JP4796967B2 - アルツハイマー病のためのバイオマーカー - Google Patents
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Description
本出願は2003年11月7日に出願された米国仮特許出願第60/518,360号;2003年12月2日に出願された米国仮特許出願第60/526,753号、;2004年2月19日に出願された米国仮特許出願第60/546,423号;2004年2月23日に出願された米国仮特許出願第60/547,250号;2004年4月2日に出願された米国仮特許出願第60/558,896号;2004年5月18日に出願された米国仮特許出願第60/572,617号;および2004年7月8日に出願された米国仮特許出願第60/586,503号の利益を主張し、参照によりその全文を本明細書に組み入れるものとする。
アルツハイマー病は、ひとたび失われると置き換えができない脳細胞の死滅を導く進行性神経疾患の1種である。ADの手がかりとなる神経病理学的な2つの顕著な徴候は、主として凝集したβ−アミロイドタンパク質(Aβ)からなる老人斑、および高度にリン酸化されたタウタンパク質の蓄積により形成される神経原線維変化(NFT)の存在である。現在、ADの臨床診断は、病歴の評価および神経学的、神経心理学的および精神病理学的な評価を含む理学的診察、ならびに各種の生物学的、X線的、および電気生理学的な検査を必要とする。一連の試験にもかかわらず、定義的な診断は、死亡後の解剖脳検査によってしか達成されない。従って、早期の段階でADを検知でき、その疾患の進行をモニターでき、AD、正常、非AD性痴呆およびその他の神経学的疾患を識別可能な簡単な生化学試験には、満たされないニーズが存在する。
Iqbalら、J Neural Transm Suppl.1998年、53:169−80 Wangら、Acta Neuropathol(Berl).1991年、82(1):6−12 Kudoら、Brain Res.1994年、639(1):1−7 Potterら、Neurobiol Aging.2001年、22(6):923−30 Matsubaraら、Ann Neurol.1990年、28(4):561−7 Harigayaら、Intern Med.1995年、34(6):481−4 Blennowら、Dimentia.1995年、6(6):306−11 Hoekmanら、Neth.J.Med.1985年、28:551−557 Davidssonら、Neuroreport、2002年、13:611−615 Carrette、O.ら、Proteomics、2003年、3:1486−1494 Tsuzukiら、Neurosci Lett、2000年、10:171−174 Serotら、J Neurol Neurosurg Psychiatry.1997年、63(4):506−8 Riisoenら、Acta Neurol Scand.1998年、78(6):455−9 Merchedら、FEBS Lett.1998年、425(2):225−8 Levyら、J.Neuropathol.Exp.Neurol.60:94−104 Skoogら、Neurology.1998年、50:966−71 Elovaara Acta Neurol Scand.1994年、69(5):302−5
本発明は、アルツハイマー病を有しない被験体、および/または非アルツハイマー性痴呆(例えば、LBD,FTD等)を患う被験体と比較してアルツハイマー性痴呆を伴う被験体において異なる量で存在するポリペプチドをベースとするバイオマーカーを提供する。さらに、本発明は、ポリペプチドをベースとするバイオマーカーを用いて被験体のアルツハイマー病を認定する(to qualify)方法を提供する。また本発明は、アルツハイマー病の治療薬の同定方法およびアルツハイマー病と認定されたヒトの治療方法を提供する。
1実施形態において、少なくとも1種類のバイオマーカーは以下のバイオマーカー:M60464.7(ヘモペキシン)、M3513.9(7B2 CT断片)、M8291.0(ユビキチン(CTから−3aa))、M5044.2、M10379.8(10.3kDa)、M9984.6(10.3kDaに関連する)、M10265.6(10.3kDaに関連する)、M9802.4(EA−92(ChrAペプチド))、9757.0(10.3kDaに関連する)、M16207.4(膵臓リボヌクレアーゼ)、M14092.7(S−グルタチオニル化トランスサイレチン)、M13904.7(トランスサイレチンS−Cys/S−CysGly)、M12545.9(シスタチン−C(NTから−8aa))、M8183.6(ユビキチン(CTから−4aa))、M5227.4、M3687.0(セクレトニューリン(ChrC/SGIIペプチド))、M3906.4 バソスタチンII(ChrAペプチド)、M3806.2、M8955.1、M5263.9、M14565.1(膵臓リボヌクレアーゼ)、M20839.2、M6509.6(クロモグラニンBペプチド)、M4320.6(A−β 1−40)、M7258.2(クロモグラニンBペプチド)、M17349.3(アポリポタンパク質A−II二量体)、M58845.4、M8938.5(C3a des−Arg)、M6608.9、M5838.3、M23477.4(プロスタグランジン−Dシンターゼ)、M4357.0(α−1−アンチキモトリプシンCT断片)、M7653.2(オステオポンチンCT断片)、M16716.9、M4812.5(VGF(NCBI)ペプチド)、M4989.4(アセチル化チモシンβ−4)、M7878.7、M92082.4、M66479.2(アルブミン)、M3967.6、M7718.8(リン酸化オステオポンチンCT断片)、M89707.1、M11579.2、およびM4455.4、から選択される。別の好ましい実施形態において、この方法はN−アセチル化チモシンβ−4を測定する工程を包含する。さらに別の好ましい実施形態において、少なくとも1種類のバイオマーカーは表Vに名前が付けられている表IIまたは表IV−Aまたは表IV−Bのバイオマーカーのひとつから選択される。
(b)表I、表II、表IV−Aおよび表IV−Bに示される少なくとも1種類のバイオマーカーを含む容器、を含むキットを提供する。好ましい実施形態において、上記少なくとも1種類のバイオマーカーは表II、表IV−Aおよび表IV−Bのバイオマーカーからなる群から選択される。別の好ましい実施形態において、上記少なくとも1種類のバイオマーカーはN−アセチル化チモシンβ−4である。さらに別の好ましい実施形態において、上記少なくとも1種類のバイオマーカーは、表Vに名前が付けられている表II、表IV−A、または表IV−Bのバイオマーカーのひとつから選択される。
(I.序文)
バイオマーカーは、ある表現型の状態(例えば、疾患を有する)にある被験体から採取したサンプル中に、その他の表現型の状態(例えば、疾患を有していない)と比較した時とは異なる量で存在する有機生体分子である。異なる表現型の各群について、あるバイオマーカーの平均値または中央値の発現レベルが統計学的に顕著であると計算されれば、そのバイオマーカーは異なる量で各表現型に存在する。それらのうち、統計学的有意性に関する一般的な試験には、t−テスト、ANOVA、Kruskal−Wallis、Wilcoxon、Mann−Whitneyおよびオッズ比が含まれる。バイオマーカーは、単独または組み合わせて、被験体がある表現型の状態またはその他の状態に属する相対的リスクの尺度を提供する。したがって、それらは疾患(診断)、薬物の治療効果(治療)、および薬物毒性のためのマーカーとして有用である。
