CN109789199B - 鸭肠炎病毒及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及DEV及其用途。本发明特别适用于对家禽进行疫苗接种以抵抗禽类病原体。

Description

鸭肠炎病毒及其用途

技术领域

本发明涉及新型病毒及其用途。更特别地，本发明涉及新型鸭肠炎病毒构建体及其用于向动物，特别是家禽递送目的多肽或表达目的多肽的用途。本发明特别适用于对家禽进行疫苗接种以抵抗禽类病原体。

背景技术

家禽肉和蛋是重要的食物来源，由于人口的增长和家禽肉和蛋的大的质量-价格比，其消费不断增加。禽流感的最近流行使公众舆论关注家禽健康以及食品安全和保障，并且家禽疫苗技术已得到全球的关注。

表达病原体蛋白质的重组病毒通常用作针对靶向病原体的家禽疫苗。包括这些病毒的疫苗诱导外源病原体蛋白质或其片段在感染细胞内的表达，其随后可以诱导特异性和保护性体液免疫以及细胞介导的免疫。

在这方面，已经开发了多种病毒来用作病毒载体疫苗，所述病毒中已经整合了来源于病原体的外源基因。这些病毒载体(或重组病毒)通常基于禽痘病毒，如鸡痘(EP-A-0,517,292)、疱疹病毒，特别是HVT(例如WO-A-87/04463、5,980,906、5,853,733)、新城疫病毒(NDV)或禽腺病毒。根据疾病和/或动物，这些重组禽类病毒显示出不同程度的保护。

例如，由于痘病毒、NDV和腺病毒不能在鸡中持留，因此不认为它们是鸡中长期免疫的最佳候选者。表达抗原的重组HVT已显示出优势，并且目前已商业化用于在鸡中进行疫苗接种(例如

IBD、

ND或

LT)。

然而，考虑到病原体的数量和多样性的增加以及家禽消费的持续增长，需要可用于在家禽中引起有效保护性免疫的替代疫苗接种策略和/或***。特别需要有效的***以在非常幼小的动物(3天或更短时间)中或在卵内产生免疫。

在这方面，已经探索了新型病毒血清型，目的是寻找替代的相容病毒载体来改善动物中，特别是家禽中的疫苗接种，从而允许稳定的蛋白质表达和有效保护。

WO2014/0036735讨论了鸭肠炎病毒在鸡中的可能用途。DEV天然感染鸭或鹅，但对鸡没有已知的向性。该文件表明可以通过肌肉内注射向1周龄鸡施用DEV构建体。然而，在该文件中，仅报导了晚期施用。

然而，通过用DEV进行进一步实验，本发明人发现当向幼鸡(3天或更短时间)或卵内施用时，这种病毒是致命的。令人惊讶的是，尽管在孵化后一周向鸡施用野生型DEV(或含有所有天然基因的DEV构建体，如WO2014/0036735中提出的)似乎耐受良好，但在孵化后第1天或卵内施用这种构建体导致动物大量死亡(即80-100％)。甚至更令人惊讶的是，本发明人已经能够改变DEV的结构以产生可用于家禽，包括在非常早期阶段(3天或更短时间)或卵内用于家禽，并且可以在体内引起大量和早期蛋白质表达的DEV构建体。因此，这些病毒代表用于对家禽进行疫苗接种的新型有效载体。

发明内容

本发明提供了适合于在动物，特别是家禽体内表达基因或蛋白质的新型病毒构建体，包括在非常早期阶段(即孵化后第3天或更早以及卵内)。特别地，本发明提供了通过US4和US5基因的失活而获得的新型DEV，并证明这些DEV(i)在体内，特别是在鸡中是减毒的，并且(ii)是稳定的并且能够以适用于诱导保护性免疫的方式表达外源基因。此外，这些缺陷和减毒的DEV保留了快速生长速率，从而允许产生高滴度。因为这些DEV对例如鸡没有已知的天然向性，所以使用这些DEV构建体对鸡进行疫苗接种不会涉及向未接种疫苗的动物传播或污染所述未接种疫苗的动物的风险。此外，鸡没有针对DEV的母体抗体或免疫，并且本发明的病毒可用于在接种疫苗的动物中诱导非常早期的免疫产生。令人惊讶的是，如先前所述，虽然野生型DEV在幼鸡中或在卵内是致命的，但本发明的DEV是安全的并且可以在体内有效地表达目的基因。因此，这些新型DEV代表用于对非人类动物，特别是家禽进行疫苗接种并用于赋予早期保护性免疫的非常有效的载体。

本发明的一个目的更特别地涉及一种鸭肠炎病毒(DEV)，其中所述病毒具有无活性的US4和US5基因。本发明确实显示，通过使这些基因失活，可以获得活的、稳定的且可复制的DEV，并且这些病毒可用于通过***外源遗传物质而产生重组DEV。结果进一步显示，在细胞感染后这种外源遗传物质从这些病毒中高度表达，并且这种表达随时间保持稳定。此外并且令人惊讶的是，虽然发现天然DEV以及由本发明人产生的许多其它缺失的DEV构建体在幼鸡(孵化后第3天或更早)中和在卵内是致病或致命的，但US4和US5的失活产生减毒病毒，所述病毒可以安全地用于在幼小动物中，包括在卵内表达蛋白质和抗原。这个发现是完全令人惊讶的，并且为本发明的病毒提供了高的优点和效用。

因此，本发明的另一个目的涉及一种鸭肠炎病毒(DEV)，其中所述病毒具有无活性的US4和US5基因并且包含外源核酸。

根据特定实施方式，US4和US5基因被突变、缺失或中断；和/或外源核酸被安置成代替US4和US5基因序列的全部或一部分，和/或外源核酸编码禽类病原体。

在另一个特定实施方式，本发明的DEV还包含无活性的UL4、UL23或US7基因。

本发明的另一个目的是包含具有无活性的US4和US5基因的DEV的基因组的核酸分子。

本发明还涉及一种宿主细胞，其包含上文定义的DEV或核酸。

本发明还提供了一种用于产生或复制如上定义的DEV的方法，所述方法包含用上文定义的核酸分子或DEV感染感受态细胞，和收集DEV。

本发明还涉及一种制备重组DEV的方法，所述方法包含***外源核酸来代替US4和US5基因序列的全部或至少20％。

本发明还提供了一种组合物，其包含上文定义的DEV、核酸或宿主细胞；药学上或兽医学上可接受的赋形剂或载体；以及任选的佐剂。

本发明还提供了一种疫苗，其包含上文定义的DEV、核酸或宿主细胞；药学上或兽医学上可接受的赋形剂或载体；以及任选的佐剂。

本发明的另一个目的涉及上文定义的组合物、DEV、核酸或宿主细胞，其用于对禽类，特别是家禽，更特别是鸡，更特别是幼家禽(在孵化后第3天或更早或卵内)进行疫苗接种或免疫接种。

本发明的另一个目的涉及上文定义的组合物、DEV、核酸或宿主细胞，其用于在禽类，特别是家禽，更特别是鸡，更特别是幼家禽(在孵化后第3天或更早或卵内)中诱导保护性免疫。

本发明还涉及一种对非人类动物，特别是家禽，更特别是鸡，更特别是幼家禽(在孵化后第3天或更早或卵内)进行疫苗接种的方法，所述方法包含向所述非人类动物施用上文定义的组合物或病毒。

本发明的一个特定目的是一种对家禽进行疫苗接种的方法，所述方法包含卵内施用上文定义的组合物或病毒。

本发明的另一个特定目的是一种对家禽进行疫苗接种的方法，所述方法包含在孵化后第1天(即在约24小时内)施用上文定义的组合物或病毒。

在另一个方面中，本发明提供了一种在非人类动物中诱导针对一种或多种禽类病原体的免疫原性或保护性应答的方法，所述方法包含向非人类动物，特别是家禽，更特别是鸡，更特别是幼家禽(在孵化后第3天或更早或卵内)施用上文定义的组合物、疫苗或病毒。

本发明的病毒或组合物可以通过任何途径施用。优选地，在卵内或在孵化后1或2天通过皮下(例如s.c.)注射来施用所述病毒或组合物，以非常早地赋予免疫。

本发明还提供了一种用于对禽类进行免疫接种的疫苗接种试剂盒，所述试剂盒包含以下组分：

a.有效量的上述组合物，和

b.用于向所述禽类施用所述组合物的构件。

本发明可以用于在任何动物中表达多肽，优选用于对禽类进行疫苗接种，并且本发明适用于表达一种或多种多肽或肽，特别是禽类病原体的免疫原性肽。

附图说明

图1说明了鸭肠炎病毒(DEV)基因组和US基因位置的示意图。

图2说明了亲代DEV基因组中***位点的位置以及pUC18-KAPEVAC-US4US5del-BacVP2和DEV/US4US5del/BacVP2的基因组结构的示意图。显示了用于PCR反应中扩增的连接区1、连接区2和连接区3的位置。

图3显示在黑斑测定中用DEV/US4US5del/BacVP2感染的CEF的VP2表达。

图4说明了亲代DEV基因组中***位点的位置以及pUC18-KAPEVAC-US4US5del和DEV/US4US5del的基因组结构的示意图。显示了用于PCR反应中扩增的连接区1的位置。

图5说明了亲代DEV基因组中***位点的位置以及pUC18-KAPEVAC-UL23del-Coa5VP2和DEV/US4US5del/UL23/Coa5VP2的基因组结构的示意图。显示了用于PCR反应中扩增的连接区1、连接区2和连接区3的位置。

图6说明了亲代DEV基因组中***位点的位置以及pUC18-KAPEVAC-UL26-Coa5VP2和DEV/US4US5del/UL26/Coa5VP2的基因组结构的示意图。显示了用于PCR反应中扩增的连接区1、连接区2和连接区3的位置。

图7说明了亲代DEV基因组中***位点的位置以及pUC18-KAPEVAC-UL45-Coa5VP2和DEV/US4US5del/UL45/Coa5VP2的基因组结构的示意图。显示了用于PCR反应中扩增的连接区1、连接区2和连接区3的位置。

图8说明了亲代DEV基因组中***位点的位置以及pUC18-KAPEVAC-UL50-Coa5VP2和DEV/US4US5del/UL50/Coa5VP2的基因组结构的示意图。显示了用于PCR反应中扩增的连接区1、连接区2和连接区3的位置。

图9显示了在黑斑测定中用DEV/US4US5del/UL23/Coa5VP2、DEV/US4US5del/UL26/Coa5VP2、DEV/US4US5del/UL45/Coa5VP2或DEV/US4US5del/UL50/Coa5VP2感染的CEF的VP2表达。

图10为检测DEV/US4US5del/UL23/Coa5VP2、DEV/US4US5del/UL26/Coa5VP2、DEV/US4US5del/UL45/Coa5VP2或DEV/US4US5del/UL50/Coa5VP2的VP2蛋白表达的western印迹测定。1：DEV/US4US5del/UL23/Coa5VP2；2：DEV/US4US5del/UL26/Coa5VP2；3：DEV/US4US5del/UL45/Coa5VP2；4：DEV/US4US5del/UL50/Coa5VP2；5：亲代DEV；6：CEF。

具体实施方式

本发明大体上涉及包含外源基因序列的减毒DEV。本发明还涉及包含这些DEV的组合物，及其用于对动物，特别是家禽，更特别是幼家禽(在孵化后第3天或更早，或卵内)进行疫苗接种的用途。

通过参考以下定义来最充分地理解本公开：

定义

术语“病毒”特别指包含包封在衣壳或被膜中的核酸分子(例如基因组)的病毒颗粒。术语“病毒”还指病毒载体或分离的病毒基因组。

术语“重组体”指使用遗传技术产生、设计或修饰的分子。关于病毒，术语“重组体”更具体地指基因组(或祖先的基因组)已通过***或缺失至少一个核酸序列进行修饰的病毒。

与病毒有关的术语“外源核酸”指在病毒基因组中天然不存在的核酸，或天然存在于所述基因组中但以不同形式或不同位置存在的核酸。

在本说明书中，术语“核酸”指任何核酸分子或序列，如脱氧核糖核苷酸(DNA)或核糖核苷酸(RNA)，其可以是例如单链或双链的。核酸可包含或不包含ORF。核酸分子可以通过本领域中本身已知的技术，如通过人工合成、重组技术、酶促技术、在宿主细胞中复制或其组合来产生。

