CN113322222A - 一种表达猫ω干扰素的基因工程菌的生产工艺 - Google Patents

一种表达猫ω干扰素的基因工程菌的生产工艺 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种表达猫ω干扰素的基因工程菌的生产工艺，包括以下步骤：猫干扰素工程菌的构建和重组大肠杆菌诱导表达生产工艺，所述重组大肠杆菌诱导表达生产工艺依次包括发酵、上罐发酵、离心与破碎、包涵体洗涤、变性、纯化、复性和过滤除菌。本发明工艺简单有效，所制备的基因工程菌的阴性对照孔的细胞未产生任何病变，得到的干扰素本身对细胞没有毒害作用；且经104倍稀释的猫ω干扰素能100％抑制细胞病变，而105倍稀释的干扰素有3个孔出现细胞病变，106倍稀释的干扰素有5个孔出现细胞病变，得出猫ω干扰素抗VSV比活性为1.42×107U/mg。

Description

一种表达猫ω干扰素的基因工程菌的生产工艺
技术领域
本发明涉及宠物用药技术领域，具体涉及一种表达猫ω干扰素的基因工程菌的生产工艺。
背景技术
随着我国经济的迅速发展和人民生活水平的不断提高，我国的宠物行业也得到了飞速的发展。目前我国宠物犬、猫的数量约有1亿只，且数量仍在急剧增长，而围绕宠物发生的消费也在急剧增加，展示着巨大的市场前景。但是，同时我们也清楚地看到，越来越多越来越复杂的犬、猫疾病，特别是各种病毒性疾病，严重地危害着它们的健康，同时也威胁到人类健康。农业部第560公告废止了包括金刚烷胺、金刚乙胺、阿昔洛韦、吗啉(双)胍(病毒灵)、利巴韦林等抗病毒西药的使用，使得广大兽医和养殖人员急需一种无残留、安全的抗病毒药，而干扰素作为一种安全生物制品填补了市场的空白。干扰素具有的生物学活性，及其速效多能的特点使其在防止病毒性传染病，抑制肿瘤生长，免疫调节等方面具有重要意义。
本项目旨在构建高效表达工程菌诱导表达猫干扰素，制备有效的猫干扰素生物制剂，对防治猫科疾病，尤其是各种病毒性疾病具有重要的指导意义。
一般情况下，动物体内相关细胞的干扰素基因处于静止状态，只有在病毒等因素的诱导下才能表达，且表达量极微，难以直接提取纯化。因此，应用干扰素防治病毒性疾病时，必须考虑研制和开发高效生产干扰素的途径。而利用基因工程技术研制和开发重组干扰素是一条高效而经济的途径，生产具有廉价、广谱抗病毒活性、无毒害、无残留等优点的干扰素是促使干扰素在兽医临床上推广应用的有效途径。
目前，猫ω干扰素工程菌可溶性表达量相对包涵体表达量较低，且易受环境因素影响，导致蛋白发生聚沉现象，扩大生产难度增加；本文旨在提供一种猫ω干扰素包涵体的生产制备工艺。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的缺陷和不足，提供一种表达猫ω干扰素的基因工程菌的生产工艺。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种表达猫ω干扰素的基因工程菌的生产工艺，其创新点在于，包括以下步骤：猫干扰素工程菌的构建和重组大肠杆菌诱导表达生产工艺，所述重组大肠杆菌诱导表达生产工艺依次包括发酵、上罐发酵、离心与破碎、包涵体洗涤、变性、纯化、复性和过滤除菌，具体步骤如下；
S1、猫干扰素工程菌的构建：登录GenBank，查找编码猫ω干扰素成熟蛋白的基因序列(序列号为：NM_001102440.1)利用SignalP 3.0Server软件预测此基因可能含有一段信号肽序列，为其氨基酸序列的前23个氨基酸，利用TargetP 1.1server软件检测此序列功能，发现其为帮助蛋白分泌的信号肽而非蛋白结构所必需，因此去掉信号肽序列，剩下编码成熟猫ω干扰素的基因序列，其核苷酸长度为543；将猫ω干扰素的编码密码子与大肠杆菌偏好性密码子进行比对，根据密码子的兼并性，在不改变氨基酸组成和排列的基础上，对已知的编码猫ω干扰素的基因序列进行改造，替换为大肠杆菌偏好的密码子，然后将替后的基因序列5’、3’端分别加上NdeI、XhoI酶切位点进行全基因合成，并连接入原核表达质粒pET28a中，得到重组原核表达质粒pET28a-FeIFN-ω；将重组质粒转入大肠杆菌BL21中，构建筛选出猫干扰素工程菌；
S2、重组大肠杆菌诱导表达生产工艺：
