CN113347992A

CN113347992A - 重组病毒和其用途

Info

Publication number: CN113347992A
Application number: CN201980090409.8A
Authority: CN
Inventors: K·佐佐木; J·李
Original assignee: French Shihua Pharmaceutical Factory
Current assignee: French Shihua Pharmaceutical Factory; Ceva Sante Animale SA
Priority date: 2018-12-27
Filing date: 2019-12-26
Publication date: 2021-09-03
Also published as: WO2020136220A1; BR112021012434A2; ZA202104244B; EP3902561A1; US20220062411A1; MX2021007761A

Abstract

本发明涉及重组病毒和其用途。更具体地，本发明涉及对感兴趣的多肽进行编码的新型重组马立克氏病病毒以及其用于向动物，特别是家禽表达或递送此类多肽的用途。本发明特别适于针对禽类病原体对家禽进行疫苗接种。

Description

重组病毒和其用途

技术领域

本发明涉及重组病毒和其用途。更具体地，本发明涉及对感兴趣的分子进行编码的新型重组马立克氏病病毒(Marek's Disease Virus)以及其用于向动物，特别是家禽表达或递送此类分子的用途。本发明特别适于针对禽类病原体对家禽进行疫苗接种。

背景技术

家禽肉和蛋是重要的食物来源，由于人口的增长及其高质价比，因此其消耗不断增加。近期的禽流感疫情使公众舆论集中在家禽健康以及食品安全和保障上。家禽疫苗技术成为全球关注的问题。

表达病原体蛋白的重组病毒通常用作针对靶向病原体的家禽疫苗。包含此类病毒的疫苗诱导外源病原体蛋白或其片段在受感染细胞内的表达，这可以随后诱导特异性和保护性体液免疫以及细胞介导的免疫。

已知不同的病毒可以在潜伏感染或持续感染的状态下在受感染动物体内存活。因此，已经开发了此类病毒(其中已经整合了源自病原体的外源基因)用作病毒载体疫苗，以增加对免疫动物的免疫持续时间。

这些病毒载体(或重组病毒)通常基于痘病毒，如禽痘(EP-A-0,517,292)；疱疹病毒，如马立克氏病病毒血清型1、2和3(火鸡疱疹病毒(HVT))(例如，WO-A-87/04463、US5,980,906、US 5,853,733)或者，可替代地，新城疫病毒(NDV)和禽腺病毒。

这些重组禽类病毒显示出可变水平的保护。表达传染性法氏囊病(IBD)病毒的VP2蛋白的重组HVT已经显示出优于经典IBD疫苗(

IBD)的优势。感兴趣的其它HVT载体表达新城疫(ND)病毒(

ND)或传染性喉气管炎(ILT)病毒(

LT)的抗原。

基于HVT的重组病毒的实际问题之一可以是当其组合使用以赋予针对不同病原体的免疫原性时所述重组病毒的干扰。的确，当将表达不同抗原的两种不同rHVT混合时，可以诱导至少针对所述疾病之一的较低保护(参见例如，Slacum G等人,2009,《HVT重组体与其它马立克氏病疫苗的相容性(The compatibility of HVT recombinants with otherMarek's disease vaccines)》,第58届西方家禽疾病会议(58th Western PoultryDisease Conference),萨克拉门托,加利福尼亚州,美国,3月23日-25日,第84页)。

因此，需要新的方法来改善动物，特别是家禽中的疫苗接种，从而允许同时保护免受若干疾病。

已经开发了可以表达两种不同抗原性肽的多价HVT载体(参见WO2013/144355)。

使用主要位于UL的克隆区，例如在W02016/120421中还报道了基于MDV1的重组载体。还已经提到了US中的克隆位点，例如US2或US10。

本发明公开了新型重组病毒，其适用于在动物中诱导强免疫保护并且另外可以与如重组HVT疫苗等其它病毒疫苗组合使用，以获得延长的免疫。

发明内容

本发明公开了新型重组病毒，其适用于在动物中诱导强免疫保护并且另外可以与如重组HVT疫苗等其它病毒疫苗组合使用，以引发延长的免疫。本发明更具体地涉及新型属于血清型1的重组马立克氏病病毒(“rMDV1”)，其含有位于MDV086.6基因座中的一个或多个外源基因。本发明的确示出了MDV1基因组内的所述基因座允许外源基因的有效克隆和稳定表达。

因此，本发明的一个目的在于在其基因组中包括重组核酸的属于血清型1的重组马立克氏病病毒(rMDV1)，其中所述重组核酸位于基因组的MDV086.6(SORF1)基因座中。

如本发明将进一步公开的，重组核酸可以通过***MDV086.6(SORF1)编码序列内或通过***MDV086.6(SORF1)侧翼的基因间区来克隆以置换MDV086.6(SORF1)基因座的全部或一部分。

本发明的另外的目的涉及一种包括如上定义的rMDV1的基因组的核酸分子。

本发明还涉及一种包括如上定义的核酸分子的载体(例如，质粒、粘粒、病毒、染色体等)。

本发明还涉及一种包括如上定义的rMDV1、载体或核酸的宿主细胞或此类细胞的培养物。

本发明的另外的目的是一种用于产生或复制如上定义的rMDV1的方法，所述方法包括用如上定义的核酸分子或如上定义的rMDV1感染感受态细胞以及收集所述rMDV1。

本发明的另外的目的是一种用于产生rMDV1的方法，所述方法包括(i)将在启动子控制下的重组核酸引入属于血清型1的马立克氏病病毒的MDV086.6基因座中；(ii)复制所述病毒；以及(iii)收集所述病毒。

本发明的另一个目的是一种组合物，如疫苗，所述组合物包括如上定义的rMDV1以及药学上或兽医学上可接受的赋形剂和/或佐剂。

这种组合物可以用于例如对禽类(如家禽)进行疫苗接种或使其免疫。

因此，本发明的另一个目的在于用于针对病原体对禽类，优选地鸡进行疫苗接种的如上定义的rMDV1或如上定义的组合物。

本发明的另一个目的在于用于在禽类，优选地鸡中诱导或刺激免疫应答的如上定义的rMDV1或组合物。

本发明的另外的目的是如上定义的rMDV1，其用于与属于不同血清型并且表达不同抗原的另外的重组疱疹病毒组合地使用，以用于通过同时、分开、顺序或交替施用针对至少两种不同病原体对禽类，优选地鸡进行疫苗接种。

另一方面，本发明提供了一种对动物进行疫苗接种或使动物免疫的方法，所述方法包括至少一次施用如上定义的rMDV1或组合物。

在另外的方面，本发明提供一种用于在动物中诱导针对一种或多种禽类病原体的免疫原性或保护性应答的方法，所述方法包括至少一次施用如上定义的rMDV1或组合物。

本发明进一步涉及一种使禽类免疫的方法，所述方法包括向所述禽类施用有效免疫量的本发明的rMDV1或组合物。

本发明进一步提供了一种用于使禽类免疫的疫苗接种试剂盒，所述疫苗接种试剂盒包括有效量的本发明的组合物以及用于向所述禽类施用所述组合物的构件。

本发明可以用于表达任何多肽，优选地用于表达禽类病原体的抗原。适用于对如家禽等禽类进行疫苗接种。

附图说明

图1展示了可以分别用于构建(a)RR071或(b)RR072或(c)RR075的三种类型的基础同源性质粒。

图2示出了(a)重组MDV1/IBD基因组(RR071、RR072、RR075)和(b)重组MDV1/ILT基因组(RR080、RR083、RR092、RR093、RR094)的图解。

图3(a)示出了重组MDV1/IBD(RR072)基因组的图解，其指示在PCR反应中扩增以确认病毒的基因组结构的所有连结的位置。图3(b)示出了PCR分析的结果。在PASS+1时收获RR072并且准备用于PCR分析。图3(c)展示了通过重组MDV1/IBD、RR072(PASS+1)检测IBDVVP2蛋白表达的蛋白质印迹测定法。VP2蛋白的分子量为大约40kDa。

图4(a)示出了重组MDV1/ILT(RR080和RR083)基因组的图解，其指示在PCR反应中扩增以确认病毒的基因组结构的所有连结的位置。图4(b)示出了PCR分析的结果。在PASS+5时收获所有重组MDV1/ILT。图4(c)示出了通过重组MDV1/ILT病毒、RR080或RR083(PASS+1)检测ILTV gB蛋白表达的蛋白质印迹测定。估计从重组MDV1/ILT表达的ILTV gB蛋白的分子量为约53kDa。