“基因”指包含编码产物如多肽(例如肽、蛋白质等)或RNA的开放阅读框的核酸分子或序列。

在本发明的上下文中，具有“无活性”基因的DEV指不能表达由所述基因编码的功能蛋白质或RNA的DEV。因此，无活性的US4基因指突变、缺失和/或中断的US4基因，其不能编码野生型US4蛋白。无活性的US5基因指突变、缺失和/或中断的US5基因，其不能编码野生型US5蛋白。当US5基因含有5'US5和3'US5编码序列时，无活性的US5指突变、缺失和/或中断的US5基因，该基因不能编码由所述5'US5和3'US5编码序列编码的任何野生型蛋白质，例如5'US5和3'US5都含有突变或缺失或中断。

在本文中使用时，术语“减毒”是指在动物模型中基本上不会引起疾病的病毒。减毒病毒通常可以在宿主中复制而不会导致其死亡。减毒病毒更特别地指当以1×10³个空斑形成单位(pfu)/蛋的剂量注射时在胚胎中不具有毒力的病毒。最优选的减毒病毒在1×10³个pfu/蛋的剂量下在至少70％的注射的蛋中，更优选在至少80％的注射的蛋中，甚至更优选在至少90％、95％、97％、98％、99％或更多的注射的蛋中是安全的。本发明的减毒病毒对于孵化后的注射，包括在第0天(即孵化后0.1至48小时)的注射来说也是安全的。

术语“禽类”旨在涵盖所有种类的禽类，如鸟纲中的鸟，即有羽毛、翅膀、双足、温血并产蛋的脊椎动物。在本发明的上下文中，禽类或禽类物种更特别地指具有经济和/或农艺利益的鸟，如家禽，更优选鸡和火鸡；或观赏鸟，如天鹅和鹦鹉。

在本文中使用时，术语“疫苗”指可以用于引起、刺激或放大生物体中的免疫应答的试剂。

“免疫应答”指针对目的组合物或疫苗在宿主中产生细胞和/或抗体介导的免疫应答。通常，“免疫应答”包括产生特异性地针对目的组合物或疫苗中包括的抗原的抗体、B细胞、辅助性T细胞和/或细胞毒性T细胞。优选地，免疫应答是保护性的，使得增强对新感染的抗性和/或降低疾病的临床严重性。

术语“卵内”施用或注射通常是指在蛋中含有的胚胎中接种或注射。卵内注射优选在孵化前第5天至第1天之间的任何时间进行。

鸭肠炎病毒

鸭肠炎病毒(DEV)也称为鸭病毒性肠炎病毒(DVEV)，其天然地感染鸭和鹅。已经确定并且可在线获得DEV的完整核苷酸序列(参见例如JQ673560)。该病毒基因组含有约162Kb，编码约80种不同的蛋白质。已经分离了DEV的几种血清型和病毒株，如Jansen株、CSC株、CHv株、VAC株和2085株。几种DEV病毒株的完整序列可在Genbank中获得，如VAC株：IDEU082088.2；Anatid分离株C-KCE：ID KF263690.1；Anatid株CHv：ID JQ647509.1；Anatid株2085：ID JF999965；Anatid株CV：ID KJ549663.1或Anatid株CSC：ID JQ673560.1。

DEV仍然未充分表征，并且其作为表达基因的载体的用途尚未得到深入研究。例如，Liu等人(2013)和WO2014/0036735已试图使用重组DEV在鸡中表达基因。他们使用了DEV构建体，其中在不改变天然基因表达的情况下将核酸克隆在病毒基因组的US7和US8基因之间。尽管据报导这种构建体可以通过肌肉内注射转移到1周龄的鸡中，但是在该文件中或在任何其它现有技术文件中没有DEV用于家禽的卵内疫苗接种或幼家禽的疫苗接种(即孵化后第3天或之前，特别是孵化后第1天或第2天)的任何可能的用途的公开。

通过用DEV进行进一步实验，本发明人惊讶地发现当向幼鸡(3天或更短时间)或卵内施用时，这种病毒是致命的。令人惊讶的是，尽管在孵化后一周向鸡施用野生型DEV(或含有所有天然基因的DEV构建体，如WO2014/0036735中提出的)似乎耐受良好，但在孵化后第1天或卵内施用这种构建体导致动物大量死亡(即80-100％)，如实施例1中所报导的。

甚至更令人惊讶的是，本发明人已经能够改变DEV的结构以产生可用于家禽，包括在非常早期阶段(3天或更短时间)或卵内用于家禽，并且可以在体内引起大量和早期蛋白质表达的DEV构建体。更特别地，本发明人用DEV进行了进一步的研究，并产生了具有不同基因缺失或改变的各种重组体。本发明人已惊讶地发现，可以通过US4和US5基因两者的失活来获得重组DEV，所述重组DEV(i)在体内，特别是在鸡中是减毒的，并且(ii)是稳定的并且能够以适用于诱导保护性免疫的方式表达外源基因。结果进一步显示，在细胞感染后这种外源遗传物质从这些病毒中高度表达，并且这种表达随时间保持稳定。此外并且令人惊讶的是，US4和US5的失活产生减毒DEV，所述减毒DEV可以安全地用于在幼家禽中和在卵内表达蛋白质或抗原，而仅具有无活性的US4基因或仅具有无活性的US5基因的DEV在幼鸡(少于3日龄或在卵内)中仍是致病或致命的。因为DEV对例如鸡没有已知的天然向性，所以使用本发明的DEV构建体对鸡进行疫苗接种不会涉及向未接种疫苗的动物传播或污染所述未接种疫苗的动物的风险。此外，鸡没有针对DEV的母体抗体或免疫，并且本发明的病毒可用于在接种疫苗的动物中诱导非常早期的免疫产生。

因此本发明的一个目的涉及一种鸭肠炎病毒(DEV)，其中所述病毒具有无活性的US4和US5基因。

本发明的另一个目的涉及一种鸭肠炎病毒(DEV)，其中所述病毒具有无活性的US4和US5基因并且含有外源核酸。

本发明的DEV可以由任何DEV物种或病毒株制备。已经报导了许多DEV病毒株，其可从公共收藏中心获得，如Jansen株、VAC株(ID EU082088.2)、C-KCE株(ID KF263690.1)、CHV株(ID JQ647509.1)、2085株(ID JF999965)、CV株(ID KJ549663.1)或CSC株(IDJQ673560.1)。

在一个优选实施方式中，本发明的DEV衍生自或制备自选自以下的亲代病毒株：Jansen株或CSC株，或与Jansen株或CSC株具有至少90％序列同一性，更优选至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的任何DEV病毒株。

本发明显示，通过使US4和US5基因失活(即，使其无功能或缺失)，可产生即使在卵内或在幼家禽中注射时也是安全的并且可以在家禽中复制和表达蛋白质的减毒DEV。特别地，如实施例中所示，具有无活性US4和US5基因的DEV构建体是稳定的，可以在培养物中复制，并且可以安全地施用于家禽蛋或幼家禽。因此，这些病毒可以用于产生含有外源核酸物质，特别是抗原编码基因的重组DEV，以在家禽中表达这些基因。

在本发明的上下文中，具有无活性基因的DEV指不能表达由所述基因编码的功能蛋白质或RNA的DEV。因此，无活性基因特别指突变、缺失和/或中断的基因，其不能编码野生型蛋白质。

在一个特定实施方式中，所述基因由于编码序列中的一个或几个突变，特别是编码序列中阻止全长蛋白质表达的点突变而是无活性的。这些突变可以在序列中引入终止或无义密码子，或引起编码的蛋白质中的必需氨基酸残基的取代，从而产生无活性蛋白质。

在另一个实施方式中，所述基因由于所述基因的(编码)序列的至少一部分，更特别地所述基因的(编码)序列的至少20％，更优选至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少85％、至多100％的缺失而是无活性的。在一个优选实施例中，本发明的DEV具有待失活基因(的编码序列)的至少300bp的缺失。这种缺失去除了编码序列，并因此阻止野生型蛋白质或甚至任何蛋白质的表达。

在这方面，本发明的一个特定实施方式涉及一种鸭肠炎病毒(DEV)，其中所述病毒在US4和US5基因中，特别是在US4和US5基因的编码序列中具有缺失。

预测DEV的US4和US5基因编码蛋白质。然而，仍不清楚这些基因的实际功能。在本发明之前，尚未知晓产生US4-US5双重缺陷型DEV病毒的能力，并且完全不知道这些DEV病毒复制和表达外源基因而在禽类中不致命的能力。

US4基因通常由DEV基因组的1380bp组成，并且编码包含约459个氨基酸残基的蛋白质。在DVE病毒株之间，US4高度保守。通过参考CSC株，US4基因对应于基因组的nt141123至nt142502。应理解，本领域技术人员可以使用本申请中含有的信息和一般常识或通过序列比对，容易地鉴定US4基因在任何DEV病毒株中的精确位置。在本发明的特定DEV中，US4(编码)基因序列的至少20％，更优选至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至多100％被缺失。在一个优选实施例中，本发明的DEV具有US4(编码)基因序列的至少500bp，更优选至少600、700、800、900、1000bp或更多的缺失。在一个特定实施方式中，本发明的DEV具有跨越US4基因序列的至少nt 200-1000，更优选至少nt150-1150，甚至更优选至少nt100-1300的缺失。在一个特定实施例中，本发明的DEV具有US4基因序列的nt51至nt1330(即高于90％)的缺失。在另一个特定实施方式中，本发明的DEV具有US4基因序列的全部(nt1-1380)的缺失。

DEV的US5基因编码糖蛋白，该糖蛋白的功能仍然未知。在大多数DEV病毒株(例如VAC、CSC、C-KCE、CHv、CV)中，US5基因由约1620bp组成，并且编码约539个氨基酸残基的蛋白质。在一些DEV病毒株如2085株和Jansen(或Kapevac)株中，US5基因含有两个较短的编码区：约396bp的5'US5和约1197bp的3'US5，两者由约25bp的小基因间区域隔开(参见图1)。通过参考CSC株，US5基因对应于基因组的nt142662至nt144281。应理解，本领域技术人员可以使用本申请中含有的信息和一般常识或通过序列比对，容易地鉴定US5基因在任何DEV病毒株中的精确位置。在本发明的特定DEV中，US5(编码)基因序列的至少20％，更优选至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至多100％被缺失。在一个优选实施例中，本发明的DEV具有US5(编码)基因序列的至少500bp，更优选至少600、700、800、900、1000bp或更多的缺失。在一个特定实施方式中，本发明的DEV具有跨越US5基因序列的至少nt200-1000，更优选至少nt100-1100，甚至更优选至少nt80-1120的缺失。当US5基因含有两个ORF时，优选两个ORF都是无活性的。在这方面，当DVE由具有含单个ORF的US5基因序列的病毒株制备时，该DVE优选包含所述ORF的至少90％的缺失，如US5基因序列的至少nt51至nt1570的缺失，更特别是US5基因的全部的缺失。当DVE由具有含两个ORF的US5基因序列的病毒株制备时，该DVE优选包含每个所述ORF的至少90％的缺失，更优选包含第一ORF的至少90％、全部基因间区域和第二ORF的至少90％的缺失。

在一个特定实施方式中，本发明的DEV具有跨越US4基因的至少一部分、整个US4-US5基因间区域和US5基因的一部分的连续区域的缺失。

在另一个特定实施方式中，DVE包含如下核苷酸区域的缺失，所述核苷酸区域包含US4基因的至少50％、US4基因和US5基因之间的基因间区域的全部和US5基因的至少50％。

在一个更优选实施方式中，DVE包含如下核苷酸区域的缺失，所述核苷酸区域包含US4基因的全部、US4基因和US5基因之间的基因间区域的全部和US5基因的全部。这种构建体的一个特定实例为例如DEV/US4US5/BacVP2。

如上文所指示，本发明的DVE可以含有一种或几种目的外源核酸。外源核酸通常在转录启动子的控制下。优选地，将启动子与外源核酸一起克隆。启动子可以是衍生自细胞或病毒基因的任何天然或合成启动子。合适启动子的实例包括例如鸡β-肌动蛋白(Bac)启动子或其衍生物，如Coa5；Pec启动子；鼠巨细胞病毒(Mcmv)立即早期(ie)1启动子；人巨细胞病毒启动子(Hcmv)；猿猴病毒(SV)40启动子和劳氏肉瘤病毒(Rous Sarcoma virus；RSV)启动子；或其保留启动子活性的任何片段。在一个变体中，将外源核酸克隆在DEV基因组中存在的转录启动子的下游并在该转录启动子的转录控制下。

