CN113387963A - 一种β-咔啉类化合物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种β‑咔啉类化合物及其制备方法和应用，所述β‑咔啉类化合物的结构式为

本发明提供一种新型的β‑咔啉类化合物，通过在β‑咔啉结构基础上加入1,10‑菲罗啉基团，能够显著提高β‑咔啉类化合物对癌细胞的生物活性，对肺癌、***、肝癌、乳腺癌等癌细胞具有很好的抑制作用。

Description

一种β-咔啉类化合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，尤其涉及一种β-咔啉类化合物及其制备方法和应用。

背景技术

生物碱是一类重要的天然化合物，广泛存在于植物、动物、海洋生物、甚至人的血液和组织中，其结构复杂且具有良好的生物活性。咔啉是吡啶并吲哚类生物碱，按照环合的方式不同可分为α、β、γ-咔啉。其中β-咔啉生物碱广泛存在自然界当中，数量最多。

自从第一个β-咔啉生物碱Harman从蒺藜科植物骆驼蓬中发现以来，每年都有大量新型β-咔啉类被分离提取出来，其主要分布在植物和海洋生物中，大多数活性良好。β-咔啉生物碱含稠环，具有高度共轭体系，大多数呈现黄色粉末状，而且具有强荧光。β-咔啉类生物碱不仅结构新颖，具有碱性，可以与酸成盐，易于体内吸收；而且也具有良好的生化活性，如可制成抗癌酶抑制剂，具有抗血栓，抗病毒，杀菌抗炎等活性。

抗肿瘤药物长期以来一直备受关注。研究表明，β-咔啉生物碱具有明显抑制癌细胞增殖的活性，在抑制肿瘤新生血管上有较为显著的作用。相关技术报道，β-咔啉生物碱对中枢神经***有作用，β-咔啉衍生物能抑制拓扑异构酶I和II，是细胞周期性蛋白依赖性激酶(CDK)的特异性抑制剂，其抑制活性与结构中芳杂环的全芳香性有着至关重要的关系。将β-咔啉环引入DNA靶向性的侧链，嵌入DNA分子中，能够下调Bcl-2的表达，在不改变Bax和p53表达的基础上，促进死亡受体Fas的表达，β-咔啉具有良好的抗肿瘤活性。

随着β-咔啉生物碱的不断被发现，他们存在各种各样的生物活性，但单纯从动植物中提取，不仅含量少而且成本高，难度极大，这就需要有机合成来大量制备。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种新型的β-咔啉类化合物，同时还提供该β-咔啉类化合物的制备方法和应用。

具体地，本发明采取的技术方案如下：

本发明的第一方面是提供一种β-咔啉类化合物，所述β-咔啉类化合物具有如下式I所示结构式：

其中，所述X包括芳基，Y包括H、C_1～10的直链或带支链的烷基、C_1～10的直链或带支链的取代烷基。本发明所述的芳基指的是含有芳香环的基团，而芳香环包括芳香单环、芳香多环、芳香杂环等。

根据本发明第一方面的β-咔啉类化合物，至少具有如下有益效果：

本发明通过在β-咔啉结构基础上加入1,10-菲罗啉基团，能够显著提高β-咔啉类化合物对癌细胞的生物活性。

在本发明的一些实施方式中，所述X选自如下基团：

本发明的第二方面是提供上述β-咔啉类化合物的制备方法，合成路线为：

具体的制备方法包括如下步骤：

(1)化合物1与氯化亚砜反应得到化合物2；

(2)化合物2与

反应得到化合物3；

(3)化合物3与对甲基苯磺酰氯反应得到化合物4；

(4)化合物4在碱性条件下加热形成化合物5；

(5)化合物5水解得到化合物6；

(6)化合物6与1,10-菲罗啉-5-氨基反应得到化合物I，即β-咔啉类化合物。

根据本发明第二方面的制备方法，至少具有如下有益效果：

本发明的制备方法中，以色氨酸类化合物为原料，与氯化亚砜反应形成希夫碱(化合物2，色氨酸甲酯盐酸盐)，避免了直接使用HCl气体，制备方法更加安全。化合物2在路易斯酸的催化作用下，环化得到四氢β-咔啉结构(化合物3)。运用对甲基苯磺酰氯对化合物3进行取代，进而消除氧化，即得β-咔啉结构(化合物5)。在氧化过程中不使用强氧化剂和金属，条件温和，且反应无敏感基团。最后，将通过与1,10-菲罗啉-5-氨基缩合反应，对β-咔啉结构进行修饰，可增加其抗肿瘤活性。