图5展示了使用商业IBD ELISA试剂盒在用重组MDV1/IBD(RR071或RR072或RR075)疫苗接种的SPF鸡的IBDV ELISA滴度的平均值。

图6展示了用重组MDV1/ILT RR080或RR092疫苗接种的SPF鸡的临床体征评分的平均值。

具体实施方式

本发明通常涉及rMDV1，其包括位于MDV086.6(SORF1)基因座中的重组核苷酸序列。本发明还涉及组合物，如疫苗，其包括这种rMDV1，以及涉及其用于对动物，特别是家禽进行疫苗接种的用途。

通过参考以下定义将最好地理解本公开：

定义

术语“病毒”具体地指包括封装在衣壳或胶囊中的核酸分子(例如，基因组)的病毒颗粒。术语“病毒”还指病毒载体或分离的病毒基因组。

相对于疱疹病毒，术语“重组”指其基因组已经通过***至少一个核酸而被修饰的疱疹病毒，即，在疱疹病毒的基因组中天然不存在的核酸(例如，DNA，如基因)，或者在所述基因组中天然存在但却处于不同形式或处于不同定位的核酸。重组病毒可以通过多种方法，如本文所述的重组DNA技术来制备，并且一旦制成，就可以在不进一步使用还如本文所述的重组DNA技术的情况下复制。

在本说明书中，术语“核酸”、“核酸序列”和“核苷酸序列”可互换使用，并且是指具有确定序列的核酸分子，其可以是脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸。核苷酸序列可以首先通过例如重组、酶促和/或化学技术制备，并且随后在宿主细胞或体外***中复制。核苷酸序列优先地包括对分子(例如，肽或蛋白质)进行编码的开放阅读框。核苷酸序列可以含有另外的序列，如启动子、转录终止子、信号肽、IRES等。优选地，重组核酸中的开放阅读框不含有内含子。

“重组核苷酸序列”指在疱疹病毒的基因组中天然不存在的序列，或是在所述基因组中天然存在但是处于不同形式或处于不同定位的序列。典型的“重组核苷酸序列”是优选地对不是由禽类疱疹病毒天然产生的分子(如来自不同病毒或来自细胞的分子)进行编码的基因。在这种“重组核苷酸序列”的背景下的“基因”指含有开放阅读框的任何核酸分子，如由开放阅读框组成的或基本上由开放阅读框组成的核酸。基因可以进一步含有调节元件，例如启动子或终止子。

在本说明书中，术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”可互换使用，并且是指包括至少2个连续氨基酸的聚合物的任何分子。

在本发明的背景内，对于给定基因，术语“基因座”指含有开放阅读框、调节序列和侧翼基因间序列的基因组的整个区域。就此而言，MDV086.6(SORF1)基因座因此涵盖SORF1开放阅读框、SORF1启动子/终止子序列以及其5'和3'延伸的基因间序列，即一方面，位于SORF1与MDV086.4之间，并且另一方面，位于SORF1与MDV087之间。

术语“禽类物种”旨在涵盖所有种类的禽类，如鸟纲类的鸟类，即有羽毛、有翼的、两足、吸热以及产卵的脊椎动物。在本发明的背景中，禽类或禽类物种更具体地是指具有经济和/或农业利益的鸟类，例如家禽(如鸡和火鸡等)、水禽家禽(如鸭和鹅等)和观赏鸟类(如天鹅和鹦鹉等)。

如本文所使用的，术语“疫苗”指可以用于引起、刺激或扩增生物体的免疫应答的药剂。

“感兴趣的分子或产物”包含但不限于多肽(例如，肽、蛋白质等)以及RNA(例如，反义RNA、干扰RNA、适体等)。

“免疫应答”指在宿主体内对感兴趣的组合物或疫苗产生细胞和/或抗体介导的免疫应答。通常，“免疫应答”包含产生抗体、B细胞、辅助T细胞和/或细胞毒性T细胞，其特异性地针对包含在感兴趣的组合物或疫苗中的一种或多种抗原。优选地，免疫应答是保护性的，使得增强对新感染的抗性和/或降低疾病的临床严重性。

rMDV1

本发明通常涉及包括位于MDV086.6(SORF1)基因座中的重组核苷酸序列(如外源基因)的rMDV1及其用途。

马立克氏病病毒(“MDV”)是禽类疱疹病毒。MDV公开于出版物中(参见例如，Kingham等人,“火鸡的疱疹病毒的基因组：与马立克氏病病毒的比较分析(The genome ofherpesvirus of turkeys:comparative analysis with Marek's disease viruses”),《普通病毒学杂志(Journal of General Virology)》(2001)82,1123-1135)并且通常可从收藏品中获得。MDV的基因组的序列也可在基因文库中获得(GenBank登录号：DQ530348和AF291866)。

本发明利用属于血清型1的MDV，优选地靶向动物的MDV1的非病原病毒株。这种病毒株的具体实例是CVI988 Rispens病毒株(GenBank登录号：DQ530348)。

MDV1的基因组含有被组织成两个不同区域L和S的约160kbp，所述两个不同区域由反向重复序列界定的独特长(UL)和独特短(US)序列构成。基因组含有近400个报道的开放阅读框。

本发明源于以下发现：MDV1基因组中位于US区中的特定基因座可以用于有效且稳定地克隆任何感兴趣的外源基因。更具体地，发明人已经证明，MDV086.6(也被称为SORF1)基因座表示MDV1基因组中的合适的新克隆位点。MDV086.6位于US区中，位于侧翼是IR区的Us区的末端。这种基因是MDV独有的，并且所述基因对在CVI988 Rispens病毒株的情况下由76个氨基酸组成的蛋白质(Brunovskis等人,1993,PMID:7831788，这种蛋白质的假设氨基酸序列：GenBank登录号：ABF72352.1)进行编码。所述蛋白质的功能目前是未知的。通过进行实验，发明人已经证实，缺乏MDV086.6(SORF1)几乎不影响病毒生长。发明人还已经证明，可以产生其中外源基因被***所述基因座处的病毒，并且此类重组构建体可以繁殖、在体内保持感染性并且可以稳定地表达外源基因。

因此，本发明提供了含有位于MDV086.6(SORF1)基因座中的重组核酸(例如，外源基因)的新型rMDV1。

MDV086.6基因座处的克隆可以通过***基因座的编码基因序列内、***基因座的基因间区中或通过置换基因座的序列的全部或一部分来进行。术语“基因间区”是本领域熟知的并且是指位于两种指定病毒ORF之间的病毒基因组的任何区域。基因间区因此可以包含调节序列。

参考MDV1的CVI988 Rispens病毒株的基因组，MDV086.4的编码序列位于核苷酸154371与154529之间，MDV086.6(SORF1)的编码序列位于核苷酸154605与154835之间，并且MDV087(SORF2)的编码序列位于核苷酸155025与155564之间。MDV086.4与MDV086.6之间的基因间区因此位于核苷酸154529与154605之间，并且MDV086.6与MDV087之间的基因间区因此位于核苷酸154835与155025之间。因此，根据本发明，MDV086.6(SORF1)基因座处的克隆包含通过参考CVI988 Rispens病毒株在位于MDV1基因组的核苷酸154529与155025之间的任何地方进行克隆。

在本申请中，参考CVI998 Rispens病毒株的完整基因组是指在本申请的提交日以登录号DQ530348描述于Genbank中的所述基因组。

在特定实施例中，重组核酸置换基因座的序列的全部或一部分。在特定实施例中，重组核酸置换SORF1编码序列的全部或一部分和/或SORF1调节序列的全部或一部分。通常，重组核酸可以置换基因座的序列的30-100％，如ORF和/或基因座的调节部分的30-100％。在此实施例的特定方面，基因座的置换部分的长度与重组核酸的长度类似。在此实施例的另一个特定方面，基因座的置换部分包括ORF的至少90％。在此实施例的另一个特定和优选方面，重组核酸置换基因座的所有编码序列。通过参考CVI988 Rispens病毒株，这与MDV1的基因组的核苷酸154605到154835相对应。

在另一个特定实施例中，重组核酸被***基因座的编码基因序列内，基本上不缺失所述编码基因序列或甚至所述基因座。在此类实施例中，重组核酸因此中断基因组中的编码基因序列。在此类实施例中，SORF1基因产物不被重组病毒表达。此类克隆策略基本上不会导致靶基因座中的病毒序列的缺失，除了偶尔在例如1-5个核苷酸之间用于克隆目的。在此类实施例的优选方面，重组核酸位于SORF1编码序列内，即位于起始密码子与终止密码子之间。通过参考CVI988 Rispens病毒株基因组，此实施例因此包含通过***核苷酸154605到154835之间的任何地方进行克隆。此类克隆的具体说明性定位是，从起始密码子开始，在第80个与第81个核苷酸之间，在第100个与第101个核苷酸之间或在第170个与第171个核苷酸之间。

