CN113337468B - 一种双功能化外泌体及其制备方法和在脑卒中修复的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种双功能化外泌体及其制备方法和在脑卒中修复的应用。本发明首先通过酰胺化反应，分别对DA7R多肽和SDF‑1因子进行叠氮化基团修饰；其次通过琥珀酰亚胺和氨基的加成反应在外泌体表面引入DBCO基团构建DBCO‑外泌体；最终通过无铜点击化学法构建DA7R‑SDF‑1双修饰的功能化外泌体。通过本发明方法获得的双功能化外泌体表现出对卒中部位损伤血管的靶向性和募集神经干细胞的特性，从而增强其诱导神经干细胞向神经元定向分化的能力，最终通过“一体多功能”的外泌体实现神经修复。本发明为基于外泌体的中枢神经***损伤治疗和功能化外来体的合理设计铺平了道路。

Description

一种双功能化外泌体及其制备方法和在脑卒中修复的应用
技术领域
本发明属于生物载体靶向递药技术领域，具体涉及一种双功能化外泌体及其制备方法和在脑卒中修复的应用。
背景技术
中枢神经***损伤(如卒中、创伤性脑损伤、脊髓神经损伤等)常常难以治愈，极易导致人体长期残疾，严重影响了患者的生活质量。这主要是由于神经修复目前存在两大难点：神经元再生能力受限和星胶疤痕的形成。广大科研工作者对于中枢神经***损伤的修复展开了大量的研究，取得了一定的进展。
体外神经干细胞移植被广泛应用于神经修复治疗中，然而受到损伤微环境的影响，神经干细胞存活率低，且外源性干细胞移植还存在“癌变”、血栓和免疫排斥等风险。内源性神经干细胞虽然可规避细胞植入带来的风险，但是其向损伤区域的迁移数量有限，且极容易向星形胶质细胞分化，从而产生星胶疤痕，阻碍神经修复。此外，在实验动物模型中评估过的许多成功的药物疗法，如阿托伐他汀(atorvastatin)和罗素伐他汀(rosuvastatin)等他汀类药物可缓解损伤后的氧化应激反应，减少神经元的死亡。但是受到血脑屏障的限制，这些药物在中枢神经***的渗透率低于5％，无法实现高效的脑内定位递送。有研究者通过构建双多肽配体共修饰的脂质体同时实现跨血脑屏障和对损伤区神经元的靶向，有效抑制神经元的凋亡，然而，仍无法克服化学药物存在的毒副作用。因此，亟待寻求一种新的治疗策略，能够既对机体安全有效，又可实现定点递送，还能有效募集神经干细胞并诱导其向神经元定向分化，最终实现神经修复。
近年来，外泌体作为一种新型的无细胞替代疗法受到广泛的研究和关注。外泌体是由细胞分泌的具有完整膜结构的细胞外囊泡，可通过内含的RNA、蛋白质等活性分子调控细胞的功能及生物学行为，其作用与其母细胞的特性也息息相关。外泌体还具有良好的跨血脑屏障能力和生物相容性等特点。间充质干细胞分泌的外泌体能够有效地调节缺血性卒中后的神经元突触重塑和功能恢复，也具有对神经炎症的抑制作用，可有效保护受损区的神经元。然而，成熟神经元的固有再生能力有限，神经元再生主要依赖于神经干细胞，而间充质干细胞外泌体缺乏对神经干细胞向神经元分化的诱导能力。
M2小胶质细胞作为一类抑制神经炎症、促进神经修复的重要免疫细胞，其培养基被发现可促进神经干细胞向神经元分化，提示了其分泌的外泌体存在潜在促神经干分化能力。但是另一方面，神经干细胞由侧脑室产生并向损伤区迁移，由于迁移距离过长，导致其向损伤区迁移数量有限。因此，如何提高外泌体对神经干细胞的募集作用是目前亟待解决的问题，构建一种功能化的外泌体实现对神经干细胞的募集和分化作用，将能够有效地实现神经修复和再生。
全身给药后，由于外泌体易被肝、脾等脏器中的单核巨噬细胞***吞噬并快速清除，导致仅有极少量的外泌体能够到达病灶区，极大地限制了其临床应用。因此，寻找新的技术，对外泌体进行修饰改造，调控外泌体的体内行为，增加其对神经损伤区的靶向性，从而提高递送的有效性，将有望提高外泌体疗法在神经修复中的效果。有前期研究提出不同方式的外泌体的修饰方法，一是通过改造母细胞从而改造外泌体，但是改造方法复杂、成本大且基因改造可能带来潜在的伦理风险等；二是直接改造外泌体，比如通过穿膜法载药，脂溶性或两亲性材料直接进行疏水***，有研究者利用修饰了靶向抗体的PEG(聚乙二醇)化胶束，通过疏水插膜法，成功在外泌体表面引入PEG和靶向分子，增加了其体内循环时间，并实现了对肿瘤的靶向。但这种方法缺乏特异性和选择性。还有通过化学修饰法直接进行膜修饰，如采用含铜(I)点击化离子催化下，与含叠氮基团的荧光素共价连接，得到共价荧光标记的外泌体。但是Cu(I)离子的使用对细胞有毒性且会干扰蛋白活性。
综上所述，目前仍然需要寻求一种安全快捷的修饰方法，通过对外泌体进行特异性修饰以提高外泌体对损伤区域的靶向性，增强其对神经修复效果。
发明内容