在一个特定实施方式中，将外源核酸安置在DEV病毒基因组的US4基因序列中，以添加到现有US4基因序列中(因此通过中断基因序列使基因失活)，或代替US4基因的缺失序列，或在突变的US4基因序列中。在一个替代性实施方式中，将外源核酸安置在DEV病毒基因组的US5基因序列中，以添加到现有US5基因序列中(因此通过中断基因序列使基因失活)，或代替US5基因的缺失序列，或在突变的US5基因序列中。

在一个优选实施方式中，本发明的DEV在US4和US5基因序列中具有缺失，并且含有被安置成代替缺失的核苷酸的外源核酸。

在一个替代性实施方式中，本发明的DEV具有无活性的US4和US5基因，并含有安置在不同克隆位点中的外源核酸，例如在选自以下的位点中：UL4基因、UL44基因、UL27-UL26基因间区域、UL23基因、UL45-UL46基因间区域、UL50-UL51基因间区域、US7基因、US7-US8基因间区域或US10基因。在这种情况下，可以克隆外源核酸以代替所述基因的全部或一部分，或可以将外源核酸***所述基因中。

此外，本发明的DEV可以包含几种外源核酸。在这方面，可以在单个或几个不同启动子的控制下将所述几种外源核酸***病毒中的相同位置中，例如上述US4/US5区域中。或者，可以将外源核酸***病毒的不同克隆位点中，如上述US4/US5区域中的一个位点，和优选选自以下的不同区域中的至少一个位点：UL4基因、UL44基因、UL27-UL26基因间区域、UL23基因、UL45-UL46基因间区域、UL50-UL51基因间区域、US7基因、US7-US8基因间区域或US10基因，通常代替内源基因或区域的全部或一部分。

UL4基因通常由DEV基因组的717bp组成。通过参考CSC株，UL4基因对应于基因组的nt112845至nt113561。应理解，本领域技术人员可以使用本申请中含有的信息和一般常识或通过序列比对，容易地鉴定UL4基因在任何DEV病毒株中的精确位置。在一个特定实施方式中，本发明涉及一种鸭肠炎病毒(DEV)，其中所述病毒具有无活性的US4、US5和UL4基因。更特别地，本发明涉及一种DEV，其中所述病毒具有无活性的US4、US5和UL4基因，并且包含克隆到US4/US5基因中或UL4基因中以优选代替所述基因的至少20％的第一外源核酸。在本发明的特定DEV中，UL4基因序列的至少20％，更优选至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至多100％被缺失。在一个优选实施例中，本发明的DEV具有UL4基因序列的至少500bp，更优选至少600、700、800、900、1000bp或更多的缺失。

UL23基因通常由DEV基因组的1077bp组成。通过参考CSC株，UL23基因对应于基因组的nt77997至nt79073。应理解，本领域技术人员可以使用本申请中含有的信息和一般常识或通过序列比对，容易地鉴定UL23基因在任何DEV病毒株中的精确位置。在一个特定实施方式中，本发明涉及一种鸭肠炎病毒(DEV)，其中所述病毒具有无活性的US4、US5和UL23基因。更特别地，本发明涉及一种DEV，其中所述病毒具有无活性的US4、US5和UL23基因，并且包含克隆到US4/US5基因中或UL23基因中以优选代替所述基因的至少20％的第一外源核酸。在本发明的特定DEV中，UL23基因序列的至少20％，更优选至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至多100％被缺失。在一个优选实施例中，本发明的DEV具有UL23基因序列的至少500bp，更优选至少600、700、800、900、1000bp或更多的缺失。在一个特定实施方式中，本发明的DEV具有跨越UL23基因序列的至少nt 200-900，更优选至少nt100-1000，甚至更优选至少nt80-1000的缺失。在一个特定实施例中，本发明的DEV具有UL23基因序列的nt51至nt1027(即约90％)的缺失。

US7基因通常由DEV基因组的1116bp组成。通过参考CSC株，US7基因对应于基因组的nt145769至nt146884。应理解，本领域技术人员可以使用本申请中含有的信息和一般常识或通过序列比对，容易地鉴定US7基因在任何DEV病毒株中的精确位置。在一个特定实施方式中，本发明涉及一种鸭肠炎病毒(DEV)，其中所述病毒具有无活性的US4、US5和US7基因。更特别地，本发明涉及一种DEV，其中所述病毒具有无活性的US4、US5和US7基因，并且包含克隆到US4/US5基因中或US7基因中以优选代替所述基因的至少20％的第一外源核酸。在本发明的特定DEV中，US7基因序列的至少20％，更优选至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至多100％被缺失。在一个优选实施例中，本发明的DEV具有US7基因序列的至少500bp，更优选至少600、700、800、900、1000bp或更多的缺失。

本发明还涉及一种DEV，其中所述病毒包含克隆到US4/US5基因中的第一外源核酸和克隆在位于UL27和UL26基因之间的基因间区域中的第二外源核酸，优选用于代替所述基因的至少20％。本发明还涉及一种DEV，其中所述病毒包含无活性的US4和US5基因，并且其中所述病毒包含克隆在位于UL27和UL26基因之间的基因间区域中的外源核酸。通过参考CSC株，位于UL27和UL26之间的基因间区域对应于基因组的nt72195至nt72646。可以在这种域内的任何位置，更优选在nt72300和nt72500之间，更优选在nt72350和nt72450之间进行克隆。在一个特定实施方式中，在nt72431和nt72432之间进行克隆。

本发明还涉及一种DEV，其中所述病毒包含无活性的UL4基因，并且其中所述病毒包含克隆在位于US7和US8基因之间或UL45和UL46基因之间或UL50和UL51基因之间的基因间区域中的外源核酸。通过参考CSC株，位于UL45和UL46之间的基因间区域对应于基因组的nt25132至nt25352。可以在这种域内的任何位置，更优选在nt25200和nt25300之间进行克隆。在一个特定实施方式中，在nt25275和nt25276之间进行克隆。通过参考CSC株，位于UL50和UL51之间的基因间区域对应于基因组的nt15914至nt16063。可以在这种域内的任何位置，更优选在nt15970和nt16010之间进行克隆。在一个特定实施方式中，在nt15979和nt15980之间进行克隆。

病毒构建和克隆可以通过本领域中本身已知的技术来实现。基因克隆和质粒构建是本领域普通技术人员众所周知的，并且可以基本上通过标准分子生物学技术(分子克隆：实验手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual),第4版,美国冷泉港实验室(ColdSpring Harbor Laboratory),美国纽约冷泉港(Cold Spring Harbor,New York,USA),2012)进行。通常，重组病毒可以通过病毒基因组与构建体(例如同源质粒)之间的同源重组来制备，所述构建体包含待***的核酸，该核酸侧接有来自***位点的核苷酸以允许重组。可以在有或没有内源序列缺失的情况下进行克隆。在一个特定实施方式中，克隆重组序列以代替基因组序列的至少一部分，如至少50个核苷酸或更多。这种缺失提高了病毒的克隆能力。

为了构建，通常首先将含有靶向***区的序列克隆到合适的载体中以产生同源载体。载体的实例包括质粒，如pBR322、pBR325、pBR327、pBR328、pUC18、pUC19、pUC7、pUC8或pUC9；噬菌体，如λ噬菌体和M13噬菌体；或粘粒，如pHC79。通过常规克隆方法将靶区序列整合到载体中。使用的靶区序列优选具有足够的长度，以允许随后与DEV病毒基因组进行体内同源重组。优选地，克隆的靶区序列的长度应为至少约100个核苷酸，通常超过300个，如500至2000个核苷酸。接着将外源核酸(其通常含有基因和启动子)***到克隆在载体中的靶区中。***应优选以如下方式进行，即在克隆的***序列的每一侧上留下长度足以允许同源重组的靶区序列部分(例如至少50个核苷酸，优选至少100个核苷酸)。可以通过经典技术如限制酶和连接程序将外源核酸引入克隆的靶区中。在适合的情况下，可以在靶区的特定位点处引入突变以产生限制酶的新切割位点。本领域技术人员众所周知的常规诱变技术可用于该目的，如体外诱变或PCR。接着可以使用已知技术如电穿孔、磷酸钙、基于lipofectin的方法等将外源核酸已被***到靶区中的同源载体引入DEV感染的细胞或DEV基因组转染的细胞中。从而通过在所述细胞中病毒和载体之间的重组来产生重组病毒。可以使用已知技术，例如通过杂交、测序、PCR或功能测定对所得重组病毒进行基因型或表型选择以检测由外源核酸编码的任何产物，如实施例中所述。可以在细胞培养物中大规模培养所选择的重组病毒，之后可以收集重组病毒。

外源基因

本发明的DEV可以含有任何外源核酸，优选任何外源基因。外源基因可以编码任何目的产物，如RNA或生物学活性和/或免疫原性(例如抗原性)蛋白质、多肽或肽。在一个优选实施方式中，外源基因编码抗原，甚至更优选衍生自能够在动物，特别是禽类中引起感染的病原生物体的抗原的肽或多肽。在禽类中引起感染的病原体的实例包括病毒、细菌、真菌、原生动物等。免疫原性(多)肽优选可以为(衍生自)所述病原体的表面蛋白质、分泌的蛋白质或结构蛋白质或其片段。多肽可以衍生自任何来源，例如病毒、原核、真核或合成的。

在一个优选实施方式中，外源基因编码鸟病原体的抗原肽。

病原体的特定实例包括但不限于禽流感病毒；禽副粘病毒1型，也称为新城疫病毒(NDV)；禽间质肺病毒；马立克氏病(Marek's disease)病毒；甘保罗病(Gumboro disease)病毒，也称为传染性法氏囊病病毒(IBDV)；传染性喉气管炎病毒(ILTV)；传染性支气管炎病毒(IBV)；埃希氏大肠杆菌(Escherichia coli)；沙门氏菌(Salmonella)物种；多杀巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)；鸭疫里氏杆菌(Riemerella anatipestifer)；鼻气管鸟杆菌(Ornithobacterium rhinotracheale)；鸡败血支原体(Mycoplasma galisepticum)；滑膜支原体(Mycoplasma synoviae)；感染禽类物种的支原体微生物；或球虫。

优选地，外源基因编码选自以下的抗原：NDV的F蛋白、NDV的HN蛋白、IBDV的VP2蛋白、ILTV的gB蛋白、鸡败血支原体的40K蛋白或禽流感病毒的表面蛋白质血凝素(HA)或其免疫原性片段。在本发明的上下文中，术语蛋白质的“片段”优选指所述蛋白质的包含至少5个，甚至更优选5-100个连续氨基酸残基的片段。在一个优选实施方式中，这种片段包含至少一个表位和/或在体内具有免疫原性，即可以引起结合全长蛋白质的抗体的产生。

免疫原性肽的特定实例包括例如包含VP2的氨基酸残基1-453、gB的氨基酸残基1-469或F的氨基酸残基1-540的肽。

优选的DEV

本发明的优选DEV包含整个US4和US5基因的缺失。

本发明的特定DEV包含如下连续区域的缺失，该连续区域包含US4基因序列的核苷酸序列的至少50％、整个US4-US5基因间区域和US5基因序列的核苷酸序列的至少50％。

本发明的另一种特定DEV包含如下连续区域的缺失，该连续区域包含US4基因序列的核苷酸序列的全部、整个US4-US5基因间区域和US5基因序列的核苷酸序列的全部。

在本发明的优选DEV中，外源核酸编码禽类抗原，更优选VP2、HN或F蛋白或其免疫原性片段。

本发明的另一种优选DEV包含无活性的US4和US5基因和至少一种选自以下的其他缺失：

US7基因序列的至少nt100-nt1000的缺失，

UL4基因序列的至少nt100-nt1200的缺失，和/或

UL23基因序列的至少nt100-nt1000的缺失。

本发明的另一种优选DEV包含无活性的US4和US5基因以及被克隆到优选选自以下的不同区域中的至少一种外源核酸：UL4基因、UL44基因、UL27-UL26基因间区域、UL23基因、UL45-UL46基因间区域、UL50-UL51基因间区域、US7基因、US7-US8基因间区域或US10基因。

核酸

本发明还涉及一种包含具有无活性US4和US5基因的DEV的基因组的核酸分子。这种核酸可以是单链或双链的DNA或RNA。在一个特定实施方式中，核酸是含有上文定义的DEV的基因组的DNA分子。