(A.バイオマーカー)
本発明は、アルツハイマー病を有しない被験体、および/または非アルツハイマー性痴呆(例えば、LB、FTD等)を伴う被験体と比較するとアルツハイマー病の被験体では量が異なるポリペプチドをベースとするバイオマーカーを提供する。さらに、本発明は、ポリペプチドをベースとするバイオマーカーを用いて被験体のアルツハイマー病を認定する方法を提供する。それらは質量分析により決定されるような質量対電荷比により、飛行時間型質量分析におけるそれらのスペクトルピークの形状により、吸着剤表面へのそれらの結合特性により特徴付けられる。これらの特性は、特定の検出された生体分子が本発明のバイオマーカーであるか否かを決定するための方法を提供する。これらの特性は、上記生体分子が識別されるように上記生体分子の本来の特性を表すもので、プロセスを限定するものではない。1態様において、本発明はこれらのバイオマーカーの単離型を提供する。
タンパク質はしばしば、検出可能な異なる質量により特徴づけられた複数の異なる形態でサンプル中に存在することがわかっている。これらの形態は翻訳前および翻訳後のいずれか、あるいは両方での修飾による結果であり得る。翻訳前修飾型は、アレル変異体、スライス変異体、およびRNA編集体を含む。翻訳後修飾型は、タンパク質切断(例えば、親タンパク質の断片)、グリコシル化、リン酸化、脂質化、酸化、メチル化、シスチニル化、スルホン化およびアセチル化の結果生じる修飾型を含む。特定のタンパク質およびその全ての修飾型の集合を、本明細書中では「タンパク質クラスター」と呼ぶ。特定のタンパク質およびその全ての修飾型の集合のうち、当該特定のタンパク質以外のものを、本明細書中では「修飾タンパク質クラスター」と呼ぶ。本発明の任意のバイオマーカーの修飾型(表I、表II、表IV−A、表IV−BおよびVに示されるそれらのセットを含む)もそれら自体バイオマーカーとして使用可能である。修飾型は、診断において、タンパク質の非修飾型よりも優れた分別性能を示し得る場合もある。
本発明のバイオマーカーは任意の好適な方法により検出できる。この分野に利用され得る検出の実例は、光学的方法、電気化学的方法(ボルタンメトリーおよびアンペロメトリー技法)、原子間力顕微鏡、および無線周波数法、例えば、多極化共鳴スペクトル法を含む。光学的方法の実例は、顕微鏡法に加えて、共焦点および非共焦点の、蛍光、発光、化学発光、吸収、反射率、透過率、および複屈折または屈折率検出法(例えば、表面プラズモン共鳴、偏光解析法、共振ミラー法、グレーチングカプラー導波管法または干渉法)の検出がある。
好ましい実施形態において、本発明のバイオマーカーは、気相のイオンを検出するために質量スペクトロメータを利用する方法である質量分析により検出される。質量スペクトロメータの例は、飛行時間型、磁場型、四重極フィルター型、イオン捕捉型、イオンサイクロトロン共鳴、静電場分析機およびこれらの融合型である。
本発明で使用するための好ましい質量スペクトルの技法は、例えば、HutchensおよびYipの両者により米国特許第5,719,060号および同第6,225,047号に記載されるような「表面増強レーザー脱離およびイオン化(Surface Enhanced Laser Desorption and Ionization)」または「SELDI」である。これは、脱離/イオン化気相イオン質量スペクトル法(例えば、質量分析)の1方法で、検体(ここでは、1以上の上記バイオマーカー)がSELDI質量分析プローブの表面上に捕捉されるものをさす。SELDIにはいくつかの種類が存在する。
その他の質量分析方法において、上記バイオマーカーを最初に、上記バイオマーカーに結合するクロマトグラフィー特性を有するクロマトグラフィー樹脂上に捕捉する。本発明の実施例において、これは多様な方法を含み得る。例えば、上記バイオマーカーはCM Ceramic HyperD F樹脂等の陽イオン交換樹脂上に捕捉することができ、樹脂を洗浄し、MALDIによって上記バイオマーカーを溶出させ検出することができる。別の方法においては、この方法は、陽イオン交換樹脂に供する前に陰イオン交換樹脂上でのサンプル分画を先に行うことができる。別の方法においては、陰イオン交換樹脂およびMALDIによる検出を直接的に行うことができる。さらにその他の方法においては、上記バイオマーカーに結合する抗体を含むイムノクロマトグラフィー樹脂上に上記バイオマーカーを捕捉し、非結合物質を除去するために上記樹脂を洗浄し、上記樹脂から上記バイオマーカーを溶出させて、上記の溶出したバイオマーカーをMALDIまたはSELDIにより検出することができる。
飛行時間型質量分析による検体の分析は、飛行時間型スペクトルを生成する。最終的に分析される飛行時間型スペクトルは、通常、サンプルに対するイオン化エネルギーの単パルス由来のシグナルを示さず、むしろ多数のパルス由来シグナルの合計を示す。このことがノイズを減らし、ダイナミックレンジを増加させる。この飛行時間型データを、次いでデータ処理に供する。CiphergenのProteinChip(登録商標)ソフトウェアにおいて、データプロセスは通常、質量スペクトルを生成するためのTOFからM/Zへの変換と、装置上の補正値を消去するためのベースライン減算、および高頻度なノイズを低減するためのフィルタリングを含む。
本発明のバイオマーカーを検出するための好ましいプロトコールは以下である。試験するサンプルを、表IおよびIIにも示すような、陽イオン交換吸着剤(好ましくはCM−10またはWCX−2プロテインチップアレイ(Ciphergen Biosystems社))、陰イオン交換吸着剤(好ましくはQ−10プロテインチップアレイ(Ciphergen Biosystems社))、疎水***換吸着剤(好ましくはH50プロテインチップアレイ(Ciphergen Biosystems社))および/またはIMAC吸着剤(好ましくはIMAC30プロテインチップアレイ(Ciphergen Biosystems社))を含むアフィニティー捕捉プローブと接触させる。非結合分子を洗い落とす間に、バイオマーカーを保持するであろうバッファーで上記プローブを洗浄する。各バイオマーカーに対し好適な洗浄の例は、実施例および表Iにおいて同定されたバッファーである。上記バイオマーカーはレーザー脱離/イオン化質量分析により検出される。
別の実施形態において、本発明のバイオマーカーはイムノアッセイにより測定することができる。イムノアッセイは、上記バイオマーカーを捕捉するために抗体等の生体特異的捕捉試薬を必要とする。抗体は、技術的によく知られた方法により、例えば、動物を上記バイオマーカーで免疫することにより生産することができる。バイオマーカーは、それらの結合特性に基づいてサンプルから単離することができる。別の方法においては、ポリペプチドバイオマーカーのアミノ酸配列が未知である場合、上記ポリペプチドを技術的によく知られた方法により合成し、また抗体を生成するために使用することができる。
(A.単独マーカー)