本发明的目的就是为了解决上述技术问题，从而提供一种功能化外泌体及其制备方法和在脑卒中修复的应用。本发明提供的双功能化外泌体具有对卒中损伤血管的靶向性和募集神经干细胞的特性，能够增强其诱导神经干细胞向神经元定向分化的能力，最终实现神经修复。该双外泌体在体外能有效靶向HUVECs，募集NSCs，促进其神经分化。该双功能化外泌体还可改善短暂性大脑中动脉闭塞(tMCAO)后小鼠脑缺血区M2-Exo的积累，减少脑萎缩体积，促进神经行为恢复，增加神经发生。
本发明的目的之一是提供一种双功能化外泌体的制备方法，其包括以下步骤：
(1)BV2小胶质细胞的培养和极化
在DMEM培养基中培养BV2小胶质细胞，用IL-4处理细胞，使BV2向M2极化，得到M2-BV2细胞；
(2)外泌体分离
第一次超速离心收集消耗无外泌体的FBS血清用于配制含5％FBS血清的无外泌体DMEM培养基，用于培养M2-BV2细胞；随后取M2-BV2细胞培养上清，进行差速超速离心，除去细胞和细胞碎片；将外泌体重悬在PBS缓冲液中，进行第二次超速离心，然后再次悬浮在PBS缓冲液中低温保存以备后用；
(3)双功能化外泌体的构建
S1，将0.15mg/mL步骤(2)所得外泌体与PBS中的10μM二苯基环辛炔-四聚乙二醇-活性酯反应4h，超滤管离心(去除过量的二苯基环辛炔-四聚乙二醇-活性酯)；
S2，将12μL的64ng/μL叠氮-琥珀酰亚胺酯交联剂添加到PBS中的10μg SDF-1中，并在室温下反应4h，超滤管清洗(去除未结合的交联剂)；
S3，将S1和S2反应所得物和6.5μL浓度为5mM的叠氮-DA7R混合后于4℃反应过夜，超滤管离心(去除未修饰的配体)，得到纯化的双功能化外泌体，记为DA7R-SDF-1-Exo，重悬于PBS中进行低温(如-80℃)保存。
值得指出的是，在步骤(3)中，对于各物质用量的记载仅作为一个举例，本领域技术人员可以根据步骤(3)中的记载，对各物质的用量进行对应性的增减或减少调整，这种调整同样属于本发明的保护范围。
本发明提供的上述方法，是基于无铜点击化学法，通过环辛炔和叠氮的点击反应在M2-外泌体表面同时共修饰DA7R(一种逆序翻转的D构型多肽，可靶向血管)和SDF-1(基***衍生因子-1，可介导细胞迁移的趋化因子)，以此构建一种DA7R和SDF-1双功能化的外泌体(Dual-Exo)。试验结果表明，经过双修饰的外泌体表现出比其它未修饰和单独修饰的外泌体更好的神经损伤修复效果，通过本发明方法赋予了外泌体对卒中部位损伤血管的靶向性和募集神经干细胞的特性，从而增强其诱导神经干细胞向神经元定向分化的能力，最终通过“一体多功能”的外泌体实现更好地神经修复。
本发明的上述方法，首先，通过酰胺化反应，分别对DA7R多肽和SDF-1因子进行叠氮化基团修饰；其次，通过琥珀酰亚胺和氨基的加成反应在外泌体表面引入DBCO基团构建DBCO-外泌体；最终通过无铜点击化学法构建DA7R-SDF-1双修饰的功能化外泌体，并对其理化特性进行验证。通过体外细胞实验分别验证DA7R-SDF-1-Exo对干细胞的募集能力，对HUVEC细胞的靶向能力和诱导神经干细胞定向分化的潜能。通过构建tMCAO小鼠模型，验证其体内对卒中部位的靶向能力。最后通过神经行为学和免疫组化切片验证DA7R-SDF-1-Exo对小鼠神经修复的能力及机制。总之，本发明使M2-外泌体具有血管内皮细胞归巢和NSC募集的能力。该DA7R-SDF-1-Exo在缺血性中风后表现出改善的神经发生作用。
进一步的是，步骤(1)中所述DMEM培养基中含有10％胎牛血清和1％青霉素/链霉素混合物，所述DMEM培养基于37℃培养箱中培养。
进一步的是，步骤(1)中所述IL-4的使用浓度为20ng/mL，处理细胞的时间为48h。
进一步的是，步骤(2)中所述第一次超速离心的操作为在4℃下以100000g超速离心16h，所述第二次超速离心的操作为在4℃下以100000g超速离心70min。
进一步的是，步骤(2)中所述差速超速离心的步骤为：在4℃下，分别于300g离心10min，2000g离心10min，10000g离心30min，100000g离心70min。
进一步的是，步骤(3)中所述S1中超滤管离心的次数为4次，超滤管截留的分子量为10kDa，所述S3中超滤管离心的次数为4次，超滤管截留的分子量为3kDa。
进一步的是，步骤(3)中所述S2中超滤管清洗的次数为4次，超滤管截留的分子量为3kDa。
本发明的目的之二是提供一种由如上所述的制备方法得到的双功能化外泌体。该外泌体表现出具有血管内皮细胞归巢和NSC募集的能力，且在缺血性中风后表现出改善的神经发生作用。
