CN113325182A - 配对抗体的高效筛选方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种高亲和力配对抗体的高效筛选方法，通过Protein A/G磁珠填料把阳性克隆细胞上清液中的抗体吸附下来，测定抗体浓度，选取预设量的抗体标记形成捡抗，包被未标抗体，采用正交棋盘法的ELISA试验，根据ELISA结果，筛选OD值高的实验组，复核抗体对。本发明配方抗体筛选从确定阳性克隆细胞株到抗体配对的整个实验过程的完成只需2天时间，耗材试剂平均成本不到100块钱，从而实现高效、低成本获取最优的的抗体对。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种配对抗体的高效筛选方法。
背景技术
配对抗体(抗体对)是指能够和抗原同时结合的一对抗体，主要用于双抗体夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)。
抗体配对的原理如下：通常情况下，一个抗原分子拥有多个抗原决定簇，将抗原注射入动物体内进行免疫，针对不同的抗原决定簇会产生不同的抗体。产生的抗体具有特异性与专一性，即一个抗体分子只会特异性地结合一个抗原决定簇。两个针对不同抗原决定簇的抗体，有可能同时结合到抗原分子上。如果两个抗体同时结合到同一个抗原分子上，那么这两个抗体就是配对抗体。
通常，配对抗体的筛选方法是双抗夹心ELISA。配对抗体筛选的原理为：在得到了单克隆抗体后，需要从中取出两种单克隆抗体，一种作为捕获抗体，另一种作为酶标记抗体。将捕获抗体包被在微孔板上，先加入抗原，孵育后洗去未结合的抗原，再加入酶标记抗体孵育后洗去未结合的标记抗体，最后加入显色液显色。如果可以显色，说明标记抗体与抗原特异性结合，该捕获抗体与标记抗体为一对配对抗体。如果不能显色，说明标记抗体不能与抗原结合，从而被洗脱，该捕获抗体与标记抗体不是配对抗体。如果选择的两种单克隆抗体不能进行配对，则需重新选择两种单抗，重新进行试验，直至找出可以配对的抗体。
单克隆抗体主要是利用杂交瘤技术制备，正常情况下会得到50～100个阳性单克隆，有时候甚至会更多，几百上千个阳性单克隆。常规筛选配对抗体的技术是先选择5～10个阳性单克隆细胞，通过制备小鼠腹水纯化出相应的抗体，得到抗体后，再全部酶标抗体做为检抗，最后通过棋盘法进行一一配对验证，选择出较好的一对。从周期上来说，从阳性单克隆细胞到制备出抗体一般情况下需要12～15天，而且需要每个阳性克隆株最少需要打一只小鼠的腹水得到相应的单克隆抗体。如果第一批未筛选到好的抗体对，需要重新再进行第二批阳性单克隆制备抗体，周而复始，直到筛选出亲和力较高的抗体对。同时，从人力、原料、耗材成本上来说，每个阳性单克隆细胞都需要经过克隆株放大、制备小鼠腹水、腹水纯化、标记、ELSIA配对等步骤，效率较低，成本相对较高。
发明内容
基于此，有必要提供一种配对抗体的高效筛选方法，可以快速筛选出一个项目中一对灵敏度最高抗体对的方法，成本相对较低。
本发明采用如下技术方案：
本发明提供一种配对抗体的筛选方法，包括如下步骤：获取阳性克隆细胞株；分别收集各株阳性克隆细胞的上清液；分别采用Protein A/G磁珠吸附各所述上清液中的抗体，洗脱，中和，收集，获得抗体混合物；分别测定所述抗体混合物的浓度，在ELISA板中统一标记预定量抗体，作为酶标记抗体；分别包被作为捕获抗体的未标记抗体，采用棋盘法的ELISA试验，选择OD值较高的样品，获得具有优异亲和力的抗体对。
进一步地，所述的配对抗体的筛选方法还包括采用制备腹水、纯化抗体的方式对所述具有优异亲和力的抗体对对进行高亲和力配对复核的步骤。
在其中一些实施例中，获取阳性克隆细胞株的步骤：抗原免疫实验动物，血清效价检测，细胞融合，筛选检测，亚克隆，检测得到所述阳性克隆株细胞。
在其中一些实施例中，采用甘氨酸溶液洗脱ProteinA/G磁珠吸附的抗体。
在其中一些实施例中，所述中和步骤采用的中和液为pH9.0的Tris-HCl溶液。