本発明のバイオマーカーは、例えばアルツハイマー病を診断するために、被験体におけるアルツハイマー病の病態を判断するための診断テストに使用することができる。「アルツハイマー病の病態」という語句は、とりわけ、アルツハイマー病と非アルツハイマー病、および、特に、アルツハイマー病と非アルツハイマー病の正常、またはアルツハイマー病と非アルツハイマー性痴呆を区別することを含む。この病態に基づいて、付加的な診断テストまたは治療手順または処方計画を含むさらなる方法が示され得る。
個々のバイオマーカーが有用な診断用バイオマーカーである一方で、バイオマーカーの組み合わせが、単独のバイオマーカーよりも大きい、特定の状態における予測値を提供し得ることが見出されている。具体的には、サンプル中の複数のバイオマーカーの検出が、テストの感度および/または特異度を増加させ得る。
ある実施形態において、本発明は、被験体におけるアルツハイマー病の進行のリスクを調べるための方法を提供する。バイオマーカーの量またはパターンは、例えば高い、中程度の、低い等の各種のリスク状態において特徴的である。アルツハイマー病の進行リスクは、適切な単一のバイオマーカーまたは複数のバイオマーカーを測定すること、および、次いでそれらを分類アルゴリズムへと供し、または特定のリスクレベルと関連している対照量のバイオマーカーおよび/またはバイオマーカーのパターンと比較することにより、決定される。
ある実施形態において、本発明は、被験体におけるアルツハイマー病の段階を調べるための方法を提供する。上記疾患の各段階は、特徴的な量のバイオマーカーまたはバイオマーカーのセットの相対量(パターン)を有する。疾患の上記段階は、適切な単数のバイオマーカーまたは複数のバイオマーカーを測定すること、および次いでそれらを分類アルゴリズムへと供し、または特定の段階と関連している対照量のバイオマーカーおよび/またはバイオマーカーのパターンと比較することにより、決定される。
ある実施形態において、本発明は、被験体におけるアルツハイマー病の経過を調べるための方法を提供する。疾患の経過は、疾患の進行(悪化)および疾患の逆行(改善)を含む、長期にわたる疾患状態の変化をさす。長期にわたり、バイオマーカーの量又相対量(例えば、パターン)は変化する。例えば、バイオマーカーM9984.6およびM10265.6(表IV−B)の濃度はアルツハイマーの患者由来のサンプルにおいて増加し、一方、ヘモペキシンの濃度はアルツハイマーの患者由来のサンプルにおいて減少する。したがって、疾患または非疾患に向かう長期的な増加または減少のいずれかのこれらのマーカーの傾向は、上記疾患の経過を示す。従って、この方法は被験体における1以上のバイオマーカーを少なくとも2つの異なる時点、例えば、最初の時と2度目の時に測定する工程を包含し、および量における変化があればそれを比較する工程を包含する。疾患の経過はこれらの比較に基づいて調べられる。同様に、この方法は、治療に対する応答を調べるために有用である。治療が効果的である場合、上記バイオマーカーは正常に近づくであろうし、一方、治療が効果的でない場合、上記バイオマーカーは疾患を示す方へと向かうであろう。
アルツハイマー病の病態の認定における上記方法のある種の実施形態において、上記方法は被験体の治療を管理する工程をさらに包含する。このような管理には、内科医または臨床医学者の行為と、それに続くアルツハイマー病の病態の決定を含む。例えば、内科医がアルツハイマー病の診断を行い、次いでコリンエステラーゼインヒビターの処方または投与等のある種の治療計画を立てる場合、抗グルタミン酸作動性治療または酸化防止剤がそれに続き得る。別の方法においては、非アルツハイマー病または非アルツハイマー性痴呆の診断は、患者が患うであろう特定の痴呆を調べるためのさらなるテストが続き得るだろう。診断テストがアルツハイマー病の病態における最終的な結果を与えない場合にも、更なるテストが要求され得るだろう。
いくつかの実施形態において、「既知のサンプル」等のサンプルを用いて生成されたスペクトル(例えば、質量スペクトルまたは飛行時間型スペクトル)に由来するデータを、分類モデルを「訓練する」ために使用することができる。「既知のサンプル」は、予め分類されているサンプルである。上記スペクトルに由来し、また上記分類モデルを形成するために使用されるデータは、「トレーニングデータ」として参照される。ひとたび訓練されると、分類モデルは、未知のサンプルを使用して生成されたスペクトル由来のデータにおけるパターンを認識できるようになる。上記分類モデルを次いで、未知のサンプルを階級に分類するために使用することができる。このことは、例えば、特定の生体サンプルがある種の生物学的状態(例えば、疾患状態と非疾患状態)に関連しているか否かを予測することにおいて有用であり得る。
別の実施形態において、本発明はアルツハイマー病の病態を認定するためのキットを提供し、上記キットは本発明によりバイオマーカーを検出するために使用される。ある実施形態において、上記キットは、捕捉試薬をその上に付着させ、上記捕捉試薬が本発明のバイオマーカーと結合しているチップ、マイクロタイタープレートまたはビーズまたは樹脂等の固体の支持体を含む。したがって、例えば、本発明のキットは、ProteinChip(登録商標)アレイ等のSELDIのための質量分析プローブを含み得る。生体特異的捕捉試薬の場合、上記キットは、反応表面を伴う固相支持体および生体特異的捕捉試薬を含む容器を含み得る。
イムノアッセイのキャリブレーションは、イムノアッセイにおいて生じる結果の品質を保証するために重要である。キャリブレーションは一般的に、予め決められた量または濃度の標的分析物を含むイムノアッセイキャリブレーターの使用を含む。イムノアッセイにおいて上記キャリブレーターにより生じたシグナルは、上記キャリブレーター中の標的分析物の量に相関する。このキャリブレーションは、順に、テストサンプル中で測定されるシグナルの量を、テストサンプル中の標的分析物の量と相関させるために使用される。しかし、キャリブレーターにより生じたシグナルは、例えば、キャリブレーター中の標的分析物が分解されたり、シグナルを弱めるように修飾されたりした場合には、キャリブレーター中における真の分析物の量を表さない。
イムノアッセイは、標的分析物に対し生成した抗体を含むイムノアッセイ試薬の使用を含む。このようなアッセイの正確性は、上記イムノアッセイ試薬中の抗体の強度および純度に依存する。抗体試薬中の夾雑物の存在は、抗体試薬中における抗体の量の正確な測定を妨げ得る。例えば、本発明は、イムノアッセイ試薬として使用されるADバイオマーカーに対する抗体の品質を、例えば試薬中で抗体が分解されたものなどの修飾物を特異的に検出することにより調べるための方法を提供する。
本発明の上記方法は、その他の応用をさらに有する。例えば、上記バイオマーカーは、上記バイオマーカーの発現をin vitroまたはin vivoで調節する化合物を探索するために使用することができ、その化合物は順に、患者におけるアルツハイマー病の治療または抑制において有用であり得る。その他の例において、上記バイオマーカーは、アルツハイマー病に対する治療への応答をモニターするために使用できる。さらにその他の例においては、被験体がアルツハイマー病を進行するリスクを有しているかについて
調べるための遺伝的研究において、上記バイオマーカーを使用することができる。