在另一个特定实施例中，将重组核酸***到SORF1编码序列，其5'或3'侧翼的基因间区中。在这方面，优选的基因间区是位于MDV086.6(SORF1)编码序列与MDV087(SORF2)编码序列之间的基因间区。这种区域位于SORF1起始密码子与SORF2起始密码子之间(因为两个编码序列处于相反朝向)。因此，此实施例包含通过参考CVI988 Rispens病毒株在MDV1基因组的核苷酸定位154835与155025之间的任何地方进行克隆。这种克隆的说明性定位位于核苷酸154835与154836之间。此类克隆策略基本上不会导致靶基因座中的病毒序列的缺失，除了偶尔在例如1-5个核苷酸之间用于克隆目的。

本发明的优选rMDV1在MDV086.6(SORF1)基因座中含有重组核酸并且保留至少一个侧翼基因，例如SORF2的编码序列。具体地，本发明的载体在克隆区不含有跨越若干病毒基因的基因组缺失，因此允许稳定性/可复制性效率。因此，本发明的特定rMDV1在MDV086.6(SORF1)基因座中含有重组核酸并且保留SORF2和/或US1的编码序列。

重组核酸

本发明的rMDV1中含有的核酸可以对任何感兴趣的产物，如任何蛋白质、肽或多肽，例如生物活性多肽、免疫原性(即，抗原性)多肽等进行编码。

在优选的实施例中，感兴趣的产物是抗原，如抗原性蛋白、多肽或肽，甚至更优选地源自能够引起动物，特别是禽类感染的病原生物体的抗原的蛋白质、肽或多肽。引起禽类感染的病原体的实例包含病毒、细菌、真菌、原生动物等。免疫原性多肽可以优选地是(源自)所述病原体的表面蛋白、分泌蛋白或结构蛋白或其片段。多肽可以源自任何来源，例如，病毒、原核、真核或合成的。

在优选的实施例中，核酸对鸟类病原体的抗原进行编码。

鸟类病原体的具体实例包含但不限于禽流感病毒、1型禽副粘病毒，也称为新城疫病毒(NDV)、禽偏肺病毒、马立克氏病病毒、干保罗病病毒(Gumboro disease virus)，也称为传染性法氏囊病病毒(IBDV)、传染性喉气管炎病毒(ILTV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、大肠杆菌、沙门氏菌属(Salmonella species)、多杀性巴氏杆菌(Pasteurellamultocida)、鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer)、鼻气管鸟杆菌(Ornithobacterium rhinotracheale)、支原体加利坏疽抗毒素(Mycoplasma gallisepticum)、滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae)、感染禽类物种或球虫的支原体微生物。

优先地，抗原选自NDV的F蛋白、IBDV的VP2蛋白、ILTV的gB蛋白、支原体加利坏疽抗毒素的40K蛋白和禽流感病毒的表面蛋白血凝素(HA)或其免疫原性片段。

在本发明的背景内，术语蛋白质的“片段”优选地指包括所述蛋白质的至少5个连续氨基酸残基，甚至更优选地5-100个的片段。在优选实施例中，这种片段包括至少一个表位和/或在体内具有免疫原性，即，可以引起与全长蛋白结合的抗体的产生。

免疫原性肽的具体实例包含例如包括VP2的氨基酸残基1-453的肽。

重组核酸可以含有启动子以驱动感兴趣的产物的表达。启动子可以是适用于在例如禽类细胞中表达的任何启动子，如细胞启动子、病毒启动子、合成/人工启动子等，所述启动子可以被调节或不被调节。在特定实施例中，启动子选自鸡β-肌动蛋白(Bac)启动子或其衍生物，如Coa5；Pec启动子；鼠类巨细胞病毒(Mcmv)即刻早期(ie)1启动子；人巨细胞病毒启动子(Hcmv)；猿猴病毒(SV)40启动子；以及劳斯氏肉瘤病毒(RSV)启动子或其保留启动子活性的任何片段。

在特定实施例中，启动子是鸡β肌动蛋白启动子或由其衍生的启动子，如Coa5启动子。

鸡β肌动蛋白启动子的序列在本领域已经报道并且可在公共基因文库上获得。说明性序列示于SEQ ID NO:22中。

“源自”鸡β肌动蛋白启动子的启动子是包括鸡β肌动蛋白启动子的功能片段的序列，优选地鸡β肌动蛋白启动子的转录活性片段的序列的启动子。启动子可以进一步包括可以是人工的和/或从不同的启动子获得的另外的残基或功能结构域。源自鸡β肌动蛋白启动子的启动子通常包括所述鸡β肌动蛋白启动子的序列的至少50个连续核苷酸，或与其具有至少90％序列同一性，优选地与其具有至少96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，并且单独地或当与另外的结构域组合时表现出转录活性。

用于本发明的鸡β肌动蛋白源性启动子序列更优选地是至少包括鸡β肌动蛋白启动子的核心序列的序列。核心序列通常位于天然启动子的核苷酸-1200到-900之间，甚至更优选地在nt-1192与-922之间的区域内。鸡β肌动蛋白启动子的核心序列的具体实例呈现于SEQ ID NO:20中。

在特定实施例中，本发明中使用的启动子含有鸡β肌动蛋白启动子的核心序列，所述核心序列包括(i)SEQ ID NO:20或(ii)与SEQ ID NO:20具有至少90％序列同一性，优选地与SEQ ID NO:20具有至少96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，以及表现出转录启动子活性。

在特定实施例中，启动子是Coa5启动子。

在另一个特定实施例中，启动子是RSV启动子。

rMDV1病毒构建

基因克隆和质粒构建是本领域的普通技术人员所熟知的，并且可以基本上通过标准分子生物技术来进行(《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:A LaboratoryManual.)》第4版,冷泉港实验室(Cold Spring Harbor Laboratory),冷泉港,纽约,美国,2012)。

通常，重组病毒可以通过病毒基因组与包括待***的核酸的构建体(例如，质粒)之间的同源重组来制备，所述核酸的侧翼是来自***位点的核苷酸以允许重组。可以在缺失或不缺失内源序列的情况下进行***。

为此目的，通常首先将含有靶向MDV086.6(SORF1)基因座的序列克隆到合适的载体中。载体的实例包含质粒，如pBR322、pBR325、pBR327、pBR328、pUC18、pUC19、pUC7、pUC8或pUC9等；噬菌体，如λ噬菌体和M13噬菌体；粘粒，如pHC79。

根据常规克隆方法将靶区序列整合到载体中。所使用的靶区序列优选地具有足够的长度，以便允许随后与病毒基因组的体内同源重组。优选地，克隆靶区序列的长度应为至少大约100个核苷酸，通常高于300个，如介于1000个与2000个核苷酸之间。

将用于***到病毒中的编码序列和启动子序列***到克隆到载体中的病毒基因组的靶区中。***应优选地以如下方式进行：在克隆***物的每一侧上留下足以允许同源重组的长度(例如，至少50个核苷酸，优选地至少100个核苷酸)的靶区的序列的一部分。可以通过经典的限制酶和连接程序将编码序列和启动子序列引入到克隆靶区中。如果合适，可以在靶区的特定位点处进行突变，以产生限制酶的新切割位点。本领域的技术人员熟知的常规诱变技术可以用于所述目的，例如体外诱变或PCR。

可以使用已知的技术(如电穿孔、磷酸钙、基于脂转染素的方法等)将其中已经将编码序列和启动子序列***到如上获得的靶区中的载体引入到MDV1感染的细胞或MDV1基因组转染的细胞中。重组病毒由此通过在所述细胞中在MDV1-DNA的同源区与载体之间的重组产生。当载体的量在0.1到1000μg的范围内时，重组病毒的生成效率是特别优化的。

可以使用已知的选择技术在基因型或表型上选择所得重组病毒，例如通过杂交、检测与重组核酸序列一起整合的基因编码的酶活性或免疫学检测由重组病毒表达的抗原性肽。可以在细胞培养中大规模培养所选重组病毒，此后可以收集含有肽的重组病毒。

优选rMDV1

本发明的优选rMDV对选自NDV的F蛋白、IBDV的VP2蛋白、ILTV的gB蛋白、支原体加利坏疽抗毒素的40K蛋白和禽流感病毒的表面蛋白HA的抗原性肽或其免疫原性片段进行编码。

本发明的优选rMDV1包括对IBDV的VP2抗原或ILTV的gB抗原进行编码的重组核酸，所述重组核酸置换基因组的MDV086.6(SORF1)编码区和/或调节区的全部或一部分。

