CN113390810A - 一种鲜烟叶的烟碱提取方法及烟碱含量测定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于烟碱含量的测定技术领域。针对现有对烟碱含量对测定方法需要对新鲜烟叶进行烤制或杀青,步骤繁琐,耗时长,效率低的问题,本发明提供一种鲜烟叶的烟碱提取方法及烟碱含量测定方法,将鲜叶样品液氮研磨后,先用18.5%盐酸提取,后用等体积水稀释盐酸至9%并加5%的活性炭进行二次提取,该方法可实现鲜烟叶样品的烟碱快速提取及含量测定,可排除鲜烟叶中杂质对测定结果的影响,操作简便,可在短时间内完成鲜烟叶的烟碱含量测定,能应用于大规模鲜烟叶样品的烟碱含量检测。

Description

一种鲜烟叶的烟碱提取方法及烟碱含量测定方法
技术领域
本发明属于烟碱含量的测定技术领域,具体涉及一种鲜烟叶的烟碱提取方法及烟碱含量测定方法。
背景技术
烟碱又名尼古丁,是一种存在于茄科植物中的含氮生物碱,占烟草栽培品种生物碱总量的90~95%。烟碱是烟叶吃味的来源,能刺激吸烟者的味觉感官,使之获得生理满足感,是决定烟叶感官品质和工业可用性的重要因素。烟碱是衡量烟叶品质的重要要素之一,直接影响烟草制品的生理强度、烟气特征和安全性,对烟叶香气品质也有重要影响,其含量与香气量的关系呈极显著正相关。目前,优质烟叶的烟碱含量约1.5%~3.5%。
基于烟碱对于烟叶的重要影响,其含量的测定成为烟草行业比较重要的内容。烟叶中的烟碱含量测定方法很多,例如紫外分光光度法、硅钨酸沉淀法、GC/MS法、高效液相色谱等,这些方法样品处理复杂,需要烤制或杀青干叶,实验步骤多,耗时长,且对仪器和设备要求较高。现在通用的酸提方法是在粉碎的干样中加入活性炭和硫酸震荡提取,需要杀青或烤制干叶,需要的测定时间较长。目前,实验室中的鲜烟叶杀青处理需要使用烘箱来完成,而烘箱本身空间有限,当处理样品数量较多时,就无法一次性完成所有烟叶的杀青,极大限制了实验进度的推进。此外,杀青之后的研磨处理也是一个耗时费力的过程,并且已杀青完的烟叶若不及时处理非常容易回潮,则需重新烘干烟叶中的水分。此外,也有人提出《一种非水蒸气蒸馏法测定烟碱含量的方法》,相对而言,过程繁琐,效率低下。因此,开发一种能够不杀青、快速且高效的测定鲜烟叶烟碱的方法尤为重要。
发明内容
针对现有的烟碱含量的测定方法需要对新鲜烟叶进行烤制或杀青,步骤繁琐,耗时长,效率低的上述问题,本发明提供一种鲜烟叶的烟碱提取方法及烟碱含量测定方法,该方法操作方便,成本低,设备要求低,极大地提高了烟碱含量的测定效率,非常适用于大批量的烟叶烟碱含量水平比较,对于不同的选育品种中烟碱含量的测定高效且方便。
本发明是通过以下技术方案实现的:
本发明一方面提供一种鲜烟叶的烟碱提取方法,采用酸提倍释法,包括如下步骤:
(1)取新鲜的烟叶,液氮研磨后,加入体积为vmL浓度16%-22%的盐酸,混匀,室温提取(即酸提);
(2)高速离心,取上清液,将上清液用等体积的水稀释(即倍释),并加入活性炭,活性炭的终浓度为5%,混匀;
(3)高速离心,取上清液,每1mL上清液加入2mL浓度为8%-11%的盐酸中,混匀,室温二次提取;
(4)高速离心,取上清液,既为烟碱提取液。
本发明另一方面提供一种鲜烟叶的烟碱含量测定方法,该测定方法在上述的酸提倍释法的基础上,还包括如下步骤:
(5)测定烟碱提取液在259nm,236nm和282nm处的吸光度;将叶片含水率一致设定为90%,根据下列公式计算样品的烟碱含量:
Figure BDA0003167416380000021
式中,1.059为校正系数;34.3为烟碱在水溶液中的比消光系数;A259、A236和A282表示吸光度测定值。
进一步的,所述步骤(1)盐酸的浓度为18.5%。
进一步的,所述步骤(1)每0.3g新鲜的烟叶,液氮研磨后,用2mL的盐酸稀释,室温提取3min。