在本发明的一些实施方式中，步骤(1)中，所述化合物1与氯化亚飒的摩尔比为1：1～1.5；反应温度为50～110℃，反应时间为5～10h。在实际操作中，可将化合物1溶于有机溶剂(如甲醇、苯、氯仿、四氯化碳、二氯甲烷等)中，在10℃以下温度(如冰浴条件下)加入氯化亚砜，然后在50～110℃下加热回流，反应结束后除去溶剂，清洗、干燥得到化合物2。

在本发明的一些实施方式中，步骤(2)中，所述化合物2与

的摩尔比为1：1～1.5；所述反应的温度为60～100℃，反应的时间为5～20h，优选10～15h；所述反应在保护氛围下进行。

在本发明的一些实施方式中，步骤(3)中，所述化合物3与对甲基苯磺酰氯的摩尔比为1：1～1.5；所述反应的温度为5～40℃，反应的时间为2～10h，优选3～5h。所述反应在碱性催化剂存在下进行，所述碱性催化剂与对甲基苯磺酰氯的比例为1μL：1～1.5mmol。所述碱性催化剂包括吡啶、三乙胺、碳酸钾、1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯(DBU)中的任意一种或多种。在实际操作中，可在低温下(如-10～0℃)加入吡啶等碱性催化剂和对甲基苯磺酰氯。

在本发明的一些实施方式中，步骤(4)中，所述碱性条件的pH为8～12，在实际操作中，可通过加入碳酸钾、碳酸钠、氢氧化钠、氢氧化钾等碱性物质来形成所述碱性条件；所述加热温度为80～120℃，加热时间为3～5h。

在本发明的一些实施方式中，步骤(5)中，所述水解在pH为10～14的条件下进行。所述水解温度为80～110℃，水解时间为1～2h。水解结束后，加入酸将反应体系调节为弱酸性(pH＝3～5)。

在本发明的一些实施方式中，步骤(6)中，所述化合物6与1,10-菲罗啉-5-氨基的摩尔比为1：1～1.5；所述反应的温度为10～40℃，反应时间为20～24h。所述反应在活化剂存在下进行，所述活化剂包括1-羟基苯并***(HOBT)、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸(TBTU)、N,N-二异丙基乙胺(DIEA)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDCI)中的任意一种或多种。优选地，所述活化剂为HOBT、DIEA和EDCI的组合物，其比例可根据实际进行调整。作为示例，所述HOBT、DIEA和EDCI的比例为6～12mmol：400～600uL：6～12mmol。

本发明的第三方面是提供上述β-咔啉类化合物在制备抗癌药物中的应用。更具体地，提供上述β-咔啉类化合物在制备抗肺癌药物、抗***药物、抗肝癌药物、抗乳腺癌药物中的应用。

本发明的第四方面是提供一种药物组合物，所述药物组合物含有上述β-咔啉类化合物。

相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：

本发明提供一种新型的β-咔啉类化合物，通过在β-咔啉结构基础上加入1,10-菲罗啉基团，能够显著提高β-咔啉类化合物对癌细胞的生物活性，对肺癌、***、肝癌、乳腺癌等癌细胞具有很好的抑制作用。

