CN113387935B - 抑制三突变表皮生长因子受体酪氨酸激酶的化合物及用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了抑制三突变表皮生长因子受体酪氨酸激酶的化合物，其特征在于，其结构式如下：
Figure DDA0003176651610000011
其中：取代基R1为
Figure DDA0003176651610000012
Figure DDA0003176651610000013
Figure DDA0003176651610000014
中的一种；取代基R2为
Figure DDA0003176651610000015
中的一种；取代基X为H或者Cl；取代基R3为H、
Figure DDA0003176651610000016
Figure DDA0003176651610000017
中的一种。

Description

抑制三突变表皮生长因子受体酪氨酸激酶的化合物及用途
技术领域
本发明公开了抑制三突变表皮生长因子受体酪氨酸激酶的化合物及用途。
背景技术
肺癌是目前世界上发病率和病死率最高的恶性肿瘤之一，肺癌中约80％-85％为非小细胞肺癌(NSCLC)，患者确诊时病情大致已处于局部晚期或晚期。
以表皮生长因子受体(EGFR)为靶点研究发现的表皮生长因子受体—酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)可明显提高非小细胞肺癌患者的生存期。表皮生长因子受体是一种跨膜蛋白，分为胞外配体结合区、跨膜区及含TK结构域的胞内区三部分。当表皮生长因子受体与细胞外相应配体结合后，会诱导激酶活化，从而激活下游信号传导途径，导致肿瘤细胞增殖、存活、分化、转移等。
目前，批准上市的EGFR-TKI药物有吉非替尼、厄洛替尼、阿法替尼、奥西替尼和阿美替尼。
吉非替尼和厄洛替尼为第一代可逆性的EGFR-TKIs，主要用于治疗EGFR的敏感型突变导致的肺癌。
阿法替尼为第二代不可逆的EGFR-TKI，主要用于治疗EGFR-T790M基因突变导致的肺癌。
奥西替尼和阿美替尼为第三代不可逆的EGFR-TKI，主要用于治疗耐药后产生EGFR-T790M基因突变而导致的肺癌。
近期，研究发现大部分病人服用奥西替尼一段时间后，发生了新的EGFR-C797S突变，从而对药物产生了耐药性。因此发现新的小分子抑制剂，用于治疗突变EGFR成为亟待解决的问题。
发明内容
发明目的：本发明针对上述现有技术存在的问题做出改进，即本发明公开了抑制三突变表皮生长因子受体酪氨酸激酶的化合物及用途。
技术方案：抑制三突变表皮生长因子受体酪氨酸激酶的化合物，其结构式如下：
Figure BDA0003176651590000021
其中：
取代基R1为
Figure BDA0003176651590000022
Figure BDA0003176651590000023
中的一种；
取代基R2为
Figure BDA0003176651590000024
中的一种；
取代基X为H或者Cl；
取代基R3为H、
Figure BDA0003176651590000025
Figure BDA0003176651590000026
中的一种。
进一步地，所述抑制三突变表皮生长因子受体酪氨酸激酶的化合物为化合物1-化合物33中的一种，化合物1-化合物33的取代基如下表所示：
Figure BDA0003176651590000027
Figure BDA0003176651590000031
Figure BDA0003176651590000041
更进一步地，所述抑制三突变表皮生长因子受体酪氨酸激酶的化合物为化合物12、化合物13、化合物14、化合物16、化合物28、化合物30、化合物31、化合物32、化合物33中的一种。
进一步地，上述三突变表皮生长因子受体酪氨酸激酶为EGFRL858R/T790M/C797S激酶。
上述化合物作为EGFRL858R/T790M/C797S激酶的抑制剂。
有益效果：本发明公开的抑制三突变表皮生长因子受体酪氨酸激酶的化合物能够很好的抑制EGFRL858R/T790M/C797S激酶。
附图说明
图1为本发明公开的抑制三突变表皮生长因子受体酪氨酸激酶的化合物12、化合物32、化合物33的EGFRL858R/T790M/C797S激酶活性IC50曲线图。
具体实施方式：
下面对本发明的具体实施方式详细说明。
抑制三突变表皮生长因子受体酪氨酸激酶的化合物，其结构式如下：
Figure BDA0003176651590000042
其中：
取代基R1为
Figure BDA0003176651590000051
Figure BDA0003176651590000052
中的一种；
取代基R2为
Figure BDA0003176651590000053
中的一种；
取代基X为H或者Cl；
取代基R3为H、
Figure BDA0003176651590000054
Figure BDA0003176651590000055
中的一种。
进一步地，所述抑制三突变表皮生长因子受体酪氨酸激酶的化合物为化合物1-化合物33中的一种，化合物1-化合物33的取代基如下表所示：
Figure BDA0003176651590000056
Figure BDA0003176651590000061
Figure BDA0003176651590000071
更进一步地，所述抑制三突变表皮生长因子受体酪氨酸激酶的化合物为化合物12、化合物13、化合物14、化合物16、化合物28、化合物30、化合物31、化合物32、化合物33中的一种。
进一步地，上述三突变表皮生长因子受体酪氨酸激酶为EGFRL858R/T790M/C797S激酶。
上述化合物作为EGFRL858R/T790M/C797S激酶的抑制剂。
一、化合物1-化合物33的合成
1、化合物1-化合物4的合成
