CN113337448B - 一种柠檬酸杆菌及其在防治金龟子中的应用 - Google Patents

一种柠檬酸杆菌及其在防治金龟子中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种柠檬酸杆菌及其在防治金龟子中的应用。所述柠檬酸杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.22672。

Description

一种柠檬酸杆菌及其在防治金龟子中的应用
技术领域
本发明涉及一种柠檬酸杆菌，特别是其可以用于防治金龟子。
背景技术
柠檬酸杆菌(Citrobacter)也称枸橼酸杆菌，1932年首次提出，属于肠杆菌科。柠檬酸杆菌直径约1.0μm，长2.0-6.0μm，是一类革兰氏阴性、杆状、无鞭毛、利用柠檬酸盐作为其碳源，发酵葡萄糖和碳水化合物并产酸产气的兼性厌氧菌。随着DNA杂交技术的发展，柠檬杆菌属由原先的3个种发展到目前11个种，已知柠檬酸杆菌在37℃环境生长最佳，常见于动物和人类的水、土壤、食道和肠道，虽然有些菌株可引起泌尿道感染、败血症和婴儿脑膜炎，但并不认为其是人类疾病的重要病原体，而被认为是条件致病菌。柠檬酸杆菌具有吸附Cd2+和重金属铀的能力，吸附能力受pH、菌体浓度及质子浓度的影响。柠檬酸杆菌属通过一些酶释放磷酸基团然后合成磷酸盐的形式富集重金属。杨丽平等人分离出一株在厌氧和微氧条件下具有硫酸盐还原功能的柠檬酸杆菌，同时可利用硫酸盐还原功能特异性基因引物扩增到异化亚硫酸盐还原酶基因。孙晶等人分离到具有烷烃降解功能的柠檬酸杆菌。
柠檬酸杆菌更多有益功能有待开发。
发明内容
本发明之一提供了一种柠檬酸杆菌(Citrobacter sp.)，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.22672。
本发明之二提供了一种工程菌，其通过对如本发明之一所述的柠檬酸杆菌进行遗传改良后得到。其中，由于该工程菌是以本发明的柠檬酸杆菌CGMCC No.22672为靶标，而且采取的手段一般是向其中转入和/或敲除特定的基因和/或DNA片段等，因此，该工程菌仍然为柠檬酸杆菌。另外，该工程菌可以为提高了对金龟子害虫活性的工程菌。还可以为兼具其他病虫害活性和/或被赋予了其他有益特性的工程菌株。
在一个具体实施方式中，所述工程菌通过向所述柠檬酸杆菌转化携带抗病基和/或抗虫基因的质粒得到。
本发明之三提供了一种组合物，其包括如发明之一所述的柠檬酸杆菌或如发明之二所述的工程菌，和可接受的载体。
本发明之四提供了根据本发明之一所述的柠檬酸杆菌、本发明之二所述的工程菌或本发明之三所述的组合物在用于防治金龟子(Scarabaeidae)中的应用。
在一个具体实施方式中，所述金龟子为鳃金龟(Holotrichia)和/或星花金龟(Protaetia)。
在一个具体实施方式中，所述鳃金龟(Holotrichia)为暗黑鳃金龟(Holotrichiaparallela)和/或大黑鳃金龟(Holotrichia oblita)；所述星花金龟(Protaetia)为白星花金龟(Protaetia brevitarsis)。
在一个具体实施方式中，所述金龟子(Scarabaeidae)为幼虫期金龟子。
在一个具体实施方式中，所述鳃金龟(Holotrichia)为幼虫期鳃金龟(Holotrichia)；所述星花金龟(Protaetia)为幼虫期星花金龟(Protaetia)。
在一个具体实施方式中，所述暗黑鳃金龟(Holotrichia parallela)为幼虫期暗黑鳃金龟(Holotrichia parallela)；所述大黑鳃金龟(Holotrichia oblita)为幼虫期大黑鳃金龟(Holotrichia oblita)；所述白星花金龟(Protaetia brevitarsis)为幼虫期白星花金龟(Protaetia brevitarsis)。
本发明的有益效果：
本发明首次发现柠檬酸杆菌中存在对金龟子有杀虫活性的菌株。这不但拓宽了柠檬酸杆菌的用途，也拓宽了防治金龟子的手段。此外，由于是首次发现柠檬酸杆菌对金龟子具有杀虫活性，在分类地位上，其与苏云金芽胞杆菌等已知微生物属于不同的属，因此，其杀虫机理会与现有技术中的杀虫微生物或杀虫物质有所不同，这将有利于有害生物的抗性治理。
附图说明
图1为IPPBiotC41菌株基于16S rDNA的***发育树。
菌种保藏
本发明筛选的柠檬酸杆菌被定名为IPPBiotC41，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.22672，保藏日期为2021年06月07日，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。其***分类为Citrobacter sp.。