核酸可以是游离形式，或在载体如质粒、BAC等中。核酸可以是分离的，或被包含在宿主细胞中。

细胞培养物

本发明的重组病毒可以在任何感受态细胞培养物中繁殖。在实现所需的病毒生长后，可以使用刮刀或胰蛋白酶将细胞从孔上脱离，并且可以通过离心使感染的细胞与上清液分离。

感受态细胞的实例包括CEF、含胚蛋、鸡肾细胞等。可以将细胞或病毒在约37℃下在培养基如Eagle's MEM、Leibowitz-L-15/McCoy 5A(1:1混合物)培养基中培养3至6天。通常将感染的细胞悬浮在含有10％二甲亚砜(DMSO)的培养基中，并在液氮下冷冻储存。

组合物和疫苗

本发明还涉及组合物，如疫苗，其包含本发明的一种或多种DEV。

本发明的组合物和疫苗可以在药学上或兽医学上可接受的介质或赋形剂中包含DEV。另外或替代地，组合物和疫苗可以包含合适的佐剂。

根据本发明的组合物和疫苗可以包含合适的溶剂，如水性缓冲液或磷酸盐缓冲液。优选地，组合物和疫苗还包含添加剂，如稳定剂、防腐剂、着色剂、表面活性剂等。

例如，本发明的组合物或疫苗可以用一种或多种其它添加剂来配制以维持等渗性、生理pH和稳定性，例如缓冲液，如生理盐水(0.85％)、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、柠檬酸盐缓冲液、三(羟甲基氨基甲烷)(TRIS)、Tris缓冲盐水等；或抗生素，例如新霉素或链霉素等。

在一个特定实施方式中，本发明的组合物包含防腐剂。

在另一个特定实施方式中，本发明的组合物包含增溶剂。

在另一个特定实施方式中，本发明的组合物包含佐剂。可以从多种来源中的任一种获得佐剂，包括来源于动物的各种蛋白质和肽(例如激素、细胞因子、共刺激因子)、来源于病毒和其它来源的新型核酸(例如双链RNA、CpG)等，其在单独或组合使用时足以增强免疫应答。

本发明的组合物可以是液体(溶液、悬浮液、乳液)或固体(粉末、凝胶、糊剂、油)，并且所述组合物可以被配制成用于任何施用途径。优选地，所述组合物被配制成用于注射，如卵内注射，或用于例如静脉内、皮下、肌肉内、眶内、眼内、皮内和/或腹膜内注射。或者，所述组合物可以被配制成用于口服、经眼(例如通过滴眼液)、鼻内或经眼-鼻施用，例如使用气溶胶或喷雾剂。

每个疫苗剂量可以含有足以在禽类物种中引发保护性免疫应答的合适剂量。这种剂量的优化是本领域中众所周知的。每剂的抗原量可以通过已知方法使用抗原/抗体反应，例如通过ELISA方法来确定。

根据疫苗接种方案，本发明的疫苗可以以单次剂量或重复剂量施用。

在一个特定实施方式中，本发明涉及一种疫苗，其包含上文定义的病毒、核酸或细胞以及合适的赋形剂或佐剂。

在另一个特定实施方式中，本发明涉及一种疫苗，其包含具有上文定义的病毒、核酸或细胞以及合适的赋形剂或佐剂的液体组合物。

本发明还涉及上述病毒、组合物、疫苗、核酸或细胞用于对禽类物种如家禽进行免疫接种的用途，以及通过施用免疫有效量的上述病毒、组合物、疫苗、核酸或细胞对禽类物种进行免疫接种的方法。

本发明的另一个目的涉及上文定义的组合物、DEV、核酸或宿主细胞，其用于对禽类，特别是家禽，更特别是鸡，更特别是幼家禽(在孵化后第3天或更早)或在卵内进行疫苗接种或免疫接种。

本发明的另一个目的涉及上文定义的组合物、疫苗、DEV、核酸或宿主细胞，其用于在禽类，特别是家禽，更特别是鸡，更特别是幼家禽(在孵化后第3天或更早)中或在卵内诱导保护性免疫。

本发明还涉及一种对非人类动物，特别是家禽，更特别是鸡，更特别是幼家禽(在孵化后第3天或更早或在卵内)进行疫苗接种的方法，所述方法包含向所述非人类动物施用上文定义的组合物、疫苗、DEV、核酸或宿主细胞。

本发明的一个特定目的是一种对家禽进行疫苗接种的方法，所述方法包含卵内施用上文定义的组合物、疫苗、DEV、核酸或宿主细胞。

本发明的另一个特定目的是一种对家禽进行疫苗接种的方法，所述方法包含在孵化后第1天或第2天施用上文定义的组合物、疫苗、DEV、核酸或宿主细胞。

在另一个方面中，本发明提供了一种在非人类动物中诱导针对一种或多种禽类病原体的免疫原性或保护性应答的方法，所述方法包含向所述非人类动物，特别是家禽，更特别是鸡，更特别是幼家禽(在孵化后第3天或更早)或卵内施用上文定义的组合物、疫苗、DEV、核酸或宿主细胞。

如实验部分中所示，本发明的病毒特别有利于对幼家禽(在孵化后第1天、第2天或第3天)进行疫苗接种或用于卵内疫苗接种。实际上，本发明令人惊讶地显示，本发明的病毒在这种早期施用后是安全的，而天然或野生型DEV是致命的。这种早期施用与由这些病毒引起的免疫早期产生的组合特别有利于诱导早期保护性免疫，然后家禽可以基本上暴露于病原体。

就此而言，在更一般方面中，本发明还涉及一种用于对禽类，特别是家禽，更特别是鸡进行疫苗接种或免疫接种的方法，该方法包括向所述禽类卵内施用编码抗原的减毒DEV。本发明还涉及一种用于在禽类，特别是家禽，更特别是鸡中表达外源基因的方法，该方法包含向所述禽类卵内施用含有所述外源基因的减毒DEV。本发明还涉及含有外源基因的减毒DEV用于通过卵内施用所述DEV在禽类中表达所述基因的用途。本发明还涉及一种编码抗原的减毒DEV，所述减毒DEV用于通过卵内施用所述DEV来诱导免疫应答或对禽类进行疫苗接种。DEV优选包含无活性的内源基因，使得所述DEV是减毒的并且在卵内注射后耐受良好。

本发明还涉及用于对禽类物种进行免疫接种的疫苗接种试剂盒，所述试剂盒包含有效量的上述多价疫苗和用于向所述物种施用所述组分的构件。例如，这种试剂盒包含填充有根据本发明的疫苗的注射装置和关于真皮内、皮下、肌肉内或卵内注射的说明书。或者，试剂盒包含填充有根据本发明的疫苗的喷雾/气溶胶或滴眼装置以及关于经眼-鼻施用、口服或粘膜施用的说明书。

本发明的其它方面和优点将在以下实验部分中公开，该实验部分是对要求保护的发明的说明。

实施例

实施例1：野生型DEV在蛋或幼家禽中的毒力

进行了一项临床研究来研究以不同的时间表注射后DEV在鸡中的致病性或毒力。更具体地，在卵内(在孵化前第3天)、在孵化后第1天或在孵化后第4天进行注射。所用的DEV为野生型DEV Jansen株。施用剂量为100或1000pfu/剂。作为对照，施用PBS溶液。通过测量孵化后每天的死亡率来评估致病性。

结果如下表所示。

(1)接种时的日龄

(2)在9日龄至19日龄之间死亡的鸟的数量

上述结果显示，在孵化后第4天注射wtDEV是安全的，存活率为100％(参见第5组)。与之形成鲜明对比的是，卵内注射DEV后，100％的鸟到4日龄时都死亡，而卵内注射PBS则是安全的。因此，这些结果显示，虽然wtDEV可能适用于向成年动物施用，但令人惊讶的是，它在幼小动物(孵化后第3天或更短时间)中或卵内施用时是致命的。

实施例2：具有无活性US4或US5基因的DEV的毒力

2.1.包含无活性US4基因或US5基因的DEV的构建。

为了尝试降低对小鸡胚胎的毒力，构建了US4或US5无活性DEV。

rpsLneo-DsRed2盒的构建

通过PCR反应构建rpsLneo-DsRed2盒的2.8-kb DNA片段。简单地说，进行三个PCR反应。使用SEQ ID NO：1(5'-GGCCTGGTGATGATGGCGGGATCGTTGTAT-3')和SEQ ID NO：2(5'-CCATGGTGCTGCGCTCAGAAGAACTCGTCA-3')的引物对以及rpsLneo(SEQ ID NO：3)的合成片段的模板进行第一PCR反应。使用SEQ ID NO：4(5'-ACGAGTTCTTCTGAGCGCAGCACCATGGCC-3')和SEQ ID NO：5(5'-TCGGAGGAGGCCATCCTTAAGAGCTGTAAT-3')的引物对以及pSI哺乳动物表达载体(普洛麦格公司(Promega)，目录号E1721)的模板质粒进行第二PCR反应。使用SEQ IDNO：6(5'-TACAGCTCTTAAGGATGGCCTCCTCCGAGA-3')和SEQ ID NO：7(5'-GCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAAT-3')的引物对以及pIRES2-DsRed2(Clontech，目录号632420)的模板质粒进行第三PCR反应。使用来自第一和第二PCR反应的PCR产物的混合物作为模板并使用SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：5作为引物进行另一个PCR反应。将该PCR产物和来自第三PCR反应的PCR产物混合并与SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：7的引物对一起用于最终PCR反应，得到rpsLneo-DsRed2盒。

***盒的构建

通过PCR反应构建rpsLneo-DsRed2盒的DNA片段，其中将5'和3'端的DEV US4或US5区同源序列(每个50bp)添加到其两端。使用rpsLneo-DsRed2盒作为模板进行PCR反应。对于US4无活性DEV来说，使用的引物对为SEQ ID NO：8(5'-ATGGCAACAATGATAGCTGTGGTGTTAGTTTTTTTGGGACGC GTTTTAGGGGCCTGGTGATGATGGCGGG-3')和SEQ ID NO：9(5'-TTAAACTAATGGAACGCGTTGGAATTTCAAGTCTTGGCGCCC AAACATCGGCAGTGAAAAAAATGCTTTA-3')，并且对于US5无活性DEV来说，使用的引物对为SEQ ID NO：10(5'-ATGTATACAGACGTTACGGTCATGTGGGTAGCCGTGATTTTA TTTACTATGGCCTGGTGATGATGGCGGG-3')和SEQ ID NO：11(5'-TCATACCATACAAAGGCATAGGTACAGCCCACAGGTTAAAA ACAAAGAAAGCAGTGAAAAAAATGCTTTA-3')。将获得的PCR片段(US4-rpsLneo-DsRed2和US5-rpsLneo-DsRed2盒)电泳并纯化。

携带rpsLneo-DsRed2基因的重组DEV的构建

通过在用0.5μg US4-rpsLneoDsRed2或US5-rpsLneoDsRed2转染的携带DEV基因组的埃希氏大肠杆菌菌株中同源重组，进行US4或US5区域中携带rpsLneo-DsRed2基因的重组DEV的构建。使用Gene Pulser Xcell(Bio-Rad实验室(Bio-Rad Laboratories))在1.75kV、25μF和200ohm下通过电穿孔进行转染。转染后，将埃希氏大肠杆菌种植在Luria-Bertani(LB)琼脂平板上，并在30℃下温育过夜。通过使用扩增rpsLneo-DsRed2基因和DEV基因组的***位点区域之间的区域(连接区1)的引物对进行PCR来鉴定携带在US4或US5区域中含有rpsLneo-DsRed2基因的适当***序列的埃希氏大肠杆菌克隆。对于US4无活性DEV来说，引物是SEQ ID NO：12(5'-AAGTGTATAAATTAGACAAGTAGCTATGCG-3')和SEQ ID NO：13(5'-TCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGC-3')，并且对于US5无活性DEV来说，引物是SEQ ID NO：13和SEQID NO：14(5'-GTTTATATTGACGCGGAATGTTGAC-3')。从携带适当***序列的埃希氏大肠杆菌克隆中提取DEV DNA，并使用Nucleofector II(瑞士巴塞尔市龙沙公司(Lonza,Basel,Switzerland))转染到CEF中。将转染的细胞添加到Leibovitz's L-15(美国生命技术公司(Life Technologies Corp.)，目录号41300-39)、McCoy's 5A培养基(美国生命技术公司，目录号21500-061)(1:1)和4％小牛血清[LM(+)培养基]中，种植在96孔组织培养板中，接着在37℃下在4-5％CO₂中温育5-7天，直至可见DEV细胞病变效应(CPE)。成功拯救了在US4或US5区域中携带rpsLneo-DsRed2基因的DEV(DEV/US4/rpsLneo-DsRed2或DEV/US5/rpsLneo-DsRed2)。