2.1、发酵：取1mL带有重组质粒甘油管接种于200mL含卡那霉素的LB培养液(胰蛋白胨10％，酵母浸出粉5％，氯化钠10％)中，37℃培养200r/min培养12-18小时，制备一级种子；一级种子液以4％的接种量接种于600mL含卡那霉素的LB培养液，共接两瓶，37℃培养200r/min培养4h，制备二级种子；
2.2、上罐发酵：在发酵罐内装入培养基和消泡剂后，灭菌后按照培养基体积的5％接种二级种子液，37℃通气培养，在培养至OD600值为4.0-6.0时加入终浓度为0.3mM的IPTG进行诱导表达，再继续培养5-6h，pH控制在6.5左右，溶氧控制在30％以上，当溶液迅速上升时，流加补料；
2.3、离心与破碎：培养结束后，离心收集菌体，对湿重菌体进行称重，按1:20(w/v)比例用溶液I(pH值8.0，10mmol/L Tris·Cl、1.0mmol/L EDTA)重悬菌体，高压均质机在800～1000bar破碎3～5次，将破碎菌体4℃以8000r/min离心30min，所得沉淀即为包涵体；
2.4、包涵体洗涤：将包涵体分别用溶液II(pH值8.0，10mmol/L Tris·Cl、1.0mmol/L EDTA、1％TritonX-100)、溶液III(pH值8.0，10mmol/L Tris·Cl、1.0mmol/LEDTA、2.0mol/L尿素)各洗涤一次，4℃以8000r/min离心20分钟收集沉淀，即为初步纯化的干扰素包涵体：
2.5、变性：按1:40(w/v)比例加入变性液充分溶解包涵体，2～8℃搅拌48小时，使包涵体完全溶解，4℃以8000r/min离心10分钟收集上清，再0.22μm过滤，即为包涵体的变性溶液；
2.6、纯化：按照蛋白纯化仪的操作说明进行操作，采用ChelatingSepharoseTMFast Flow亲和层析填料预装装柱，用PBS清洗至基线平稳，再用结合缓冲液(pH值8.0，500mmol/L咪唑、50mmol/L Tris·Cl、100mmol/L NaCl、8.0mol/L尿素)平衡至基线平稳；平衡后取10mL变性溶液上样，再用结合缓冲液洗去未与层析柱结合的杂蛋白；最后用洗脱缓冲液(pH值8.0，500mmol/L咪唑、50mmol/L Tris·Cl、100mmol/L NaCl、8.0mol/L尿素)洗脱收集目的蛋白；
2.7、复性：将上述收集的目的蛋白按Bradford蛋白质定量试剂盒说明书进行蛋白含量测定；变性蛋白适量分批缓慢加到复性液，使复性液中蛋白终浓度为0.1mg/ml，2～8℃边加边搅拌，复性24～48小时，复性后用透析去除小分子物质；
2.8、过滤除菌：采用0.22μm过滤除菌，即为干扰素半成品。
进一步的，所述步骤变性中的变性液：pH值8.0，10mmol/L Tris·Cl、6.0-8.0mol/L盐酸胍。
进一步的，所述变性液：pH值8.0，10mmol/L Tris·Cl、7.0mol/L的盐酸胍。
进一步的，所述步骤纯化中的上样和洗脱时流速控制在0.5mL/min。
进一步的，所述步骤复性中的复性液：pH值8.0，10mmol/L Tris、400-600mmol/LL-Arg、500mmol/L尿素、1.0mmol/L EDTA、2mmol/L胱氨酸、0.4mmol/L半胱氨酸、10-15％甘油、0.1-0.5％PEG6000。
进一步的，所述复性液：pH值8.0，10mmol/L Tris、400mmol/L L-Arg、500mmol/L尿素、1.0mmol/L EDTA、2mmol/L胱氨酸、0.4mmol/L半胱氨酸、10％甘油、0.1％PEG6000。
本发明有益效果为：
本发明工艺简单有效，所制备的基因工程菌的阴性对照孔的细胞未产生任何病变，得到的干扰素本身对细胞没有毒害作用；且经104倍稀释的猫ω干扰素能100％抑制细胞病变，而105倍稀释的干扰素有3个孔出现细胞病变，106倍稀释的干扰素有5个孔出现细胞病变，得出猫ω干扰素抗VSV比活性为1.42×107U/mg。
附图说明
图1为细胞破碎沉淀SDS-PAGE蛋白电泳图；
图2为Western Blot图。
图中M：蛋白Marker；1：IPTG诱导表达；2：未经IPTG诱导表达的。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步的说明。