て完全長に対する短縮型バイオマーカーの相対レベルをテストされる化合物は、任意の低分子化合物またはタンパク質、糖、核酸または脂質等の生物学的物質であり得る。別の方法においては、モジュレーターはプロテアーゼまたは遺伝子組換えプロテアーゼである。通常、試験化合物は小さな化学分子およびペプチドであろう。ほとんどの場合、化合物は水系または有機系(特にDMSOをベースとする)溶液に溶解されるが、原則的には任意の化合物を潜在的なモジュレーターまたは結合化合物として本発明のアッセイにおいて使用できる。上記アッセイは、アッセイステップを自動化することにより、およびアッセイのための任意の簡便な供給源から化合物を提供することにより、大きな化学物質ライブラリーをスクリーニングするように設計され、それらは通常、並行して行われる(例えば、ロボットアッセイにおけるマイクロタイタープレート上のマイクロタイターフォーマット)。Sigma(St.Louis、ミズーリ州)、Aldrich(St.Louis、ミズーリ州)、Sigma−Aldrich(St.Louis、ミズーリ州)、Fluka Chemika−Biochemica Analytika(Buchs、スイス)等を含む化学物質の供給者が多く存在することが理解されるだろう。
ポジトロン放出断層撮影法(Positron Emisson Tomography)(PET)またはシングルフォトン放出コンピュータ化断層撮影法(single photon emission computerized tomography)(SPECT)イメージング等の、非侵襲性の医療診断画像技術は、癌、冠動脈疾患および脳疾患を検出するために特に有用である。PETおよびSPECTイメージングは器官および組織の化学的機能を示すものであり、一方で、X線、CTおよびMRI等のその他の画像技術は構造を示す。PETおよびSPECTイメージングの使用は、アルツハイマー病等の脳疾患の進行における特定およびモニタリングのために、次第に有用性を増してきている。いくつかの例において、PETおよびSPECTイメージングの使用は、症状が発現するより数年早くアルツハイマー病を検出することを可能にする。
(実施例1.アルツハイマー病のためのバイオマーカーの発見)
以下の実施例に記載されるプロトコールを用いて65名のスウェーデン人の患者サンプルからマススペクトルを生成した。そのうち30名はアルツハイマー病と診断され、35名は痴呆を呈しなかった。この調査のために、認識力テスト、一般的な血液検査および尿検査、利用可能な場合にはMRIまたはCT画像検査、およびCSF中のタウおよびA−β(42)の測定を含むNINCDS−ADRDA基準にしたがって、患者をAD患者として診断した。痴呆の重篤度はミニメンタルステート試験(MMSE)を用いて評価した。30のアルツハイマー病サンプルを平均MMSEスコア21(5〜30の範囲)を示す患者群から採取した。35名の対照患者は年齢をマッチングさせてあり、平均MMSEスコア29(25〜30の範囲)を示した。18より高いMMSEスコアは軽度の痴呆の証拠とみなされており、24より高いMMSEスコアは非常に軽度なケースとみなされている。
陰イオン交換分画のためのバッファーのリスト:
U1(1M 尿素、0.22% CHAPS、50mM Tris−HCl pH9)
0.1% OGP含有50mM Tris−HCl pH9(洗浄バッファー1)
0.1% OGP含有50mM Hepes pH7(洗浄バッファー2)
0.1% OGP含有100mM 酢酸ナトリウム pH5(洗浄バッファー3)
0.1% OGP含有100mM 酢酸ナトリウム pH4(洗浄バッファー4)
33.3% イソプロパノール/16.7% アセトニトリル/0.1% トリフルオロ酢酸(洗浄バッファー5)
注記:洗浄バッファー4を樹脂に適用するまでは洗浄バッファー5をバッファートレイに等分しないこと。これによって揮発性有機溶媒の蒸発という問題が生じないようにする
材料リスト:
フィルタープレート
5枚のv字ウェル型96穴ウェルディッシュ(F1〜F5とラベルする)
a.樹脂を洗浄する
Hyper Q DF 樹脂(BioSepra、Cergy、フランス)を5倍ベッド容量の50mM Tris−HCl pH9で3回洗浄することにより樹脂を調製する。次に、50%懸濁液として50 mM Tris−HCl pH9中に保存する
b.樹脂を平衡化する
フィルタープレートの各ウェルに125μLのHyper Q DFを添加する
バッファーをフィルターに通す
150μLのU1を各ウェルに添加する
バッファーをフィルターに通す
150μLのU1を各ウェルに添加する
バッファーをフィルターに通す
150μLのU1を各ウェルに添加する
バッファーをフィルターに通す
c.樹脂とCSFを結合させる
各チューブから150μLのサンプルをフィルタープレートの適当なウェル内にピペッティングする
4℃の状態で30分間Vortexにかける。
フィルタープレートの下にv字ウェル型96穴ウェルプレートF1を配置する
プレートF1中の流入物を回収する
100μLの洗浄バッファー1をフィルタープレートの各ウェルに添加する
室温(RT)の状態で10分間Vortexにかける
プレートF1中のpH9溶離液を回収する
画分1は流入物とpH9溶離液を含む
100μLの洗浄バッファー2をフィルタープレートの各ウェルに添加する
室温(RT)の状態で10分間Vortexにかける
フィルタープレートの下にv字ウェル型96穴ウェルプレートF2を配置する
プレートF2中の画分2を回収する
100μLの洗浄バッファー2をフィルタープレートの各ウェルに添加する
室温(RT)の状態で10分間Vortexにかける
プレートF2中の画分2の残りを回収する
画分2はpH7溶離液を含む
100μLの洗浄バッファー3をフィルタープレートの各ウェルに添加する
室温(RT)の状態で10分間Vortexにかける
フィルタープレートの下にv字ウェル型96穴ウェルプレートF3を配置する
プレートF3中の画分3を回収する
100μLの洗浄バッファー3をフィルタープレートの各ウェルに添加する
室温(RT)の状態で10分間Vortexにかける
プレートF3中の画分3の残りを回収する
画分3はpH5溶離液を含む
100μLの洗浄バッファー4をフィルタープレートの各ウェルに添加する
室温(RT)の状態で10分間Vortexにかける
フィルタープレートの下にv字ウェル型96穴ウェルプレートF4を配置する
プレートF4中の画分4を回収する
100μLの洗浄バッファー4をフィルタープレートの各ウェルに添加する
室温(RT)の状態で10分間Vortexにかける
プレートF4中の画分4の残りを回収する
画分4はpH4溶離液を含む
100μLの洗浄バッファー5をフィルタープレートの各ウェルに添加する
室温(RT)の状態で10分間Vortexにかける
フィルタープレートの下にv字ウェル型96穴ウェルプレートF5を配置する
プレートF5中の画分5を回収する
100μLの洗浄バッファー5をフィルタープレートの各ウェルに添加する
室温(RT)の状態で10分間Vortexにかける
プレートF5中の画分5の残りを回収する
画分5は有機溶媒溶離液を含む
チップ結合プロトコールを開始するまで凍結する。
CSF画分をチップと結合させる
60μLの対応するバッファーを各ウェルに添加する
20μLのQカラム画分を添加する。
IMAC3アレイ(Ciphergen Biosystems社)
100mM CuSO4
100mM リン酸ナトリウム+0.5M NaCl pH7
WCX2アレイ(Ciphergen Biosystems社)
100mM 酢酸ナトリウム pH4
H50アレイ(Ciphergen Biosystems社)
10%アセトニトリル+0.1%TFA
アレイの調製
アレイをバイオプロセッサー中に配置する
IMACアレイに銅をロードする