具体实施方式
以下通过优选的实施案例的形式对本发明的上述内容作进一步的详细说明，但其不构成对本发明的限制。
如无特别说明，本发明的实施例中的试剂均可通过商业途径购买。
引物由生工生物工程北京分公司合成部合成，测序由中国农业科学院农作物基因资源与基因改良国家重大科学工程开放实验室完成，生化及分子生物学试剂均为市售分析纯。
TSB培养基购自sigma，货号为T8907-1KG。
实施例1
菌株的分离与分类鉴定
1.1田间花生种植与蛴螬接种
在河北廊坊实验基地试验田选取1亩地种植花生，在播种前选取五点在田间深埋304不锈钢网箱以限制后续接种的蛴螬向周边扩散。播种时，每穴播种3粒花生种子，每3天浇一次水。在花生结荚期接种已经饥饿处理48h的暗黑鳃金龟三龄幼虫，每个网箱15头，在接种暗黑鳃金龟幼虫后的7d时取样，每个网箱点3个重复采集花生根际土。
1.2田间根际土壤采集及处理
花生根际土采集及处理如下：
完整取出花生根系，抖落花生根上的非根际土，仅留下与根表距离<1mm的根际土，用无菌剪刀剪下带有根际土的花生根系，将根系放至无菌的50mL离心管中，加入1×PBS缓冲液，直至没过整个花生根系，浸泡静置15min后，涡旋震荡15S，将花生根系取出后，用100目筛过滤掉根际土壤悬液中的须根、杂质等，然后离心3200g，15min，在去掉部分上清后，用留下的5mL上清重新悬浮离心沉淀物(根际土)，得到根际土壤悬液。将该根际土壤悬液用于根际细菌的分离。
1.3根际可培养细菌的分离
参照Bai等人的文章(Bai et al.,2015)，使用TSB根际细菌分离培养基对根际土壤悬液中的可培养细菌进行分离：将根际土壤悬液进行10倍梯度稀释，选取稀释107、108、109三个梯度进行涂板，每个重复涂40μL土壤悬液，于30℃恒温培养箱中培养1天，1个平板计作1个重复，每个梯度3个重复。一周后，发现稀释至103时，每个平板上生长的菌落量较大，且十分密集，难以挑取单菌落进行再次培养；稀释至105时，每个平板上生长的菌落过少；只有稀释至104时，每个平板上生长的菌落数量在100-300个之间，因此选用该稀释梯度挑取菌落。挑取300个单菌落使用TSB平板进行纯化培养，以此方式纯化培养3次，得到纯化的分离菌株。
对每株分离菌株进行编号。
实施例2
生物活性分析
(1)暗黑鳃金龟幼虫生物活性测定
将编号为IPPBiotC41的单克隆接种于装有5mL液体LB培养基(胰蛋白胨10.0g/L，酵母提取物5.0g/L，NaCl 10.0g/L，121℃灭菌20min)的试管中，在30℃下培养12小时进行活化，然后将活化得到的菌液转接至固体LB培养基(LB液体培养基加琼脂15g/L，培养皿直径15cm)上，30℃培养12小时，用无菌刮铲收集菌体，用PBS缓冲液将菌体均匀悬浮，并对悬浮的菌体进行平板计数。将计数后的菌体超声破碎(Ampl 70％，脉冲3s，停5s)，从而使总蛋白从菌体中释放出来，得到破碎后的菌液。
制备得到胡萝卜丝，将胡萝卜丝用清水冲洗，晾至表面无水分。将胡萝卜丝分别浸泡于破碎后的菌液中，约20min后取出，均匀放于6孔生测板中，每孔约4-5条，剩余菌液拌于60g土中，最终生测浓度为1×108和1×109cfu/g。将拌好的土均匀分装至相应浓度下的6孔生测板中，每个孔内接入1头初孵2日龄暗黑鳃金龟的幼虫，放至于温度为25℃，光照为L:D＝16:8的培养箱中饲养。每个重复20头，5个重复。以PBS缓冲液作为阴性对照。7天后调查死、活虫数，计算平均死亡率和校正死亡率。
Figure BDA0003182460160000041
结果见表1。
表1 IPPBiotC41对暗黑鳃金龟幼虫生物活性测定
生测样品(cfu/g) 平均死亡率 校正死亡率
1×10<sup>8</sup> 59％ 51.65％
1×10<sup>9</sup> 70％ 64.6％
阴性对照 15.3％ —
根据表1的结果可知，IPPBiotC41对暗黑鳃金龟的幼虫具有杀虫活性。
(2)大黑鳃金龟幼虫生物活性测定
将生测浓度设置为1×106、1×107、1×108和1×109cfu/g，生物活性测定对象由暗黑鳃金龟初孵2日龄幼虫替换为大黑鳃金龟初孵2日龄幼虫。其他同本实施例第(1)小节。
结果见表2。
表2 IPPBiotC41对大黑鳃金龟幼虫生物活性测定
生测样品(cfu/g) 平均死亡率 校正死亡率
1×10<sup>6</sup> 8.3％ 2.9％
1×10<sup>7</sup> 19.4％ 14.6％