本发明的β-咔啉类化合物制备工艺简单，条件温和，产率、纯度高，容易实现并适用于规模化生产。

附图说明

图1为实施例1中化合物6(4-BrPβCA)的核磁谱图；

图2为实施例1中化合物I(4-BrPPβC)在pH分别为7.50～8.50(1)、11.50～12.50(2)和2.30～3.30(3)下的紫外吸收光谱；

图3为实施例1中化合物I(4-BrPPβC)的核磁谱图；

图4为实施例2中化合物6(4-ClPβCA)的核磁谱图；

图5为实施例2中化合物I(4-ClPPβC)在pH分别为7.50～8.50(1)、11.50～12.50(2)和2.30～3.30(3)下的紫外吸收光谱；

图6为实施例2中化合物I(4-ClPPβC)的核磁谱图；

图7为实施例3中化合物6(4-FPβCA)的核磁谱图；

图8为实施例3中化合物I(4-FPPβC)在pH分别为7.50～8.50(1)、11.50～12.50(2)和2.30～3.30(3)下的紫外吸收光谱；

图9为实施例3中化合物I(4-FPPβC)的核磁谱图；

图10为实施例1的化合物I(4-BrPPβC)的Hoechst 33342染色试验结果。

图11为实施例1的化合物I(4-BrPPβC)Annexin V染色实验。

图12为实施例1的化合物I(4-BrPPβC)的活性氧染色实验。

具体实施方式

以下结合具体的实施例进一步说明本发明的技术方案。

实施例1

β-咔啉类化合物4-BrPPβC的制备：

(1)化合物2的合成

将色氨酸(化合物1，0.82g，4mmol)溶于20mL甲醇，冰浴下滴加氯化亚砜(0.29ml，4mmol)，在100℃下冷凝回流7h，所得溶液减压蒸馏除去溶剂，乙酸乙酯漂洗，抽滤，烘干后得到白色粉末，产率90.6％。

(2)化合物3(4-BrP-4H-βC)的合成

在反应管中加入化合物2(1.019g，4mmol)，再加入4-溴苯甲醛(0.74g，4mmol)，溶于20mL异丙醇中，在氩气保护下80℃加热回流13h，所得液体减压蒸馏除去溶剂，加苯漂洗，抽滤，烘干得到淡黄色固体，产率94.3％。

(3)化合物4(4-BrP-N-Ts-4H-βC)的合成

将化合物3(1.54g，4mmol)溶于15mL二氯甲烷中，-5℃加入400μL吡啶和对甲基苯磺酰氯(0.76g，4mmol)，撤去冷冻后室温搅拌3h，减压蒸馏除去溶剂，用10mL10％碳酸钾溶液洗涤，无水硫酸镁干燥，石油醚淋洗，抽滤，得到黄色固体，产率96.0％。

(4)化合物5(4-BrPβC)的合成

将化合物4(2.16g，4mmol)溶于10mL二甲基亚砜中，加入碳酸钾(0.69g，5mmol)，80℃加热回流3h，反应结束后降至室温，加入水100mL，放置过夜，搅拌抽滤，水漂洗，干燥得到产物，产率80.0％。

(5)化合物6(4-BrPβCA)的合成

将化合物5(1.52g，4mmol)溶于乙醇：水(V/V＝1:2)(乙醇10mL，水20mL)，加入氢氧化钠(0.40g，12mmol)，80℃冷凝回流1h，反应后的溶液用HCl调节pH为5，抽滤，干燥得到黄色固体，产率70％。所得产物的核磁谱图如图1所示。

(6)化合物I(4-BrPPβC)的合成

将化合物6(1.49g，4mmol)加入HOBT(0.81g，6mmol)、DIEA(400uL)，1,10-菲罗啉-5-氨基(phen-NH₂，0.78g，4mmol)，再加入EDCI(1.15g，6mmol)，继续室温下反应20h，减压旋蒸，用水漂洗后抽滤，得到产物，产率85.8％，粗产物过硅胶柱纯化。所得产物在pH分别为7.50～8.50、11.50～12.50和2.30～3.30下的紫外吸收光谱依次如图2的曲线1～3所示；核磁谱图如图3所示。

实施例2

β-咔啉类化合物4-ClPPβC的制备：

(1)化合物2的合成

同实施例1。

(2)化合物3(4-ClP-4H-βC)的合成

在反应管中加入化合物2(2.03g，8mmol)，再加入4-氯苯甲醛(1.12g，8mmol)，溶于30mL异丙醇中，在氩气保护下100℃加热回流12h，所得液体减压蒸馏除去溶剂，加苯剧烈搅拌，抽滤，烘干得到淡黄色固体。

(3)化合物4(4-ClP-N-Ts-4H-βC)的合成

将化合物3(2.72g，8mmol)溶于15mL二氯甲烷中，-5℃下加入800μL吡啶和对甲基苯磺酰氯(1.52g，8mmol)，撤去冷冻后室温搅拌5h，减压蒸馏除去溶剂，用10mL10％碳酸钾溶液洗涤，无水硫酸镁干燥，石油醚淋洗，抽滤，得到黄色固体。

(4)化合物5(4-ClPβC)的合成

将化合物4(3.96g，8mmol)溶于5mL二甲基亚砜中，加入碳酸钾(0.97g，7mmol)，120℃加热回流5h，反应结束后降至室温，加入水100mL，放置过夜，搅拌抽滤，水漂洗，干燥得到产物。