IMAC3アレイの各スポットに50μlのCuSO4をロードする
室温(RT)の状態で5分間Vortexにかける
CuSO4を除去し、繰り返す
水ですすぐ
アレイを平衡化する
アレイに適した100μlのチップ洗浄バッファーを各ウェルに添加する
RTの状態で5分間Vortexにかける
Vortex後にバッファーを除去する
アレイに適した100μlのチップ洗浄バッファーを各ウェルに添加する
RTの状態で5分間Vortexにかける
Vortex後にバッファーを除去する
CSF画分をアレイと結合させる
アレイに適した60μlのチップ洗浄バッファーを各ウェルに添加する
20μlのCSF画分を添加する
RTの状態で30分間Vortexにかける
サンプルおよびバッファーを除去する
アレイを洗浄する
アレイに適した100μlのチップ洗浄バッファーを各ウェルに添加する
RTの状態で5分間Vortexにかける
Vortex後にバッファーを除去する
アレイに適した100μlのチップ洗浄バッファーを各ウェルに添加する
RTの状態で5分間Vortexにかける
Vortex後にバッファーを除去する
アレイに適した100μlのチップ洗浄バッファーを各ウェルに添加する
RTの状態で5分間Vortexにかける
Vortex後にバッファーを除去する
水で2回すすぐ
基質を添加する
バイオプロセッサーの上部およびガスケットを取り除く
アレイを乾燥させる
SPA:
50%SPA(シナピン酸)を含む50%アセトニトリルおよび0.5%TFA 1μlを添加する
空気乾燥させる
1μlの50%SPAを添加する
空気乾燥させる。
エネルギー吸収分子:50%SPA
質量上限を100000 ダルトン、最適範囲を2000 ダルトン〜100000 ダルトンに設定する
開始時レーザー強度を200に設定する
開始時検出装置感度を8に設定する
焦点を質量8000ダルトンに合わせる
質量偏向を1000ダルトンに合わせる
データ取得方法をSeldi定量法に合わせる
Seldi捕捉パラメーターを20に、Δを4に合わせる
transients perを10に、終了ポジションを80に合わせる
強度225において2ショットの加温ポジションに合わせ、加温ショットを含まない
サンプルを処理する。
得られたスペクトルは、Ciphergen Biosystems、IncのBiomarker WizardおよびBiomarker Pattern Softwareと共にCiphergen ExpressTM DataManager Softwareにより分析した。各グループについてのマススペクトルを散布図分析に供した。散布図中の各タンパク質クラスターに関しアルツハイマー病および対照グループを比較するためにMann−Whitneyテスト分析を利用し、およびタンパク質は上記の2群の間で顕著に異なるもの(p<0.0001)を選択した。
NVNFQKAINEKLGQYASPTAKRCCQDGVTRLPMMRSCEQRAARVQQPDCREPFLSCCQFAESLRKKSRDKGQAGLQ(配列番号1)
(理論的分子量は8607.88 Daである)。
アルツハイマー病のためのマーカーとしてのβ2ミクログロブリンの使用を検証するために、158の脳脊髄液(CSF)サンプルを3つのグループ:(1)アルツハイマー病(AD)、(2)対照、および(3)非アルツハイマー性痴呆(非AD)として予め診断された被験体から採取した。これらのグループにおけるサンプルの分布を以下の表IIIに示す。
50%アセトニトリル中で30分間H50アレイをバルク洗浄し、次いで、30分間空気乾燥する。
室温(RT)にて5分間振盪する
振盪後にバッファーを除去する
100μLの結合バッファーを各ウェルに添加する
室温(RT)にて5分間振盪する
振盪後にバッファーを除去する
45μLの結合バッファーを各ウェルに添加する
5μLのニート(neat)なCSFサンプルを添加する
室温(RT)にて30分間振盪する
振盪後にサンプルバッファーを除去する
100μLの結合バッファーを各ウェルに添加する
室温(RT)にて5分間振盪する
振盪後にバッファーを除去する
100μLの結合バッファーを各ウェルに添加する
室温(RT)にて5分間振盪する
振盪後にバッファーを除去する
1μlの50%SPA(シナピン酸)を含む50%アセトニトリルおよび0.5%TFAを添加する
空気乾燥させる
1μlの50%SPAを添加する
空気乾燥させる
アレイを分析する
結果(図3)は(1)アルツハイマー病を患う被験体におけるβ2ミクログロブリンのレベルが非アルツハイマー性痴呆を患う被験体のレベルよりも顕著に高いこと;(2)アルツハイマー病を患う被験体におけるβ2ミクログロブリンのレベルが痴呆の症状を示さない被験体のレベルよりも顕著に高いこと;および(3)非アルツハイマー性痴呆を患う被験体におけるβ2ミクログロブリンのレベルは痴呆の症状を示さない被験体のレベルよりも顕著に低いことを示す。
本実施例のために、スウェーデン人およびフィンランド人の患者からの237のCSFサンプルを使用した。これらのサンプルには以下のものが含まれた:アルツハイマー病患者由来の98サンプル(MMSE>24を示す83の非常に軽度のケースを含む)、前頭側頭型痴呆(FTD)患者由来の31サンプル、レヴィー小体痴呆(DLB)患者由来の29サンプル、および9のうつ病対照を含む79の年齢マッチングさせた正常個体由来サンプル。診断は上記実施例中で論じたNINCDS−ADRDA基準に従って行った。237のサンプルを訓練のための群(2/3)および盲検試験のための群(1/3)に無作為に分けた。
CSF画分をチップと結合させる
45μLの対応するバッファーを各ウェルに添加する
5μLのニートなCSFを添加する
チップ洗浄バッファーリスト:
IMAC30アレイ(Ciphergen Biosystems社):
適宜、100mM CuSO4またはNiSO4
100mM リン酸ナトリウム+0.5M NaCl pH7
H50アレイ(Ciphergen Biosystems社):
10%アセトニトリル+0.1%TFA
Q10アレイ(Ciphergen Biosystems社):
100mM Tris pH9.0
CM10アレイ(Ciphergen Biosystems社):
100mM 酢酸ナトリウム pH4
アレイの調製
アレイをバイオプロセッサー中に配置する
適宜、IMAC30アレイに銅またはニッケルをロードする
IMAC30アレイの各スポットに50μlのCuSO4(またはNiSO4)をロードする
室温(RT)の状態で5分間Vortexにかける
CuSO4(またはNiSO4)を除去し、繰り返す
水ですすぐ
アレイを平衡化する
アレイに適した100μlのチップ洗浄バッファーを各ウェルに添加する
RTの状態で5分間Vortexにかける
Vortex後にバッファーを除去する
アレイに適した100μlのチップ洗浄バッファーを各ウェルに添加する
RTの状態で5分間Vortexにかける
Vortex後にバッファーを除去する
CSF画分をアレイと結合させる
アレイに適した45μlのチップ洗浄バッファーを各ウェルに添加する
5μlのCSF画分を添加する
RTの状態で30分間Vortexにかける
サンプルおよびバッファーを除去する
アレイを洗浄する
アレイに適した100μlのチップ洗浄バッファーを各ウェルに添加する
RTの状態で5分間Vortexにかける
Vortex後にバッファーを除去する
アレイに適した100μlのチップ洗浄バッファーを各ウェルに添加する
RTの状態で5分間Vortexにかける