基因组结构的验证

通过扩增***基因每端的连接区域(连接区1、连接区2和连接区3)的三个PCR反应来验证重组体DEV/US4/rpsLneo-DsRed2或DEV/US5/rpsLneo-DsRed2的基因组结构。连接区1的PCR反应中使用的引物对如上所述。在DEV/US4/rpsLneo-DsRed2中，对于连接区2来说，PCR反应中使用的引物对是SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：15(5'-CATTTTAACCGTTTAAGTCAACATTCCGC-3')，并且对于连接区3来说，PCR反应中使用的引物对是SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：15。在DEV/US5/rpsLneo-DsRed2中，对于连接区2来说，PCR反应中使用的引物对是SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：16(5'-ACTGAGATGTTGGACCATCAAATCCTG-3')，并且对于连接区3来说，PCR反应中使用的引物对是SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：16。观察到PCR产物的预期尺寸，证实DEV/US4/rpsLneo-DsRed2和DEV/US5/rpsLneo-DsRed2具有预期的基因组结构。

2.2.通过具有无活性US4或US5基因的重组DEV表达外源基因。

通过DsRed2的激发来证实DEV/US4/rpsLneo-DsRed2或DEV/US5/rpsLneo-DsRed2表达DsRed2蛋白。使用用DEV/US4/rpsLneo-DsRed2或DEV/US5/rpsLneo-DsRed2感染的CEF进行DsRed2的激发。简单地说，用DEV/US4/rpsLneo-DsRed2、DEV/US5/rpsLneo-DsRed2或亲代DEV病毒株以约0.01的感染复数感染6孔板中的CEF细胞。接种后3天，在563nm下激发细胞，并在重组体DEV/US4/rpsLneo-DsRed2或DEV/US5/rpsLneo-DsRed2的空斑中观察到红色荧光，从而证实重组DEV的实际蛋白质表达。

2.3.具有无活性US4或US5基因的重组DEV的活力和稳定性。

使DEV/US4/rpsLneo-DsRed2或DEV/US5/rpsLneo-DsRed2在CEF中传代15次，并证实了rpsLneo-DsRed2的***基因的稳定性。每三到四天进行一次传代。每传代五次，通过荧光显微镜检查DEV/US4/rpsLneo-DsRed2或DEV/US5/rpsLneo-DsRed2的空斑的红色荧光，并通过使用实施例2中所示的引物扩增连接区域(连接区1、连接区2和连接区3)的PCR分析来证实它们的基因组结构。对所有观察的病毒都观察到了红色荧光和预期的PCR产物尺寸，证实DEV/US4/rpsLneo-DsRed2和DEV/US5/rpsLneo-DsRed2保留了rpsLneo-DsRed2基因至少15代。

2.4.卵内施用后US4或US5无活性DEV的毒力。

将DEV/US4/rpsLneo-DsRed2或DEV/US5/rpsLneo-DsRed2接种到SPF鸡的18日龄胚胎中，以研究其对小鸡胚胎的致病性或毒力。通过20号和1.5英寸针，向小鸡胚胎卵内施用约1000pfu/0.1ml的DEV/US4/rpsLneo-DsRed2、DEV/US5/rpsLneo-DsRed2、亲代DEV或0.1mlPBS。每天观察小鸡中与DEV相关的临床症状，如抑郁和死亡，持续11天。结果如下表所示。

(1)在6日龄至11日龄之间死亡的鸟的数量

卵内接种US4或US5无活性DEV的所有小鸡在孵化后4天均死亡，而接种亲代DEV的95％的小鸡死亡。这些结果显示，US4或US5无活性DEV在卵内施用后仍对小鸡胚胎具有致病性和毒力。

实施例3：包含无活性US4和US5基因的DEV的构建。

为了构建US4和US5无活性DEV，首先构建同源载体，接着通过在埃希氏大肠杆菌中同源重组用于产生病毒。质粒构建和DNA操作基本上根据标准分子生物学技术(分子克隆：实验手册,第4版,美国冷泉港实验室,美国纽约冷泉港,2012)进行。

同源载体的构建

通过在***位点处添加SfiI识别位点的PCR反应来克隆DEV基因组中侧接于US3和US6基因的1.1-kb DNA片段。简单地说，使用从DEV中提取的DNA作为模板进行两个PCR反应。使用的引物对为SEQ ID NO：17(5'-GCGCATGCTAGCTGATCTAACTTTAC-3')和SEQ ID NO：18(5'-GGTGGCCAATAAGGCCTGACGGCAATATGT-3')，以及SEQ ID NO：19(5'-TCAggccttattggccACCAGCTACACAAG-3')和SEQ ID NO：20(5'-GCGAATTCGATTAATTCTCCCGAACTGTTG-3')。使用来自两个前述PCR反应的PCR产物的混合物作为模板并使用SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：20作为引物进行另一个PCR反应。在用EcoRI和SphI消化后，将获得的PCR片段克隆到pUC18载体(GenBank登录号L09136)中，得到pUC18-KAPEVAC-US4US5del-SfiI，其包含DEV基因组的US3和US6区域的一部分。接着，通过利用质粒pUC18-KAPEVAC-US4US5del-SfiI构建含有启动子和来自标准攻击株的IBDV VP2基因(VP2-STC)的同源载体。首先，用SfiI切割pUC18-KAPEVAC-US4US5del-SfiI，并用碱性磷酸酶希瓦氏菌物种(Shewanella sp.)S1B1重组体(PAP)(Funakoshi DE110号)去磷酸化。接着，通过BglI消化p45/46bacVP2-STC#11(美国专利号6,764,684)获得鸡β-肌动蛋白(Bac)启动子(SEQ ID NO：21)和VP2-STC基因。最后，将该Bac启动子-VP2-STC盒***SfiI消化的pUC18-KAPEVAC-US4US5del-SfiI中，得到pUC18-KAPEVAC-US4US5del-BacVP2stc(图2)。使用这种质粒pUC18-KAPEVAC-US4US5del-BacVP2stc构建DEV/US4US5del/BacVP2stc(图2)。

DEV/US4US5del/BacVP2的构建

通过在用0.5μg pUC18-KAPEVAC-US4US5del-BacVP2stc转染的携带DEV基因组的埃希氏大肠杆菌菌株中同源重组，进行US4-US5区域中携带BacVP2基因的DEV的构建。转染条件如实施例2中所述。通过使用扩增BacVP2基因和DEV基因组的***位点区域之间的区域(连接区1，图2)的引物对进行PCR来鉴定携带含有BacVP2基因的适当***序列的埃希氏大肠杆菌克隆。引物是SEQ ID NO：22(5'-GTCCACTATGCCATGACATAGGTG-3')和SEQ ID NO：23(5'-GAGCAACTTCGAGCTGATCC-3')。从携带适当***序列的埃希氏大肠杆菌克隆中提取DEVDNA并转染到CEF中。温育转染的细胞直至可见DEV CPE。成功地构建了敲除US4和US5基因并具有BacVP2基因的DEV/US4US5del/BacVP2。

基因组结构的验证

通过扩增***基因每端的连接区域(连接区1、连接区2和连接区3)的三个PCR反应来验证DEV/US4US5del/BacVP2的基因组结构。连接区1的PCR反应中使用的引物对如上所述。连接区2的PCR反应中使用的引物对是SEQ ID NO：24(5'-GCCAGGGAATCCAGGGAAAAAGAC-3')和SEQ ID NO：12。对于连接区3，使用SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：12。观察到PCR产物的预期尺寸，证实DEV/US4US5del/BacVP2具有预期的基因组结构。

实施例4：通过DEV/US4US5del/BacVP2表达VP2基因。

通过黑斑测定来证实重组体DEV/US4US5del/BacVP2表达VP2蛋白。简单地说，用甲醇:丙酮混合物(1:2)固定用DEV/US4US5del/BacVP2感染的CEF，并与抗IBDV VP2单克隆抗体R63(ATCC编号：HB-9490)一起温育。接着，与生物素化的抗小鼠IgG抗体(VectorLaboratories，目录号BA-9200)一起温育，然后使用VECTASTAIN ABC-AP试剂盒(VectorLaboratories，目录号AK-5000)，通过添加NBT/BCIP溶液(罗氏应用科学(Roche AppliedScience)，目录号1681451)将表达VP2蛋白的空斑染色。如图3所示，在用DEV/US4US5del/BacVP2感染的细胞中观察到VP2蛋白的表达。

实施例5：DEV/US4US5del/BacVP2的卵内施用。

将DEV/US4US5del/BacVP2接种到18日龄的SPF小鸡胚胎中。通过20号和1.5英寸针，以约1000pfu/0.1ml的重组体DEV/US4US5del/BacVP2、亲代DEV或0.1ml PBS对所有组的胚胎进行卵内疫苗接种。每天观察小鸡中与DEV相关的临床症状，如抑郁和死亡，持续35天。孵化后5周，检查鸡的重量增加，进行尸体剖检并观察大致可观察到的病变。结果如下表所示。

(1)在3日龄至8日龄之间死亡的鸟的数量

(2)在12日龄至35日龄之间死亡的鸟的数量

用敲除了US4和US5两种基因的DEV/US4US5del/BacVP2接种的鸟的死亡率为11.8％，而用亲代DEV接种的鸟的死亡率为100％，表明DEV的毒力和致病性通过US4和US5两种基因的失活(例如缺失)而显著降低。此外，用DEV/US4US5del/BacVP2接种的存活鸟的平均体重与用PBS接种的鸟的平均体重相当。这些结果证明本发明的DEV用于卵内疫苗接种的功效。

实施例6：包含无活性US4和US5基因的DEV/Coa5VP2的构建。

在该部分中，构建了在US4和US5基因两者中具有缺失并携带由Bac启动子的核心区域(Coa5启动子；SEQ ID NO：25)驱动的VP2基因的DEV。为了构建这些DEV，首先构建同源载体，接着通过在埃希氏大肠杆菌中同源重组用于产生病毒。

pUC18-KAPEVAC-US4US5del的构建

通过PCR反应来克隆DEV基因组中侧接于US3和US6基因的1.1-kb DNA片段(图4)。简单地说，使用从DEV中提取的DNA作为模板进行两个PCR反应。使用的引物对为SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：26(5'-GCTTGTGTAGCTGGTTGACGGCAATATG-3')，以及SEQ ID NO：27(5'-CATATTGCCGTCAACCAGCTACACAAGC-3')和SEQ ID NO：20(5'-gcGAATTCGATTAATTCTCCCGAACTGTTG-3')。使用来自两个前述PCR反应的PCR产物的混合物作为模板并使用SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：20作为引物进行另一个PCR反应。用EcoRI和SphI消化后，将获得的PCR片段克隆到pUC18载体中，得到pUC18-KAPEVAC-US4US5del(图4)。