本发明的目的之三是提供一种如上所述的双功能化外泌体的应用，其是将该双功能化外泌体用于中枢神经***损伤的修复，包括脑卒中、创伤性脑损伤或脊髓神经损伤，特别是将该双功能化外泌体用于脑卒中的修复。
本发明的有益效果如下：
(1)本发明基于无铜点击化学法，通过环辛炔和叠氮的点击反应在M2-外泌体表面同时共修饰DA7R(一种与血管结合的高亲和力肽)和SDF-1(基质细胞衍生因子)，构建得到了一种DA7R和SDF-1双功能化的外泌体(DA7R-SDF-1-Exo，Dual-Exo)，赋予了外泌体对卒中损伤血管的靶向性和募集神经干细胞的特性，从而增强其诱导神经干细胞向神经元定向分化的能力，最终通过“一体多功能”的外泌体实现神经修复；
(2)本发明的双功能化外泌体在体外能有效靶向HUVECs，募集NSCs，促进其神经分化。另外，DA7R和SDF-1修饰可改善短暂性大脑中动脉闭塞(tMCAO)后小鼠脑缺血区M2-Exo的积累，减少脑萎缩体积，促进神经行为恢复，增加神经发生。本发明为以外泌体为基础的中枢神经***损伤的***治疗提供了新思路。
附图说明
图1为Dual-Exo外泌体的分离、修饰和表征结果：(A)用20ng/mL IL-4诱导BV2小胶质细胞48小时，然后用Iba1(M0标记物)/CD206(M2标记物)或Iba1/Arg(M2标记物)进行双重免疫染色，比例尺，50μm；(B)Westernblot检测有或没有IL-4诱导的BV2细胞中CD206和Arg的表达；(C)通过无铜点击化学方法在M2-外泌体表面对DA7R和SDF-1进行双重修饰的示意图设计；(D)Dual-Exo的荧光图像，外泌体用Dil-red染色，DA7R用FITC标记，SDF-1用Cy5.5标记，比例尺1.0μm；通过NTA和TEM图像检测外泌体的形貌特征和粒径分布(E)M2-Exo和Dual-Exo(F)的大小分布，比例尺，100nm；(G)细胞裂解液、M2-Exo和Dual-Exo中外泌体标记物TSG101和CD63的蛋白质印迹分析。
图2为M2-Exo对NSC分化影响；(A)代表性荧光图片表示经不同制剂，包括PBS，M0-Exo，M2-Exo,Dual-Exo处理7天之后，NSC的分化为神经元(Tuj1+)和星胶细胞(GFAP+)的情况；(B)不同组NSC分化为Tuj1+细胞的百分比；(C)不同组NSC分化为GFAP+细胞的百分比，***p<0.001，比例尺，100μm。
图3为M2-Exo的生物信息学分析：与M0外泌体相比，差异表达的M2外泌体miRNA靶基因的GO富集分析(前30位)，富集得分反映了特定GO术语所分析基因的富集程度。
图4为HUVEC对不同外泌体的摄取水平及其对NSC的募集作用：(A)用0.25μM Exo，DA7R-Exo或Dual-Exo处理4h的HUVEC的共聚焦荧光图像，比例尺，10μm；(B)使用流式细胞仪定量分析被HUVEC摄取的外泌体的百分比；(C)外泌体诱导NSC跨孔迁移的示意图；(D)将NSCs接种在transwell上，用空白培养基，Exo，SDF-1-Exo和Dual-Exo处理48小时，用棉棒擦去transwell膜上侧未迁移的NSC细胞，随后DAPI染色标记迁移到tranwell膜的下侧的NSC，比例尺，200μm；(E)通过image J软件计算NSC迁移百分比，***p＜0.001，比例尺，200μm。
图5为Dual-Exo体内的缺血性脑靶向能力：(A)从tMCAO小鼠收集的大脑照片用于说明病变区域(左半球：同侧病变区域，右半球：对侧健康区域)；(B)在给药后2小时，从分别给予Cy5.5标记游离外泌体，DA7R-Exo和Dual-Exo的模型小鼠分离大脑的离体IVIS图像；(D)缺血性脑中荧光强度的半定量分析；(E)同侧与对侧区域中荧光信号的比率；给药后2小时，不同的Dil-红色标记的外泌体(红色)与CD31阳性血管内皮细胞(绿色)共定位于缺血区域的代表性图像(C)和统计分析(F)，n＝3，*p<0.05，***p<0.001，比例尺，25μm。
图6为Dual-Exo的治疗可减少缺血性脑卒中引起的脑萎缩体积，改善小鼠神经生物学功能的恢复；(A)tMCAO小鼠治疗示意图；(B)假手术组、PBS组、Exo组、DA7R-Exo组或Dual-Exo组分别在第1天、第3天、第5天、第7天分别给予不同剂型(20μg外泌体/次)，并在第14天取脑进行焦油紫染色，虚线表示梗死区域；(C)各组脑梗塞体积(n＝4～5)；(D)缺血再灌注后第1、3、7、14天的神经学评估；(E)tMCAO小鼠第14天的mNSS评分；(F)Rotarod试验；(G)悬钢丝试验，n＝8，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图7为Dual-Exo的治疗增强了tMCAO小鼠的神经发生：(A)NPC(Nestin阳性细胞，绿色)的代表性荧光图像；(B)在中风后14天，在缺血小鼠大脑的SVZ(顶部)或纹状体(底部)区域中用PBS，外来体，DA7R-Exo或Dual-Exo处理的组中的成神经细胞(DCX阳性细胞，绿色)迁移，DAPI(蓝色)：细胞核，比例尺，50μm；(C)SVZ区域中巢蛋白阳性细胞的相对积分密度(IntDen)，数据表示为PBS组的平均IntDen之比，定量分析同侧心室的SVZ(D)和纹状体(E)区域中的DCX+细胞；(F)DCX单元迁移距离，n＝3，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行具体描述，有必要指出的是，以下实施例仅仅用于对本发明进行解释和说明，并不用于限定本发明。本领域技术人员根据上述发明内容所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
实施方法例
一、BV2小胶质细胞培养、极化及鉴定
在37℃培养箱中，在含有10％FBS(胎牛血清)和1％青霉素链霉素的DMEM培养基中培养细胞。BV2向M2极化方法如下：用20ng/mL的IL-4(白细胞介素)处理BV2细胞48h，免疫荧光法检测Iba-1、CD206和ARG抗体。Westernblotting(免疫蛋白印迹)检测IL-4处理的BV2细胞和未处理的BV2细胞CD206和ARG的表达。
二、外泌体分离
首先，在4℃下以100000g超速离心16h收集消耗外泌体的FBS血清用于配制DMEM培养基。取M2-BV2细胞培养上清，于4℃差速超速离心，分别于300g离心10min，2000g离心10min，10000g离心30min，100000g离心70min进行离心操作，除去细胞和细胞碎片。最后，将外泌体重悬在PBS缓冲液中，在100000g下再次超速离心70min，然后再悬浮在PBS中进行进一步修饰和表征。
三、功能化外泌体的构建
采用无铜点击化学方法制备了双功能外泌体(记为DA7R-SDF-1-Exo)，其制备步骤如下：
首先，用杂双功能交联剂修饰外泌体表面的活性DBCO基团：在室温(R.T.)下，将0.15mg/ml外泌体与PBS中的10μM DBCO-PEG4-NHS反应4h，通过在超滤管中离心4次(10kDa)去除过量的DBCO-PEG4-NHS。
其次，通过SDF-1与NHS-N3的反应合成了叠氮化物修饰的SDF-1：将NHS-N3(12μL，64ng/μL)添加到PBS中的10μg SDF-1中，并在室温下反应4h。将未结合的NHS-N3用超滤管清洗4次(3kDa)。
最后，混合Exo-DBCO、SDF-1-N3和DA7R-N3，于4℃反应过夜，随后使用超滤管(3kDa)离心4次，去除未修饰的配体，得到纯化的DA7R-SDF-1-Exo，重悬于PBS中，-80℃保存。
为了评价SDF-1和DA7R是否成功结合在外泌体上，应用N3-Cy5.5-NHS标记SDF-1，DA7R-N3用FITC标记，外泌体用DiI-red染色。这些三重荧光标记的DA7R-SDF-1-Exo通过共焦激光扫描显微镜(CLSM)拍摄。
四、功能化外泌体的表征
用BCA蛋白检测试剂盒检测不同的外泌体，包括未修饰的外泌体、DA7R-Exo、SDF-1-Exo和Dual-Exo，并用western印迹法分析外泌体标记物肿瘤易感基因101(TSG101)和CD63，利用透射电镜(TEM，technai G2-spirtbiotwin，FEI，USA)观察外泌体的形态，将外泌体滴入碳包铜网格上1min，再用1％醋酸铀酰二水合物染色1min后进行观察，通过纳米颗粒跟踪分析(NTA)分析外泌体的粒径和颗粒数。
五、双标记外泌体上多肽量的计算
首先，在叠氮-DA7R上通过在C端引入赖氨酸用一个FITC标记。随后采用相同的无铜点击化学方法对N3-DA7R-FITC进行修饰。使用酶标仪绘制游离N3-DA7R-FITC的标准曲线，读取DA7R-Exo-FITX荧光强度，代入标准曲线，计算DA7R在外泌体中的浓度，并通过连接外泌体的粒子浓度来确定DA7R在外泌体上的数目。另外，SDF-1用ELISA试剂盒定量。
六、NSC(神经干细胞)培养、分化和迁移分析
NSC培养：NSC来源于出生后1天的ICR小鼠海马的两个半球。用胰蛋白酶消化细胞，然后在37℃的培养箱中用5％CO2悬浮于添加了1％B27、20ng/mL内皮生长因子(EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的正常DMEM-F12中。