Vortex後にバッファーを除去する
アレイに適した100μlのチップ洗浄バッファーを各ウェルに添加する
RTの状態で5分間Vortexにかける
Vortex後にバッファーを除去する
水で2回すすぐ
基質を添加する
バイオプロセッサーの上部およびガスケットを取り除く
アレイを乾燥させる
SPA:
1μlの50%SPA(シナピン酸)を含む50%アセトニトリルおよび0.5%TFAを添加する
空気乾燥させる
1μlの50%SPAを添加する
空気乾燥させる
CHCA
1μlの50%CHCAを溶解させた50%アセトニトリル+0.25%TFAを添加する
空気乾燥させる
1μlの50%CHCAを添加する
空気乾燥させる
(2.特定のチップの結合プロトコール)
Q10チップ
アレイを平衡化する
1.100μLの100mM Tris pH9を各ウェルに添加する
2.室温にて5分間混合する
3.混合後にバッファーを除去する
4.100μLの100mM Tris pH9を各ウェルに添加する
5.室温にて5分間混合する
6.混合後にバッファーを除去する
サンプルをアレイに添加する
1.50μLの100mM Tris pH9を各ウェルに添加する
2.5μLのCSFを添加する
3.室温にて30分間混合する
4.サンプルおよびバッファーを除去する
アレイを洗浄する
1.100μLの100mM Tris pH9を各ウェルに添加する
2.室温にて5分間混合する
3.混合後にバッファーを除去する
4.100μLの100mM Tris pH9を各ウェルに添加する
5.室温にて5分間混合する
6.混合後にバッファーを除去する
7.100μLの100mM Tris pH9を各ウェルに添加する
8.室温にて5分間混合する
9.混合後にバッファーを除去する
10.脱イオン水で2回すすぐ
EAMを添加する
1.バイオプロセッサーのリザーバーおよびガスケットを取り除く
2.直ちにアレイを乾燥させる
3.EAMを適用する:
SPAに対して
a.400μLの50% アセトニトリル、0.5% TFAをSPAチューブに添加する
b.室温にて5分間混合する
c.1μLを各スポットに添加する
d.空気乾燥させる
e.1μLを各スポットに添加する
f.空気乾燥させる
CHCAに対して
a.200μLの50% ACN、0.5% TFAをCHCAチューブに添加する
b.室温にて5分間混合する
c.室温にて10,000rpmで1分間遠心分離にかける
d.上清を除去し、等量の50%アセトニトリル、0.25%TFAで希釈する
e.1μLを各スポットに適用する
f.空気乾燥させる
g.1μLを各スポットに適用する
h.空気乾燥させる
CM10
アレイを平衡化する
1.100μLの100mM 酢酸ナトリウム pH4を各ウェルに添加する
2.室温にて5分間混合する
3.混合後にバッファーを除去する
4.100μLの100mM 酢酸ナトリウム pH4を各ウェルに添加する
5.室温にて5分間混合する
6.混合後にバッファーを除去する
サンプルをアレイに添加する
1.50μLの100mM 酢酸ナトリウム pH4を各ウェルに添加する
2.5μLのCSFを添加する
3.室温にて30分間混合する
4.サンプルおよびバッファーを除去する
アレイを洗浄する
1.100μLの100mM 酢酸ナトリウム pH4を各ウェルに添加する
2.室温にて5分間混合する
3.混合後にバッファーを除去する
4.100μLの100mM 酢酸ナトリウム pH4を各ウェルに添加する
5.室温にて5分間混合する
6.混合後にバッファーを除去する
7.100μLの100mM 酢酸ナトリウム pH4を各ウェルに添加する
8.室温にて5分間混合する
9.混合後にバッファーを除去する
10.脱イオン水で2回すすぐ
EAMを添加する
1.バイオプロセッサーのリザーバーおよびガスケットを取り除く
2.直ちにアレイを乾燥させる
3.EAMを適用する:
SPAに対して
a.400μLの50% アセトニトリル、0.5% TFAをSPAチューブに添加する
b.室温にて5分間混合する
c.1μLを各スポットに添加する
d.空気乾燥させる
e.1μLを各スポットに添加する
f.空気乾燥させる
CHCAに対して
a.200μLの50% ACN、0.25% TFAをCHCAチューブに添加する
b.室温にて5分間混合する
c.室温にて10,000rpmで1分間遠心分離を行う
d.上清を除去し、等量の50%アセトニトリル、0.25%TFAで希釈する
e.1μLを各スポットに適用する
f.空気乾燥させる
g.1μLを各スポットに適用する
h.空気乾燥させる
IMAC30およびH50プロテインチップ
IMAC30およびH50プロテインチップのプロトコールについては、それぞれ実施例1および2のプロトコールを参照されたい。IMAC30プロテインチップに対するプロトコールは、陰イオン交換分画ステップを除外した点を除き、本実施例における全てのチップと同様に、IMAC3プロテインチップに対して行われるものと本質的に同じである。IMAC30プロテインチップはサンプル閉じ込めのための疎水性バリアという付加的特徴を有するIMAC3アレイに対する代替となるものである。IMAC3アレイと同様に、IMAC30アレイは使用する前に遷移金属(例えば、銅またはニッケル)を用いて活性化する。
以下の条件をデータ取得のために使用した。
IMAC30 Ni:CHCA;SPA 低、SPA 高
Q10: CHCA、SPA 低、SPA 高
CM10: CHCA;SPA 低、SPA 高
H50: CHCA;SPA 低、SPA 高
CHCA
検出器電圧を2850ボルトに設定する
1000ダルトン〜200000ダルトンの範囲で最適化し、最大質量200000ダルトンに設定する
開始時レーザー強度を170に設定する
検出器感度を7に設定する
4000ダルトンの質量に焦点を合わせる
質量ディフレクターを1000ダルトンに設定する
データ取得方法をSeldi定量法に設定する
Seldi捕捉パラメーターを22、Δを5、transients perを5、終了ポジションを82に合わせる
強度220において2ショットの加温ポジションに合わせ、加温ショットを含まない
サンプルを処理する
SPA低
検出器電圧を2850ボルトに設定する
1000ダルトン〜200000ダルトンの範囲で最適化し、最大質量200000ダルトンに設定する
開始時レーザー強度を194に設定する
検出器感度を8に設定する
4000ダルトンの質量に焦点を合わせる
質量ディフレクターを1000ダルトンに設定する
データ取得方法をSeldi定量法に設定する
Seldi捕捉パラメーターを22、Δを5、transients perを5、終了ポジションを82に合わせる
強度220において2ショットの加温ポジションに合わせ、加温ショットを含まない
サンプルを処理する
SPA高
検出器電圧を2850ボルトに設定する
10000ダルトン〜200000ダルトンの間で最適化し、最大質量200000ダルトンに設定する
開始時レーザー強度を199に設定する
検出器感度を8に設定する
12000ダルトンの質量に焦点を合わせる
マスディフレクターを4000ダルトンに設定する
データ取得方法をSeldi定量法に設定する
Seldi捕捉パラメーターを22、Δを5、transients perを5、終了ポジションを82に合わせる
強度220において2ショットの加温ポジションに合わせ、加温ショットを含まない
サンプルを処理する
(4.データ分析)