DEV/US4US5del的构建

通过在用0.5μg pUC18-KAPEVAC-US4US5del转染的携带DEV基因组的埃希氏大肠杆菌中同源重组，进行在US4和US5基因两者中具有缺失的重组体DEV/US4US5del的构建。通过使用扩增US3和US6之间的区域(连接区1；图4)的引物对进行PCR来鉴定携带适当缺失的埃希氏大肠杆菌克隆(DH10B/DEV/US4US5del)。使用的引物是SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：20。从埃希氏大肠杆菌克隆中提取DEV DNA并转染到CEF中来拯救DEV/US4US5del。

pUC18-KAPEVAC-UL23del-Coa5VP2的构建

通过在***位点处添加SfiI识别位点的PCR反应来克隆DEV基因组中侧接于UL24和UL22基因的1.0-kb DNA片段(图5)。简单地说，使用从DEV中提取的DNA作为模板进行两个PCR反应。使用的引物对为SEQ ID NO：28(5'-GCGCATGCCAATTGTCTAATTCCAG-3')和SEQ IDNO：29(5'-CCCGGCCAATAAGGCCACAGAAAAAGCGCG-3')，以及SEQ ID NO：30(5'-CTGTGGCCTTATTGGCCGGGATCTGGAAC-3')和SEQ ID NO：31(5'-GCGAATTCATGTGCTACGCCCAG-3')。使用来自两个前述PCR反应的PCR产物的混合物作为模板并使用SEQ ID NO：28和SEQID NO：31作为引物进行另一个PCR反应。用EcoRI和SphI消化后，将获得的PCR片段克隆到pUC18载体中，得到pUC18-KAPEVAC-UL23del-SfiI。接着，通过利用质粒pUC18-KAPEVAC-UL23del-SfiI构建含有启动子和VP2-STC的同源载体。首先，用SfiI切割pUC18-KAPEVAC-UL23del-SfiI并用PAP去磷酸化。通过BglI和XbaI消化从质粒pGICOA(美国专利号6,866,852)获得Coa5启动子，并与p45/46bacVP2-STC#11(美国专利号6,764,684)的XbaI-EcoRI片段(6.3-kb)和EcoRI-BglI片段(0.1-kb)连接，得到p45/46COA5VP2-STC#11。接着通过BglI消化从p45/46COA5VP2-STC#11切下Coa5启动子-VP2-STC盒，并与SfiI消化的pUC18-KAPEVAC-UL23del-SfiI连接，得到pUC18-KAPEVAC-UL23del-Coa5VP2。使用这种质粒构建DEV/US4US5del/UL23/Coa5VP2。

pUC18-KAPEVAC-UL26-Coa5VP2的构建

通过在***位点处添加SfiI识别位点的PCR反应来克隆DEV基因组中侧接于UL26和UL27基因的1.0-kb DNA片段(图6)。简单地说，使用从DEV中提取的DNA作为模板进行两个PCR反应。使用的引物对为SEQ ID NO：32(5'-CGGTCGACACTCCCAGGGGTGAAGC-3')和SEQ IDNO：33(5'-CGGCCAATAAGGCCAAGAATGCATTCGGCC-3')，以及SEQ ID NO：34(5'-TGGCCTTATTGGCCGCCGTATGAATTGCGC-3')和SEQ ID NO：35(5'-GCGAGCTCCTGCAACCACAGACCGC-3')。使用来自两个前述PCR反应的PCR产物的混合物作为模板并使用SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：35作为引物进行另一个PCR反应。用SalI和SacI消化后，将获得的PCR片段克隆到pUC18载体中，得到pUC18-KAPEVAC-UL26-SfiI。接着，通过利用质粒pUC18-KAPEVAC-UL26-SfiI构建含有启动子和来自标准攻击株的IBDV VP2基因的同源载体。首先，用SfiI切割pUC18-KAPEVAC-UL26-SfiI并用PAP去磷酸化。通过SfiI消化从pUC18-KAPEVAC-UL23del-Coa5VP2切下Coa5启动子-VP2-STC盒，并与SfiI消化的pUC18-KAPEVAC-UL26-SfiI连接，得到pUC18-KAPEVAC-UL26-Coa5VP2。使用这种质粒构建DEV/US4US5del/UL26/Coa5VP2。

pUC18-KAPEVAC-UL45-Coa5VP2的构建

通过在***位点处添加SfiI识别位点的PCR反应来克隆DEV基因组中侧接于UL45和UL46基因的1.0-kb DNA片段(图7)。简单地说，使用从DEV中提取的DNA作为模板进行两个PCR反应。使用的引物对为SEQ ID NO：36(5'-CGGTCGACATAGAACGCGCTTCATCTAA-3')和SEQID NO：37(5'-TGGCCAATAAGGCCGTTTATTGTTTATTAT-3')，以及SEQ ID NO：38(5'-CGGCCTTATTGGCCAATCTGATTCATCCAA-3')和SEQ ID NO：39(5'-GCGAGCTCCGCCTAATCACAATCGGTATTG-3')。使用来自两个前述PCR反应的PCR产物的混合物作为模板并使用SEQ ID NO：36和SEQ ID NO：39作为引物进行另一个PCR反应。用SalI和SacI消化后，将获得的PCR片段克隆到pUC18载体中，得到pUC18-KAPEVAC-UL45-SfiI。接着，通过利用质粒pUC18-KAPEVAC-UL45-SfiI构建含有启动子和来自标准攻击株的IBDV VP2基因的同源载体。首先，用SfiI切割pUC18-KAPEVAC-UL45-SfiI并用PAP去磷酸化。通过SfiI消化从pUC18-KAPEVAC-UL23del-Coa5VP2切下Coa5启动子-VP2-STC盒，并与SfiI消化的pUC18-KAPEVAC-UL45-SfiI连接，得到pUC18-KAPEVAC-UL45-Coa5VP2。使用这种质粒构建DEV/US4US5del/UL45/Coa5VP2。

pUC18-KAPEVAC-UL50-Coa5VP2的构建

通过在***位点处添加SfiI识别位点的PCR反应来克隆侧接于UL50和UL51基因的DEV基因组的1.0-kb DNA片段(图8)。简单地说，使用从DEV中提取的DNA作为模板进行两个PCR反应。使用的引物对为SEQ ID NO：40(5'-CCGCATGCGCAACTATATATGTCGGTC-3')和SEQ IDNO：41(5'-GGGCCAATAAGGCCCAAAAGTACATTTTGT-3')，以及SEQ ID NO：42(5'-GGGCCTTATTGGCCCAATTTATTTACTATT-3')和SEQ ID NO：43(5'-GCGAATTCTGGATATGATATACCGTTGC-3')。使用来自两个前述PCR反应的PCR产物的混合物作为模板并使用SEQ ID NO：40和SEQ ID NO：43作为引物进行另一个PCR反应。用EcoRI和SphI消化后，将获得的PCR片段克隆到pUC18载体中，得到pUC18-KAPEVAC-UL50-SfiI。接着，通过利用质粒pUC18-KAPEVAC-UL50-SfiI构建含有启动子和来自标准攻击株的IBDV VP2基因的同源载体。首先，用SfiI切割pUC18-KAPEVAC-UL50-SfiI并用PAP去磷酸化。通过SfiI消化从pUC18-KAPEVAC-UL23del-Coa5VP2切下Coa5启动子-VP2-STC盒，并与SfiI消化的pUC18-KAPEVAC-UL50-SfiI连接，得到pUC18-KAPEVAC-UL50-Coa5VP2。使用这种质粒构建DEV/US4US5del/UL50/Coa5VP2。

DEV/US4US5del/Coa5VP2stc的构建

通过在用DEV/US4US5del和用0.5μg pUC18-KAPEVAC-UL23del-Coa5VP2、pUC18-KAPEVAC-UL26-Coa5VP2、pUC18-KAPEVAC-UL45-Coa5VP2或pUC18-KAPEVAC-UL50-Coa5VP2中的一个转染的埃希氏大肠杆菌菌株中同源重组，进行在US4和US5基因中具有缺失并在UL23、UL26/UL27、UL45/UL46或UL50/UL51区域中携带Coa5VP2基因的重组DEV的构建。转染条件如实施例2中所述。转染后，通过使用扩增Coa5VP2基因和DEV基因组的***位点区域之间的区域(连接区1，图5-8)的引物对进行PCR来鉴定携带含有Coa5VP2基因的适当***序列的埃希氏大肠杆菌克隆。引物是SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：28(对于***位点UL23来说)，SEQ ID NO：32(对于***位点UL26/UL27来说)，SEQ ID NO：36(对于***位点UL45/UL46来说)，或SEQ ID NO：40(对于***位点UL50/UL51来说)。从携带适当***序列的埃希氏大肠杆菌克隆中提取修饰的DEV DNA并使用Nucleofector II转染到CEF中。将转染的细胞添加到LM(+)培养基中，种植在96孔组织培养板中，接着在37℃、4-5％CO₂下温育5-7天，直至可见DEV CPE。转染后，成功拯救了具有无活性US4和US5基因并携带Coa5VP2基因的DEV(DEV/US4US5del/UL23/Coa5VP2、DEV/US4US5del/UL26/Coa5VP2、DEV/US4US5del/UL45/Coa5VP2和DEV/US4US5del/UL50/Coa5VP2)。

基因组结构的验证

通过扩增***基因每端的连接区域(连接区1、连接区2和连接区3；图5-8)的三个PCR反应来验证DEV/US4US5del/UL23/Coa5VP2、DEV/US4US5del/UL26/Coa5VP2、DEV/US4US5del/UL45/Coa5VP2和DEV/US4US5del/UL50/Coa5VP2的基因组结构。连接区1的PCR反应中使用的引物对如上所述。对于连接区2来说，PCR反应中使用的引物对是SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：31(***位点UL23)、SEQ ID NO：35(***位点UL26/UL27)、SEQ ID NO：39(***位点UL45/UL46)或SEQ ID NO：43(***位点UL50/UL51)。对于连接区3来说，使用引物对SEQ ID NO：28/SEQ ID NO：31(***位点UL23)、SEQ ID NO：32/SEQ ID NO：32/SEQ ID NO：35(***位点UL26/UL27)、SEQ ID NO：36/SEQ ID NO：39(***位点UL45/UL46)或SEQ IDNO：40/SEQ ID NO：43(***位点UL50/UL51)。观察到PCR产物的预期尺寸，证实DEV/US4US5del/UL23/Coa5VP2、DEV/US4US5del/UL26/Coa5VP2、DEV/US4US5del/UL45/Coa5VP2和DEV/US4US5del/UL50/Coa5VP2具有预期的基因组结构。

实施例7：通过包含无活性US4和US5基因的DEV/Coa5VP2表达VP2基因。

通过黑斑测定和western印迹分析来证实DEV/US4US5del/UL23/Coa5VP2、DEV/US4US5del/UL26/Coa5VP2、DEV/US4US5del/UL45/Coa5VP2和DEV/US4US5del/UL50/Coa5VP2的VP2蛋白的表达。黑斑测定的方法如实施例4中所述。如图9所示，在用DEV/US4US5del/UL23/Coa5VP2、DEV/US4US5del/UL26/Coa5VP2、DEV/US4US5del/UL45/Coa5VP2或DEV/US4US5del/UL50/Coa5VP2感染的细胞中观察到VP2蛋白的表达。使用用DEV/US4US5del/UL23/Coa5VP2、DEV/US4US5del/UL26/Coa5VP2、DEV/US4US5del/UL45/Coa5VP2或DEV/US4US5del/UL50/Coa5VP2感染的CEF和抗IBDV VP2单克隆抗体R63进行western印迹。简单地说，用一种重组病毒或亲代DEV感染12孔板中的CEF。接种后4天，用胰蛋白酶收获细胞，并以913×g离心5分钟。用PBS洗涤沉淀物并用25μl PBS重悬。添加相同体积的2×SDS样品缓冲液(130mM Tris-Cl(pH 6.8)、6％SDS、20％甘油、10％2-巯基乙醇和0.01％溴酚蓝)后，使细胞悬浮液沸腾5分钟。通过使用12.5％聚丙烯酰胺凝胶进行SDS-PAGE来分离样品，并转移至PVDF膜(Immobilon-P，密理博公司(Millipore))。将膜完全干燥，接着与R63单克隆抗体一起温育。洗去R63抗体后，与生物素化的抗小鼠IgG抗体一起温育，然后使用VECTASTAINABC-AP试剂盒。通过添加NBT/BCIP溶液显现与R63单克隆抗体结合的蛋白质。在具有重组细胞的所有泳道中观察到4万道尔顿的蛋白质条带，这是VP2蛋白的预期尺寸(图10)，证实用重组病毒感染的细胞表达VP2蛋白。

实施例9：包含无活性US4和US5基因的DEV/Coa5VP2的稳定性。

使DEV/US4US5del/UL23/Coa5VP2、DEV/US4US5del/UL26/Coa5VP2、DEV/US4US5del/UL45/Coa5VP2和DEV/US4US5del/UL50/Coa5VP2在CEF中传代15次，并适当地证实了BacVP2的***基因的稳定性。每三到四天进行一次传代。每传代五次，通过黑斑测定来检查用DEV/US4US5del/UL23/Coa5VP2、DEV/US4US5del/UL26/Coa5VP2、DEV/US4US5del/UL45/Coa5VP2或DEV/US4US5del/UL50/Coa5VP2感染的细胞的VP2基因表达，并且通过用实施例7中所示的引物扩增连接区域(连接区1、连接区2和连接区3；图5-8)的PCR分析来证实它们的基因组结构。结果，没有观察到US4和US5基因的逆转并且没有观察到Coa5VP2基因的缺失，表明这些病毒在CEF中是稳定的。