NSC分化：将第一代神经干细胞接种于48孔板上，以2×105/mL的密度接种于增殖培养基中，培养2天。然后用分化培养基(神经细胞基础培养基、2％B27和1％100×谷氨酰胺)代替培养基，加入100ng/mLM0-Exo、M2-Exo或Dual-Exo。每隔2天交换一次培养基，第7天应用免疫荧光染色法(细胞核用DAPI，星形胶质细胞用GFAP，神经元用Tuj1)。应用image J软件计算NSC分化百分率。
为了评价Dual-Exom募集NSC迁移的能力，在孔径为8μm的transwell平板上每孔培养3×104个细胞。然后在transwell下室分别加入空白培养基、Exo、SDF-1-Exo或Dual-Exo。培养48小时后，丢弃培养基，用PBS洗涤细胞两次。然后用棉签完全擦拭细胞膜上侧的非迁移性神经干细胞，然后用DAPI染色细胞膜下侧的神经干细胞10分钟，最后用PBS洗涤细胞3次，并在倒置荧光显微镜下成像，以定量迁移的神经干细胞。用image J软件计数细胞，计算NSCs穿过细胞膜的数量(n＝3)。NSC迁移百分率为实验组迁移数与对照组的比值。
七、miRNAs靶基因的基因集富集分析
首先，分别用RT-PCR检测M2外泌体和M0外泌体的miRNA序列。然后，选择12个明显上调的miRNAs，并使用包括Targetscan(http://genes.mit.edu/targetscan.test/ucsc.html)，miRDB公司(http://mirdb.org/)和miRWalk(http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/)在内的三个数据库预测其潜在的靶向候选基因。然后，将三个数据库中的交叉基因进行整合，筛选出神经***相关基因。最后，进行GO富集分析，将预测的目标基因映射到GO数据库中(http://www.geneontology.org/)基于超几何分布和错误发现率校正，通过调整p＜0.05来定义显著丰富的GO项。
八、Dual-Exo对HUVECs的靶向性
为评价Dual-Exo对人脐静脉内皮细胞HUVECs的体外靶向性，首先将0.25μM Dil-red标记的外泌体、DA7R-Exo和Dual-Exo分别与HUVECs细胞在37℃孵育4h，随后。先用PBS洗涤HUVEC，用胰蛋白酶消化收集HUVEC，然后将细胞悬浮于PBS中进行流式细胞术检测，检测DiI阳性细胞百分率。
定性分析：将HUVEC细胞接种于24孔玻璃底培养皿(NEST BiotechnologyCo.Ltd)，37℃培养12h，用不同的外泌体培养基孵育4h，洗涤2次，用4％多聚甲醛固定15min，加入1μg/mL DAPI对细胞核进行染色后CLSM荧光成像。
九、tMCAO小鼠模型
动物实验按照上海交通大学机构动物护理与使用委员会批准的方案进行。选取成年雄性ICR小鼠(30-35g)用于构建tMCAO。首先仔细剥离颈总动脉、颈内动脉和颈外动脉，随后从颈外动脉向颈内动脉穿入6-0尼龙包硅缝合线，直达大脑中动脉起点。使用激光多普勒血流测量仪(Moor LAB；Moor Instruments，Devon，UK)监测血流。当脑血流量降低到基线的80％时，闭塞成功率即被确定。MCAO后90min拔除缝线再灌注，血流量恢复至基线的70％为再灌注成功。
十、Dual-Exo的体内生物分布
为探讨Dual-Exo在tMCAO模型小鼠脑内的定点递送效率，在缺血再灌注24小时后，分别向tMCAO模型小鼠静脉注射不同Cy5.5标记的外泌体，包括游离的exosomes、DA7R-Exo和Dual-Exo。2h后处死小鼠，先后用0.9％生理盐水和4％多聚甲醛灌流。然后使用IVIS光谱图像仪器采集器官进行成像，并利用Living图像软件进行半定量分析。
另外，静脉注射不同的外泌体(Exo、DA7R-Exo、Dual-Exo)2h或6h后进行免疫荧光测定，取脑组织进行CD31、GFAP、MAP2或Iba-1抗体染色。用imagej软件计算Dual-Exo与血管的共定位。
十一、体内神经生物学功能恢复试验
采用神经行为学实验评价Dual-Exo对神经修复的影响。tMCAO后1天，将小鼠随机分为4组(n＝8)，分别为PBS组、M2-Exo组、DA7R-Exo组和Dual-Exo组。分别在第1、3、5、7天对不同组小鼠进行给药，外泌体组的小鼠剂量为20μg。采用改良神经严重度评分法(mNSS)、Rotarod试验和悬丝试验等神经行为学方法对小鼠的中风程度、运动协调性、耐力和肌力进行评价。对于mNSS的评估，小鼠被分为0-14级(正常评分为0，最大缺陷评分为14)，评分越高，表现越差。对于Rotarod试验，将小鼠置于旋转杆上，记录小鼠在旋转杆上的持续时间。通过重复3次评估平均持续时间。对于悬棒实验，将小鼠前肢置于金属丝上，记录其到达左侧或右侧终点的时间，基本分数是10分，如果老鼠到达终点，加1分，如果小鼠掉落，则减一分。