本发明的另一个优选rMDV1包括对IBDV的VP2抗原或ILTV的gB抗原进行编码的重组核酸，所述重组核酸位于基因组的MDV086.6(SORF1)编码区内，基本上没有所述编码区的缺失。

本发明的另一个优选rMDV1包括对IBDV的VP2抗原或ILTV的gB抗原进行编码的重组核酸，所述重组核酸位于MDV086.6(SORF1)与MDV087(SORF2)之间的基因间区中。

本发明的另一个优选rMDV1包括在Coa5启动子的控制下***MDV086.6(SORF1)基因编码序列中的对IBDV的VP2蛋白或其免疫原性片段进行编码的重组核苷酸序列。

本发明的另一个优选rMDV1包括置换MDV086.6(SORF1)基因座的全部或一部分的至少一种重组核酸。优选地，禽类抗原是在Coa5启动子的控制下或在劳斯氏肉瘤病毒(RSV)启动子的控制下的VP2或gB蛋白或其免疫原性片段。

本发明的另一个优选rMDV1包括***到MDV086.6(SORF1)与MDV087(SORF2)之间的基因间区中的至少一种重组核酸。优选地，禽类抗原是在Coa5启动子的控制下的VP2或gB蛋白或其免疫原性片段。

本发明的此类rMDV1的具体和优选实例包含RR071、RR072、RR075、RR080、RR083、RR092、RR093和RR094。

在RR071中，对SEQ ID NO:19的IBDV的VP2蛋白进行编码的核苷酸序列位于SEQ IDNO:20的Coa5启动子的控制下，在3'-末端处连接到SEQ ID NO:21的SV40聚腺苷酸化信号，以正(加号)方向(链)***MDV1的MDV086.6(SORF1)的编码序列中。

在RR072中，对SEQ ID NO:19的IBDV的VP2蛋白进行编码的核苷酸序列位于SEQ IDNO:20的Coa5启动子的控制下，在3'-末端处连接到SEQ ID NO:21的SV40聚腺苷酸化信号，并且以负(减号)方向置换MDV1的MDV086.6(SORF1)的编码序列。

在RR075中，对SEQ ID NO:19的IBDV的VP2蛋白进行编码的核苷酸序列位于SEQ IDNO:20的Coa5启动子的控制下，在3'-末端处连接到SEQ ID NO:21的SV40聚腺苷酸化信号，并且以正方向***MDV1的MDV086.6(SORF1)与MDV087(SORF2)之间的基因间区中。

在RR080中，对SEQ ID NO:23的ILTV的gB蛋白进行编码的核苷酸序列位于SEQ IDNO:20的Coa5启动子的控制下，并且以正方向置换MDV1的MDV086.6(SORF1)的编码序列。

在RR083中，对SEQ ID NO:23的ILTV的gB蛋白进行编码的核苷酸序列位于SEQ IDNO:24的RSV启动子的控制下，并且以负方向置换MDV1的MDV086.6(SORF1)的编码序列。

在RR092中，对SEQ ID NO:23的ILTV的gB蛋白进行编码的核苷酸序列位于SEQ IDNO:20的Coa5启动子的控制下，并且以负方向***MDV1的MDV086.6(SORF1)的编码序列中。

在RR093中，对SEQ ID NO:23的ILTV的gB蛋白进行编码的核苷酸序列位于SEQ IDNO:20的Coa5启动子的控制下，并且以负方向***MDV1的MDV086.6(SORF1)的编码序列中。

在RR094中，对SEQ ID NO:23的ILTV的gB蛋白进行编码的核苷酸序列位于SEQ IDNO:20的Coa5启动子的控制下，并且以正方向***MDV1的MDV086.6(SORF1)与MDV087(SORF2)之间的基因间区中。

细胞培养物

本发明的重组病毒可以在任何感受态细胞培养物中增殖。在实现所需的病毒生长后，可以使用刮刀或胰蛋白酶将细胞从孔中分离，并且可以通过离心将受感染细胞与上清液分离。

感受态细胞的实例包含CEF、含胚卵、鸡肾细胞等。细胞或病毒可以在培养基，如Eagle's MEM、Leibowitz-L-15/McCoy 5A(1:1混合物)培养基中在约37℃下培养3到6天。受感染细胞通常悬浮于含有10％二甲亚砜(DMSO)或

1(ZENOAQ)的培养基中，并且在液氮下或在例如-85℃的深冷冰箱中冷冻储存。

组合物和疫苗

本发明还涉及组合物，如疫苗，其包括一种或多种本发明的重组MDV1，以及药学上或兽医学上可接受的赋形剂和/或佐剂。

合适的赋形剂和佐剂是技术人员已知的。

本发明的rMDV可以以活形式使用(例如，制备活疫苗)或者可替代地，以灭活、减毒或杀死形式使用。这些形式的生产是本领域已知的。

优选地，本发明的组合物是疫苗。

根据本发明的组合物或疫苗可以进一步包括合适的溶剂，例如水性缓冲液或磷酸盐缓冲液。优选地，组合物或疫苗还包括添加剂。本发明的添加剂可以从多种来源中的任一种获得，包含与组合物或疫苗一起施用的源自动物的各种蛋白质和肽(例如，激素、细胞因子、共刺激因子)以及源自病毒和其它来源的新型核酸(例如，双链RNA、CpG)等。另外，任何数量的上述物质的组合可以提供免疫增强作用。

本发明的组合物或疫苗可以进一步与一种或多种另外的添加剂一起调配以维持等渗性、生理pH和稳定性，例如缓冲液，如生理盐水(0.85％)、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、柠檬酸盐缓冲液、三(羟甲基氨基甲烷)(TRIS)、三缓冲盐水等，或抗生素，例如新霉素或链霉素。

施用途径可以是任何途径，包含口服、眼部(例如，通过滴眼剂)、使用气雾剂的眼鼻施用、鼻内、饲料中、水中的泄殖腔或通过喷雾、卵内、局部施用或通过注射(例如，静脉内、皮下、肌内、眶内、眼内、皮内和/或腹膜内)疫苗接种。技术人员将容易地针对每种类型的施用途径适配疫苗组合物的调配物。

每个疫苗剂量可以含有足以在禽类物种中引发保护性免疫应答的合适剂量。这种剂量的优化是本领域熟知的。每剂量的抗原量可以通过使用抗原/抗体反应的已知方法来确定，例如通过ELISA方法。

本发明的组合物或疫苗可以以单剂量或以重复剂量进行施用，这取决于疫苗接种方案。

本发明的组合物或疫苗的进一步有利之处在于所述组合物或疫苗针对靶向的禽类病原体赋予鸟类物种保护，如实例6所示。

用途

本发明进一步涉及一种用于针对病原体对禽类，如家禽进行疫苗接种的本发明的rMDV1或组合物(疫苗)。

此类疫苗接种优选地通过施用免疫学有效量的根据本发明的rMDV1或组合物(疫苗)来进行。

本发明的rMDV1或组合物(疫苗)可以有利地皮内、皮下、肌内、口服、卵内、通过粘膜施用或者通过眼鼻施用，优选地皮下施用。

本发明的rMDV1或组合物(疫苗)可以方便地与属于不同血清型并且表达不同抗原的另外的重组疱疹病毒组合地使用，以用于通过同时、分开、顺序或交替施用来对禽类，优选地鸡进行疫苗接种。

本发明进一步涉及用于使禽类物种免疫的疫苗接种试剂盒，所述疫苗接种试剂盒包括有效量的如上所述的组合物或疫苗以及用于向所述物种施用所述组合物或疫苗的构件。例如，此类试剂盒包括填充有根据本发明的疫苗的注射装置以及用于皮内、皮下、肌内或卵内注射的说明书。可替代地，试剂盒包括填充有根据本发明的疫苗的喷雾剂/气雾剂或滴眼剂装置以及用于眼鼻施用、口腔或粘膜施用的说明书。

本发明的另外的方面和优点将在以下实验部分中公开，所述实验部分是对所要求保护的发明的说明。

实例

发明人构建了具有***MDV086.6基因座中的不同表达盒的一系列重组MDV1。其示意图示出于图2(a)和图2(b)中。

这些病毒被指定如下(病毒/***位点/***的基因(方向))：

RR071：rMDV1/MDV086.6(Ins)/Coa5_VP2(+)

RR072：rMDV1/MDV086.6(Sub)/Coa5_VP2(-)

RR075：rMDV1/MDV086.6-087/Coa5_VP2(+)

RR080：rMDV1/MDV086.6(Sub)/Coa5_gBdel(+)