实施例10：包含无活性US4和US5基因的DEV/Coa5VP2的卵内施用。

在该研究中，检查了卵内安全性和针对毒性IBDV的保护功效。

将DEV/US4US5del/UL23/Coa5VP2、DEV/US4US5del/UL26/Coa5VP2、DEV/US4US5del/UL45/Coa5VP2和DEV/US4US5del/UL50/Coa5VP2或亲代DEV接种到SPF鸡的18日龄胚胎中。通过20号和1.5英寸针，以约1000pfu/0.1ml的重组病毒、亲代DEV或0.1ml PBS对所有组的胚胎进行卵内疫苗接种。每天观察小鸡中与DEV相关的临床症状，如抑郁和死亡，持续42天。将其放血并在1至5周龄之间每周检查体重，以评估针对IBDV的体液免疫并检查病毒的毒力。用市售IBDV ELISA试剂盒(ID SCREEN IBD VP2；IDVet)对抗IBDV抗体进行定量。通过口服途径用10³平均胚胎感染剂量(EID₅₀)的毒性IBDV标准攻击(STC)株攻击除第1组之外的所有鸡。每天观察鸡中与IBD相关的临床症状，如抑郁和死亡。攻击后7天，对鸡进行尸体剖检并观察大致可观察到的法氏囊病变，如水肿、变色、萎缩、出血和黄色或凝胶状渗出物。在尸体剖检时还测量身体和法氏囊的重量以计算B/B指数，B/B指数是受攻击的鸟的法氏囊的重量与体重之间的比率除以未受攻击的鸟的同一比率。

这个试验的结果证实了在体内的安全性、稳定性和有效表达。

序列表

SEQ ID NO：1F-rpsL：(5'-GGCCTGGTGATGATGGCGGGATCGTTGTAT-3')

SEQ ID NO：2R-SV40启动子-neoR-rpsL：(5'-CCATGGTGCTGCGCTCAGAAGAACTCGTCA-3')

SEQ ID NO：3rpsLneo：(5'-GGCCTGGTGATGATGGCGGGATCGTTGTATATTTCTTGACACCTTTTCGGCATCGCCCTAAAATTCGGCGTCCTCATATTGTGTGAGGACGTTTTATTACGTGTTTACGAAGCAAAAGCTAAAACCAGGAGCTATTTAATGGCAACAGTTAACCAGCTGGTACGCAAACCACGTGCTCGCAAAGTTGCGAAAAGCAACGTGCCTGCGCTGGAAGCATGCCCGCAAAAACGTGGCGTATGTACTCGTGTATATACTACCACTCCTAAAAAACCGAACTCCGCGCTGCGTAAAGTATGCCGTGTTCGTCTGACTAACGGTTTCGAAGTGACTTCCTACATCGGTGGTGAAGGTCACAACCTGCAGGAGCACTCCGTGATCCTGATCCGTGGCGGTCGTGTTAAAGACCTCCCGGGTGTTCGTTACCACACCGTACGTGGTGCGCTTGACTGCTCCGGCGTTAAAGACCGTAAGCAGGCTCGTTCCAAGTATGGCGTGAAGCGTCCTAAGGCTTAAGGAGGACAATCATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAGGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGCGCAGCTGTGCTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGAAGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGTATCCATCATGGCTGATGCAATGCGGCGGCTGCATACGCTTGATCCGGCTACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATCAGGATGATCTGGACGAAGAGCATCAGGGGCTCGCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGCGCATGCCCGACGGCGAGGATCTCGTCGTGACCCATGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGATTCATCGACTGTGGCCGGCTGGGTGTGGCGGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGGCTACCCGTGATATTGCTGAAGAGCTTGGCGGCGAATGGGCTGACCGCTTCCTCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGA-3')

SEQ ID NO：4F-neoR-SV40启动子：(5'-ACGAGTTCTTCTGAGCGCAGCACCATGGCC-3')

SEQ ID NO：5R-dsRed-SV40启动子-内含子：(5'-TCGGAGGAGGCCATCCTTAAGAGCTGTAAT-3')

SEQ ID NO：6F-SV40启动子-内含子-dsRed：(5'-TACAGCTCTTAAGGATGGCCTCCTCCGAGA-3')

SEQ ID NO：7R-SV40polyA-dsRed：(5'-GCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAAT-3')

SEQ ID NO：8F-DEV-US4-rpsLneo：(5'-ATGGCAACAATGATAGCTGTGGTGTTAGTTTTTTTGGGACGCGTTTTAGGGGCCTGGTGATGATGGCGGG-3')

SEQ ID NO：9R-DEV-US4-rpsLneoSV40DsRed：(5'-TTAAACTAATGGAACGCGTTGGAATTTCAAGTCTTGGCGCCCAAACATCGGCAGTGAAAAAAATGCTTTA-3')

SEQ ID NO：10F-DEV-US5-rpsLneo：(5'-ATGTATACAGACGTTACGGTCATGTGGGTAGCCGTGATTTTATTTACTATGGCCTGGTGATGATGGCGGG-3')

SEQ ID NO：11R-DEV-US5-rpsLneoSV40DsRed：(5'-TCATACCATACAAAGGCATAGGTACAGCCCACAGGTTAAAAACAAAGAAAGCAGTGAAAAAAATGCTTTA-3')

SEQ ID NO：12F-VAC-136981：(5'-AAGTGTATAAATTAGACAAGTAGCTATGCG-3')

SEQ ID NO：13R-neo：(5'-TCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGC-3')

SEQ ID NO：14F-VAC-138520：(5'-GTTTATATTGACGCGGAATGTTGAC-3')

SEQ ID NO：15R-VAC-138560：(5'-CATTTTAACCGTTTAAGTCAACATTCCGC-3')

SEQ ID NO：16R-VAC-140339：(5'-ACTGAGATGTTGGACCATCAAATCCTG-3')

SEQ ID NO：17F-SphI-KAPEVAC-138500：(5'-gcGCATGCTAGCTGATCTAACTTTAC-3')

SEQ ID NO：18R-KAPE-US45del-SfiI***序列：(5'-GGTGGCCAATAAGGCCTGACGGCAATATGT-3')

SEQ ID NO：19F-KAPE-US45del-SfiI***序列：(5'-TCAggccttattggccACCAGCTACACAAG-3')

SEQ ID NO：20R-EcoRI-KAPEVAC-142750：(5'-gcGAATTCGATTAATTCTCCCGAACTGTTG-3')

SEQ ID NO：21鸡β-肌动蛋白启动子：(5'-tgcagctcagtgcatgcacgctcattgcccatcgctatccctgcctctcctgctggcgctccccgggaggtgacttcaaggggaccgcaggaccacctcgggggtggggggagggctgcacacgcggaccccgctccccctccccaacaaagcactgtggaatcaaaaaggggggaggggggatggaggggcgcgtcacacccccgccccacaccctcacctcgaggtgagccccacgttctgcttcactctccccatctcccccccctccccacccccaattttgtatttatttattttttaattattttgtgcagcgatgggggcggggggggggggggcgcgcgccaggcggggcggggcggggccaggggcggggcggggcgaggcggagaggtgcggcggcagccaatcagagcggcgcgctccgaaagtttccttttatggcgaggcggcggcggcggcggccctataaaaagcgaagcgcgcggcgggcgggagtcgctgcgcgctgccttcgccccgtgccccgctccgccgccgcctcgcgccgcccgccccggctctgactgaccgcgttactcccacaggtgagcgggcgggacggcccttctcctccgggctgtaattagcgcttggtttaatgacggctcgtttcttttctgtggctgcgtgaaagccttaaagggctccgggagggccctttgtgcgggggggagcggctcggggggtgcgtgcgtgtgtgtgtgcgtggggagcgccgcgtgcggctccgcgctgcccggcggctgtgagcgctgcgggcgcggcgcggggctttgtgcgctccgcagtgtgcgcgaggggagcgcggccgggggcggtgccccgcggtgcggggggggctgcgaggggaacaaaggctgcgtgcggggtgtgtgcgtgggggggtgagcagggggtgtgggcgcggcggtcgggctgtaacccccccctgcacccccctccccgaagttgctgagcacggcccggcttcgggtgcggggctccgtgcggggcgtggcgcggggctcgccgtgccgggcggggggtggcggcaggtgggggtgccgggcggggcggggccgcctcgggccggggagggctcgggggaggggcgcggcggcccccggagcgccggcggctgtcgaggcgcggcgagccgcagccattgccttttatggtaatcgtgcgagagggcgcagggacttcctttgtcccaaatctgtgcggagccgaaatctgggaggcgccgccgcaccccctctagcgggcgcggggcgaagcggtgcggcgccggcaggaaggaaatgggcggggagggccttcgtgcgtcgccgcgccgccgtccccttctccatctccagcctcggggctgtccgcagggggacggctgccttcgggggggacggggcagggcggggttcggcttctggcgtgtgaccggcggggtttatatcttcccttctctgttcctccgcagccccc-3')

SEQ ID NO：22F-KAPEVAC-138407：(5'-GTCCACTATGCCATGACATAGGTG-3')

SEQ ID NO：23STC1109S：(5'-GAGCAACTTCGAGCTGATCC-3')

SEQ ID NO：24STC201AS：(5'-GCCAGGGAATCCAGGGAAAAAGAC-3')

SEQ ID NO：25Coa5启动子：(5'-TATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGAGTCGCTGCGCGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGT-3')

SEQ ID NO：26R-KAPE-US45del：(5'-GCTTGTGTAGCTGGTTGACGGCAATATG-3')

SEQ ID NO：27F-KAPE-US45del：(5'-CATATTGCCGTCAACCAGCTACACAAGC-3')

SEQ ID NO：28F-SphI-KAPEVAC-76350：(5'-GCGCATGCCAATTGTCTAATTCCAG-3')

SEQ ID NO：29R-KAPE-UL23del-SfiI***序列：(5'-CCCGGCCAATAAGGCCACAGAAAAAGCGCG-3')

SEQ ID NO：30F-KAPE-UL23del-SfiI***序列：(5'-CTGTGGCCTTATTGGCCGGGATCTGGAAC-3')

SEQ ID NO：31R-EcoRI-KAPEVAC-78350：(5'-GCGAATTCATGTGCTACGCCCAG-3')

SEQ ID NO：32F-SalI-VAC68400：(5'-CGGTCGACACTCCCAGGGGTGAAGC-3')

SEQ ID NO：33R-SfiI-UL26-27-***序列：(5'-CGGCCAATAAGGCCAAGAATGCATTCGGCC-3')

SEQ ID NO：34F-SfiI-UL26-27-***序列：(5'-TGGCCTTATTGGCCGCCGTATGAATTGCGC-3')

SEQ ID NO：35R-SacI-VAC69400：(5'-GCGAGCTCCTGCAACCACAGACCGC-3')

SEQ ID NO：36F-SalI-VAC21300：(5'-CGGTCGACATAGAACGCGCTTCATCTAA-3')

SEQ ID NO：37R-SfiI-UL45-46-***序列：(5'-TGGCCAATAAGGCCGTTTATTGTTTATTAT-3')

SEQ ID NO：38F-SfiI-UL45-46-***序列：(5'-CGGCCTTATTGGCCAATCTGATTCATCCAA-3')

SEQ ID NO：39R-SacI-VAC22300：(5'-GCGAGCTCCGCCTAATCACAATCGGTATTG-3')

SEQ ID NO：40F-SphI-VAC12000：(5'-CCGCATGCGCAACTATATATGTCGGTC-3')

SEQ ID NO：41R-SfiI-UL50-51-***序列：(5'-GGGCCAATAAGGCCCAAAAGTACATTTTGT-3')

SEQ ID NO：42F-SfiI-UL50-51-***序列：(5'-GGGCCTTATTGGCCCAATTTATTTACTATT-3')

SEQ ID NO：43R-EcoRI-VAC13000：(5'-GCGAATTCTGGATATGATATACCGTTGC-3')