在其中一些实施例中，所述酶标记抗体为HRP标记抗体。
在其中一些实施例中，所述采用棋盘法的ELISA试验的具体步骤为：(1)将所有细胞株纯化后的抗体2μg/mL、0.1mL包被在ELISA板中，于4℃条件下过夜；(2)采用5％的脱脂奶粉于37℃条件下封闭2h；(3)分别加入抗原或者样本每孔0.2μg，于37℃条件下孵育1h；(4)每个HRP标记的抗体(检抗)按照1:2000稀释，每孔加入0.1mL，于37℃条件下孵育40min；(4)加入TMB显色20min，读取各孔溶液的OD450nm值。
本发明所述的配对抗体的筛选方法筛选获得的配对抗体在检测领域中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明配对抗体的筛选方法是可以快速筛选出一个项目中一对灵敏度最高抗体对的方法，不用再单独培养细胞来收集上清液，在放大细胞株冻存的时候收集上清液即可；然后采用ProteinA/G磁珠纯化细胞上清液中的抗体，步骤简单，损失少，1～2h内可以纯化20-30株抗体；测定浓度后，按着统一浓度进行HRP标记及包被，排除抗体量不等导致OD值高低差异的问题；可以一次性把所有的阳性克隆细胞株全部进行正交实验，从而筛选出高亲和力、灵敏度最好的抗体对。
附图说明
图1是实施例2中以包抗3号和检抗5作为抗体对进行样本检测的标曲曲线拟合图。
图2是实施例2中以包抗6号和检抗14号作为抗体对进行样本检测的标曲曲线拟合图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，以使本领域的技术人员更加清楚地理解本发明。
以下各实施例，仅用于说明本发明，但不止用来限制本发明的范围。基于本发明中的具体实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的情况下，所获得的其他所有实施例，都属于本发明的保护范围。
在本发明实施例中，若无特殊说明，所有原料组分均为本领域技术人员熟知的市售产品；在本发明实施例中，若未具体指明，所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
本实施方式提供一种筛选优异亲和力抗体对的方法，包括如下步骤：
S1，获取阳性克隆细胞。
具体地，本步骤采用抗原免疫实验动物，对免疫实验动物的血清效价检测，提取脾脏细胞与骨髓瘤细胞进行融合，筛选检测，亚克隆，检测得到阳性克隆株细胞。
S2，分别收集各阳性克隆细胞株的上清液。该步骤可在细胞株冻存的时候收集上清液即可，不用再单独培养细胞来收集上清液。
S3，分别采用Protein A磁珠和Protein G磁珠作为混合填料(Protein A/G磁珠)吸附各抗体上清液中的抗体，洗脱，中和，收集获得抗体混合物。采用Protein A/G磁珠纯化抗体，步骤简单，损失少，1-2h内可以纯化20～30株抗体，效率高。
在本步骤中，优选采用甘氨酸溶液洗脱ProteinA/G磁珠吸附的抗体。采用中和步骤采用的中和液为pH9.0的Tris-HCl溶液。
S4，测定所得抗体混合物的浓度，在ELISA中统一采用HPR或者生物素标记标记预定量抗体。
S5，分别包被未标记部分抗体，并用HRP标记做检抗，进行棋盘ELISA实验，选择测试OD值较高的样品组，暂定为待复核抗体对。抗体测浓度后，按统一浓度进行HRP标记及包被，排除抗体量不等导致的OD值的高低不同的问题。采用正交棋盘法的ELISA试验，可以一次性把所有的阳性克隆株全部进行正交实验，从而筛选出灵敏度最好的抗体对。整个实验过程从定株到配对完成只需2天时间，平均耗材试剂成本不到100块钱，从而实现高效、低成本获取最灵敏(最优)的抗体对。
S6，再采用制备腹水抗体、纯化抗体的方法，对待复核抗体对进行复核。
下面举例说明：
试验材料：
抗原是：新冠病毒S蛋白，哺乳表达***表达。
Pro G磁珠和Pro A磁珠购自中科森辉微球技术(苏州)有限公司。