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施方式仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
一种表达猫ω干扰素的基因工程菌的生产工艺，包括以下步骤：
1、猫干扰素工程菌的构建：
登录GenBank，查找编码猫ω干扰素成熟蛋白的基因序列(序列号为：NM_001102440.1)利用SignalP 3.0Server软件预测此基因可能含有一段信号肽序列，为其氨基酸序列的前23个氨基酸，利用TargetP 1.1server软件检测此序列功能，发现其为帮助蛋白分泌的信号肽而非蛋白结构所必需，因此去掉信号肽序列，剩下编码成熟猫ω干扰素的基因序列，其核苷酸长度为543；将猫ω干扰素的编码密码子与大肠杆菌偏好性密码子进行比对，根据密码子的兼并性，在不改变氨基酸组成和排列的基础上，对已知的编码猫ω干扰素的基因序列进行改造，替换为大肠杆菌偏好的密码子，旨在提高基因在大肠杆菌中的表达水平，优化后的基因序列为：
ATGTGTGCGCTGCCGGGTAGCCACGCGCAGGTTAGCCGTGATAACCTGGTTCTGCTGGGCCAGATGCGTCGTCTGAGCCCGTTCCTGTGCCTGCGTGCGCGTAAAGATTTCCGTTTCCCGCGTGAAATGCTGGAAGGTGGACAGCTGCGTGAAGCGCAGGCGGCGGCGGCGGTTCTGCGTGAACTGCTGCAGCAGACCTTCAACCTGCTGCACACCGAACGTTCTAGCGCAGCGTGGAGCCCGGCGCCGCTGCACGGCCTGCGTAGCGGCCTGCACCGTCAGCTGGAAGCGCTGGATGCGTGCCTGCTGCAGGCGACTGGCGAAGGTGAACGTGCTACCGGCGAAGGTGAACGTGCGCCGGGCATGCACGGTCCGGTTCTGGCGATCAAACGTTACTTCCAGGATATCCGTGTTTACCTGGAAGATGAAGGCTACTCTGATTGCGCGTGGGAAATCGTTCGTCTGGAAATCATGCGTGCGTTAAGCAGCTCCGCCACCCTGCAAGATTCCTTAGCCATCAAAGACGGCGATCTGGGTAGCAGCTAA
然后将替后的基因序列5’、3’端分别加上NdeI、XhoI酶切位点，送上海生工生物公司进行全基因合成，并连接入原核表达质粒pET28a中，得到重组原核表达质粒pET28a-FeIFN-ω；将重组质粒转入大肠杆菌BL21中，构建筛选出猫干扰素工程菌。
2、重组大肠杆菌诱导表达生产工艺：
2.1发酵
取1mL带有重组质粒甘油管接种于200mL含卡那霉素的LB培养液(胰蛋白胨10％，酵母浸出粉5％，氯化钠10％)中，37℃培养200r/min培养12-18小时，制备一级种子；一级种子液以4％的接种量接种于600mL含卡那霉素的LB培养液，共接两瓶，37℃培养200r/min培养4h，制备二级种子。
2.2上罐发酵
在发酵罐内装入培养基和消泡剂后，灭菌后按照培养基体积的5％接种二级种子液，37℃通气培养，在培养至OD600值为4.0～6.0时加入终浓度为0.3mM的IPTG进行诱导表达，再继续培养5～6h，pH控制在6.5左右，溶氧控制在30％以上，当溶液迅速上升时，流加补料。
2.3离心与破碎
培养结束后，离心收集菌体，对湿重菌体进行称重，按1:20(w/v)比例用溶液I(pH值8.0，10mmol/L Tris·Cl、1.0mmol/L EDTA)重悬菌体，高压均质机在800～1000bar破碎3～5次，将破碎菌体4℃以8000r/min离心30min，所得沉淀即为包涵体。
2.4包涵体洗涤
将包涵体分别用溶液II(pH值8.0，10mmol/L Tris·Cl、1.0mmol/L EDTA、1％TritonX-100)、溶液III(pH值8.0，10mmol/L Tris·Cl、1.0mmol/L EDTA、2.0mol/L尿素)各洗涤一次，4℃以8000r/min离心20分钟收集沉淀，即为初步纯化的干扰素包涵体。
2.5变性