RR083：rMDV1/MDV086.6(Sub)/RSV_gBdel(-)

RR092：rMDV1/MDV086.6(Ins)/Coa5_gBdel(-)

RR093：rMDV1/MDV086.6(Ins)/Coa5_gBdel(+)

RR094：rMDV1/MDV086.6(Ins)/Coa5_gBdel(-)。

实例1:同源性载体的构建

质粒构建基本上通过标准分子生物学技术来进行(《分子克隆：实验室手册》第4版,冷泉港实验室,冷泉港,纽约,美国,2012)。

pUC18_MDV086.6(Ins)SfiI的构建

通过PCR克隆靶基因座侧翼的MDV1 Rispens病毒株基因组MDV086.6(SORF1)基因的1.1-kb DNA片段，使得在MDV086.6(SORF1)的中间添加SfiI识别位点(图1(a))。简言之，使用从MDV1 Rispens病毒株(PASS+21)中提取的DNA作为模板，进行两个PCR步骤。在第1步PCR中使用的引物对是SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4。使用源自第1步PCR的PCR产物的混合物作为模板以及SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:4作为引物进行第2步PCR。在用KpnI和Sac I消化之后，将获得的PCR片段克隆到pUC18载体(GenBank登录号：L09136)中，从而产生pUC18_MDV086.6(Ins)_SfiI。这种基础同源性质粒描绘于图1(a)中。

pUC18_MDV086.6(Sub)_SfiI的构建

通过PCR克隆靶基因座侧翼的MDV1 Rispens病毒株基因组MDV086.6(SORF1)基因的1.1-kb DNA片段，使得MDV086.6(SORF1)被SfiI识别位点置换(图1(b))。简言之，使用从MDV1 Rispens病毒株(PASS+21)中提取的DNA作为模板，进行两个PCR步骤。在第1步PCR中使用的引物对是SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8。使用源自第1步PCR的PCR产物的混合物作为模板以及SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:8作为引物进行第2步PCR。在用KpnI和Sac I消化之后，将获得的PCR片段克隆到pUC18载体(GenBank登录号：L09136)中，从而产生pUC18_MDV086.6(Sub)_SfiI。这种基础同源性质粒描绘于图1(b)中。

pUC18_MDV086.6/087_SfiI的构建

通过PCR克隆靶基因座侧翼的MDV1 Rispens病毒株基因组(位于MDV086.6(SORF1)与MDV087(SORF2)之间的基因间区)的1.3-kb DNA片段，使得在MDV086.6(SORF1)与MDV087(SORF2)之间添加SfiI识别位点(图1(c))。简言之，使用从MDV1 Rispens病毒株(PASS+21)中提取的DNA作为模板，进行两个PCR步骤。在第1步PCR中使用的引物对是SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:8。使用源自第1步PCR的PCR产物的混合物作为模板以及SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:8作为引物进行第2步PCR。在用KpnI和Sac I消化之后，将获得的PCR片段克隆到pUC18载体(GenBank登录号：L09136)中，从而产生pUC18_MDV086.6/087_SfiI。这种基础同源性质粒描绘于图1(c)中。

pUC18_MDV086.6(Sub)_Coa5VP2(-)的构建

利用质粒pUC18_MDV086.6(Sub)_SfiI，构建了含有来自标准攻击病毒株(VP2-STC)的Coa5启动子和的IBDV VP2基因的同源性载体。这种同源性载体用于构建重组MDV1/IBD、RR072。首先，将pUC18_MDV086.6(Sub)_SfiI用SfiI裂解，并且用碱性磷酸酶希瓦氏菌属S1B1重组体(PAP)去磷酸化(Funakoshi#DE110)。“Coa5启动子IBDV VP2 SV40 polyA信号”基因盒是通过pUC18-MDV071-Coa5VP2stc(WO 2016120421 A1)的SfiI-BglI消化获得并且将其***到SfiI消化的pUC18_MDV086.6(Sub)_SfiI，从而产生pUC18_MDV086.6(Sub)_Coa5VP2(-)。这种质粒在负方向上含有“Coa5启动子_IBDV VP2_SV40 polyA信号”基因盒。

pUC18_MDV086.6(Ins)_Coa5VP2(+)的构建

关于这种同源性载体的构建，使用pUC18_MDV086.6(Sub)_Coa5VP2(-)作为PCR模板并且使用SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12作为引物，通过PCR扩增“Coa5启动子_IBDV VP2_SV40 polyA信号”基因盒。将获得的PCR片段用SfiI消化并且***到pUC18_MDV086.6(Ins)_SfiI中。所得质粒pUC18_MDV086.6(Ins)_Coa5VP2(+)用于制备RR071。这种质粒在正方向上含有“Coa5启动子_IBDV VP2_SV40 polyA信号”基因盒。

pUC18_MDV086.6/087_Coa5VP2(+)的构建

关于这种同源性载体的构建，使用pUC18_MDV086.6(Sub)_Coa5VP2(-)作为PCR模板并且使用SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12作为引物，通过PCR扩增“Coa5启动子_IBDV VP2_SV40 polyA信号”基因盒。将获得的PCR片段用SfiI消化并且***到pUC18_MDV086.6/087_SfiI中。所得质粒pUC18_MDV086.6/087_Coa5VP2(+)用于制备RR075。这种质粒在正方向上含有Coa5启动子-VP2-STC基因盒。

pUC18_MDV086.6(Sub)_Coa5gBdel(+)的构建

利用质粒pUC18_MDV086.6(Sub)_SfiI，构建这种同源性载体并且用于制备RR080。首先，将pUC18_MDV086.6(Sub)_SfiI用SfiI裂解，并且用PAP去磷酸化。通过PCR扩增构建“Coa5启动子_ILTV gBdel”基因盒，并且将其***到SfiI消化的pUC18_MDV086.6(Sub)_SfiI中，从而产生pUC18_MDV086.6(Sub)_Coa5gBdel(+)。ILTV gBdel基因的核苷酸序列最初是通过亚克隆从ILTV病毒株632(EP1731612A1)获得的。在此，这种基因被轻微修饰而没有氨基酸改变。本文件中采用的ILTV gBdel的序列示出为SEQ ID NO:23。这种质粒在正方向上含有“Coa5启动子_ILTV gBdel”基因盒。

pUC18_MDV086.6(Sub)_RSVgBdel(-)的构建

利用质粒pUC18_MDV086.6(Sub)_SfiI，构建这种同源性载体并且用于制备RR083。通过亚克隆构建“RSV启动子_ILTV gBdel”基因盒，并且将其***到SfiI消化的pUC18_MDV086.6(Sub)_SfiI中，从而产生pUC18_MDV086.6(Sub)_RSVgBdel(-)。通过使用pBK-RSV载体(Stratagene公司)作为PCR模板，亚克隆RSV启动子的核苷酸序列。所述序列示出为SEQID NO:24。这种质粒在负方向上含有“RSV启动子ILTV gBdel”基因盒。

pUC18_MDV086.6(Ins)_Coa5gBdel(-)的构建

利用质粒pUC18_MDV086.6(Ins)_SfiI，构建这种同源性载体并且用于制备RR092。通过PCR扩增获得“Coa5启动子_ILTV gBdeF”基因盒，并且将其***到SfiI消化的pUC18_MDV086.6(Ins)_SfiI中，从而产生pUC18_MDV086.6(Ins)_Coa5gBdel(-)。这种质粒在负方向上含有“Coa5启动子_ILTV gBdel”基因盒。

pUC18_MDV086.6(Ins)_Coa5gBdel(+)的构建

利用质粒pUC18_MDV086.6(Ins)_SfiI，构建这种同源性载体并且用于制备RR093。通过PCR扩增获得“Coa5启动子_ILTV gBdel”基因盒，并且将其***到SfiI消化的pUC18_MDV086.6(Ins)_SfiI中，从而产生pUC18_MDV086.6(Ins)_Coa5gBdel(+)。这种质粒在正方向上含有“Coa5启动子_ILTV gBdeF”基因盒。

pUC18_MDV086.6/087 Coa5gBdel(-)的构建

利用质粒pUC18_MDV086.6/087_SfiI，构建这种同源性载体并且用于制备RR094。通过PCR扩增获得“Coa5启动子_ILTV gBdel”基因盒，并且将其***到SfiI消化的pUC18_MDV086.6(Ins)_SfiI中，从而产生pUC18_MDV086.6/087_Coa5gBdel(-)。这种质粒在负方向上含有“Coa5启动子_ILTV gBdel”基因盒。