R3为H取代类化合物的合成路线如下，通过该合成路线合成了化合物1、2、3、4，共4个小分子，该类化合物的R3片段均为H取代。
Figure BDA0003176651590000072
化合物1-a的合成
Figure BDA0003176651590000081
将5-氟-2-硝基-苯甲醚(430mg，2.00mmoL)置于25mL两口反应瓶中，抽真空后氮气保护，加入12mL无水DMA溶剂，后逐滴加入DIPEA(662μL，4.00mmoL)，室温下搅拌5min后，逐滴加入N1，N1，N2-三甲基乙烷-1，2-二胺(327μL，2.00mmoL)，随后逐渐升温至60℃，反应6-8h，TLC检测反应完全后，冷却反应液，加入适量1M盐酸溶液调节pH值至碱性，后加入适量饱和NaHCO3溶液调节pH值至中性，加入蒸馏水，使用二氯甲烷萃取三次，合并有机相，后用饱和NaCl溶液洗涤，有机相用无水NaSO4干燥，后减压浓缩至干，得黄色油状液体粗产物，通过硅胶色谱柱进行分离(使用二氯甲烷：甲醇＝30：1至15：1进行洗脱)，得到化合物1-a(396mg，产率78.2％)，为黄色固体。
化合物1-b的合成
Figure BDA0003176651590000082
将化合物1-a(420mg，1.66mmoL)置于50mL单口反应瓶中，加入15mL无水甲醇溶剂，后加入Pd/C(80.0mg，20％质量比)无水甲醇(5mL)的稀释液，所得悬浮液，在H2环境下，室温搅拌4-5h，TLC检测反应完全后，将悬浮液倒入装有滤纸与硅藻土的漏斗内，减压抽滤，所得滤液减压浓缩至干，得紫色固体粗产物，通过硅胶色谱柱进行分离(使用二氯甲烷：甲醇＝15：1至10：1进行洗脱)，得到化合物1-b(320mg，产率86.3％)，为淡紫色泡沫状固体。
化合物1-c的合成
Figure BDA0003176651590000083
将无水氯化铝(1.80g，13.4mmoL)置于50mL两口反应瓶中，抽真空后氮气保护，加入20mL无水DME溶剂，逐滴加入2，4-二氯嘧啶(2.00g，13.4mmoL)，室温下搅拌15min后，逐滴加入1-甲基吲哚(1.67mL，13.4mmoL)，随后逐渐升温至80℃，反应2-4h，TLC检测反应完全后，冷却反应液，并在20min内，将其逐滴加入剧烈搅拌的饱和NaHCO3溶液(300mL)中，室温下搅拌30min左右，使用布氏漏斗减压抽滤，固体用水洗涤3次，所得固体加入适量的水与二氯甲烷，直至固体完全溶解，使用二氯甲烷萃取三次，合并有机相，后用饱和NaCl溶液洗涤，有机相用无水NaSO4干燥，减压浓缩至干，得红棕色固体粗产物，通过硅胶色谱柱进行分离(使用石油醚：乙酸乙酯＝6：1至2：1进行洗脱)，得到化合物1-c(1.48g，产率45.3％)，为米色固体粉末。
化合物1的合成
Figure BDA0003176651590000091
将化合物1-c(120mg，0.490mmoL)与化合物1-b(110mg，0.490mmoL)置于10mL两口反应瓶中，抽真空后氮气保护，加入3mL无水2-戊醇溶剂，室温下搅拌5min后，逐滴加入4-甲基苯磺酸一水合物(186mg，0.980mmoL)，随后逐渐升温至105℃，反应4h，TLC检测反应完全后，冷却反应液，加入适量饱和NaHCO3溶液调节pH值至中性，加入适量蒸馏水，使用二氯甲烷萃取三次，合并有机相，后用饱和NaCl溶液洗涤，有机相用无水NaSO4干燥，后减压浓缩至干，得黄色固体粗产物，通过硅胶色谱柱进行分离(二氯甲烷：甲醇＝25：1至20：1进行洗脱)，得到化合物1(117mg，产率55.4％)，为黄色固体。
化合物2-a的合成
Figure BDA0003176651590000092
将2，4-二氯嘧啶(559mg，3.75mmoL)置于25mL两口反应瓶中，抽真空后氮气保护，加入11mL无水DMA溶剂，后逐滴加入DIPEA(1550μL，9.38mmoL)，室温下搅拌5min后，逐滴加入1，2，3，4-四氢喹啉(471μL，3.75mmoL)，随后逐渐升温至100℃，反应6-8h，TLC检测反应完全后，冷却反应液，加入适量1M盐酸溶液调节pH值至碱性，后加入适量饱和NaHCO3溶液调节pH值至中性，加入蒸馏水，使用二氯甲烷萃取三次，合并有机相，后用饱和NaCl溶液洗涤，有机相用无水NaSO4干燥，后减压浓缩至干，得黄色油状液体粗产物，通过硅胶色谱柱进行分离(使用石油醚：乙酸乙酯＝6：1至4：1进行洗脱)，得到化合物2-a(330mg，产率36.0％)，为淡黄色固体。
化合物2的合成
Figure BDA0003176651590000101
合成步骤与化合物1相同，反应所得浅黄色粗产物，通过硅胶色谱柱进行分离(使用二氯甲烷：甲醇＝25：1至20：1进行洗脱)，得到化合物2
化合物3-a的合成
Figure BDA0003176651590000102
合成步骤与化合物2-a相同，反应所得黄色粗产物，通过硅胶色谱柱进行分离(使用石油醚：乙酸乙酯＝6：1至4：1进行洗脱)，得到化合物3-a(452mg，产率43.0％)，为浅黄色固体。
化合物3的合成
Figure BDA0003176651590000103
合成步骤与化合物1相同，反应所得浅黄色粗产物，通过硅胶色谱柱进行分离(使用二氯甲烷：甲醇＝25：1至20：1进行洗脱)，得到化合物3(49.2mg，产率21.5％)，为黄色固体。
化合物4-a的合成
Figure BDA0003176651590000104
合成步骤与化合物2-a相同，反应所得黄色粗产物，通过硅胶色谱柱进行分离(使用石油醚：乙酸乙酯＝6：1至4：1进行洗脱)，得到化合物4-a(498mg，产率45.0％)，为浅黄色固体。
化合物4的合成
Figure BDA0003176651590000111