按1:40(w/v)比例加入变性液(pH值8.0，10mmol/L Tris·Cl、7.0mol/L盐酸胍)充分溶解包涵体，2～8℃搅拌48小时，使包涵体完全溶解，4℃以8000r/min离心10分钟收集上清，0.22μm过滤，即为包涵体的变性溶液。
2.6纯化
按照蛋白纯化仪的操作说明进行操作，采用GE公司Chelating SepharoseTMFastFlow亲和层析填料预装装柱，用PBS清洗至基线平稳，再用结合缓冲液(pH值8.0，500mmol/L咪唑、50mmol/L Tris·Cl、100mmol/L NaCl、8.0mol/L尿素)平衡至基线平稳；平衡后取10mL变性溶液上样，再用结合缓冲液洗去未与层析柱结合的杂蛋白；最后用洗脱缓冲液(pH值8.0，500mmol/L咪唑、50mmol/L Tris·Cl、100mmol/L NaCl、8.0mol/L尿素)洗脱收集目的蛋白；其中上样和洗脱时流速控制在0.5mL/min。
2.7复性
将上述收集的目的蛋白按Bradford蛋白质定量试剂盒说明书进行蛋白含量测定。变性蛋白适量分批缓慢加到复性液(pH值8.0，10mmol/L Tris、400mmol/L L-Arg、500mmol/L尿素、1.0mmol/L EDTA、2mmol/L胱氨酸、0.4mmol/L半胱氨酸、10％甘油、0.1％PEG6000)，使复性液中蛋白终浓度为0.1mg/ml，2～8℃边加边搅拌，复性24～48小时，复性后用透析去除小分子物质。
2.8过滤除菌
采用0.22μm滤器过滤除菌，即为干扰素半成品。
进一步的，试验过程中分别收集变性液、纯化过程中的结合液和洗脱液，进行10倍稀释后，SDS-PAGE、Western Blot检测，考察蛋白表达效果。
实验结果：SDS-PAGE和Western Blot检测猫干扰素表达结果见图1、2。
进一步的，猫ω干扰素活性检测
将复性后制备的重组猫ω干扰素样品，进行抗病毒活性检测，采用微量细胞病变抑制法进行测定，将CRFK接种96孔板，待长成单层后弃去培养液，加入10倍系列稀释的重组猫ω干扰素，每个稀释度做6个重复，培养18-24小时后弃上清，用10TCID50的水泡性口炎病毒(VSV)进行攻毒，同时设立阴性对照(只加10倍稀释的干扰素，不加病毒)，阳性对照(只加病毒，不加干扰素)，空白对照(不加干扰素，不加病毒)，攻毒培养24小时，倒置显微镜下观察细胞病变，待阳性对照孔出现75％病变时判定结果。
实验结果：(1)阴性对照孔的细胞未产生任何病变，说明本实施例得到的干扰素本身对细胞没有毒害作用；(2)经104倍稀释的猫ω干扰素能100％抑制细胞病变，而105倍稀释的干扰素有3个孔出现细胞病变，106倍稀释的干扰素有5个孔出现细胞病变，由上述结果得出猫ω干扰素抗VSV比活性为1.42×107U/mg。
以上所述，仅用以说明本发明的技术方案而非限制，本领域普通技术人员对本发明的技术方案所做的其它修改或者等同替换，只要不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (6)

1.一种表达猫ω干扰素的基因工程菌的生产工艺，其特征在于，包括以下步骤：猫干扰素工程菌的构建和重组大肠杆菌诱导表达生产工艺，所述重组大肠杆菌诱导表达生产工艺依次包括发酵、上罐发酵、离心与破碎、包涵体洗涤、变性、纯化、复性和过滤除菌，具体步骤如下；
S1、猫干扰素工程菌的构建：登录GenBank，查找编码猫ω干扰素成熟蛋白的基因序列(序列号为：NM_001102440.1)利用SignalP 3.0Server软件预测此基因可能含有一段信号肽序列，为其氨基酸序列的前23个氨基酸，利用TargetP 1.1server软件检测此序列功能，发现其为帮助蛋白分泌的信号肽而非蛋白结构所必需，因此去掉信号肽序列，剩下编码成熟猫ω干扰素的基因序列，其核苷酸长度为543bp；将猫ω干扰素的编码密码子与大肠杆菌偏好性密码子进行比对，根据密码子的兼并性，在不改变氨基酸组成和排列的基础上，对已知的编码猫ω干扰素的基因序列进行改造，替换为大肠杆菌偏好的密码子，然后将替后的基因序列5’、3’端分别加上NdeI、XhoI酶切位点进行全基因合成，并连接入原核表达质粒pET28a中，得到重组原核表达质粒pET28a-FeIFN-ω；将重组质粒转入大肠杆菌BL21中，构建筛选出猫干扰素工程菌；