1×10<sup>8</sup> 30.6％ 26.5％
1×10<sup>9</sup> 63.9％ 61.8％
阴性对照 5.6％ —
根据表2的结果可知，IPPBiotC41对大黑鳃金龟的幼虫具有杀虫活性。
(3)白星花金龟生物活性测定
将编号为IPPBiotC41的单克隆接种于装有5mL液体LB培养基(胰蛋白胨10.0g/L，酵母提取物5.0g/L，NaCl 10.0g/L，121℃灭菌20min)的试管中，在30℃下培养12小时进行活化，然后将活化得到的菌液转接至固体LB培养基(LB液体培养基加琼脂15g/L，培养皿直径15cm)上，30℃培养12小时，用无菌刮铲收集菌体，用PBS缓冲液将菌体均匀悬浮，并对悬浮的菌体进行平板计数。将计数后的菌体用PBS缓冲液稀释至1×109cfu/mL，并进行超声破碎(Ampl 70％，脉冲3s，停5s)，从而使总蛋白从菌体中释放出来，得到破碎后的菌液。
将三龄白星花金龟幼虫置于冰上，略微冷冻至不活跃。用注射器吸取适量重悬菌液，将注射器针头***待注射虫的口器中，注射50μL。注射后的幼虫置于加入适量饲料的暗盒中，每组7只，3个重复。以PBS缓冲液作为阴性对照。于25℃培养箱中培养7d后调查死、活虫数，计算死亡率。
结果见表3。
表3 IPPBiotC41对白星花金龟幼虫生物活性测定
Figure BDA0003182460160000051
根据表3的结果可知，IPPBiotC41对白星花金龟的幼虫具有杀虫活性。
(3)大猿叶甲生物活性测定
将编号为IPPBiotC41的单克隆接种于装有5mL液体LB培养基(胰蛋白胨10.0g/L，酵母提取物5.0g/L，NaCl 10.0g/L，121℃灭菌20min)的试管中，在30℃下培养12小时进行活化，然后将活化得到的菌液转接至固体LB培养基(LB液体培养基加琼脂15g/L，培养皿直径15cm)上，30℃培养12小时，用无菌刮铲收集菌体，用PBS缓冲液将菌体均匀悬浮，并对悬浮的菌体进行平板计数。将计数后的菌体用PBS缓冲液稀释至1×109cfu/mL，并进行超声破碎(Ampl 70％，脉冲3s，停5s)，从而使总蛋白从菌体中释放出来，得到破碎后的菌液。
在9cm的平皿中放入9cm的灭菌定性滤纸，用灭菌蒸馏水喷湿。将白菜叶片清洗晾干。取10mL上述破碎后的菌液，向其中加入100μL10％洗涤灵，混合均匀后，浸泡白菜叶片，然后将白菜叶晾干，放入培养皿中，用毛笔接入大猿叶甲初孵幼虫，每皿30头虫，接完虫以2层卫生纸严格密封，每组三次重复。以PBS缓冲液作为阴性对照。放置25℃培养箱中培养，48h后调查死、活虫数，计算死亡率。
结果见表4。
表4 IPPBiotC41对大猿叶甲幼虫生物活性测定
生测样品 平均死亡率 校正死亡率
IPPBiot41 10.0％ 3.6％
阴性对照 6.7％ —
根据表4的结果可知，IPPBiotC41对大猿叶甲幼虫无杀虫活性。
实施例3
IPPBiotC41菌株的鉴定
参照分子克隆中提取革兰氏阴性细菌的所述方法提取IPPBiotC41基因组DNA。用细菌16S rDNA通用引物：27F(如SEQ ID No.1所示)和1492R(如SEQ ID No.2所示)扩增IPPBiotC41的16S rDNA序列，得到的1.4kb左右多片段。经试剂盒纯化进行TA克隆，转化大肠杆菌得到的克隆子，经过菌液PCR验证正确后送生工生物工程(上海)股份有限公司测序，所得序列为1404bp(如SEQ ID No.3所示)。所测序列提交EzBioCloud网站进行同源性比较，采用MEGA6.0构建***发育树(图1)。根据图1的***发育树可知，其与柠檬酸杆菌属的布氏柠檬酸杆菌菌株亲缘关系较近，因此，本发明的IPPBiotC41的***分类为柠檬酸杆菌(Citrobacter sp.)。
将IPPBiotC41菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.22672，保藏日期为2021年06月07日，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。其***分类为柠檬酸杆菌(Citrobacter sp.)。
序列表
<110> 中国农业科学院植物保护研究所
<120> 一种柠檬酸杆菌及其在防治金龟子中的应用
<130> LHA2160376
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
cggttacctt gttacgactt 20
<210> 3
<211> 1404
<212> DNA
<213> 柠檬酸杆菌(Citrobacter sp.)