スペクトルデータは、CiphergenExpressTM Data Manager 2.1.を使用して大規模データ処理および単変量解析を行うProteinChip Software バージョン 3.1.を用いて収集した。スペクトルの前処理工程には、ベースライン減算を含むスペクトルの前処理、および、内生分析物由来の既知の質量サンプルを使用した内部分子量キャリブレーションを含んでいた。ピーク強度の標準化は外部係数0.2を用いて総イオン電流により実行した。ピークラベリングおよび異なるスペクトルにわたるクラスター化はユーザーが定義して設定を利用し、ソフトウェアによって自動的に行った。各グループにわたる個々のピークについてのピーク強度 P値は、2群比較についてMann−Whitneyテストを用いて、および3以上の群についてKruskal−Wallisテストを用いて計算した。サンプルを最も良好に分類するように予め定義した表現型に基づき、多変量データ分析をBiomarker PatternsTM Software 5.0を用いて実行した。
上記プロテインチップおよび条件を使用して、トレーニング群(「調査2」、すなわち、上記サンプル群の2/3)の解析の後に、単変量バイオマーカー群(P<0.005)について全条件下で同定した。結果を以下の表IIにまとめる。
(表IV−B)
M11727:このタンパク質はβ2ミクログロブリン(Swiss−Prot 登録番号P01884、http://us.expasy.org/cgi−bin/niceprot.pl?P01884)として同定された。この知見は実施例1および2の知見と一致する。β2ミクログロブリン(B2M)は、(1)主要組織適合複合体 クラスI分子の細胞内輸送を指令する;および(2)炎症における重要な役割も担うインターフェロンおよび特定のサイトカインによってモジュレートされるという意味において、炎症性反応の強力なイニシエーターである。ADに対するCSFバイオマーカーとしてのB2Mの役割は今までに議論されていた。しかし、今回、血液中のADのためのバイオマーカーとしてB2Mが同定された。
(特性判定された神経病理学的関連性を有するマーカーのリスト)
(A.サンプルプロトコール)
1. 0.25mg/mLのシスタチンC抗体を含む2μLの溶液をPS−20アレイ(Ciphergen Biosystems社、Fremont、カリフォルニア州)の各スポットに手作業で載せる。陰性対照として、同濃度のIgGを別のスポットに対して使用する。
CysC Δ1−8のアルツハイマー病のためのマーカーとしての使用を検証するために、158の脳脊髄液(CSF)サンプルは、3つのグループ:(1)アルツハイマー病(AD)、対照、および非アルツハイマー性痴呆(非AD)として予め診断された被験体から採取した。これらのグループのサンプル分布は上記表IIIに示す。
上述したように、バイオマーカーの組み合わせは、単一のバイオマーカーのみよりも特定の症状について、より大きな予測値を提供し得る。サンプル中の複数のバイオマーカーは試験の感度および/または特異度を増加させ得る。患者のアルツハイマー病の病態を認定するための好ましいバイオマーカー群は、その群の中のバイオマーカーがin vivoで互いに独立して調節されるものである。好ましい試験は80%より高い感度および特異度を有する。さらにより好ましいのは、感度および特異度の両方が90%より高い試験である。組み合わせ試験のために好ましいバイオマーカー群のひとつの例は、M17349.3(アポリポタンパク質 A−II二量体)、M60464.7(ヘモペキシン)、およびM3513.9(7B2 CT断片)である。好ましいバイオマーカー群の別の例は、M17349.3(アポリポタンパク質 A−II二量体)、M60464.7(ヘモペキシン)、M10379.8(10.3kDa)および M11725.7(β−2−ミクログロブリン)を含む群である。
Claims (28)
- 被験体におけるアルツハイマー病の病態を認定するためのデータを収集する方法であって、該方法は、以下:
該被験体由来のCSFサンプル中のバイオマーカーを測定する工程であって、該バイオマーカーが、M12545.9(シスタチン−C(NTから−8aa))である、工程、を包含し、
ここで、該CSFサンプル中の該バイオマーカーの測定から得られた測定値は、アルツハイマー病の病態と相関関係付けされ得;そして
該M12545.9(シスタチン−C(NTから−8aa))は、全長シスタチンCのN末端から8アミノ酸が欠失しているシスタチンCの短縮型形態である、方法。 - 請求項1に記載の方法であって、前記被験体由来の生体サンプル中の少なくとも1種類のさらなるバイオマーカーを測定する工程をさらに包含し、該少なくとも1種類のさらなるバイオマーカーが、M16207.4(膵臓リボヌクレアーゼ)、M8938.5(C3a des−Arg)、M3513.9(7B2 CT断片)、M8291.0(ユビキチン(CTから−3aa))、M9802.4(EA−92(ChrAペプチド))、M14092.7(S−グルタチオニル化トランスサイレチン)、M13904.7(トランスサイレチンS−Cys/S−CysGly)、M8183.6(ユビキチン(CTから−4aa))、M5227.4、M3687.0(セクレトニューリン(ChrC/SGIIペプチド))、M3906.4 バソスタチンII(ChrAペプチド)、M14565.1(膵臓リボヌクレアーゼ)、M6509.6(クロモグラニンBペプチド)、M4320.6(A−β 1−40)、M7258.2(クロモグラニンBペプチド)、M23477.4(プロスタグランジン−Dシンターゼ)、M4357.0(α−1−アンチキモトリプシンCT断片)、M7653.2(オステオポンチンCT断片)、M4812.5(VGF(NCBI)ペプチド)、M4989.4(アセチル化チモシンβ−4)、M7718.8(リン酸化オステオポンチンCT断片)、M6446.3(アポリポタンパク質C−I)、M17349.3(アポリポタンパク質A−II二量体)、M60464.7(ヘモペキシン)、M11725.7(β−2−ミクログロブリン)、M78936.5(トランスフェリン)、M13349.5(シスタチンC)、M66479.2(アルブミン)およびM8585.9(ユビキチン)からなる群から選択される、方法。
- 少なくとも以下の各バイオマーカー:
M12545.9(シスタチン−C(NTから−8aa))、M16207.4(膵臓リボヌクレアーゼ)、M8938.5(C3a des−Arg)、M6446.3(アポリポタンパク質C−I)およびM13349.5(シスタチンC)が、測定される、請求項2に記載の方法。 - 少なくとも以下の各バイオマーカー:
M12545.9(シスタチン−C(NTから−8aa))およびM6446.3(アポリポタンパク質C−I)が、測定される、請求項2に記載の方法。 - 少なくとも以下の各バイオマーカー:
M12545.9(シスタチン−C(NTから−8aa))およびM16207.4(膵臓リボヌクレアーゼ)が、測定される、請求項2に記載の方法。 - 前記バイオマーカーが、
SELDIプローブの吸着剤表面上の該バイオマーカーを捕捉し、レーザー脱離イオン化質量分析法によって該捕捉されたバイオマーカーを検出すること
によって測定される、請求項1または2のいずれかに記載の方法。 - 前記バイオマーカーが、イムノアッセイにより測定される、請求項1または2のいずれかに記載の方法。
- 前記相関関係付けが、ソフトウェア分類アルゴリズムにより実行される、請求項1または2のいずれかに記載の方法。