进一步的,所述步骤(3)盐酸的浓度为9%。
进一步的,所述步骤(2)、(3)和(4)离心速度为12000-14000rpm。
进一步的,所述步骤(2)、(3)和(4)离心速度均为13000rpm,离心时间均为5min。
本发明的方法可实现鲜烟叶样品的烟碱快速提取及含量测定,可排除鲜烟叶中杂质对测定结果的影响,操作简便,可在30min之内完成鲜烟叶的烟碱含量测定,并能应用于大规模鲜烟叶样品的烟碱含量检测。实测表明,3个人一天可以完成500份以上鲜烟叶样品的烟碱提取及烟碱含量测定,若用GC/MS法完成相同样本数量的烟碱提取及烟碱含量测定则需10天以上的时间。
本方法是用于鲜叶烟碱含量测量的简便方法,用于比较的样品尽可能从相同部位采集(将样品含水量影响降至最低):一般以从上往下数第n片做一致性标记。必要时可多取一份样品用于含水量测定。
通过本发明中所提供的方法处理后的样本提取液具有良好的稳定性,无论是通过等比放大或缩小提取过程中各试剂的用量,还是将提取液在室温下放置过夜后,最终测定结果仍然是稳定。
附图说明
图1为实施例1本发明方法与GC/MS方法对鲜烟叶烟碱含量检测结果比较;
图2为实施例2等比例缩小(0.5×体系)与原体系(1×体系)测定结果比较;
图3为实施例2等比例放大(2×体系)与原体系(1×体系)测定结果比较;
图4为实施3提取完成之时(0h)和放置过夜(24h)的测定结果比较;
图5为实施例4不同的处理方式下提取效果及透光率的差异。
图6为实施例4不同的活性炭浓度对于烟碱含量测定的影响。
具体实施方式
下面结合具体实施例及附图对本发明做进一步详细说明。
需要说明的是,下述实施方案中所述实验方法,如无特殊说明,均为常规方法,所述试剂和材料,如无特殊说明,均可从商业途径获得。
实施例1:快速测定田间烟草植株叶片中的烟碱含量
取常规品种和低烟碱品种的烟叶样品,每株烟草从上到下第四片烟叶作为标记,每个品种随机取10株样品,每片鲜叶分别采用本发明所展示方法进行处理,具体如下:取0.3g鲜叶于液氮中充分研磨后,全部转入2mL 18.5%盐酸中,充分混匀,室温提取3min。13000rpm离心5min,将上清全部转入新的离心管中,加入2mL去离子水,加入0.06g活性炭粉末(终浓度5%)。13000rpm离心5min,将吸取1mL上清液至新的离心管中,加入2mL 9%盐酸,充分混匀。13000rpm离心5min,将上清液转移到新的离心管中,分别测定其在259nm(A259),236nm(A236)和282nm(A282)处的吸光度,并根据公式:
Figure BDA0003167416380000031
计算得出这些样品的烟碱含量,具体见下表:
表1:田间10株样品烟碱含量测定结果(本发明的测定方法)
Figure BDA0003167416380000032
Figure BDA0003167416380000041
同时,采用GC/MS法进行对比验证。GC/MS法的操作步骤如下:将新鲜烟叶杀青,取10mg均匀的干叶样品在1mL 10%NaOH(w/v)溶液中浸泡20分钟,然后加入等量的二氯甲烷,涡旋震荡,离心后收集有机层。使用Agilent Technologies 7890A色谱仪进行烟碱含量测定,使用DB 5MS柱和Agilent Technologies 5975C MSD检测器,载气为氦气。柱子先在100℃下保持5min,然后以50℃/min的速度增加至210℃,然后在210℃保持4min。离子源温度为230℃,四极温度为150℃。以Sigma-Aldrich的烟碱纯品为标准对照。
本发明中的测定方法与现有GC/MS方法检测结果对比如附图1所示。本发明的测定方法与GC/MS方法对烟碱检测结果差异不大,差值在10%以内,因此推断采用本发明中的鲜烟叶烟碱测定方法是可靠的。