实例2:重组MDV1的构建

重组MDV1的构建是通过经培养的细胞中的同源重组进行的。对于经培养的细胞中的同源重组，如Morgan等人(《禽类疾病(Avian Diseases)》,34:345-351,1990)所述制备野生型MDV1 Rispens病毒株(PASS+22)的病毒DNA。使用核转染II(瑞士巴塞尔的龙沙集团(Lonza,Basel,Switzerland))通过电穿孔将大约2μg的MDV1 Rispens病毒株DNA和1μg的同源性载体之一转染到大约10⁷个CEF细胞中。将经转染的细胞添加到Leibovitz's L-15(生命技术公司(Life Technologies Corp.)，目录号：41300-39)、McCoy's 5A培养基(生命技术公司)，目录号：21500-061)(1:1)和4％小牛血清[LM(+)培养基]，种植在96孔组织培养板中，并且然后在37℃下在4-5％CO₂中温育5-7天，直到重组MDV1噬斑变得可见。然后通过胰蛋白酶消化将细胞从板上脱离，同等地转移到具有CEF的两个96孔板，并且温育4到6天直到观察到噬斑。通过黑色噬斑测定进行筛选，仅对表达IBDV VP2蛋白或ILTV gB蛋白的噬斑进行染色。简言之，将两个板之一用甲醇:丙酮混合物(1:2)固定，并且与抗IBDV VP2小鼠单克隆抗体R63(ATCC编号：HB-9490)或抗ILTV gB小鼠单克隆抗体#1_B4_7(未公开)一起温育。接下来，与生物素化抗小鼠IgG抗体(载体实验室(Vector Laboratories)，目录号：BA-9200)一起培育，并且然后与VECTASTAIN ABC-AP试剂盒(载体实验室，目录号：AK-5000)一起温育，通过添加NBT/BCIP溶液(罗氏应用科学部(Roche Applied Science)，目录号：1681451)对表达VP2蛋白或gB蛋白的噬斑进行染色。鉴定含有经染色的重组噬斑的孔，并且使来自另一个96孔板上的对应孔的细胞胰蛋白酶化。然后将细胞在新鲜的二级CEF细胞中稀释并转移到96孔板中以完成第一轮纯化。重复纯化程序，直到所有噬斑在黑色噬斑测定中均被阳性染色。

实例3:基因组结构的验证

使用RR072作为模型案例，下面描述了重组MDV1/IBD的表征方法。简言之，通过三个PCR反应扩增***基因的每个端的连结区，验证重组MDV1/IBD的基因组结构。图3(a)示出了位于RR072中的所有连结的位置。PCR反应中使用的引物对是连结1的SEQ ID NO:13和SEQID NO:15，以及连结2的SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:16，以及连结3的SEQ ID NO:13和SEQID NO:14。图3(b)表明RR072具有正确的基因组结构。用所有其它重组MDV1/IBD，即RR071和RR075观察到预期大小的PCR产物，从而证实这些重组MDV1/IBD也具有预期的基因组结构。

类似地，重组MDV1/ILT的表征通过RR080和RR083的案例进行描述。也通过三个PCR反应扩增***基因的每个端的连结区，验证重组MDV1/ILT的基因组结构。图4(a)示出了位于RR080和RR083中的所有连结。PCR反应中使用的引物对是连结4的SEQ ID NO:13和SEQ IDNO:17，以及连结5的SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:18，以及连结6的SEQ ID NO:13和SEQ IDNO:14，以及连结7的SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:18，以及连结8的SEQ ID NO:14和SEQ IDNO:17。图4(b)示出了RR080和RR083两者都具有客观的基因组结构。用所有其它重组MDV1/ILT，即RR092和RR093以及RR094观察到预期大小的PCR产物，从而证实这些重组MDV1/ILT也具有预期的基因组结构。

实例4:通过重组MDV1表达VP2抗原

本发明的重组MDV1/IBD对VP2抗原的表达通过蛋白质印迹测定得到证实。使用经重组病毒和抗IBDV兔血清感染的CEF细胞进行蛋白质印迹。简言之，将12孔板中的CEF细胞用一种重组病毒或另一种重组病毒病毒株以大约0.01的感染复数进行感染。接种后三天，用胰蛋白酶收获细胞并在913x g下离心5分钟。用PBS洗涤沉淀物，并用100μl PBS重悬。在添加相同体积的2x SDS样品缓冲液(130mM Tris-Cl(pH6.8)、6％SDS、20％甘油、10％2-巯基乙醇和0.01％溴苯酚蓝)之后，将细胞悬浮液煮沸5分钟。使用10％聚丙烯酰胺凝胶通过SDS-PAGE分离样品并且转移到PVDF膜(固相膜(Immobilon-P)，密理博公司(Millipore))。将膜完全干燥，并且然后与抗IBDV兔血清一起温育。在洗掉抗IBDV兔血清之后，生物素化抗兔IgG抗体(载体实验室，目录号：BA-9200)，并且然后用VECTASTAIN ABC-AP试剂盒(载体实验室，目录号：AK-5000)。通过添加NBT/BCIP溶液(罗氏应用科学部，目录号：1681451)使与抗IBDV兔血清结合的蛋白质可视化。

如图3(c)所示，在RR072感染细胞的泳道中观察到40千道尔顿(kDa)的蛋白质条带，这是VP2蛋白的预期大小。

其它重组MDV1/IBD，RR071和RR075也通过蛋白质印迹分析证实其表达VP2蛋白。

实例5:通过重组MDV1表达gB抗原

基本上如实例4所述，使用RR080和RR083对来自本发明的重组MDV1/ILT的gB蛋白表达进行评估。为了检测ILTV gB蛋白，采用抗ILTV gB小鼠单克隆抗体(#1_B4_7，未公开的克隆)作为第1抗体。估计从重组MDV1/ILT表达的gB蛋白的分子量为约为53kDa。

如图4(c)所示，在RR080或RR083的泳道中检测到约53kDa的蛋白质条带。

实例6：本发明的重组MDV1/IBD在SPF鸡中的功效

在SPF鸡中研究RR071、RR072和RR075的功效。将一天龄的鸡分成五个小组，并且将第3组、第4组和第5组的小鸡用大约3000个噬斑形成单位(pfu)/0.2ml的重组MDV1之一进行皮下疫苗接种(RR071：第3组，RR072：第4组，RR075：第5组)。使第2组中的小鸡(非免疫的、经攻击的阳性对照)保持未进行疫苗接种。使第1组中的小鸡(非免疫的、未经攻击的对照)保持未进行疫苗接种且未经攻击。每周对介于1周龄与5周龄之间的鸡进行放血，并且用商业IBDV ELISA试剂盒(ID

IBD VP2：IDvet)测试抗IBDV抗体的存在。攻击是在5周龄时进行的。对于攻击，3×10³个EID₅₀的毒性IBDV STC病毒株是通过口服途径施用的。每日观察鸡的与IBD相关的临床体征，如抑郁和死亡。攻击后七天，对鸡进行尸体剖检并观察到可显著观察的囊损伤，如水肿、变色、萎缩、出血和黄色或凝胶状渗出物。在尸体剖检时还测量了身体和囊的重量，以便计算B/B指数，所述指数是囊重量与经攻击的鸟类体重之间的比率除以未经攻击的鸟类的同一比率。

IBDV ELISA的结果示出于图5中。

表1中提供了功效结果。

表1：由本发明的重组MDV1/IBD在SPF鸡5周龄时针对毒性IBDV攻击引发的保护

小组编号	小组	鸡的数量	B/B指数	攻击后死亡数量	具有囊损伤的数量/总数量	保护％
							1	NINC	15	1.00	0	0	100
2	NIC	15	0.53	10	5	0
							3	RR071	15	0.89	0	3	80
4	RR072	14	0.96	0	2	86
							5	RR075	15	0.75	0	5	67

结果显示，RR071、RR072和RR075在体内引发针对IBDV攻击感染的保护性免疫。

实例7：本发明的重组MDV1/ILT在SPF鸡中的功效

在SPF鸡中研究重组MDV1/ILT(RR080、RR092)的功效。将一天龄的鸡分成三个小组，并且将第2组和第3组的小鸡用大约3000个噬斑形成单位(pfu)/0.2ml的重组MDV1/ILT之一进行皮下疫苗接种(RR080：第2组，RR092：第3组)。使第1组中的鸡(非免疫的、经攻击的阳性对照)保持未进行疫苗接种。每周对介于1周龄与5周龄之间的鸡进行放血。攻击是在5周龄时进行的。对于攻击，1×10³个EID₅₀的毒性ILTV US病毒株是通过口服途径施用的。每日观察鸡的与ILT相关的临床体征，如打喷嚏和呼吸运动失调。每日临床体征评分是通过将“当天的临床体征总分”除以“当天的活鸡数”来计算的。当计算临床体征分时，将死亡计数为6分，并且其它临床体征计数为每1个症状1分。图6总结了用每种重组MDV1/ILT进行疫苗接种的鸡的临床体征评分的平均值。攻击后十一天，对鸡进行尸体剖检并观察到可显著观察到的呼吸道损伤，如血痰等。