合成步骤与化合物1相同，反应所得浅黄色粗产物，通过硅胶色谱柱进行分离(使用二氯甲烷：甲醇＝25：1至20：1进行洗脱)，得到化合物4(53.0mg，产率22.5％)，为黄色固体。
2、化合物5-化合物10的合成
Figure BDA0003176651590000112
化合物5-a的合成
Figure BDA0003176651590000113
将5-氟-2-硝基苯甲醚(2.00g，11.7mmoL)置于100mL单口反应瓶中，加入65mL无水甲醇溶剂，后加入Pd/C(300mg，15％质量比)无水甲醇(5mL)的稀释液，所得悬浮液，在H2环境下，室温搅拌4-5h，TLC检测反应完全后，将悬浮液倒入装有滤纸与硅藻土的漏斗内，减压抽滤，所得滤液减压浓缩至干，得紫色固体粗产物，通过硅胶色谱柱进行分离(使用石油醚：乙酸乙酯＝15：1至10：1进行洗脱)，得到化合物5-a(1.42g，产率86.0％)，为淡紫色固体。
化合物5-b的合成
Figure BDA0003176651590000121
将化合物5-a(675mg，4.78mmoL)置于单口反应瓶中，抽真空后氮气保护，在冰水浴条件下，再加入5mL浓硫酸溶剂，搅拌40min后，向体系内加入硝酸钾(512mg，4.78mmoL)，在0-5℃下，继续搅拌2-3h，TLC检测反应完全后，将反应液逐滴加入剧烈搅拌的250mL冰水中，后加入适量25％氨水，调节pH至8-9，使用二氯甲烷萃取三次，合并有机相，后用饱和NaCl溶液洗涤，有机相用无水NaSO4干燥，后减压浓缩至干，得棕黑色粗产物，通过硅胶色谱柱进行分离(使用石油醚：乙酸乙酯＝4：1至2：1进行洗脱)，得到化合物5-b(447mg，产率50.2％)，为红棕色固体。
化合物5-c的合成
Figure BDA0003176651590000122
将化合物5-b(360mg，1.93mmoL)与化合物1-c(390mg，1.93mmoL)置于25mL两口反应瓶中，抽真空后氮气保护，加入12mL无水2-戊醇溶剂，室温下搅拌5min后，后加入4-甲基苯磺酸一水合物(736mg，3.87mmoL)，随后逐渐升温至105℃，反应4h，TLC检测反应完全后，冷却反应液，减压抽滤，使用2-戊醇洗涤滤饼两次，后用二氯甲烷溶解，减压浓缩至干，加入适量乙腈溶剂，超声后进行离心(3000r/min，10min)，弃去上清液，所得固体用二氯甲烷溶解，减压浓缩至干，得黄色固体粗产物，通过硅胶色谱柱进行分离(使用二氯甲烷：甲醇＝30：1至20：1进行洗脱)，得到化合物5-c(720mg，产率94.8％)，为黄色固体。
化合物5-d的合成
Figure BDA0003176651590000131
将化合物5-c(520mg，1.32mmoL)置于50mL两口反应瓶中，抽真空后氮气保护，加入16mL无水DMA溶剂，后逐滴加入DIPEA(436μL，2.64mmoL)，室温下搅拌5min后，逐滴加入N1，N1，N2-三甲基乙烷-1，2-二胺(172μL，1.32mmoL)，随后逐渐升温至100℃，反应6-8h，TLC检测反应完全后，冷却反应液，加入适量1M盐酸溶液调节pH值至碱性，后加入适量饱和NaHCO3溶液调节pH值至中性，加入蒸馏水，使用二氯甲烷萃取三次，合并有机相，后用饱和NaCl溶液洗涤，有机相用无水NaSO4干燥，后减压浓缩至干，得黄色油状液体粗产物，通过硅胶色谱柱进行分离(使用二氯甲烷：甲醇＝20：1至15：1进行洗脱)，得到化合物5-d(488mg，产率77.7％)，为橘红色固体。
化合物5-e的合成
Figure BDA0003176651590000132
将化合物5-d(700mg，1.47mmoL)置于50mL单口反应瓶中，加入12mL无水乙醇溶剂，后加入Pd/C(105mg，15％质量比)无水乙醇(5mL)的稀释液，所得悬浮液，在H2环境下，室温搅拌4-5h，TLC检测反应完全后，将悬浮液倒入装有滤纸与硅藻土的漏斗内，减压抽滤，所得滤液减压浓缩至干，得紫色固体粗产物，通过硅胶色谱柱进行分离(使用二氯甲烷：甲醇＝15：1至10：1进行洗脱)，得到化合物5-e(540mg，产率84.7％)，为淡绿色泡沫状固体。
化合物5的合成
Figure BDA0003176651590000133
将化合物5-e(65.0mg，0.146mmoL)置于10mL单口反应瓶中，抽真空后氮气保护，加入3mL无水DCM溶剂，在冰水浴下，逐滴加入DIPEA(48.0μL，0.274mmoL)，在0℃下搅拌5min后，逐滴加入丙烯酰氯(11.5μL，0.146mmoL)，在0℃下反应2-3h，TLC检测反应完全后，加入适量1M盐酸溶液调节pH值至碱性，后加入适量饱和NaHCO3溶液调节pH值至中性，加入蒸馏水，使用二氯甲烷萃取三次，合并有机相，后用饱和NaCl溶液洗涤，有机相用无水NaSO4干燥，后减压浓缩至干，得黄色粗产物，通过硅胶色谱柱进行分离(使用二氯甲烷：甲醇＝20：1至15：1进行洗脱)，得到化合物5(25.0mg，产率34.2％)，为黄色固体。
化合物6的合成
Figure BDA0003176651590000141
合成步骤与化合物5相同，反应所得黄色粗产物，通过硅胶色谱柱进行分离(使用二氯甲烷：甲醇＝20：1至15：1进行洗脱)，得到化合物6(31.0mg，产率42.5％)，为浅黄色固体。
化合物7的合成
Figure BDA0003176651590000142
将化合物HATU(81.7mg，0.215mmoL)置于10mL单口反应瓶中，抽真空后氮气保护，加入2mL无水DCM溶剂，在冰水浴下，逐滴加入2-甲基丙烯酸(16.7μL，0.197mmoL)，后逐滴加入DIPEA(59.2μL，0.358mmoL)，在0℃下搅拌30min后，逐滴加入化合物5-e(80.0mg，0.197mmoL)，缓慢升温至室温，过夜反应18-20h，TLC检测反应完全后，加入适量1M盐酸溶液调节pH值至碱性，后加入适量饱和NaHCO3溶液调节pH值至中性，加入蒸馏水，使用二氯甲烷萃取三次，合并有机相，后用饱和NaCl溶液洗涤，有机相用无水NaSO4干燥，后减压浓缩至干，得黄色粗产物，通过硅胶色谱柱进行分离(使用二氯甲烷：甲醇＝20：1至15：1进行洗脱)，得到化合物7(45.0mg，产率44.2％)，为黄色固体。