(5)化合物6(4-ClPβCA)的合成

将化合物5(2.70g，8mmol)溶于乙醇：水(V/V＝1:2)(乙醇10mL)，加入氢氧化钠(0.8g，20mmol)，110℃冷凝回流，反应后的溶液用HCl调节pH为5，抽滤，干燥得到黄色固体。所得产物的核磁谱图如图4所示。

(6)化合物I(4-ClPPβC)的合成

将化合物5(2.58g，8mmol)加入HOBT(1.62g，12mmol)、DIEA(600uL)，phen-NH₂(1.56g，8mmol)，再加入EDCI(2.30g，12mmol)，继续室温下反应24h，减压旋蒸，用水漂洗后抽滤，得到产物，粗产物过硅胶柱纯化。所得产物在pH分别为7.50～8.50、11.50～12.50和2.30～3.30下的紫外吸收光谱依次如图5的曲线1～3所示；核磁谱图如图6所示。

实施例3

β-咔啉类化合物4-FPPβCD的制备：

(1)化合物2的合成

同实施例1

(2)化合物3(4-FP-4H-βC)的合成

在反应管中加入化合物2(1.02g，4mmol)，再加入4-氟苯甲醛(0.50g，4mmol)，溶于20mL异丙醇中，在氩气保护下60℃加热回流10h，所得液体减压蒸馏除去溶剂，加苯剧烈搅拌，抽滤，烘干得到淡黄色固体。

(3)化合物4(4-FP-N-Ts-4H-βC)的合成

将化合物3(1.30g，4mmol)溶于15mL二氯甲烷中，-5℃下加入400μL吡啶和对甲基苯磺酰氯(0.76g，4mmol)，撤去冷冻后室温搅拌3h，减压蒸馏除去溶剂，用10mL10％碳酸钾溶液洗涤，无水硫酸镁干燥，石油醚淋洗，抽滤，得到黄色固体。

(4)化合物5(4-FPβC)的合成

将化合物3(1.91g，4mmol)溶于8mL二甲基亚砜中，加入碳酸钾(0.69g，5mmol)，80℃加热回流4h，反应结束后降至室温，加入水100mL，放置过夜，搅拌抽滤，水漂洗，干燥得到产物。

(5)化合物6(4-FPβCA)的合成

将化合物5(1.28g，4mmol)溶于乙醇：水(V/V＝1:2)(乙醇10mL)，加入氢氧化钠(0.40g，12mmol)，80℃冷凝回流1h，反应后的溶液用HCl调节pH为5，抽滤，干燥得到黄色固体。所得产物的核磁谱图如图7所示。

(6)化合物I(4-FPPβC)的合成

将化合物6(1.22g，4mmol)加入HOBT(0.81g，6mmol)、DIEA(400uL)，phen-NH₂(0.78g，4mmol)，再加入EDCI(1.15g，6mmol)，继续室温下反应20h，减压旋蒸，用水漂洗后抽滤，得到产物，粗产物过硅胶柱纯化。所得产物在pH分别为7.50～8.50、11.50～12.50和2.30～3.30下的紫外吸收光谱依次如图8的曲线1～3所示；核磁谱图如图9所示。

生物活性测试

(1)对实施例1～3中的化合物6和化合物I的细胞毒性进行试验，试验方法如下：

细胞毒性实验采用MTT法测定：取处于对数生长期的A549、HeLa、HepG-2、MCF-7、BEAS-2B细胞以5×10³/孔均匀接种于96孔板，预培养24h。待细胞贴壁，更换培养基，分别以浓度梯度的方式加入4-BrPβCA、4-BrPPβC、4-ClPβCA、4-ClPPβC、4-FPβCA、4-FPPβC(DMSO处理组作为对照组，不接种细胞组作为空白组)。孵育完成后，加入MTT于96孔板中于37℃孵育4h，随后小心吸出培养液，室温下加入150μL/孔DMSO溶解甲鐕，震荡摇匀后，采用酶标仪于490nm波长处测定OD值，并计算细胞存活率。

重复三次独立实验后，使用SPSS16.0求半数抑制浓度(Half-inhibitoryconcentration，IC50)。

细胞毒性试验数据如下表1所示：

表1.化合物6和化合物I的细胞毒性试验结果

表1的测试结果反映，通过在化合物6的β-咔啉结构基础上加入1,10-菲罗啉基团，得到的化合物I对肺癌、***、肝癌、乳腺癌等癌细胞的IC₅₀显著降低，显著提高对癌细胞的生物活性。其中以4-BrPPβC的效果最为显著。