实施例2:等比缩放实验
本发明的测定方法,在试剂用量在等比缩放后仍具有较高的稳定性,因此可以在较小或者较大的体系下完成烟碱含量测定。
(一)以下展示的是对本发明中快速测定鲜叶中烟碱含量的方法中所使用的试剂用量经过等比例缩小后测定某田间烟草植株叶片中的烟碱含量。
以每株烟草从上到下第四片烟叶作为标记,取若干植株,每片鲜叶分别采用本发明所展示的方法进行处理:取0.15g鲜叶于液氮中充分研磨后,全部转入1mL 18.5%盐酸中,充分混匀,室温提取3min。13000rpm离心5min,将上清全部转入新的离心管中,加入1mL去离子水,加入0.03g活性炭粉末(终浓度5%)。13000rpm离心5min,将吸取1mL上清液至新的离心管中,加入2mL 9%盐酸,充分混匀。13000rpm离心5min,将上清液转移到新的离心管中,分别测定其在259nm(A259),236nm(A236)和282nm(A282)处的吸光度,并根据公式:
Figure BDA0003167416380000042
计算得出这些样品的烟碱含量。等比例缩小(0.5×体系)与原体系(1×体系)对比结果如图2所示,二者并没有显著性差异。这说明等比缩放后提取液仍具有较高的稳定性,且与原体系差异不大,进一步说明提取方法的可靠性。
(二)以下展示的是对本发明中快速测定鲜叶中烟碱含量的方法中所使用的试剂用量经过等比例放大后测定某田间烟草植株叶片中的烟碱含量。
以每株烟草从上到下第四片烟叶作为标记,取若干植株,每片鲜叶分别采用本发明所展示的方法进行处理:取0.6g鲜叶于液氮中充分研磨后,全部转入4mL 18.5%盐酸中,充分混匀,室温提取3min。13000rpm离心5min,将上清全部转入新的离心管中,加入1mL去离子水,加入0.03g活性炭粉末(终浓度5%)。13000rpm离心5min,将吸取1mL上清液至新的离心管中,加入2mL 9%盐酸,充分混匀。13000rpm离心5min,将上清液转移到新的离心管中,分别测定其在259nm(A259),236nm(A236)和282nm(A282)处的吸光度,并根据公式:
Figure BDA0003167416380000051
计算得出这些样品的烟碱含量。
等比例放大(2×体系)与原体系(1×体系)对比结果如图3所示,二者并没有显著性差异。这说明等比缩放后提取液仍具有较高的稳定性,且与原体系差异不大,进一步说明提取方法的可靠性。
实施例3:稳定性实验
本发明中所提供的方法处理后的样本提取液具有良好的稳定性,将提取液在室温下放置过夜后,最终测定结果仍然是稳定。以下展示的是在本发明中快速测定鲜叶中烟碱含量的方法中,将提取液放置24h后的测定结果。具体如下:以每株烟草从上到下第四片烟叶作为标记,每片鲜叶分别采用本发明所展示方法进行处理,具体如下:取0.3g鲜叶于液氮中充分研磨后,全部转入2mL 18.5%盐酸中,充分混匀,室温提取3min。13000rpm离心5min,将上清全部转入新的离心管中,加入2mL去离子水,加入0.06g活性炭粉末(终浓度5%)。13000rpm离心5min,将吸取1mL上清液至新的离心管中,加入2mL 9%盐酸,充分混匀。13000rpm离心5min,将上清液转移到新的离心管中,分别在提取完成之时(0h)和放置过夜(24h)测定其在259nm(A259),236nm(A236)和282nm(A282)处的吸光度,并根据公式:
Figure BDA0003167416380000061
计算得出这些样品的烟碱含量。提取完成之时(0h)和放置过夜(24h)烟碱含量统计结果如图4所示,二者并没有显著性差异。这说明提取液具有较高的稳定性,放置过夜仍能测定出较为准确的烟碱含量,进一步说明提取方法的可靠性。
实施例4活性炭对透光度和测定结构的影响
操作步骤:
(1)取新鲜的烟叶0.3g,液氮研磨后,全部加入2mL 18.5%盐酸,充分混匀,室温提取3min。