化合物8的合成
Figure BDA0003176651590000151
合成步骤与化合物7相同，反应所得棕黑色粗产物，通过硅胶色谱柱进行分离(使用二氯甲烷：甲醇＝20：1至15：1进行洗脱)，得到化合物8(30.0mg，产率29.5％)，为浅黄色固体。
化合物9的合成
Figure BDA0003176651590000152
合成步骤与化合物7相同，反应所得浅黄色粗产物，通过硅胶色谱柱进行分离(使用二氯甲烷：甲醇＝20：1至15：1进行洗脱)，得到化合物9
化合物10-a的合成
Figure BDA0003176651590000153
将氟乙酸乙酯(916μL，9.42mmoL)置于50mL单口反应瓶中，抽真空后氮气保护，加入14mL乙醇：水(9:1)溶剂，后逐滴加入氢氧化钠(448mg，11.2mmoL)，在室温下反应20h，TLC检测反应完全后，反应液直接减压浓缩至干，再溶于8mL 3M的稀盐酸溶液中，向体系内加入适量NaCl至溶液饱和，使用乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，其用无水NaSO4干燥，后减压浓缩至干，得到化合物10-a(460mg，产率52.2％)，为白色晶体。
化合物10的合成
Figure BDA0003176651590000161
合成步骤与化合物7相同，反应所得浅黄色粗产物，通过硅胶色谱柱进行分离(使用二氯甲烷：甲醇＝20：1至15：1进行洗脱)，得到化合物10(67.0mg，产率67.4％)，为黄色固体。
3、化合物11-化合物27的合成
Figure BDA0003176651590000162
化合物11-a的合成
Figure BDA0003176651590000163
将5-氟-2-硝基苯甲醚(257mg，1.50mmoL)置于25mL两口反应瓶中，抽真空后氮气保护，加入8mL无水DMA溶剂，后逐滴加入DIPEA(540μL，3.00mmoL)，室温下搅拌5min后，逐滴加入1-甲基-4-(4-哌啶基)哌嗪(300mg，1.63mmoL)，随后逐渐升温至100℃，反应6-8h，TLC检测反应完全后，冷却反应液，加入适量1M盐酸溶液调节pH值至碱性，后加入适量饱和NaHCO3溶液调节pH值至中性，加入蒸馏水，使用二氯甲烷萃取三次，合并有机相，后用饱和NaCl溶液洗涤，有机相用无水NaSO4干燥，后减压浓缩至干，得黄色油状液体粗产物，通过硅胶色谱柱进行分离(使用二氯甲烷：甲醇＝25：1至20：1进行洗脱)，得到化合物11-a(145mg，产率62.0％)，为橘红色固体。
化合物11-b的合成
Figure BDA0003176651590000171
将化合物11-a(360mg，1.08mmoL)置于25mL单口反应瓶中，加入7mL无水甲醇溶剂，后加入Pd/C(54.0mg，15％质量比)无水乙醇(4mL)的稀释液，所得悬浮液，在H2环境下，室温搅拌4-5h，TLC检测反应完全后，将悬浮液倒入装有滤纸与硅藻土的漏斗内，减压抽滤，所得滤液减压浓缩至干，得紫色固体粗产物，通过硅胶色谱柱进行分离(使用二氯甲烷：甲醇＝15：1至10：1进行洗脱)，得到化合物11-b(276mg，产率91.0％)，为淡黄色泡沫状固体。
化合物11的合成
Figure BDA0003176651590000172
将化合物1-c(82.0mg，0.334mmoL)与化合物11-b(101mg，0.334mmoL)置于10mL两口反应瓶中，抽真空后氮气保护，加入2mL无水2-戊醇溶剂，室温下搅拌5min后，逐滴加入4-甲基苯磺酸一水合物(105mg，0.668mmoL)，随后逐渐升温至105℃，反应4h，TLC检测反应完全后，冷却反应液，加入适量饱和NaHCO3溶液调节pH值至中性，加入适量蒸馏水，使用二氯甲烷萃取三次，合并有机相，后用饱和NaCl溶液洗涤，有机相用无水NaSO4干燥，后减压浓缩至干，得浅黄色粗产物，通过硅胶色谱柱进行分离(二氯甲烷：甲醇＝20：1至15：1进行洗脱)，得到化合物11(55.7mg，产率32.0％)，为黄色固体。
化合物12的合成
Figure BDA0003176651590000181
合成步骤与化合物11相同，反应所得黄色固体粗产物，通过硅胶色谱柱进行分离(使用二氯甲烷：甲醇＝20：1至15：1进行洗脱)，得到化合物12(50mg，产率30.1％)，为黄色固体。1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.24(d,J＝8.5Hz,1H),7.93(d,J＝5.9Hz,1H),7.42–7.36(m,2H),7.20–7.16(m,2H),7.04(t,J＝7.5Hz,1H),6.53(d,J＝9.1Hz,2H),6.44(d,J＝6.0Hz,1H),3.98(t,J＝6.5Hz,2H),3.87(s,3H),3.64(d,J＝12.0Hz,2H),2.96–2.50(m,13H),2.48(s,3H),2.04–1.93(m,4H),1.75(apparent q,J＝11.3,10.5Hz,2H).13C NMR(100MHz,Chloroform-d)δ162.37,159.87,156.08,148.96,146.67,139.52,132.64,129.04,126.04,124.00,123.38,123.28,119.66,108.94,101.48,97.80,62.08,55.79,54.44,50.64,47.87,45.11,45.00,28.05,27.33,24.22.