S2、重组大肠杆菌诱导表达生产工艺：
2.1、发酵：取1mL带有重组质粒甘油管接种于200mL含50μg/ml卡那霉素的LB培养液(胰蛋白胨10％，酵母浸出粉5％，氯化钠10％)中，37℃培养200r/min培养12-18小时，制备一级种子；一级种子液以4％的接种量接种于600mL含卡那霉素的LB培养液，共接两瓶，37℃培养200r/min培养4h，制备二级种子；
2.2、上罐发酵：在发酵罐内装入培养基和消泡剂后，灭菌后按照培养基体积的5％接种二级种子液，37℃通气培养，在培养至OD600值为4.0-6.0时加入终浓度为0.3mM的IPTG进行诱导表达，再继续培养5-6h，pH控制在6.5左右，溶氧控制在30％以上，当溶液迅速上升时，流加补料；
2.3、离心与破碎：培养结束后，离心收集菌体，对湿重菌体进行称重，按1:20(w/v)比例用溶液I(pH值8.0，10mmol/L Tris·Cl、1.0mmol/L EDTA)重悬菌体，高压均质机在800～1000bar破碎3～5次，将破碎菌体4℃以8000r/min离心30min，所得沉淀即为包涵体；
2.4、包涵体洗涤：将包涵体分别用溶液II(pH值8.0，10mmol/L Tris·Cl、1.0mmol/LEDTA、1％TritonX-100)、溶液III(pH值8.0，10mmol/L Tris·Cl、1.0mmol/L EDTA、2.0mol/L尿素)各洗涤一次，4℃以8000r/min离心20分钟收集沉淀，即为初步纯化的干扰素包涵体：
2.5、变性：按1:40(w/v)比例加入变性液充分溶解包涵体，2～8℃搅拌48小时，使包涵体完全溶解，4℃以8000r/min离心10分钟收集上清，再0.22μm过滤，即为包涵体的变性溶液；
2.6、纯化：按照蛋白纯化仪的操作说明进行操作，采用Chelating SepharoseTMFastFlow亲和层析填料预装柱，用PBS清洗至基线平稳，再用结合缓冲液(pH值8.0，500mmol/L咪唑、50mmol/L Tris·Cl、100mmol/L NaCl、8.0mol/L尿素)平衡至基线平稳；平衡后取10mL变性溶液上样，再用结合缓冲液洗去未与层析柱结合的杂蛋白；最后用洗脱缓冲液(pH值8.0，500mmol/L咪唑、50mmol/L Tris·Cl、100mmol/L NaCl、8.0mol/L尿素)洗脱收集目的蛋白；
2.7、复性：将上述收集的目的蛋白按Bradford蛋白质定量试剂盒说明书进行蛋白含量测定；变性蛋白适量分批缓慢加到复性液，使复性液中蛋白终浓度为0.1mg/ml，2～8℃边加边搅拌，复性24～48小时，复性后用透析去除小分子物质；
2.8、过滤除菌：采用0.22μm滤器过滤除菌，即为干扰素半成品。
2.根据权利要求1所述的一种表达猫ω干扰素的基因工程菌的生产工艺，其特征在于，所述步骤变性中的变性液：pH值8.0，10mmol/L Tris·Cl、6.0-8.0mol/L盐酸胍。
3.根据权利要求2所述的一种表达猫ω干扰素的基因工程菌的生产工艺，其特征在于，所述变性液：pH值8.0，10mmol/L Tris·Cl、7.0mol/L的盐酸胍。
4.根据权利要求1所述的一种表达猫ω干扰素的基因工程菌的生产工艺，其特征在于：所述步骤纯化中的上样和洗脱时流速控制在0.5mL/min。
5.根据权利要求1所述的一种表达猫ω干扰素的基因工程菌的生产工艺，其特征在于，所述步骤复性中的复性液：pH值8.0，10mmol/L Tris、400-600mmol/L L-Arg、500mmol/L尿素、1.0mmol/L EDTA、2mmol/L胱氨酸、0.4mmol/L半胱氨酸、10-15％甘油、0.1-0.5％PEG6000。
6.根据权利要求5所述的一种表达猫ω干扰素的基因工程菌的生产工艺，其特征在于，所述复性液：pH值8.0，10mmol/L Tris、400mmol/L L-Arg、500mmol/L尿素、1.0mmol/LEDTA、2mmol/L胱氨酸、0.4mmol/L半胱氨酸、10％甘油、0.1％PEG6000。
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