医用酒精、PBS缓冲液(pH7.4)、CB9.6、脱脂奶粉、洗液、终止液、显色剂TMB、浸板液、辣根过氧化物酶(HRP)、生物素、羊抗小鼠二抗、PB缓冲液(pH7.4)、甘氨酸等均为常规试剂。
实施例1
本实施例提供一种阳性克隆细胞株的制备方法，包括如下步骤：采用哺乳表达***的新冠病毒S蛋白作为抗原，通过弗氏佐剂乳化抗原、皮下多点多次注射，免疫Balb/c小鼠4只。首次免疫用完全弗氏佐剂与抗原1:1混合形成油包状后，每只小鼠免疫50μg的抗原，免疫体积1mL；3周后用不完全弗氏佐剂进行乳化抗原加强免疫，加强免疫每次间隔2周，一共最少经过4次免疫。抗原的好坏、乳化的效果、免疫的次数直接决定了免疫后动物的抗血清的效价的高低；效价越高，那么最终阳性克隆会越多，最终配对的对数以及配对的亲和力就会越高。选取血清抗体效价高的免疫小鼠，取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合，筛选阳性细胞株22株，进行克隆编号。
收集冻存的22株阳性克隆细胞进行上清液抗体效价检测，检测结果如下表所示：
| 编号 | 克隆号 | OD值 |
| 1 | 1B8D11 | 2.665 |
| 2 | 2F2D8 | 2.6303 |
| 3 | 2G12F3 | 2.6776 |
| 4 | 2C5D4 | 2.6419 |
| 5 | 1B1C4 | 2.3473 |
| 6 | 8G10G9 | 2.33 |
| 7 | 8G10B11 | 2.3118 |
| 8 | 6F12C9 | 2.5356 |
| 9 | 6B10E3 | 2.4282 |
| 10 | 2H10B10 | 2.4904 |
| 11 | 3B10D11 | 2.4579 |
| 12 | 3B10B11 | 2.3201 |
| 13 | 2G8B5 | 2.4918 |
| 14 | 1B1E4 | 2.5324 |
| 15 | 1B1B2 | 2.5718 |
| 16 | 2C5D6 | 2.6122 |
| 17 | 4A9C8 | 2.364 |
| 18 | 4F4A3 | 2.5032 |
| 19 | 8G8F1 | 2.1351 |
| 20 | 8G8G1 | 2.3041 |
| 21 | 8H6E3 | 2.2827 |
| 22 | 8H6E5 | 2.5061 |
| 23 | 阳性血清(1:1000) | 2.2333 |
| 24 | 阴性(SP2/0上清) | 0.0873 |
由上表可以看出，22株阳性单克隆细胞的检测结果均呈阳性。
实施例2
本实施例提供一种高效筛选高亲和力配对抗体的方法，包括如下步骤：
(1)分别收集实施例1所得的22株阳性克隆细胞的上清液10mL。
(2)分别采用Pro G磁珠和Pro A磁珠作为混合磁珠填料(Protein A/G)磁珠置于实施例1所得的22株阳性克隆细胞的上清液中吸附抗体，分别用220μL的甘氨酸溶液洗脱，再分别加入5μL中和液pH9.0的Tris-HCl溶液中和，纯化收集所得抗体混合物的浓度如下表所示：
| 编号 | 克隆号 | 体积 | 浓度(mg/mL) |
| 1 | 1B8D11 | 200μL | 1.23 |
| 2 | 2F2D8 | 200μL | 0.89 |
| 3 | 2G12F3 | 200μL | 1.02 |
| 4 | 2C5D4 | 200μL | 0.54 |
| 5 | 1B1C4 | 200μL | 0.56 |
| 6 | 8G10G9 | 200μL | 0.98 |
| 7 | 8G10B11 | 200μL | 0.74 |
| 8 | 6F12C9 | 200μL | 0.67 |
| 9 | 6B10E3 | 200μL | 1.11 |
| 10 | 2H10B10 | 200μL | 1.25 |
| 11 | 3B10D11 | 200μL | 0.8 |
| 12 | 3B10B11 | 200μL | 0.83 |
| 13 | 2G8B5 | 200μL | 0.78 |