- 前記データは、前記病態に基づいて被験体の治療を管理することにおける使用が意図される、請求項1または2のいずれかに記載の方法。
- アルツハイマー病の病態がアルツハイマー病、非痴呆、および非アルツハイマー性痴呆から選択される、請求項1または2のいずれかに記載の方法。
- アルツハイマー病の病態がアルツハイマー病および非アルツハイマー性痴呆から選択される、請求項1または2のいずれかに記載の方法。
- 非アルツハイマー性痴呆がレヴィー小体を伴う痴呆および前頭側頭型痴呆から選択される、請求項11に記載の方法。
- 前記吸着剤が陽イオン交換吸着剤である、請求項6に記載の方法。
- 前記吸着剤が生体特異的吸着剤である、請求項6に記載の方法。
- 前記吸着剤が疎水性吸着剤である、請求項6に記載の方法。
- 前記バイオマーカーが、質量以外の検出手段により測定される、請求項1に記載の方法。
- 前記バイオマーカーが、イムノアッセイにより測定される、請求項16に記載の方法。
- 前記測定値がアルツハイマー病と相関する場合に、被験体の治療の管理が、該被験体へのコリンエステラーゼ阻害剤の投与を包含する、請求項9に記載の方法。
- 被験体の管理の後にM12545.9(シスタチン−C(NTから−8aa))を測定する工程、
をさらに包含する、請求項9に記載の方法。 - キットであって、以下:
(a)固体支持体であって、該固体支持体は、該支持体に付着した捕捉試薬を含み、該捕捉試薬が、M12545.9(シスタチン(NTから−8aa))と結合する、固体支持体、ならびに
(b)被験体におけるアルツハイマー病の病態を認定するための情報を収集するために、該固体支持体を使用してM12545.9(シスタチン(NTから−8aa))を検出するための、説明書、
を含み、該M12545.9(シスタチン−C(NTから−8aa))は、全長シスタチンCのN末端から8アミノ酸が欠失しているシスタチンCの短縮型形態である、キット。 - 請求項20に記載のキットであって、
第2の固体支持体、および
被験体におけるアルツハイマー病の病態を認定するための情報を収集するために、該第2の固体支持体を使用するための、説明書、
をさらに含み、該固体支持体は、該支持体に付着した捕捉試薬を含み、該捕捉試薬が、M3513.9(7B2 CT断片)、M8291.0(ユビキチン(CTから−3aa))、M9802.4(EA−92(ChrAペプチド))、M14092.7(S−グルタチオニル化トランスサイレチン)、M13904.7(トランスサイレチンS−Cys/S−CysGly)、M8183.6(ユビキチン(CTから−4aa))、M5227.4、M3687.0(セクレトニューリン(ChrC/SGIIペプチド))、M3906.4 バソスタチンII(ChrAペプチド)、M14565.1(膵臓リボヌクレアーゼ)、M6509.6(クロモグラニンBペプチド)、M4320.6(A−β 1−40)、M7258.2(クロモグラニンBペプチド)、M23477.4(プロスタグランジン−Dシンターゼ)、M4357.0(α−1−アンチキモトリプシンCT断片)、M7653.2(オステオポンチンCT断片)、M4812.5(VGF(NCBI)ペプチド)、M4989.4(アセチル化チモシンβ−4)、M7718.8(リン酸化オステオポンチンCT断片)、M17349.3(アポリポタンパク質A−II二量体)、M60464.7(ヘモペキシン)、M11725.7(β−2−ミクログロブリン)、M78936.5(トランスフェリン)、M66479.2(アルブミン)、M8585.9(ユビキチン)、膵臓リボヌクレアーゼ(M16207.4)、C3a des−Arg(M8938.5)、シスタチンC(M13349.5)、およびアポリポタンパク質C−I(M6446.3)からなる群から選択される少なくとも1種類のさらなるバイオマーカーと結合する、キット。 - 前記捕捉試薬を含む固体支持体が、SELDIプローブである、請求項20または21のいずれかに記載のキット。
- (c)M12545.9(シスタチン−C(NTから−8aa))を含む容器、
をさらに含む、請求項20または21のいずれかに記載のキット。 - 前記捕捉試薬が陽イオン交換吸着剤である、請求項20に記載のキット。
- (c)陰イオン交換クロマトグラフィー吸着剤、
をさらに含む、請求項20または21のいずれかに記載のキット。 - ソフトウェアであって、以下:
a.サンプルに起因するデータにアクセスするコードであって、該データは該サンプル中のバイオマーカーの測定値を含み、該バイオマーカーは、M12545.9(シスタチン−C(NTから−8aa))である、コード;ならびに
b.該サンプルのアルツハイマー病の病態を該サンプル中の該バイオマーカーの測定から得られた測定値の関数として分類する分類アルゴリズムを実行するコード、
を備え;
該M12545.9(シスタチン−C(NTから−8aa))は、全長シスタチンCのN末端から8アミノ酸が欠失しているシスタチンCの短縮型形態である、ソフトウェア。 - 請求項26に記載のソフトウェアであって、前記分類アルゴリズムが、M16207.4(膵臓リボヌクレアーゼ)、M8938.5(C3a des−Arg)、M3513.9(7B2 CT断片)、M8291.0(ユビキチン(CTから−3aa))、M9802.4(EA−92(ChrAペプチド))、M14092.7(S−グルタチオニル化トランスサイレチン)、M13904.7(トランスサイレチンS−Cys/S−CysGly)、M8183.6(ユビキチン(CTから−4aa))、M5227.4、M3687.0(セクレトニューリン(ChrC/SGIIペプチド))、M3906.4
バソスタチンII(ChrAペプチド)、M6509.6(クロモグラニンBペプチド)、M4320.6(A−β 1−40)、M7258.2(クロモグラニンBペプチド)、M23477.4(プロスタグランジン−Dシンターゼ)、M4357.0(α−1−アンチキモトリプシンCT断片)、M7653.2(オステオポンチンCT断片)、M4812.5(VGF(NCBI)ペプチド)、M4989.4(アセチル化チモシンβ−4)、M7718.8(リン酸化オステオポンチンCT断片)、M6446.3(アポリポタンパク質C−I)、M17349.3(アポリポタンパク質A−II二量体)、M60464.7(ヘモペキシン)、M11725.7(β−2−ミクログロブリン)、M78936.5(トランスフェリン)、M13349.5(シスタチンC)、M66479.2(アルブミン)およびM8585.9(ユビキチン)からなる群から選択される少なくとも1種類のさらなるバイオマーカーの測定値の関数として前記サンプルの前記アルツハイマー病の病態を分類する、ソフトウェア。 - 被験体の痴呆の病態を認定するためのデータを収集する方法であって、該痴呆の病態は非痴呆および非アルツハイマー性痴呆から選択され、該方法は、
該被験体由来の生体サンプル中のM12545.9(シスタチン−C(NTから−8aa))を測定する工程、
を包含し、
ここで、該生体サンプル中の該M12545.9(シスタチン−C(NTから−8aa))の測定から得られた測定値は、非アルツハイマー性痴呆の病態と相関関係付けされ得;そして
該M12545.9(シスタチン−C(NTから−8aa))は、全長シスタチンCのN末端から8アミノ酸が欠失しているシスタチンCの短縮型形態である、方法。
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