坐标作图,结果显示:不同时期样本,平台检测新型冠状病毒中和抗体趋势与金斯瑞ELISA接近(见图3)。
表6:不同时期样本的抑制情况
应当注意的是,以上所述的实施例仅用于解释本发明,并不构成对本发明的任何限制。通过参照典型实施例对本发明进行了描述,但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇,而不是限定性词汇。可以按规定在本发明权利要求的范围内对本发明作出修改,以及在不背离本发明的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本发明涉及特定的方法、材料和实施例,但是并不意味着本发明限于其中公开的特定例,相反,本发明可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。
Claims (12)
1.一种用于检测新型冠状病毒中和抗体的受体试剂,其包含够与活性氧反应产生可检测的化学发光信号的受体微球;所述受体微球的内部填充有化学发光剂,所述受体微球的表面连接有新型冠状病毒RBD蛋白。
2.根据权利要求1所述的受体试剂,其特征在于,所述受体微球在受体试剂中的Zeta电位在-5mV至-60mV电位之间;优选在-5.1mV至-49.4mV电位之间;更优选在-25.4mV至-49.4mV电位之间;最优选在-32.7mV至-49.4mV电位之间。
3.根据权利要求1或2所述的受体试剂,其特征在于,所述受体微球的表面包被有多糖,所述新型冠状病毒RBD蛋白与多糖相连,且每毫克所述受体微球的总糖含量不低于25微克;优选地,每毫克所述受体微球的总糖含量不低于30微克;进一步优选地,每毫克所述受体微球的总糖含量不低于35微克。
4.根据权利要求3所述的受体试剂,其特征在于,所述糖含量是通过蒽酮法检测的;
优选地,所述糖选自含有三个或更多个未修饰或修饰的单糖单元的碳水化合物,优选选自葡聚糖、淀粉、糖原、菊粉、果聚糖、甘露聚糖、琼脂糖、半乳聚糖、羧基葡聚糖和氨基葡聚糖;更优选选自葡聚糖、淀粉、糖原和聚核糖。
5.根据权利要求1-4任意一项所述的受体试剂,其特征在于,所述受体微球与新型冠状病毒RBD蛋白的质量比为10:(0.3~0.6);优选为10:(0.4~0.5)。
6.根据权利要求1-5中任意一项所述的受体试剂,其特征在于,所述受体试剂中受体微球-新型冠状病毒RBD蛋白的浓度为40-60μg/mL;优选为45~50μg/mL。
7.一种用于检测新型冠状病毒中和抗体的试剂盒,其包括:
试剂1,其为如权利要求1~6中任意一项所述受体试剂;
试剂2,其包含与特异性配对成员中的一员结合的人ACE2蛋白。
8.根据权利要求7所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂2中特异性配对成员中的一员-人ACE2蛋白的浓度为0.3~0.6μg/mL;优选为0.4~0.5μg/mL。
9.根据权利要求7或8所述的试剂盒,其特征在于,所述特异性配对成员选自抗体、抗体片段、配体、寡核苷酸、寡核苷酸结合蛋白、凝集素、半抗原、抗原、免疫球蛋白结合蛋白、抗生物素蛋白、亲和素或生物素组成的一对物质;优选地,所述特异性配对成员为生物素-亲和素。
10.根据权利要求9所述的试剂盒,其特征在于,所述生物素选自带有不同活化基团的生物素,优选选自能与氨基反应的带NHS活化基团的生物素,更优选为NHS-LC-LC-生物素。
11.一种利用如权利要求7-10中任意一项所述的试剂盒检测样本中新型冠状病毒中和抗体的方法,其包括:通过使待测样本中的新型冠状病毒中和抗体与受体微球-新型冠状病毒RBD蛋白结合,进而阻止受体微球-新型冠状病毒RBD蛋白与特异性配对成员中的一员-人ACE2蛋白结合,使得受体微球-新型冠状病毒RBD蛋白-人ACE2蛋白-供体微球的复合物减少,进而使得反应生成可检测的化学发光信号值降低,根据化学发光信号值的抑制率,判断待测样本中是否存在新型冠状病毒中和抗体。
12.根据权利要求11所述的方法,其特征在于,当化学发光信号值的抑制率≥50%时,结果判定为阳性;当化学发光信号值的抑制率<50%时,结果判定为阴性。
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