| 14 | 1B1E4 | 200μL | 0.69 |
| 15 | 1B1B2 | 200μL | 0.61 |
| 16 | 2C5D6 | 200μL | 0.73 |
| 17 | 4A9C8 | 200μL | 0.71 |
| 18 | 4F4A3 | 200μL | 0.62 |
| 19 | 8G8F1 | 200μL | 1.31 |
| 20 | 8G8G1 | 200μL | 0.6 |
| 21 | 8H6E3 | 200μL | 0.49 |
| 22 | 8H6E5 | 200μL | 1.09 |
每株阳性克隆细胞的上清液大概可以纯化出约100-260μg的抗体。
(3)分别对应各株阳性克隆细胞取20μg抗体，在ELISA板中进行HRP标记，后期当酶标二抗来用。
(4)分别包被未标记部分抗体，并用HRP标记做检抗，进行棋盘ELISA实验，具体步骤如下：将纯化后的所有抗体用2μg/ml的浓度0.1mL包被22个孔，在ELISA板中4℃过夜；5％的脱脂奶粉37℃封闭2h；加入抗原(新冠病毒S蛋白)或者样本每孔0.2μg，37℃孵育1h；每个HRP标记的抗体(检抗)按照正交叉的方法，每个孔按照1:2000稀释，每孔0.1mL，37℃孵育40min；加入TMB显色20min，读数。
在本步骤中，由于ELISA板是8*12＝96孔的板子，该实验是22个克隆株+无关对照蛋白和空白实验，所以在包被的时候需要多块板子组合成棋盘，这样防止加漏或者加错。在实际实验中，包被的抗体可以横向22个孔，共包被24，检抗可以竖向。
采用磁珠抗体交叉配对实验(包被抗体2μg/ml，0.1mL；蛋白0.2μg，检抗1:2000)测得ELISA配对OD450nm数据结果如下表：
从正交棋盘法的结果统计表中可以看到，共配对出109对抗体对，其中亲和力在中等以上的有16对，亲和力较高的有7对。
(5)针对筛选的亲和力比较高的7对抗体进行制备腹水，抗体纯化：
细胞株复苏、放大，将放大后的细胞免疫空白小鼠腹腔，9-12天后开始收集腹水，进行抗体纯化：水洗、PB缓冲液平衡Pro G亲和层析柱，腹水离心过滤后用PB缓冲液稀释5倍后上样Pro G层析柱，PB洗杂，pH为2.8的甘氨酸溶液洗脱，洗脱后马上及时用pH9.0的Tris-HCl溶液中和，将中和后洗脱液超滤，透析到PBS缓冲液中，透析完成后抗体纯度、浓度检测。标记抗体，进一步验证的数据统计如下表：
| 包抗编号 | 包抗克隆号 | 检抗编号 | 检抗克隆号 | OD<sub>450nm</sub>值 |
| 1 | 1B8D11 | 3 | 2G12F3 | 0.9401 |
| 1 | 1B8D11 | 9 | 6B10E3 | 0.843 |
| 3 | 2G12F3 | 5 | 1B1C4 | 1.3524 |
| 9 | 6B10E3 | 21 | 8H6E3 | 0.9564 |
| 14 | 1B1E4 | 6 | 8G10G9 | 1.3608 |
| 16 | 2C5D4 | 5 | 1B1C4 | 1.2842 |
| 20 | 8G8G1 | 5 | 1B1C4 | 0.854 |
纯化后双抗夹心ELISA数据统计见下表：
根据腹水验证方式大量制备抗体，大量纯化，进行大规格标记，进行双抗夹心ELISA实验，实验结果与前述筛选方法的抗体对相符合。
本实验筛选出了亲和力优异的抗体对，而且把对应的22株抗体全部完全配对了，无遗漏。其中亲和力最好的一对：包抗3号和检抗5号。其次亲和力最好是：包抗6号和检抗14号。
进一步选择亲和力最好的一对：包抗3号和检抗5号进行检测，检测方法包括如下步骤：
分别用未标记的3号，用2μg/ml的浓度0.1mL包被8个孔，在ELISA板中4℃过夜；采用5％的脱脂奶粉，于37℃条件下封闭2h；加入抗原(新冠病毒S蛋白)第一个孔浓度250ng/mL、体积0.1mL，往下依次倍比稀释7个梯度，最后一个孔加PBS稀释液；37℃孵育1h；将HRP标记的5号标记后，统一浓度(检抗)，每个孔按照1:2000稀释，每孔0.1mL，37℃条件下孵育40min；加入TMB显色20min，读数。