表2中提供了结果。

表2：由本发明的重组MDV1/ILT在SPF鸡5周龄时针对毒性ILTV攻击引发的保护

小组编号	小组	鸡的数量	经攻击的数量	死亡的数量	症状数量	保护％
							1	NIC	15	15	7	8	0
2	RR080	15	15	3	2	66.7
							3	RR092	15	15	3	1	73.3

结果表明，本发明的重组MDV1/ILT RR080和RR092在体内引发针对ILTV攻击感染的保护性免疫。

序列表

<110> 法国诗华大药厂

<120> 重组病毒和其用途

<130> B2919

<160> 24

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 1

ctaggaggta ccaagtctca gacaaaccgc 30

<210> 2

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 2

ggagaatatt ctgtaggcct tattggccgg accggcagaa ctt 43

<210> 3

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 3

aagttctgcc ggtccggcca ataaggccta cagaatattc tcc 43

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 4

cctgttgagc tccggaattt tcggaccaat 30

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 5

gccggcggta ccgagttctc ttttttttta 30

<210> 6

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 6

gtttgacaaa acctgggcct tattggcccc tcgcatatgg ggg 43

<210> 7

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 7

cccccatatg cgaggggcca ataaggccca ggttttgtca aac 43

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 8

ctggatgagc tcgacatggc acatcgtcta 30

<210> 9

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 9

atgttgcgac atatgcatgg ccttattggc ccctcgcata tgggggtgg 49

<210> 10

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 10

ccacccccat atgcgagggg ccaataaggc catgcatatg tcgcaacat 49

<210> 11

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 11

aactgaggcc ttattggcct gcagtatttt gtgcagc 37

<210> 12

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 12

gccctgggcc aataaggcct aagatacatt gatgagt 37

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 13

agctaaccac agcgtgtctc 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 14

aaagcattct cggtcccctg 20

<210> 15

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 15

tgaactacac aaaattgata ctga 24

<210> 16

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 16

cggtccggtt gttggcatca gaa 23

<210> 17

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 17

ggggtcgact catctgtaga cactgtg 27

<210> 18

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 18

ggggaattcg actgtgttgt ggaatat 27

<210> 19

<211> 1367

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> vp2

<400> 19

atgacaaacc tgcaagatca aacccaacag attgttccgt tcatacggag ccttctgatg 60

ccaacaaccg gaccggcgtc cattccggac gacaccctgg agaagcacac tctcaggtca 120

gagacctcga cctacaattt gactgtgggg gacacagggt cagggctaat tgtctttttc 180

cctggattcc ctggctcaat tgtgggtgct cactacacac tgcagagcaa tgggaactac 240

aagttcgatc agatgctcct gactgcccag aacctaccgg ccagttacaa ctactgcagg 300

ctagtgagtc ggagtctcac agtgaggtca agcacactcc ctggtggcgt ttatgcacta 360

aacggcaccg taaacgccgt gaccttccaa ggaagcctga gtgaactgac agatgttagc 420

tacaatgggt tgatgtctgc aacggccaac atcaacgaca aaattgggaa tgtcctagta 480

ggggaagggg tcaccgtcct cagcttaccc acatcatatg atcttgggta tgtgaggctt 540

ggtgacccca ttcctgctat agggcttgac ccaaaaatgg tagccacatg tgacagcagt 600

gacaggccca gagtctacac cataactgca gccgatgatt accaattctc atcacagtac 660

caaccaggtg gggtaacaat cacactgttc tcagccaaca ttgatgctat cacaagcctc 720

agcattgggg gagagctcgt gttccaaaca agcgtccaag gccttgtact gggcgctacc 780

atctacctta taggctttga tgggactaca gtaatcacca gagctgtggc ctcagacaat 840

gggctgactg ccggcaccga caatcttatg ccattcaatc ttgtgattcc gaccaacgag 900

ataacccagc caatcacatc catcaaactg gagatagtga cctccaaaag tggcggtcag 960

gcaggggacc agatgtcatg gtcggcaagt gggagcctag cagtgacaat ccatggtggc 1020

aactatccag gggccctccg tcccgtcaca ctagtagcct acgaaagagt ggcaacagga 1080

tccgtcgtta cggtagccgg ggtgagcaac ttcgagctga tcccaaatcc tgaactagca 1140

aagaacctgg ttacagaata cggccgattt gacccaggag ccatgaacta cacaaaattg 1200

atactgagtg agagggaccg tcttggcatc aagaccgtct ggccaacaag ggagtacact 1260

gactttcgtg agtacttcat ggaggtggcc gacctcaact ctcccctgaa gattgcagga 1320

gcatttggct tcaaagacat aatccgggcc ataaggaggt gagtcga 1367

<210> 20

<211> 274

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> coa5启动子

<400> 20

tattttgtgc agcgatgggg gcgggggggg ggggggcgcg cgccaggcgg ggcggggcgg 60

ggcgaggggc ggggcggggc gaggcggaga ggtgcggcgg cagccaatca gagcggcgcg 120

ctccgaaagt ttccttttat ggcgaggcgg cggcggcggc ggccctataa aaagcgaagc 180

gcgcggcggg cgggagtcgc tgcgcgctgc cttcgccccg tgccccgctc cgccgccgcc 240

tcgcgccgcc cgccccggct ctgactgacc gcgt 274

<210> 21

<211> 302

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> sv40 polyA

<400> 21

ctaattgttt gtgtatttta gattcacagt cccaaggctc atttcaggcc cctcagtcct 60

cacagtctgt tcatgatcat aatcagccat accacatttg tagaggtttt acttgcttta 120

aaaaacctcc cacacctccc cctgaacctg aaacataaaa tgaatgcaat tgttgttgtt 180

aacttgttta ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac aaatttcaca 240

aataaagcat ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat caatgtatct 300