十二、脑梗死体积估计
在tMCAO手术后第14天将小鼠安乐死，取大脑，将其冠状切成30μm，并用0.05％的间苯二酚乙酸紫酯染色。随后，使用Image J软件测量同侧和对侧半球的面积，通过从对侧半球的面积中减去同侧半球的面积，然后根据以下公式乘以截面间隔厚度来计算梗塞体积：
V＝Σh/3[ΔSn+(ΔSn*ΔSn+1)1/2+ΔSn+1]。
其中，V：体积，h：两个相邻部分之间的距离，ΔSn和ΔSn+1：两个相邻部分之间的面积。
十三、免疫荧光染色
采用免疫组化方法，用1％Triton-X孵育10min，然后用1％BSA封闭60min。随后分别用不同的一抗孵育，然后与一抗DCX(1：200)或Nestin(1：200)4℃孵育过夜。然后将二抗AlexFluor 488驴抗兔(1：500)用于DCX，AlexFluor488驴抗小鼠(1：500)用于Nestin。通过计算侧脑室或纹状体中每组切片的3个随机视野的荧光密度的强度来进行统计分析。
实验结果例
一、Dual-Exo的制备与表征
首先用IL-4处理BV2小胶质细胞，诱导其向M2型极化，随后通过免疫荧光和western blot检测M2型小胶质细胞标记物ARG和CD206。如图1A和1B所示，IL-4处理后，M2小胶质细胞中检ARG和CD206的表达相比未经IL-4处理的M0小胶质细胞明显增加。随后收集M2小胶质细胞培养基，从中分离提纯外泌体(M2-Exo)进行进一步修饰。
采用无铜点击化学法，将DA7R和SDF-1修饰在M2-Exo表面(图1C)。首先，利用链接剂DBCO-PEG4-NHS与外泌体膜蛋白上的氨基共价结合，在外泌体表面引入DBCO基团。然后，将DBCO-外泌体与SDF-1-N3和DA7R-N3结合形成稳定的***键。为了验证SDF-1和DA7R成功修饰在外泌体表面，我们使用了三种不同的荧光染料进行标记：Cy5.5标记SDF-1，FITC标记DA7R，DiI标记外体。荧光结果显示，三种染料可共定位，表明SDF-1、DA7R和外泌体的共定位(图1D)。用DA7R-FITC荧光标准曲线计算DA7R在外泌体上的含量，用Elisa试剂盒测定SDF-1的浓度。结果表明，1mg/ml修饰的外泌体平均含有45.4μg/ml DA7R和9.46μg/mLSDF-1。
此外，通过透射电镜和NTA对未修饰的外泌体、DA7R-外泌体、SDF-1-外泌体和双标记外泌体的形态进行了表征。结果显示，所有外泌体均为杯形，平均直径为120nm，表明双重修饰对外泌体的形状和直径没有显著改变(图1E-1F)。此外，westernblot分析结果显示，外泌体标记物TSG101和CD63在M2-Exo和Dual-Exo中明显表达，但在M2-BV2细胞裂解中未检测到(图1G)，表明外泌体提纯成功，且双多肽的修饰不影响外泌体标记物的表达。
二、Dual-Exo促进神经干向神经元的分化
观察M2-Exo和Dual-Exo诱导NSC向神经元分化的作用，并与魏经IL-4极化的小胶质细胞来源的外泌体(M0-Exo)进行比较。如图2所示，9.4±0.15％的NSC经Dual-Exo处理后分化为神经元(Tuj1阳性细胞)，与未修饰的M2-Exo相似(9.6±1.3％)，显著高于M0-Exo处理组(3.1±1.6％)和对照组(3.8±0.29％)。此外，经Dual-Exo处理后，只有小部分(29.0±4.3％)的NSC向星形胶质细胞(GFAP阳性细胞)分化，而经空白培养基或M0-Exo处理的NSC有80％以上向星形胶质细胞分化(图2C)。这些结果表明M2-Exo能促进NSC的神经元分化。DA7R和SDF-1的双重修饰不影响外泌体对NSCs的分化作用。
为了研究M2-外泌体对NSC分化的潜在机制，根据此前PCR研究结果对M0-Exo和M2-Exo的研究，将其中上调的miRNA序列的的预测靶基因进行了GO富集分析，从中筛选出与神经***有关的所有目标基因并进行GO富集分析。如图3所示，对NSC分化和神经元发育的负调控是排名前30位的最高富集途径。由于miRNA通过负调控其靶基因发挥其功能，因此GO结果表明M2-Exo有潜力通过丰富的miRNA促进NSC分化为神经元，这可以部分解释NSC分化测定的结果。
三、Dual-Exo的血管靶向性和神经干细胞募集效应