其中，采用包抗3号和检抗5号进行样本检测的数据见下表和图1：
通过检测结果测试发现，采用包抗3号和检抗5号进行样本检测的极限浓度是7.8125ng/mL，在一定浓度范围内线性关系良好，表明采用该抗体对能够实现对样本的准确检测。
同样采用上述检测方法，采用包抗1号和检抗9号进行样本检测的数据见下表和图2：
通过检测结果测试发现，采用包抗1号和检抗9号检测的极限浓度是62.5ng/ml，在一定浓度范围内线性关系良好。
通过上述验证实验，可以看出该高效筛选方法结果与预期结果一致，实现了快速高效、低成本获取最优抗体对的目的，相比传统抗体阶段筛选抗体对方法来说，时间节约大约百分之60％(缩短至2天内)，成本节约百分之70％(平均成本降至100元内)。
实施例3
本实施例提供一种PDCoV-ORF1ab的配对抗体的筛选方法，包括如下步骤：
S1，采用大肠杆菌***制备抗原PDCoV-ORF1ab蛋白，采用与实施例1相同的方法进行免疫、融合、制备阳性克隆株，共得到14个阳性克隆株。收集冻存的14株阳性克隆细胞进行上清液抗体效价检测，检测结果如下表所示：
| 编号 | 克隆号 | OD<sub>450nm</sub>值 |
| 1 | 14G11G9 | 2.7826 |
| 2 | 14G11A11 | 2.6199 |
| 3 | 13F10A9 | 2.796 |
| 4 | 8E4B6 | 2.6384 |
| 5 | 9E3F7 | 2.4816 |
| 6 | 12F11F8 | 2.4203 |
| 7 | 12G6G9 | 2.4203 |
| 8 | 3H5E6 | 2.523 |
| 9 | 9C3C5 | 2.6867 |
| 10 | 11F12H6 | 2.122 |
| 11 | 6D12B5 | 2.6463 |
| 12 | 8E7F6 | 2.5436 |
| 13 | 3H9G4 | 2.5752 |
| 14 | 13E7E1 | 2.666 |
| 15 | 阳性血清1:10000 | 2.1899 |
| 16 | 阴性SP2/0上清 | 0.0439 |
S2，分别收集上步骤所得的14株阳性克隆细胞的上清液10mL。分别采用Pro G磁珠和Pro A磁珠作为混合磁珠填料(Protein A/G)磁珠置于实施例1所得的14株阳性克隆细胞的上清液中吸附抗体，分别用220μL的甘氨酸溶液洗脱，再分别加入5μL中和液pH9.0的Tris-HCl溶液中和，纯化收集所得抗体混合物的浓度如下表所示：
S3，分别对应各株阳性克隆细胞取20μg抗体，在ELISA板中进行HRP标记，后期当酶标二抗来用。分别包被未标记部分抗体，并用HRP标记做检抗，进行棋盘ELISA实验，具体步骤如下：将纯化后的所有抗体用2μg/ml的浓度0.1mL包被22个孔，在ELISA板中4°过夜；5％的脱脂奶粉37°封闭2h；加入抗原(新冠病毒S蛋白)或者样本每孔0.2μg，37°孵育1h；每个HRP标记的抗体(检抗)按照正交叉的方法，每个孔按照1:2000稀释，每孔0.1mL，37°孵育40min；加入TMB显色20min，读数，结果统计见下表：
备注：以上数据横向包抗，纵向检抗。
从上述正交棋盘法的结果统计表中可以看到，本实施例共配对出68对抗体对，其中亲和力在中等以及较差的有62对，亲和力较高的有6对。
S4，针对筛选的亲和力比较高的对抗体进行制备腹水：细胞株复苏、放大，将放大后的细胞免疫空白小鼠腹腔，9-12天后开始收集腹水。纯化抗体：水洗、PB缓冲液平衡Pro G亲和层析柱，腹水离心过滤后用PB缓冲液稀释5倍后上样Pro G层析柱，PB缓冲液洗杂，pH为2.8的甘氨酸溶液洗脱，洗脱后马上及时用pH9.0的Tris-HCl溶液中和，将中和后洗脱液超滤，透析到PBS缓冲液中，透析完成后抗体纯度、浓度检测。标记抗体，进一步验证的数据统计如下表：