化合物13的合成
Figure BDA0003176651590000182
合成步骤与化合物11相同，反应所得浅黄色粗产物，通过硅胶色谱柱进行分离(使用二氯甲烷：甲醇＝20：1至15：1进行洗脱)，得到化合物13(47.6mg，产率26.0％)，为黄色固体。1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.13(d,J＝8.8Hz,1H),8.08(s,1H),7.41(s,1H),7.13(d,J＝7.5Hz,1H),7.07(t,J＝7.8Hz,1H),6.96(t,J＝7.5Hz,1H),6.77(d,J＝8.1Hz,1H),6.52(s,1H),6.48(d,J＝8.7Hz,1H),3.89(t,J＝6.4Hz,2H),3.86(s,3H),3.63(d,J＝11.7Hz,2H),2.92–2.50(m,13H),2.47(s,3H),2.10–1.92(m,4H),1.72(apparent q,J＝10.9Hz,2H).13C NMR(100MHz,Methanol-d4)δ159.54,158.24,157.99,148.91,147.00,140.23,129.39,128.65,128.62,125.87,122.70,120.67,119.33,110.03,108.81,101.30,62.04,55.78,54.55,50.50,47.96,47.28,45.19,28.08,26.96,23.97.
化合物14-a的合成
Figure BDA0003176651590000183
合成步骤与化合物2-a相同，反应所得黄色粗产物，通过硅胶色谱柱进行分离(使用石油醚：乙酸乙酯＝6：1至4：1进行洗脱)，得到化合物14-a(321mg，产率33.0％)，为浅黄色固体。
化合物14的合成
Figure BDA0003176651590000191
合成步骤与化合物11相同，反应所得浅黄色粗产物，通过硅胶色谱柱进行分离(使用二氯甲烷：甲醇＝20：1至15：1进行洗脱)，得到化合物14(51.0mg，产率29.0％)，为黄色固体。1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.27(d,J＝8.6Hz,1H),7.93(d,J＝6.0Hz,1H),7.42–7.32(m,2H),7.26(d,J＝9.5Hz,1H),7.18(t,J＝7.7Hz,1H),7.09(t,J＝7.5Hz,1H),6.55(d,J＝9.8Hz,2H),6.43(d,J＝6.0Hz,1H),3.99(apparent q,J＝6.2,5.6Hz,2H),3.88(s,3H),3.65(d,J＝12.0Hz,2H),2.92–2.43(m,12H),2.40(s,3H),2.18–2.08(m,1H),1.97(d,J＝12.4Hz,2H),1.81–1.60(m,3H),1.33(apparent d,J＝6.9Hz,3H).13C NMR(100MHz,Chloroform-d)δ162.35,159.97,156.17,148.90,146.77,138.86,137.39,126.89,126.04,124.02,123.31,123.19,119.62,108.87,101.41,97.69,63.76,61.96,55.76,54.92,50.67,48.40,45.54,43.64,32.31,31.19,28.17,20.01.
化合物15的合成
Figure BDA0003176651590000192
合成步骤与化合物11相同，反应所得浅黄色粗产物，通过硅胶色谱柱进行分离(使用二氯甲烷：甲醇＝20：1至15：1进行洗脱)，得到化合物15(50.7mg，产率27.0％)，为黄色固体。
化合物16-a的合成
Figure BDA0003176651590000193
合成步骤与化合物2-a相同，反应所得黄色粗产物，通过硅胶色谱柱进行分离(使用石油醚：乙酸乙酯＝6：1至4：1进行洗脱)，得到化合物16-a(534mg，产率52.0％)，为浅黄色固体。
化合物16的合成
Figure BDA0003176651590000201
合成步骤与化合物11相同，反应所得浅黄色粗产物，通过硅胶色谱柱进行分离(使用二氯甲烷：甲醇＝20：1至15：1进行洗脱)，得到化合物16(47.6mg，产率26.3％)，为黄色固体。1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.26(d,J＝8.7Hz,1H),7.92(d,J＝5.9Hz,1H),7.34(d,J＝6.5Hz,3H),7.10(dt,J＝26.5,7.6Hz,2H),6.58–6.51(m,2H),6.43(d,J＝5.9Hz,1H),4.01(t,J＝6.6Hz,2H),3.86(s,3H),3.63(d,J＝11.8Hz,2H),2.75–2.32(m,11H),2.29(s,3H),1.93(d,J＝12.4Hz,2H),1.83–1.65(m,4H),1.28(s,6H).13C NMR(100MHz,Chloroform-d)δ162.36,160.06,156.33,148.83,146.87,140.01,138.08,125.86,125.85,123.86,123.40,123.04,119.56,108.75,101.29,97.80,61.81,55.67,55.40,50.69,48.93,45.97,42.60,38.53,33.31,29.09,28.29.