为评价DA7R肽对血管靶向性的影响，将不同DiI标记的Exo、DA7R-Exo和Dual-Exo分别与HUVECs孵育4h，然后使用荧光显微镜和流式细胞仪检测外泌体内在化的水平细胞计数。先前的研究已经证明DA7R肽与在HUVEC中高表达的VEGFR2保持高结合亲和力，FAM标记的DA7R肽可以被HUVEC有效内化。DA7R在外泌体上的修饰被认为可以增强HUVEC对其的摄取。共聚焦荧光图像的定量显示，当用DA7R肽修饰外泌体时，外泌体摄取的效率从78.3％增加到89.5％(图4A-4B)，表明DA7R修饰的外泌体显示出对HUVEC更高的靶向能力。出人意料的是，外泌体上SDF-1的修饰进一步增强了HUVEC对Dual-Exo的摄取水平，这可能归因于HUVEC中表达的C-X-C趋化因子受体4/7(CXCR4/CXCR7)，两者均为SDF-1受体。
SDF-1是一类介导细胞迁移的趋化因子，可在神经损伤期间有效诱导NSC迁移至病变部位，因此进行了Transwell分析以评估SDF-1修饰的外泌体是否仍能促进神经元的迁移。如图4C所示，在上腔室中培养NSC，并在下腔室中以100ng/ml的SDF-1浓度用空白培养基，M2-Exo，SDF-1-Exo或Dual-Exo处理。孵育48小时后，将室膜下侧的NSC用DAPI染色，并对细胞数进行计数和比较。在图4D和4E中，与对照组相比，M2-Exo组中的NSC迁移比例相似，而SDF-1-Exo组中的NSC迁移比例显着更高(2.9倍，p<0.001)或Dual-Exo(3.4倍，p<0.001)。以上结果表明，SDF-1的修饰赋予外泌体增强NSC迁移的能力。此外，DA7R的修饰没有影响SDF-1的迁移潜力。
四、Dual-Exo在tMCAO模型小鼠体内的分布
为了评估Dual-Exo在体内对缺血性卒中模型鼠的脑靶向性，先用近红外染料Cy5.5标记游离Exo，DA7R-Exo和Dual-Exo，然后分别通过尾静脉将其全身注射到tMCAO小鼠中(缺血再灌注24h后)。给药2小时后安乐处死小鼠并解剖脑用于IVIS成像。典型的病变区域标记为同侧区域，而匹配的非缺血区域称为对侧区域(图5A)。与游离外泌体相比，在Dual-Exo和DA7R-Exo组脑中观察到了明显的荧光信号，并且平均荧光强度也高于游离外泌体(图5B和5D)。此外，Dual-Exo和DA7R-Exo主要积累在同侧部位(图5E)。这些可能是由于中风后脑内皮细胞中的VEGFR2高度上调以及DA7R与VEGFR2的高结合亲和力。这些结果表明，DA7R修饰显著提高了外泌体对缺血区域的靶向性。
进一步检查了心脏，肝脏，肺脏，脾脏和肾脏中的离体荧光信号。与未修饰的外泌体相比，DA7R修饰的外泌体在肝脏中的分布增加，但在肾脏中的分布减少，这也可能归因于肝内皮细胞中VEGFR2的表达。但是，在心脏，脾脏和肺部的外泌体生物分布没有差异。这些结果表明，修饰DA7R后可能改变外泌体的清除方式。
五、Dual-Exo外泌体在缺血性病变部位的定位
为了研究中风后Dual-Exo对脑血管的共定位效率，在tMCAO后24小时将Cy5.5标记的游离外泌体，DA7R-Exo或Dual-Exo静脉内注射到中风小鼠中。然后在注射后2小时处死小鼠分离大脑用于免疫荧光测定。如图5C和5F所示，Dual-Exo明显积累在患侧，约58％与CD31标记的血管共定位，显著高于未修饰的外泌体(≈14.9％)，与DA7R-Exo相似(≈48.8％)。有趣的是，在血液循环6小时后，观察到与血管共定位的Dual-Exo明显减少，但出现在附近的脑细胞中。这些结果证明，Dual-Exo可以有效靶向内皮细胞，穿透血管并在缺血性半球中积累。
此外，还检测了其他不同类型的脑细胞，包括小胶质细胞(Iba1+细胞)、神经元(MAP2+细胞)和星形胶质细胞(GFAP+细胞)对Dual-Exo的内化情况。Dual-Exo也可能被所有这三种类型的细胞摄取，这可能归因于不同的外泌体摄取机制，包括受体介导的内吞作用、脂质筏、巨胞饮作用或微胞饮作用。
六、Dual-Exo治疗促进脑卒中后小鼠的神经再生
为了评估用Dual-Exo治疗的tMCAO小鼠的神经功能恢复，在中风后第1、3、5、7和14天进行了行为测试(图6A)。如图6D-6E所示，与卒中后第14天的PBS，Exo组相比，Dual-Exo组的神经学评分逐渐降低，并最终显着降低。此外，与PBS，Exo和DA7R-Exo组相比，Dual-Exo和DA7R-Exo组在转棒实验和悬挂测试中均表现出更好的性能(图6F-6G)。这些结果表明，Dual-Exo处理可增强tMCAO小鼠的神经功能恢复。
随后，使用Cresyl紫染色检查了缺血后第14天的脑梗塞体积。如图6B-6C所示，与DA7R-Exo(11.2±2.05mm3)，Exo(19.6±4.4mm3)和PBS(24.9±4.10mm3)相比，Dual-Exo组将脑萎缩量大幅减少至5.26±1.16mm3。这表明用DA7R和SDF-1功能化的外泌体大大增强了外泌体对缺血性中风的治疗作用。
