CN113322215B - 一种蜡样芽孢杆菌高密度发酵方法及应用 - Google Patents

一种蜡样芽孢杆菌高密度发酵方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种蜡样芽孢杆菌高密度发酵方法及应用，属于发酵工程技术领域。本发明通过将定时、瞬时补充菌体生长所需的营养物质，在菌体生长阶段转换不同的碱液以维持pH与三段式调控溶氧方式相结合的策略进行蜡样芽孢杆菌的高密度发酵。使得发酵结束后，蜡样芽孢杆菌干重达到40‑48g/L，相比传统连续发酵提高了70～135％，相比不进行补料的发酵方法提高了328％。本发明的方法有效提高蜡样芽胞杆菌菌体干重，简单易行容易实施，具有广阔的应用前景。

Description

一种蜡样芽孢杆菌高密度发酵方法及应用
技术领域
本发明涉及一种蜡样芽孢杆菌高密度发酵方法及应用，属于发酵工程技术领域。
背景技术
蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)是一种常见的益生菌，能够产生芽孢，具有较强的抗逆性，表现为耐酸碱，耐高温以及耐一些有毒的化学毒素等。在自然界中，与大多数动植物具有密切的共生关系，且能够产生多种益生因子。蜡样芽孢杆菌在处理废水，土壤修复，生产高产量的酶，细菌素，充当免疫活性物质，制备成生物菌制剂后用于治疗植物疾病，防治人与动物腹泻等方面均有应用，在农业，食品，保健品，环境保护等方面都是常用的材料。
作为益生菌制剂，在体内发挥作用的基础是达到一定的数量与活性，并且需要有稳定耐储藏的优势，蜡样芽孢杆菌的芽孢则正好具有很强的抗逆性，因此利用蜡样芽孢杆菌制备生物菌制剂时，需要提高其芽孢率。而利用蜡样芽孢杆菌高产各种生物益生物质也需要建立在菌体浓度相对较高的基础上，因此蜡样芽孢杆菌的高密度发酵对于制作益生菌制剂与生产益生物质都具有重要作用。
通常，菌体会在复合培养基中进行分批发酵，常规的高密度发酵有几种补料分批发酵方法，分别是pH-stat方法、DO-stat方法、指数供料方法、恒定速率供料方法和定时脉冲供料方法等。传统的DO-stat控制只是简单地基于营养物质限制或消耗时，培养基中的碳基质不足或者氧气消耗减少，甚至呼吸停止等造成的DO升高/尖峰的概念。DO-stat控制的基本操作方法就是，对发酵液中的预期最高与最低DO进行设置，当检测到DO高于最高值或低于最低值时，开始自动流加或限制流加营养物质，使得发酵液中的DO维持在设定范围内。DO-stat策略适用于确定成分培养基，当培养基中的营养物质被消耗后，发酵液的DO将会升高，当培养基中的营养物质丰富，即能够通过氨基酸分解来支持细胞生存与繁殖时，DO-stat策略将不再适合。
当将复合培养基用于微生物生长即高密度发酵时，相对于DO-stat策略，pH-stat策略将更适合，因为一旦培养基中的碳源物质被耗尽时，发酵液中由于消耗碳源而产生的有机酸的量减少，从而导致发酵液中的pH开始上升。pH-stat的基本操作方法与DO-stat相似，也是提前设置预期最高pH值与最低pH值，当发酵液pH超出此范围时，***开始自动流加或限制流加营养物质，但pH-stat也存在自身的不足，由于当发酵液中营养物质耗尽时，pH的变化往往会慢于DO的变化，因此相对于DO-stat，pH-stat策略的供料控制相对缓慢。DO-stat方法和pH-stat方法都具有其各自的缺陷，不能充分满足蜡样芽胞杆菌高密度发酵。
发明内容
[技术问题]
现有技术中没有报道蜡样芽胞杆菌高密度发酵的可行方法。