(2)采用实施例1的化合物I(4-BrPPβC)进行染色试验：

i.Hoechst 33342染色实验

取对数生长的A549细胞接种于40mm的Nest共聚焦皿中，细胞贴壁后，加入不同浓度4-BrPPβC和40μM 4-BrPβCA，继续孵育24h。随后细胞用预冷的PBS洗涤两遍，4％多聚甲醛室温固定20min，用冷的PBS洗涤2次。用Hoechst 33342(2μg/mL)常温下染色15min。去掉染色液，用PBS洗2次。然后用倒置荧光显微镜观察细胞核及细胞形态变化。

染色试验结果如图10所示。结果显示Hoechst 33342染色实验，40μM 4-BrPβCA作用后不能诱导A549细胞凋亡，4-BrPPβC作用后可以浓度依赖性诱导A549细胞凋亡。证明4-BrPβCA与1,10-菲罗啉-5-氨基缩合后的产物4-BrPPβC效果更好。

ii.Annexin V染色实验

取对数生长的A549细胞接种于40mm的Nest共聚焦皿中，细胞贴壁后，加入不同浓度药物继续孵育24h。随后细胞用预冷的PBS洗涤两遍，用Annexin V染色15min。去掉染色液，用PBS洗2次。然后用倒置荧光显微镜观察细胞形态变化。

试验结果如图11所示，Annexin V染色实验结果显示，4-BrPPβC作用后可以浓度依赖性的诱导A549细胞凋亡，4-BrPβCA作用后不能诱导A549细胞凋亡。

iii.活性氧染色实验

取对数生长的A549细胞接种于40mm的Nest共聚焦皿中，细胞贴壁后，加入不同浓度药物继续孵育6h。随后细胞用预冷的PBS洗涤两遍，用DCFH-DA染色15min。去掉染色液，用PBS洗2次。然后用倒置荧光显微镜观察细胞形态变化。

试验结果如图12所示，结果显示4-BrPPβC作用后引起A549细胞内活性氧水平升高，进而引起细胞凋亡。而40μM的4-BrPβCA作用后A549细胞内活性氧变化不明显。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.如下式I所示的β-咔啉类化合物：

其中，所述X包括芳基，Y包括H、C_1～10的直链或带支链的烷基、C_1～10的直链或带支链的取代烷基。

2.根据权利要求1所述β-咔啉类化合物，其特征在于：所述X选自如下基团：

3.权利要求1或2所述β-咔啉类化合物的制备方法，其特征在于：所述β-咔啉类化合物的合成路线为：

所述制备方法包括如下步骤：

(1)化合物1与氯化亚砜反应得到化合物2；

(2)化合物2与

反应得到化合物3；

(3)化合物3与对甲基苯磺酰氯反应得到化合物4；

(4)化合物4在碱性条件下加热形成化合物5；

(5)化合物5水解得到化合物6；

(6)化合物6与1,10-菲罗啉-5-氨基反应得到化合物I。

4.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于：步骤(1)中，所述化合物1与氯化亚飒的摩尔比为1：1～1.5；优选地，所述反应的温度为50～110℃；优选地，所述反应的时间为5～10h。

5.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于：步骤(2)中，所述化合物2与

的摩尔比为1：1～1.5；优选地，所述反应的温度为60～100℃；优选地，所述反应的时间为5～20h；优选地，所述反应在保护氛围下进行。

6.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于：步骤(3)中，所述化合物3与对甲基苯磺酰氯的摩尔比为1：1～1.5；优选地，所述反应的温度为5～40℃；优选地，所述反应的时间为2～10h；优选地，所述反应在碱性催化剂存在下进行；优选地，所述吡啶与对甲基苯磺酰氯的比例为1μL：1～1.5mmol。

7.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于：步骤(4)中，所述碱性条件的pH为8～12。

8.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于：步骤(6)中，所述化合物6与1,10-菲罗啉-5-氨基的摩尔比为1：1～1.5；优选地，所述反应的温度为10～40℃；优选地，所述反应时间为20～24h。

9.权利要求1或2所述β-咔啉类化合物在制备抗癌药物中的应用；优选地，所述抗癌药物包括抗肺癌药物、抗***药物、抗肝癌药物或抗乳腺癌药物。

10.一种药物组合物，其特征在于：所述药物组合物含有权利要求1或2所述β-咔啉类化合物。

Images