为了进一步验证双重修饰的外泌体对NSC募集和神经发生的影响，通过对Nestin和DCX染色进行免疫荧光测定，分别指示神经元前体细胞(NPC)和迁移的迁移的成神经母细胞。如图7A和7C所示，与其他组相比，用Dual-Exo处理的侧脑室(SVZ)区域中的Nestin阳性细胞显著增加，表明Dual-Exo处理刺激了NPC的活化。与其他组相比，在包括SVZ和纹状体区域在内的梗塞区域，DCX阳性细胞的数量显著增加(图7B，7D-7E)。此外，Dual-Exo组中成神经母细胞从SVZ到纹状体的迁移距离大大延长(图7F)，这归因于SDF-1对神经干的募集。这些结果表明，修饰DA7R和SDF-1的外泌体可增强其在缺血区域的蓄积，NSC的募集能力，并最终促进神经发生。
总体而言，本发明首次证明了M2小胶质细胞来源的外泌体具有诱导NSC分化为神经元的潜力。此外，本发明通过无铜点击化学反应设计了DA7R肽和SDF-1细胞因子修饰的M2-外泌体，使M2-外泌体具有血管内皮细胞归巢和NSC募集的能力。该DA7R-SDF-1-Exo在缺血性中风后表现出改善的神经发生作用。本发明的工作为基于外泌体的中枢神经***损伤治疗和功能化外来体的合理设计铺平了道路。

Claims (10)

1.一种双功能化外泌体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）BV2小胶质细胞的培养和极化
在DMEM培养基中培养BV2小胶质细胞，用IL-4处理细胞，使BV2向M2极化，得到M2-BV2细胞；
（2）外泌体分离
第一次超速离心收集无外泌体的FBS血清用于配制含5%FBS血清的无外泌体DMEM培养基，用于培养M2-BV2细胞；随后取M2-BV2细胞培养基，进行差速超速离心，除去细胞和细胞碎片；将外泌体重悬在PBS缓冲液中，进行第二次超速离心，然后再次悬浮在PBS缓冲液中低温保存以备后用；
（3）双功能化外泌体的构建
S1，将0.15 mg/mL步骤（2）所得外泌体与溶于PBS中的10 μM二苯基环辛炔-四聚乙二醇-活性酯反应4 h，超滤管离心；
S2，将12 μL的64 ng/μL叠氮-琥珀酰亚胺酯交联剂添加到溶于PBS中的10 μg SDF-1中反应4 h，超滤管清洗得到叠氮-SDF-1；
S3，将S1和S2反应所得物和6.5μL 浓度为5mM的叠氮-DA7R混合后于4℃反应过夜，超滤管离心后得到纯化的双功能化外泌体，记为DA7R-SDF-1-Exo，重悬于PBS中进行低温保存。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述DMEM培养基中含有10%胎牛血清和1%的青霉素与链霉素的混合物，所述DMEM培养基于37℃培养箱中培养。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述IL-4的使用浓度为20ng/mL，处理细胞的时间为48 h。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述第一次超速离心的操作为在4 ℃下以100000 g超速离心16 h，所述第二次超速离心的操作为在4 ℃下以100000g超速离心70 min。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述差速超速离心的步骤为：在4 ℃下，分别于300 g离心10 min，2000 g离心10 min，10000 g离心30 min，100000 g离心70 min。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中所述S1中超滤管离心的次数为4次，超滤管截留的分子量为10 kDa，所述S3中超滤管离心的次数为4次，超滤管截留的分子量为3 kDa。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中所述S2中超滤管清洗的次数为4次，超滤管截留的分子量为3 kDa。
8.一种由权利要求1-7任一项所述的制备方法得到的双功能化外泌体。
9.一种如权利要求8所述的双功能化外泌体的应用，其特征在于，是将该双功能化外泌体用于制备中枢神经***损伤修复方面的药物。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述中枢神经***损伤包括脑卒中、创伤性脑损伤或脊髓神经损伤。
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