进一步选择亲和力较好的3对抗体对：包抗5号和检抗7号(记为kt-A)，包抗9号和检抗10号(记为kt-B)，包抗14号和检抗11号(记为kt-C)。
采用上述3对抗体对进行猪的肠道物样本检测，检测方法包括如下步骤：分别用未标记的5号、9号及14号抗体用2μg/ml的浓度、0.1mL包被8个孔在ELISA板中4℃过夜；采用5％的脱脂奶粉于37℃条件下封闭2h；第1-6个孔加入样本0.1mL(样本采用稀释倍数1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64依次往下倍比稀释)，第七孔加阳性蛋白2μg/mL、0.1ml，最后一个孔加PBS稀释液，37℃条件下孵育1h；分别对应将HRP标记的7号、10号、11号标记后，统一浓度(检抗)，每个孔按照1:2000稀释，每孔0.1mL，37°孵育40min；加入TMB显色20min，读数。
样本检测的数据见下表：
从上述抗原配对的结果中可以看出，检测天然样本肠道物后kt-A抗体检测样本稀释倍数能达到1:32倍，kt-B抗体对和kt-C抗体对只能识别到1:16倍稀释。
通过上述实施例可以证明，本发明快速筛选出一个项目中一对灵敏度最高抗体对的方法，不用再单独培养细胞来收集上清液，在放大细胞株冻存的时候收集上清液即可；然后采用ProteinA/G磁珠纯化细胞上清液中的抗体，步骤简单，损失少，1～2h内可以纯化20-30株抗体；测定浓度后，按着统一浓度进行HRP标记及包被，排除抗体量不等导致OD值高低差异的问题；可以一次性把所有的阳性克隆细胞株全部进行正交实验，从而筛选出高亲和力、灵敏度最好的抗体对。
在此有必要指出的是，以上实施例仅限于对本发明的技术方案做进一步的阐述和说明，并不是对本发明的技术方案的进一步的限制，本发明的方法仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种配对抗体的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：
获取阳性克隆细胞株；
分别收集各株阳性克隆细胞的上清液；
分别采用Protein A/G磁珠吸附各所述上清液中的抗体，洗脱，中和，收集，获得抗体混合物；
分别测定所述抗体混合物的浓度，在ELISA板中统一标记预定量抗体，作为酶标记抗体；
分别包被作为捕获抗体的未标记抗体，采用正交棋盘法的ELISA试验，选择OD值较高的样品，获得具有优异亲和力的抗体对。
2.根据权利要求1所述的配对抗体的筛选方法，其特征在于，还包括采用制备腹水、纯化抗体的方式对所述具有优异亲和力的抗体对进行高亲和力配对复核的步骤。
3.根据权利要求1或2所述的配对抗体的筛选方法，其特征在于，获取阳性克隆细胞株的步骤包括：抗原免疫实验动物，血清效价检测，细胞融合，筛选检测，亚克隆，检测得到所述阳性克隆株细胞。
4.根据权利要求1或2所述的配对抗体的筛选方法，其特征在于，采用甘氨酸溶液洗脱Protein A/G磁珠吸附的抗体。
5.根据权利要求4所述的配对抗体的筛选方法，其特征在于，所述中和步骤采用的中和液为pH9.0的Tris-HCl溶液。
6.根据权利要求1或2所述的配对抗体的筛选方法，其特征在于，所述酶标记抗体为HRP标记抗体。
7.根据权利要求6所述的配对抗体的筛选方法，其特征在于，所述采用正交棋盘法的ELISA试验的具体步骤为：
将各细胞株纯化后的未标记抗体，分别等量包被在ELISA板中，于4°条件下过夜；
采用5％的脱脂奶粉于37℃条件下封闭；
再分别加入等量抗原，于37℃条件下孵育；
采用各稀释的酶标记抗体，于37℃条件下孵育；
采用TMB显色，读取各孔溶液的OD450nm值。
8.根据权利要求1或2所述的配对抗体的筛选方法，其特征在于，所述配对抗体筛选所针对的抗原为新冠病毒S蛋白。
9.根据权利要1至8任一项所述的配对抗体的筛选方法筛选获得的配对抗体在检测领域中的应用。
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