化合物17-a的合成
Figure BDA0003176651590000202
合成步骤与化合物2-a相同，反应所得黄色粗产物，通过硅胶色谱柱进行分离(使用石油醚：乙酸乙酯＝6：1至4：1进行洗脱)，得到化合物17-a(631mg，产率54.6％)，为浅黄色固体。
化合物17的合成
Figure BDA0003176651590000203
合成步骤与化合物11相同，反应所得浅黄色粗产物，通过硅胶色谱柱进行分离(使用二氯甲烷：甲醇＝20：1至15：1进行洗脱)，得到化合物17(41.7mg，产率21.7％)，为黄色固体。
化合物18-a的合成
Figure BDA0003176651590000204
合成步骤与化合物2-a相同，反应所得黄色粗产物，通过硅胶色谱柱进行分离(使用石油醚：乙酸乙酯＝6：1至4：1进行洗脱)，得到化合物18-a(436mg，产率47.0％)，为浅黄色固体。
化合物18的合成
Figure BDA0003176651590000211
合成步骤与化合物11相同，反应所得浅黄色粗产物，通过硅胶色谱柱进行分离(使用二氯甲烷：甲醇＝20：1至15：1进行洗脱)，得到化合物18(53.0mg，产率31.0％)，为黄色固体。
化合物19-a的合成
Figure BDA0003176651590000212
合成步骤与化合物2-a相同，反应所得黄色粗产物，通过硅胶色谱柱进行分离(使用石油醚：乙酸乙酯＝6：1至4：1进行洗脱)，得到化合物19-a(466mg，产率44.0％)，为浅黄色固体。
化合物19的合成
Figure BDA0003176651590000213
合成步骤与化合物11相同，反应所得浅黄色粗产物，通过硅胶色谱柱进行分离(使用二氯甲烷：甲醇＝20：1至15：1进行洗脱)，得到化合物19(46.0mg，产率25.0％)，为黄色固体。
化合物20-a的合成
Figure BDA0003176651590000214
合成步骤与化合物2-a相同，反应所得黄色粗产物，通过硅胶色谱柱进行分离(使用石油醚：乙酸乙酯＝6：1至4：1进行洗脱)，得到化合物20-a(317mg，产率32.5％)，为浅黄色固体。
化合物20的合成
Figure BDA0003176651590000221
合成步骤与化合物11相同，反应所得浅黄色粗产物，通过硅胶色谱柱进行分离(使用二氯甲烷：甲醇＝20：1至15：1进行洗脱)，得到化合物20(38.2mg，产率21.7％)，为黄色固体。
化合物21-a的合成
Figure BDA0003176651590000222
合成步骤与化合物2-a相同，反应所得黄色粗产物，通过硅胶色谱柱进行分离(使用石油醚：乙酸乙酯＝6：1至4：1进行洗脱)，得到化合物21-a(479mg，产率43.4％)，为浅黄色固体。
化合物21的合成
Figure BDA0003176651590000223
合成步骤与化合物11相同，反应所得浅黄色粗产物，通过硅胶色谱柱进行分离(使用二氯甲烷：甲醇＝20：1至15：1进行洗脱)，得到化合物21(42.1mg，产率22.4％)，为黄色固体。
化合物22-a的合成
Figure BDA0003176651590000231
合成步骤与化合物2-a相同，反应所得黄色粗产物，通过硅胶色谱柱进行分离(使用石油醚：乙酸乙酯＝6：1至4：1进行洗脱)，得到化合物22-a(413mg，产率41.8％)，为浅黄色固体。
化合物22的合成
Figure BDA0003176651590000232
合成步骤与化合物11相同，反应所得浅黄色粗产物，通过硅胶色谱柱进行分离(使用二氯甲烷：甲醇＝20：1至15：1进行洗脱)，得到化合物22(40.7mg，产率22.9％)，为黄色固体。
化合物23-a的合成
Figure BDA0003176651590000233
合成步骤与化合物2-a相同，反应所得黄色粗产物，通过硅胶色谱柱进行分离(使用石油醚：乙酸乙酯＝6：1至4：1进行洗脱)，得到化合物23-a(454mg，产率40.6％)，为浅黄色固体。
化合物23的合成
Figure BDA0003176651590000234
合成步骤与化合物11相同，反应所得浅黄色粗产物，通过硅胶色谱柱进行分离(使用二氯甲烷：甲醇＝20：1至15：1进行洗脱)，得到化合物23(44.6mg，产率23.6％)，为黄色固体。
化合物24-a的合成
Figure BDA0003176651590000241
合成步骤与化合物2-a相同，反应所得黄色粗产物，通过硅胶色谱柱进行分离(使用石油醚：乙酸乙酯＝6：1至4：1进行洗脱)，得到化合物24-a(274mg，产率31.7％)，为浅黄色固体。
化合物24的合成
Figure BDA0003176651590000242
合成步骤与化合物11相同，反应所得浅黄色粗产物，通过硅胶色谱柱进行分离(使用二氯甲烷：甲醇＝20：1至15：1进行洗脱)，得到化合物24(30.9mg，产率18.6％)，为黄色固体。
化合物25-a的合成
Figure BDA0003176651590000243
合成步骤与化合物2-a相同，反应所得黄色粗产物，通过硅胶色谱柱进行分离(使用石油醚：乙酸乙酯＝6：1至4：1进行洗脱)，得到化合物25-a(301mg，产率30.3％)，为浅黄色固体。
化合物25的合成
Figure BDA0003176651590000244
合成步骤与化合物11相同，反应所得浅黄色粗产物，通过硅胶色谱柱进行分离(使用二氯甲烷：甲醇＝20：1至15：1进行洗脱)，得到化合物25(30.6mg，产率17.2％)，为黄色固体。
化合物26-a的合成
Figure BDA0003176651590000251
合成步骤与化合物2-a相同，反应所得黄色粗产物，通过硅胶色谱柱进行分离(使用石油醚：乙酸乙酯＝6：1至4：1进行洗脱)，得到化合物26-a(411mg，产率47.3％)，为浅黄色固体。
化合物26的合成
Figure BDA0003176651590000252
合成步骤与化合物11相同，反应所得浅黄色粗产物，通过硅胶色谱柱进行分离(使用二氯甲烷：甲醇＝20：1至15：1进行洗脱)，得到化合物26(37.6mg，产率22.5％)，为黄色固体。
化合物27-a的合成
Figure BDA0003176651590000253
合成步骤与化合物2-a相同，反应所得黄色粗产物，通过硅胶色谱柱进行分离(使用石油醚：乙酸乙酯＝6：1至4：1进行洗脱)，得到化合物27-a(461mg，产率46.4％)，为浅黄色固体。