ta 302

<210> 22

<211> 1506

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> bac启动子

<400> 22

tgcagctcag tgcatgcacg ctcattgccc atcgctatcc ctgcctctcc tgctggcgct 60

ccccgggagg tgacttcaag gggaccgcag gaccacctcg ggggtggggg gagggctgca 120

cacgcggacc ccgctccccc tccccaacaa agcactgtgg aatcaaaaag gggggagggg 180

ggatggaggg gcgcgtcaca cccccgcccc acaccctcac ctcgaggtga gccccacgtt 240

ctgcttcact ctccccatct cccccccctc cccaccccca attttgtatt tatttatttt 300

ttaattattt tgtgcagcga tgggggcggg gggggggggg gcgcgcgcca ggcggggcgg 360

ggcggggcca ggggcggggc ggggcgaggc ggagaggtgc ggcggcagcc aatcagagcg 420

gcgcgctccg aaagtttcct tttatggcga ggcggcggcg gcggcggccc tataaaaagc 480

gaagcgcgcg gcgggcggga gtcgctgcgc gctgccttcg ccccgtgccc cgctccgccg 540

ccgcctcgcg ccgcccgccc cggctctgac tgaccgcgtt actcccacag gtgagcgggc 600

gggacggccc ttctcctccg ggctgtaatt agcgcttggt ttaatgacgg ctcgtttctt 660

ttctgtggct gcgtgaaagc cttaaagggc tccgggaggg ccctttgtgc gggggggagc 720

ggctcggggg gtgcgtgcgt gtgtgtgtgc gtggggagcg ccgcgtgcgg ctccgcgctg 780

cccggcggct gtgagcgctg cgggcgcggc gcggggcttt gtgcgctccg cagtgtgcgc 840

gaggggagcg cggccggggg cggtgccccg cggtgcgggg ggggctgcga ggggaacaaa 900

ggctgcgtgc ggggtgtgtg cgtggggggg tgagcagggg gtgtgggcgc ggcggtcggg 960

ctgtaacccc cccctgcacc cccctccccg aagttgctga gcacggcccg gcttcgggtg 1020

cggggctccg tgcggggcgt ggcgcggggc tcgccgtgcc gggcgggggg tggcggcagg 1080

tgggggtgcc gggcggggcg gggccgcctc gggccgggga gggctcgggg gaggggcgcg 1140

gcggcccccg gagcgccggc ggctgtcgag gcgcggcgag ccgcagccat tgccttttat 1200

ggtaatcgtg cgagagggcg cagggacttc ctttgtccca aatctgtgcg gagccgaaat 1260

ctgggaggcg ccgccgcacc ccctctagcg ggcgcggggc gaagcggtgc ggcgccggca 1320

ggaaggaaat gggcggggag ggccttcgtg cgtcgccgcg ccgccgtccc cttctccatc 1380

tccagcctcg gggctgtccg cagggggacg gctgccttcg ggggggacgg ggcagggcgg 1440

ggttcggctt ctggcgtgtg accggcgggg tttatatctt cccttctctg ttcctccgca 1500

gccccc 1506

<210> 23

<211> 1410

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> gbdel

<400> 23

atggctagct tgaaaatgct gatctgcgtg tgcgtggcaa tcctgatccc atctacccta 60

tctcaagatt cacacggaat tgccggaata atagaccctc gtgatacagc cagcatggat 120

gttggaaaaa tctctttctc cgaagccatt gggtcggggg caccgaaaga accccagatt 180

agaaacagaa tttttgcgtg ctcatctcca actggcgcca gtgttgcgag gcttgcccag 240

ccacgacatt gtcaccgaca tgccgattcg actaacatga ctgaaggaat tgccgtagtc 300

ttcaagcaaa acattgcccc gtacgtcttt aatgtgactc tatactataa acatataacc 360

acagttacta cgtgggcatt attctcaaga ccccaaataa caaatgagta cgtgaccagg 420

gttccaatag actatcatga aattgtcagg attgatcgat cgggagaatg ctcatccaaa 480

gcaacgtatc ataaaaattt catgtttttt gaagcttacg acaatgatga acgagaaaaa 540

aaattgcccc tggttccatc actgttaaga tcaactgtct ccaaggcgtt tcatacaact 600

aactttacta agcgacatca aaccctggga taccgaacgt ctacatcggt cgactgtgtt 660

gtggaatatc tacaggctag atctgtatac ccgtatgatt actttggaat ggcgacaggt 720

gatacagtag aaatttctcc cttttatacc aaaaacacga ccggaccaag gcgtcacagt 780

gtctacagag actatagatt tctcgaaatc gcaaattatc aagtcaggga tttggaaacc 840

ggacaaataa gaccccctaa aaaaagaaac tttctaacag atgaacaatt cactataggc 900

tgggatgcaa tggaagaaaa ggaatctgta tgtactctca gtaaatggat tgaagtcccg 960

gaagcagttc gtgtttcgta caaaaacagt taccactttt cacttaaaga tatgactatg 1020

acgttctcgt ccggaaaaca accttttaac atcagcaggc ttcatttggc tgaatgcgtt 1080

cctaccatag cttcggaggc catagatggc atctttgcca gaaagtatag ttcgactcat 1140

gtccgttctg gggacatcga atactatctc ggtagtggcg gatttctgat cgcatttcag 1200

aaactcatga gccatggctt ggctgaaatg tacctagaag aggcacaaag acaaaatcat 1260

ctcccgagag ggagagagcg tcgccaaggc gacctctaca aatgtggtat ggctgattat 1320

gatcatgaac agactgtgag gactgagggg cctgaaatga gccttgggac tgtgaatcga 1380

cctattagac ctatttactc atcgcattag 1410

<210> 24

<211> 525

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> rsv启动子

<400> 24

atctgctccc tgcttgtgtg ttggaggtcg ctgagtagtg cgcgagcaaa atttaagcta 60

caacaaggca aggcttgacc gacaattgca tgaagaatct gcttagggtt aggcgttttg 120

cgctgcttcg cgatgtacgg gccagatata cgcgtatctg aggggactag ggtgtgttta 180

ggcgaaaagc ggggcttcgg ttgtacgcgg ttaggagtcc cctcaggata tagtagtttc 240

gcttttgcat agggaggggg aaatgtagtc ttatgcaata ctcttgtagt cttgcaacat 300

ggtaacgatg agttagcaac atgccttaca aggagagaaa aagcaccgtg catgccgatt 360

ggtggaagta aggtggtacg atcgtgcctt attaggaagg caacagacgg gtctgacatg 420

gattggacga accactgaat accgcattgc agagataatt gtatttaagt gcctagctcg 480

atacaataaa cgccatttga ccattcacca cattggtgtg cacct 525

Claims

1.一种属于血清型1的重组马立克氏病病毒(recombinant Marek's Disease Virusof serotype 1，rMDV1)，其在其基因组中包括重组核苷酸序列，其中所述重组核苷酸序列位于所述基因组的MDV086.6(SORF1)基因座中。

2.根据权利要求1所述的rMDV1，其中所述重组核苷酸序列置换MDV086.6基因座的全部或一部分。

3.根据权利要求1所述的rMDV1，其中所述重组核苷酸序列位于MDV086.6编码区内，基本上没有SORF1基因座序列的缺失。

4.根据权利要求1所述的rMDV1，其中所述重组核苷酸序列位于MDV086.4与MDV086.6之间的基因间区中或者位于MDV086.6与MDV087(SORF2)之间的基因间区中。

5.根据前述权利要求中任一项所述的rMDV1，其中所述MDV1是MDV1的CVI988Rispens病毒株。

6.根据前述权利要求中任一项所述的rMDV1，其中所述重组核苷酸序列对抗原，优选地禽类病原体的抗原进行编码。

7.根据权利要求6所述的rMDV1，其中所述禽类病原体选自新城疫病毒(NDV)、干保罗病病毒(Gumboro disease virus)、传染性法氏囊病病毒(IBDV)、传染性喉气管炎病毒(ILTV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、支原体(MG)或球虫。

8.根据权利要求7所述的rMDV1，其中所述重组核苷酸序列对IBDV的VP2蛋白、ILTV的gB蛋白或其免疫原性片段进行编码。

9.根据前述权利要求中任一项所述的rMDV1，其中所述重组核苷酸序列含有转录启动子。

10.根据权利要求9所述的rMDV1，其中所述启动子选自鸡β-肌动蛋白(Bac)启动子或其衍生物，如Coa5；Pec启动子；鼠类巨细胞病毒(Mcmv)即刻早期(ie)1启动子；人巨细胞病毒启动子(Hcmv)；猿猴病毒(SV)40启动子；以及劳斯氏肉瘤病毒(Rous Sarcoma virus，RSV)启动子或其保留了启动子活性的任何片段。

11.根据权利要求1所述的rMDV1，其中所述rMDV1包括对IBDV的VP2蛋白或ILTV的gB蛋白或其免疫原性片段进行编码的重组核苷酸序列，所述重组核苷酸序列置换所述基因组的MDV086.6基因座的全部或一部分。

12.根据权利要求1所述的rMDV1，其中所述rMDV1包括对IBDV的VP2蛋白或ILTV的gB蛋白或其免疫原性片段进行编码的重组核苷酸序列，所述重组核苷酸序列位于所述基因组的MDV086.6编码区内，基本上没有所述基因座的缺失。

13.根据权利要求1所述的rMDV1，其中所述rMDV1包括对IBDV的VP2蛋白或ILTV的gB蛋白进行编码的重组核苷酸序列，所述重组核苷酸序列位于MDV086.6与MDV087之间的基因间区中。

14.一种核酸分子，其包括根据前述权利要求中任一项所述的rMDV1的基因组。

15.一种载体，其包括根据权利要求14所述的核酸分子。

16.一种宿主细胞，其包括根据权利要求1到13中任一项所述的rMDV1、根据权利要求14所述的核酸分子或根据权利要求15所述的载体。

17.一种用于产生或复制根据权利要求1到13中任一项所述的rMDV1的方法，所述方法包括用根据权利要求14所述的核酸分子或根据权利要求1到13中任一项所述的rMDV1感染感受态细胞以及收集所述rMDV1。

18.一种组合物，其包括根据权利要求1到13中任一项所述的rMDV1以及药学上或兽医学上可接受的赋形剂和/或佐剂。

19.根据权利要求1到13中任一项所述的rMDV1或根据权利要求18所述的组合物，其用于针对病原体对禽类进行疫苗接种。

20.根据权利要求1到13中任一项所述的rMDV1或根据权利要求18所述的组合物，其用于与属于不同血清型并且表达不同抗原的另外的重组疱疹病毒组合地使用，以用于通过同时、分开、顺序或交替施用针对至少两种不同病原体对禽类，优选地鸡进行疫苗接种。

21.一种用于对禽类进行疫苗接种的疫苗接种试剂盒，所述疫苗接种试剂盒包括以下组分：

a.有效量的根据权利要求18所述的组合物；以及

b.用于向所述禽类施用所述组合物的构件。