序列表

<110> 法国诗华大药厂（CEVA SANTE ANIMALE）

<120> 鸭肠炎病毒及其用途

<130> B2270

<160> 43

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 1

ggcctggtga tgatggcggg atcgttgtat 30

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 2

ccatggtgct gcgctcagaa gaactcgtca 30

<210> 3

<211> 1319

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> rpsLneo

<400> 3

ggcctggtga tgatggcggg atcgttgtat atttcttgac accttttcgg catcgcccta 60

aaattcggcg tcctcatatt gtgtgaggac gttttattac gtgtttacga agcaaaagct 120

aaaaccagga gctatttaat ggcaacagtt aaccagctgg tacgcaaacc acgtgctcgc 180

aaagttgcga aaagcaacgt gcctgcgctg gaagcatgcc cgcaaaaacg tggcgtatgt 240

actcgtgtat atactaccac tcctaaaaaa ccgaactccg cgctgcgtaa agtatgccgt 300

gttcgtctga ctaacggttt cgaagtgact tcctacatcg gtggtgaagg tcacaacctg 360

caggagcact ccgtgatcct gatccgtggc ggtcgtgtta aagacctccc gggtgttcgt 420

taccacaccg tacgtggtgc gcttgactgc tccggcgtta aagaccgtaa gcaggctcgt 480

tccaagtatg gcgtgaagcg tcctaaggct taaggaggac aatcatgatt gaacaagatg 540

gattgcacgc aggttctccg gccgcttggg tggagaggct attcggctat gactgggcac 600

aacagacaat cggctgctct gatgccgccg tgttccggct gtcagcgcag gggcgcccgg 660

ttctttttgt caagaccgac ctgtccggtg ccctgaatga actgcaggac gaggcagcgc 720

ggctatcgtg gctggccacg acgggcgttc cttgcgcagc tgtgctcgac gttgtcactg 780

aagcgggaag ggactggctg ctattgggcg aagtgccggg gcaggatctc ctgtcatctc 840

accttgctcc tgccgagaaa gtatccatca tggctgatgc aatgcggcgg ctgcatacgc 900

ttgatccggc tacctgccca ttcgaccacc aagcgaaaca tcgcatcgag cgagcacgta 960

ctcggatgga agccggtctt gtcgatcagg atgatctgga cgaagagcat caggggctcg 1020

cgccagccga actgttcgcc aggctcaagg cgcgcatgcc cgacggcgag gatctcgtcg 1080

tgacccatgg cgatgcctgc ttgccgaata tcatggtgga aaatggccgc ttttctggat 1140

tcatcgactg tggccggctg ggtgtggcgg accgctatca ggacatagcg ttggctaccc 1200

gtgatattgc tgaagagctt ggcggcgaat gggctgaccg cttcctcgtg ctttacggta 1260

tcgccgctcc cgattcgcag cgcatcgcct tctatcgcct tcttgacgag ttcttctga 1319

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 4

acgagttctt ctgagcgcag caccatggcc 30

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 5

tcggaggagg ccatccttaa gagctgtaat 30

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 6

tacagctctt aaggatggcc tcctccgaga 30

<210> 7

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 7

gcagtgaaaa aaatgcttta tttgtgaaat 30

<210> 8

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 8

atggcaacaa tgatagctgt ggtgttagtt tttttgggac gcgttttagg ggcctggtga 60

tgatggcggg 70

<210> 9

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 9

ttaaactaat ggaacgcgtt ggaatttcaa gtcttggcgc ccaaacatcg gcagtgaaaa 60

aaatgcttta 70

<210> 10

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 10

atgtatacag acgttacggt catgtgggta gccgtgattt tatttactat ggcctggtga 60

tgatggcggg 70

<210> 11

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 11

tcataccata caaaggcata ggtacagccc acaggttaaa aacaaagaaa gcagtgaaaa 60

aaatgcttta 70

<210> 12

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 12

aagtgtataa attagacaag tagctatgcg 30

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 13

tcagaagaac tcgtcaagaa ggc 23

<210> 14

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 14

gtttatattg acgcggaatg ttgac 25

<210> 15

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 15

cattttaacc gtttaagtca acattccgc 29

<210> 16

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 16

actgagatgt tggaccatca aatcctg 27

<210> 17

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 17

gcgcatgcta gctgatctaa ctttac 26

<210> 18

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 18

ggtggccaat aaggcctgac ggcaatatgt 30

<210> 19

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 19

tcaggcctta ttggccacca gctacacaag 30

<210> 20

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 20

gcgaattcga ttaattctcc cgaactgttg 30

<210> 21

<211> 1506

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 启动子

<400> 21

tgcagctcag tgcatgcacg ctcattgccc atcgctatcc ctgcctctcc tgctggcgct 60

ccccgggagg tgacttcaag gggaccgcag gaccacctcg ggggtggggg gagggctgca 120

cacgcggacc ccgctccccc tccccaacaa agcactgtgg aatcaaaaag gggggagggg 180

ggatggaggg gcgcgtcaca cccccgcccc acaccctcac ctcgaggtga gccccacgtt 240

ctgcttcact ctccccatct cccccccctc cccaccccca attttgtatt tatttatttt 300

ttaattattt tgtgcagcga tgggggcggg gggggggggg gcgcgcgcca ggcggggcgg 360

ggcggggcca ggggcggggc ggggcgaggc ggagaggtgc ggcggcagcc aatcagagcg 420

gcgcgctccg aaagtttcct tttatggcga ggcggcggcg gcggcggccc tataaaaagc 480

gaagcgcgcg gcgggcggga gtcgctgcgc gctgccttcg ccccgtgccc cgctccgccg 540

ccgcctcgcg ccgcccgccc cggctctgac tgaccgcgtt actcccacag gtgagcgggc 600

gggacggccc ttctcctccg ggctgtaatt agcgcttggt ttaatgacgg ctcgtttctt 660

ttctgtggct gcgtgaaagc cttaaagggc tccgggaggg ccctttgtgc gggggggagc 720

ggctcggggg gtgcgtgcgt gtgtgtgtgc gtggggagcg ccgcgtgcgg ctccgcgctg 780

cccggcggct gtgagcgctg cgggcgcggc gcggggcttt gtgcgctccg cagtgtgcgc 840

gaggggagcg cggccggggg cggtgccccg cggtgcgggg ggggctgcga ggggaacaaa 900

ggctgcgtgc ggggtgtgtg cgtggggggg tgagcagggg gtgtgggcgc ggcggtcggg 960

ctgtaacccc cccctgcacc cccctccccg aagttgctga gcacggcccg gcttcgggtg 1020

cggggctccg tgcggggcgt ggcgcggggc tcgccgtgcc gggcgggggg tggcggcagg 1080

tgggggtgcc gggcggggcg gggccgcctc gggccgggga gggctcgggg gaggggcgcg 1140

gcggcccccg gagcgccggc ggctgtcgag gcgcggcgag ccgcagccat tgccttttat 1200

ggtaatcgtg cgagagggcg cagggacttc ctttgtccca aatctgtgcg gagccgaaat 1260

ctgggaggcg ccgccgcacc ccctctagcg ggcgcggggc gaagcggtgc ggcgccggca 1320

ggaaggaaat gggcggggag ggccttcgtg cgtcgccgcg ccgccgtccc cttctccatc 1380

tccagcctcg gggctgtccg cagggggacg gctgccttcg ggggggacgg ggcagggcgg 1440

ggttcggctt ctggcgtgtg accggcgggg tttatatctt cccttctctg ttcctccgca 1500

gccccc 1506

<210> 22

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 22

gtccactatg ccatgacata ggtg 24

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 23

gagcaacttc gagctgatcc 20

<210> 24

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 24

gccagggaat ccagggaaaa agac 24

<210> 25

<211> 274

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 启动子

<400> 25

tattttgtgc agcgatgggg gcgggggggg ggggggcgcg cgccaggcgg ggcggggcgg 60

ggcgaggggc ggggcggggc gaggcggaga ggtgcggcgg cagccaatca gagcggcgcg 120

ctccgaaagt ttccttttat ggcgaggcgg cggcggcggc ggccctataa aaagcgaagc 180

gcgcggcggg cgggagtcgc tgcgcgctgc cttcgccccg tgccccgctc cgccgccgcc 240

tcgcgccgcc cgccccggct ctgactgacc gcgt 274

<210> 26

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 26

gcttgtgtag ctggttgacg gcaatatg 28

<210> 27

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 27

catattgccg tcaaccagct acacaagc 28

<210> 28

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 28

gcgcatgcca attgtctaat tccag 25

<210> 29

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 29

cccggccaat aaggccacag aaaaagcgcg 30

<210> 30

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 30

ctgtggcctt attggccggg atctggaac 29

<210> 31

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 31

gcgaattcat gtgctacgcc cag 23

<210> 32

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 32

cggtcgacac tcccaggggt gaagc 25

<210> 33

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 33

cggccaataa ggccaagaat gcattcggcc 30

<210> 34

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 34

tggccttatt ggccgccgta tgaattgcgc 30

<210> 35

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 35

gcgagctcct gcaaccacag accgc 25

<210> 36

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 36

cggtcgacat agaacgcgct tcatctaa 28

<210> 37

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 37

tggccaataa ggccgtttat tgtttattat 30

<210> 38

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 38

cggccttatt ggccaatctg attcatccaa 30

<210> 39

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 39

gcgagctccg cctaatcaca atcggtattg 30

<210> 40

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 40

ccgcatgcgc aactatatat gtcggtc 27

<210> 41

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 41

gggccaataa ggcccaaaag tacattttgt 30

<210> 42

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 42

gggccttatt ggcccaattt atttactatt 30

<210> 43

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 43

gcgaattctg gatatgatat accgttgc 28

Claims (25)

1.一种鸭肠炎病毒(DEV)，其中所述病毒具有无活性的US4和US5基因，并且其中所述病毒包含如下核苷酸区域的缺失，所述核苷酸区域包含所述US4基因的至少50％、所述US4基因和所述US5基因之间的基因间区域的全部和所述US5基因的至少50％。

2.根据权利要求1所述的DEV，其中所述病毒还包含无活性的UL23、US7和/或UL4基因。

3.根据权利要求2所述的DEV，其中所述病毒包含所述UL23基因序列的至少50％的缺失。

4.根据权利要求2所述的DEV，其中所述病毒包含所述US7基因序列的至少50％的缺失。

5.根据权利要求2所述的DEV，其中所述病毒包含所述UL4基因序列的至少50％的缺失。

6.根据权利要求1所述的DEV，所述DEV还包含外源核酸。

7.根据权利要求6所述的DEV，其中所述外源核酸被安置在所述无活性的US4或US5基因中。

8.根据权利要求7所述的DEV，其中所述外源核酸被安置成代替所述缺失区域。

9.根据权利要求6所述的DEV，其中所述外源核酸被安置在选自以下的***位点中：UL4基因、UL44基因、UL27-UL26基因间区域、UL23基因、UL45-UL46基因间区域、UL50-UL51基因间区域、US7基因、US7-US8基因间区域或US10基因。

10.根据权利要求6至9中任一项所述的DEV，其中所述外源核酸编码抗原或免疫刺激分子。

11.根据权利要求10所述的DEV，其中所述外源核酸编码来自禽类病原体的抗原。

12.根据权利要求10所述的DEV，其中所述抗原选自禽副粘病毒1型的抗原性蛋白质或肽，甘保罗病病毒的抗原肽，传染性喉气管炎病毒(ILTV)的抗原肽，鸡败血支原体(Mycoplasma galisepticum)的抗原肽，以及禽流感病毒的抗原肽。

13.根据权利要求12所述的DEV，其中所述抗原选自新城疫病毒(NDV)的F蛋白，传染性法氏囊病病毒(IBDV)的VP2蛋白，传染性喉气管炎病毒(ILTV)的gB蛋白，鸡败血支原体的40K蛋白，以及禽流感病毒的表面蛋白质血凝素(HA)。

14.根据权利要求12所述的DEV，其中所述抗原是IBDV的VP2蛋白，或禽流感病毒的血凝素(HA)蛋白。

15.一种核酸分子，其包含根据权利要求1至14中任一项所述的DEV的基因组。

16.一种宿主细胞，其包含根据权利要求1至14中任一项所述的DEV或根据权利要求15所述的核酸分子。

17.一种用于产生或复制根据权利要求1至14中任一项所述的DEV的方法，所述方法包含用根据权利要求15所述的核酸分子或用根据权利要求1至14中任一项所述的DEV感染感受态细胞，和收集所述DEV。

18.根据权利要求1至14中任一项所述的DEV或根据权利要求15所述的核酸在制备用于对家禽进行疫苗接种的疫苗中的用途。

19.根据权利要求18所述的用途，其中所述疫苗用于在家禽中诱导保护性免疫。

20.根据权利要求18或19所述的用途，其中所述家禽是鸡。

21.根据权利要求18或19所述的用途，其中所述DEV通过注射来施用。

22.根据权利要求18或19所述的用途，其中所述DEV被卵内施用或在孵化后第1天或第2天施用。

23.一种组合物，其包含根据权利要求1至14中任一项所述的DEV、根据权利要求15所述的核酸或根据权利要求16所述的宿主细胞以及药学上或兽医学上可接受的赋形剂或载体。

24.根据权利要求23所述的组合物，其还包含佐剂。

25.一种用于对禽类进行免疫接种的疫苗接种试剂盒，所述试剂盒包含以下组分：

a.有效量的根据权利要求23或24所述的组合物，和

b.用于向所述禽类施用所述组合物的构件。

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