化合物27的合成
Figure BDA0003176651590000261
合成步骤与化合物11相同，反应所得浅黄色粗产物，通过硅胶色谱柱进行分离(使用二氯甲烷：甲醇＝20：1至15：1进行洗脱)，得到化合物27(36.2mg，产率20.3％)，为黄色固体。
4、化合物28-化合物33的合成
Figure BDA0003176651590000262
化合物28-a的合成
Figure BDA0003176651590000263
将化合物5-b(360mg，1.93mmoL)与化合物2-a(474mg，1.93mmoL)置于25mL两口反应瓶中，抽真空后氮气保护，加入12mL无水2-戊醇溶剂，室温下搅拌5min后，后加入4-甲基苯磺酸一水合物(736mg，3.87mmoL)，随后逐渐升温至105℃，反应4h，TLC检测反应完全后，冷却反应液，减压抽滤，使用2-戊醇洗涤滤饼两次，后用二氯甲烷溶解，减压浓缩至干，加入适量乙腈溶剂，超声后进行离心(3000r/min，10min)，弃去上清液，所得固体用二氯甲烷溶解，减压浓缩至干，得黄色固体粗产物，通过硅胶色谱柱进行分离(使用二氯甲烷：甲醇＝30：1至20：1进行洗脱)，得到化合物28-a(690mg，产率90.4％)，为黄色固体。
化合物28-b的合成
Figure BDA0003176651590000271
将化合物28-a(522mg，1.32mmoL)置于50mL两口反应瓶中，抽真空后氮气保护，加入16mL无水DMA溶剂，后逐滴加入DIPEA(436μL，2.64mmoL)，室温下搅拌5min后，逐滴加入1-甲基-4-(4-哌啶基)哌嗪(135mg，1.32mmoL)，随后逐渐升温至100℃，反应6-8h，TLC检测反应完全后，冷却反应液，加入适量1M盐酸溶液调节pH值至碱性，后加入适量饱和NaHCO3溶液调节pH值至中性，加入蒸馏水，使用二氯甲烷萃取三次，合并有机相，后用饱和NaCl溶液洗涤，有机相用无水NaSO4干燥，后减压浓缩至干，得黄色油状液体粗产物，通过硅胶色谱柱进行分离(使用二氯甲烷：甲醇＝20：1至15：1进行洗脱)，得到化合物28-d(542mg，产率73.5％)，为橘红色固体。
化合物28-c的合成
Figure BDA0003176651590000272
将化合物28-b(822mg，1.47mmoL)置于50mL单口反应瓶中，加入12mL无水乙醇溶剂，后加入Pd/C(105mg，15％质量比)无水乙醇(5mL)的稀释液，所得悬浮液，在H2环境下，室温搅拌4-5h，TLC检测反应完全后，将悬浮液倒入装有滤纸与硅藻土的漏斗内，减压抽滤，所得滤液减压浓缩至干，得紫色固体粗产物，通过硅胶色谱柱进行分离(使用二氯甲烷：甲醇＝15：1至10：1进行洗脱)，得到化合物28-c(677mg，产率87.1％)，为淡黄色泡沫状固体。
化合物28的合成
Figure BDA0003176651590000281
将化合物HATU(81.7mg，0.215mmoL)置于10mL单口反应瓶中，抽真空后氮气保护，加入2mL无水DCM溶剂，在冰水浴下，逐滴加入氟乙酸(15.4mg，0.197mmoL)，后逐滴加入DIPEA(59.2μL，0.358mmoL)，在0℃下搅拌30min后，逐滴加入化合物28-c(104mg，0.197mmoL)，缓慢升温至室温，过夜反应18-20h，TLC检测反应完全后，加入适量1M盐酸溶液调节pH值至碱性，后加入适量饱和NaHCO3溶液调节pH值至中性，加入蒸馏水，使用二氯甲烷萃取三次，合并有机相，后用饱和NaCl溶液洗涤，有机相用无水NaSO4干燥，后减压浓缩至干，得黄色粗产物，通过硅胶色谱柱进行分离(使用二氯甲烷：甲醇＝20：1至15：1进行洗脱)，得到化合物28(37.7mg，产率32.5％)，为黄色固体。
化合物29的合成
Figure BDA0003176651590000282
合成步骤与化合物28相同，反应所得黄色粗产物，通过硅胶色谱柱进行分离(使用二氯甲烷：甲醇＝20：1至15：1进行洗脱)，得到化合物29(38.3mg，产率31.7％)，为黄色固体。
化合物30的合成
Figure BDA0003176651590000283
合成步骤与化合物28相同，反应所得黄色粗产物，通过硅胶色谱柱进行分离(使用二氯甲烷：甲醇＝20：1至15：1进行洗脱)，得到化合物30(40.7mg，产率34.4％)，为黄色固体。1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ9.42(s,1H),9.37(s,1H),7.92(d,J＝6.0Hz,1H),7.44(s,1H),7.34(d,J＝8.0Hz,1H),7.18–7.07(m,2H),7.01(t,J＝7.4Hz,1H),6.70(s,1H),6.50(d,J＝6.0Hz,1H),4.13(t,J＝6.3Hz,2H),4.00(s,2H),3.84(s,3H),3.50(s,3H),3.03(d,J＝11.5Hz,2H),2.76–2.64(m,8H),2.57–2.38(m,5H),2.32(s,3H),2.02–1.92(m,4H),1.79–1.67(m,2H).
化合物31的合成
Figure BDA0003176651590000291
合成步骤与化合物28相同，反应所得黄色粗产物，通过硅胶色谱柱进行分离(使用二氯甲烷：甲醇＝20：1至15：1进行洗脱)，得到化合物31(37.4mg，产率30.8％)，为黄色固体。1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ9.79(s,1H),9.45(s,1H),7.93(d,J＝5.9Hz,1H),7.46(s,1H),7.35(d,J＝8.0Hz,1H),7.18–7.10(m,2H),7.02(t,J＝7.5Hz,1H),6.73(s,1H),6.51(d,J＝6.0Hz,1H),4.13(t,J＝6.4Hz,2H),3.85(s,3H),3.35(s,2H),3.03(d,J＝11.3Hz,2H),2.78–2.64(m,8H),2.60–2.34(m,5H),2.33(s,3H),2.18(s,3H),2.05–1.95(m,4H),1.87–1.75(m,2H).