(2)13000rpm离心5min,将上清倒入含有约0.2mL体积活性炭(0.06g)2mL去离子水的离心管中,混和均匀。
(3)13000rpm离心5min,转移1mL上清至已加入2mL 9%盐酸的离心管中。
(4)13000rpm离心5min,将上清倒入新的离心管,尽量避免倒出残余活性炭。
附图5为对比不同的处理方式下提取效果及透光率的差异。
其中酸提一次指的是只加入一次18.5%盐酸进行提取,不进行操作步骤(3),酸提两次指的是在酸提一次的基础上,再次加入盐酸进行提取,进行操作步骤(3)。加入活性炭之后,能明显提高样品的透光度;提取液具有良好的稳定性,放置24小时并不影响样品的透光度。
附图6为不同的活性炭浓度对于烟碱含量测定的影响。
其中对照为已知浓度的烟碱样品,2%活性炭、5%活性炭、8%活性炭、10%活性炭分别为提取液中加入终浓度为2%、5%、8%、10%的活性炭。加入终浓度2%活性炭的样品测定值偏高,与其吸附能力较差有关,加入终浓度8%和10%活性炭的样品测定值偏低,与活性炭对烟碱吸附量有关,而加入终浓度5%的活性炭样品则与实际样品含量接近,因此终浓度5%的活性炭为最佳实验用量。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选实施方式进行描述,并非对本发明的范围进行限定,在不脱离本发明设计精神的前提下,本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进,均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (7)

1.一种鲜烟叶的烟碱提取方法,其特征在于,采用酸提倍释法,包括如下步骤:
(1)取新鲜的烟叶,液氮研磨后,加入体积为v mL浓度16%-22%的盐酸,混匀,室温提取;
(2)高速离心,取上清液,将上清液用等体积的水稀释,并加入活性炭,活性炭的终浓度为5%,混匀;
(3)高速离心,取上清液,每1mL上清液加入2mL浓度为8%-11%的盐酸中,混匀,室温二次提取;
(4)高速离心,取上清液,既为烟碱提取液。
2.一种鲜烟叶的烟碱含量测定方法,其特征在于,该测定方法包括权利要求1所述的酸提倍释法,还包括如下步骤:
(5)测定烟碱提取液在259nm,236nm和282nm处的吸光度;将叶片含水率一致设定为90%,根据下列公式计算样品的烟碱含量:
Figure FDA0003167416370000011
式中,1.059为校正系数;34.3为烟碱在水溶液中的比消光系数;A259、A236和A282表示吸光度测定值。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于,所述步骤(1)盐酸的浓度为18.5%。
4.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,所述步骤(1)每0.3g新鲜的烟叶,液氮研磨后,用2mL的盐酸稀释,室温提取3min。
5.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,所述步骤(3)盐酸的浓度为9%。
6.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于,所述步骤(2)、(3)和(4)离心速度为12000-14000rpm。
7.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,所述步骤(2)、(3)和(4)离心速度均为13000rpm,离心时间均为5min。
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