<400> 3
gcaagtcgaa cggtaacagg aagcagcttg ctgctttgct gacgagtggc ggacgggtga 60
gtaatgtctg ggaaactgcc cgatggaggg ggataactac tggaaacggt agctaatacc 120
gcataacgtc gcaagaccaa agagggggac cttcgggcct cttgccatcg gatgtgccca 180
gatgggatta gcttgttggt gaggtaacgg ctcaccaagg cgacgatccc tagctggtct 240
gagaggatga ccagccacac tggaactgag acacggtcca gactcctacg ggaggcagca 300
gtggggaata ttgcacaatg ggcgcaagcc tgatgcagcc atgccgcgtg tatgaagaag 360
gccttcgggt tgtaaagtac tttcagcggg gaggaagggg ttaaggttaa taaccttatt 420
cattgacgtt acccgcagaa gaagcaccgg ctaactccgt gccagcagcc gcggtaatac 480
ggagggtgca agcgttaatc ggaattactg ggcgtaaagc gcacgcaggc ggtctgtcaa 540
gtcggatgtg aaatccccgg gctcaacctg ggaactgcat tcgaaactgg caggcttgag 600
tctcgtagag gggggtagaa ttccaggtgt agcggtgaaa tgcgtagaga tctggaggaa 660
taccggtggc gaaggcggcc ccctggacga agactgacgc tcaggtgcga aagcgtgggg 720
agcaaacagg attagatacc ctggtagtcc acgccgtaaa cgatgtctat ttggaggttg 780
tgcccttgag gcgtggcttc cggagctaac gcgttaaata gaccgcctgg ggagtacggc 840
cgcaaggtta aaactcaaat gaattgacgg gggcccgcac aagcggtgga gcatgtggtt 900
taattcgatg caacgcgaag aaccttacct ggtcttgaca tccacagaac ttggcagaga 960
tgccttggtg ccttcgggaa ctgtgagaca ggtgctgcat ggctgtcgtc agctcgtgtt 1020
gtgaaatgtt gggttaagtc ccgcaacgag cgcaaccctt atcctttgtt gccagcggtc 1080
cggccgggaa ctcaaaggag actgccagtg ataaactgga ggaaggtggg gatgacgtca 1140
agtcatcatg gcccttacga ccagggctac acacgtgcta caatggcata tacaaagaga 1200
agcgacctcg cgagagcaag cggacctcat aaagtatgtc gtagtccgga ttggagtctg 1260
caactcgact ccatgaagtc ggaatcgcta gtaatcgtgg atcagaatgc cacggtgaat 1320
acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt cacaccatgg gagtgggttg caaaagaagt 1380
aggtagctta accttcggga gggc 1404

Claims (7)

1.一种柠檬酸杆菌(Citrobacter sp.)，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.22672。
2.一种工程菌，其通过对如权利要求1所述的柠檬酸杆菌进行遗传改良后得到。
3.根据权利要求2所述的工程菌，其特征在于，所述工程菌通过向所述柠檬酸杆菌转化携带抗病基因和/或抗虫基因的质粒得到。
4.一种组合物，其包括如权利要求1所述的柠檬酸杆菌或如权利要求2或3所述的工程菌，和可接受的载体。
5.根据权利要求1所述的柠檬酸杆菌、权利要求2或3所述的工程菌或根据权利要求4所述的组合物在用于防治金龟子(Scarabaeidae)中的应用，所述金龟子(Scarabaeidae)为幼虫期金龟子。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述金龟子为鳃金龟(Holotrichia)和/或星花金龟(Protaetia)。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述鳃金龟(Holotrichia)为暗黑鳃金龟(Holotrichia parallela)和/或大黑鳃金龟(Holotrichia oblita)；所述星花金龟(Protaetia)为白星花金龟(Protaetia brevitarsis)。
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