化合物32的合成
Figure BDA0003176651590000292
合成步骤与化合物28相同，反应所得黄色粗产物，通过硅胶色谱柱进行分离(使用二氯甲烷：甲醇＝20：1至15：1进行洗脱)，得到化合物32(40.2mg，产率35.1％)，为黄色固体。
化合物33的合成
Figure BDA0003176651590000293
合成步骤与化合物28相同，反应所得黄色粗产物，通过硅胶色谱柱进行分离(使用二氯甲烷：甲醇＝20：1至15：1进行洗脱)，得到化合物33(43.5mg，产率37.8％)，为黄色固体。
二、Kinase-Glo Max激酶实验
1、Kinase-Glo Max激酶实验原理
在该激酶实验中，使用了Kinase-Glo Max激酶活性检测试剂，它是一种均质荧光素酶检测方法，在荧光素酶的催化下，荧光素能与氧气发生反应，该过程需要消耗ATP，并产生激发态的氧化荧光素，当它从激发态回到基态时释放出光信号，光信号与体系中的ATP成正比。激酶磷酸化反应需要消耗ATP，而加入竞争性抑制剂后，可以抑制激酶磷酸化反应，减少ATP的消耗，使得光信号与体系中的激酶活性成反比。
2、Kinase-Glo Max激酶实验步骤
1、首先，将ATP、50x PTK substrate和Kinase-Glo Max等融解，室温平衡，将5xkinase assay buffer、DTT和高纯水等碎冰下缓慢融解，置于碎冰中备用。
2、将15μL DTT溶液加入到1.5mL 5x kinase assay buffer中，充分混合备用；再取500μL5x kinase assay buffer(含有DTT溶液)加入到2mL高纯水内，配成2.5mL 1xkinase assay buffer备用。
3、进行测试的化合物需提前配成相应浓度梯度，缓冲液使用高纯水稀释。
4、表1列出了测试组、对照组和空白组各组中每孔所需加入的各个试剂的量，首先应加入小体积的试剂，依次加完各试剂后，最后加入EGFRL858R/T790M/C797S三突变激酶。
表1 测试、对照、空白各组实验试剂加入量
Figure BDA0003176651590000301
5、各孔加入试剂后，将96孔板放入到30℃恒温摇床内，让其反应45分钟。
6、反应结束后，每孔加入50μL Kinase-Glo Max检测试剂，后用铝箔纸盖住孔板，让其在室温下孵育15分钟，后使用96微孔板发光检测仪检测各孔的光信号，收集数据后进行处理。
3、小分子抑制剂激酶活性结果
表2显示的是化合物1-化合物33对于EGFRL858R/T790M/C797S激酶的活性结果。其中：活性为A的化合物表示激酶抑制率大于50％，活性为B的化合物表示激酶抑制率介于30％-50％之间，活性为C的化合物表示激酶抑制率小于30％。
表2 化合物1-化合物33对于EGFRL858R/T790M/C797S激酶的活性结果
Figure BDA0003176651590000302
Figure BDA0003176651590000311
综上所述，在激酶活性实验中，化合物12、13、14、28、30、31、32、33对EGFRL858R /T790M/C797S激酶的活性抑制效果优异。
三、Kinase-GloMax激酶实验
1、Kinase-GloMax激酶实验原理
与上文相同，不再赘述。
2、激酶实验步骤
1、首先，将ATP、50xPTKsubstrate和Kinase-GloMax等融解，室温平衡，将5xkinaseassaybuffer、DTT和高纯水等碎冰下缓慢融解，置于碎冰中备用。
2、将15μL DTT溶液加入到1.5mL 5xkinaseassaybuffer中，充分混合备用；再取500μL 5xkinase assaybuffer(含有DTT溶液)加入到2mL高纯水内，配成2.5mL 1xkinaseassaybuffer备用。
3、进行测试的化合物需提前配成相应浓度梯度，缓冲液使用高纯水稀释。
4、表3列出了测试组、对照组和空白组各组中每孔所需加入的各个试剂的量，首先应加入小体积的试剂，依次加完各试剂后，最后加入EGFRL858R/T790M/C797S激酶。
表3 测试、对照、空白各组实验试剂加入量
Figure BDA0003176651590000312
Figure BDA0003176651590000321
5、各孔加入试剂后，将96孔板放入到30℃恒温摇床内，让其反应45分钟。
6、反应结束后，每孔加入50μL Kinase-GloMax检测试剂，后用铝箔纸盖住孔板，让其在室温下孵育15分钟，后使用96微孔板发光检测仪检测各孔的光信号，收集数据后进行处理。
基于上述各化合物的EGFRL858R/T790M/C797S激酶活性实验结果，我们选择化合物12、化合物32和33，对其进行EGFRL858R/T790M/C797S激酶IC50值测定。该激酶实验阳性对照化合物为AZD9291(奥希替尼)，浓度梯度范围设为1-10000nM，化合物12、32和33的浓度梯度范围设为1-1000nM，各个浓度设置4复孔进行实验，实验结果如图1和表4所示。
由图1可知，与阳性对照化合物AZD9291相比，化合物12、化合物32和化合物33对EGFRL858R/T790M/C797S激酶活性抑制均显著增强，其中化合物32的激酶抑制活性最强。
表4 EGFRL858R/T790M/C797S激酶活性结果
激酶活性抑制IC<sub>50</sub>值
AZD9291 305±73.5
化合物12 43.5±9.2
化合物32 16.6±6.1
化合物33 27.6±7.3
如表4所示，阳性对照化合物AZD9291对EGFRL858R/T790M/C797S激酶活性抑制IC50值为305nM，与文献已知数据相符。另外，化合物12、化合物32和化合物33对EGFRL858R/T790M/C797S激酶活性抑制IC50值分别为43.5nM、16.6nM和27.6nM，与对照化合物AZD9291相比，化合物12、化合物32和化合物33的激酶活性抑制分别增强了约7、19和11倍，说明化合物12、化合物32、化合物33对EGFRL858R/T790M/C797S激酶活性抑制效果优异。
上面对本发明的实施方式做了详细说明。但是本发明并不限于上述实施方式，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化。

Claims (2)

1.抑制三突变表皮生长因子受体酪氨酸激酶的化合物，其特征在于，其结构式如下：
Figure FDA0003627091060000011
所述抑制三突变表皮生长因子受体酪氨酸激酶的化合物为化合物12、化合物13、化合物14、化合物28、化合物30、化合物31、化合物32、化合物33中的一种，其取代基如下表所示：
Figure FDA0003627091060000012
2.如权利要求1所述的抑制三突变表皮生长因子受体酪氨酸激酶的化合物，其特征在于，上述三突变表皮生长因子受体酪氨酸激酶为EGFRL858R/T790M/C797S激酶。
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