[技术方案]
本发明提供了一种蜡样芽孢杆菌高密度发酵方法，其中包括定时瞬时营养物质(大豆蛋白胨、酵母提取物混合物与葡萄糖)的添加。此方法能够保证菌体生长有足够营养，且不会由于营养物质浓度过高以及营养物质的碳氮比不适宜而产生抑制效果。在菌体对数生长中期时，提高搅拌转速与通气量，在菌体达到稳定期时降低搅拌转速提高通气量，此方法是一种较简单易实施且适用于蜡样芽孢杆菌的高密度发酵方法。
本发明提供一种高密度生产蜡样芽孢杆菌菌体的方法，所述方法包括如下步骤：
(a)将活化的蜡样芽胞杆菌接种于培养基中培养获得种子液；
(b)将步骤(a)中的种子液接种于发酵初始培养基中，当发酵至对数生长期时，每隔1.5～2.5h以脉冲方式补加进料培养基，当菌体达到稳定期时，停止补加进料培养基，当发酵至25～35h，停止发酵；
在一种实施方式中，步骤(b)中，所述进料培养基含有碳源、镁盐和氮源。
在一种实施方式中，所述碳源包含葡萄糖、可溶性淀粉和/或玉米粉；
在一种实施方式中，所述氮源包含酵母提取物、大豆蛋白胨、胰蛋白胨，鱼粉蛋白胨，豆粕饼粉和/或硫酸铵。
在一种实施方式中，步骤(b)中，通过流加碱液维持pH在6～7。
在一种实施方式中，所述碱液选自但不限于氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠、氢氧化钾、氨水、碳酸钾和氢氧化钙的碱。
在一种实施方式中，在菌体生长达到稳定期前流加氨水，在菌体生长达到稳定期后流加氢氧化钠。
在一种实施方式中，氢氧化钠浓度在1-3mol/L，氨水的浓度在10-50％。
在一种实施方式中，步骤(b)中，搅拌转速为200～400rpm、通气量Gas Flo为2～5L/min。
在一实施方式中，步骤(b)中，在蜡样芽胞杆菌对数生长期中期前保持转速为200～300rpm、Gas Flo为2～3L/min，在对数生长期中期到稳定期前保持转速为300～400rpm、Gas Flo为3～4L/min，在稳定期保持转速为200～300rpm、Gas Flo为4～5L/min。
在一种实施方式中，所述蜡样芽胞杆菌包括蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)ATCC 14579。
在一种实施方式中，步骤(b)中，所述种子液以体积比5～15％的接种量接种于发酵初始培养基中。
在一种实施方式中，步骤(b)中，发酵初始培养基为20～30g/L葡萄糖，5～15g/L酵母提取物，5～15g/L大豆蛋白胨，1～5g/L MgSO4·7H2O，1～5g/L(NH4)2SO4，0.25～0.75g/LMnSO4。
在一种实施方式中，步骤(b)中，进料培养基的补加量为50～70mL/次。
在一种实施方式中，所述对数生长期中期为菌体发酵8～10h。
在一种实施方式中，步骤(b)中，温度为31～33℃。
在一种实施方式中，所述进料培养基还含有磷酸二氢钾，磷酸氢二钾，氯化钠，氯化锰和/或氯化钙。
在一种实施方式中，所述进料培养基按g/L计由以下成分组成：200～400的葡萄糖、25～75的酵母提取物、50～100的大豆蛋白胨、2～4的硫酸镁和1～3的磷酸二氢钾。
在一种实施方式中，所述进料培养基按g/L计由以下成分组成：250～350的葡萄糖、40～60的酵母提取物、60～80的大豆蛋白胨、2～4的硫酸镁和1～3的磷酸二氢钾。
本发明还提供所述一种蜡样芽孢杆菌的高密度培养方法在制备益生菌菌剂方面的应用。
有益效果：
本发明提供的一种在补料分批培养中蜡样芽孢杆菌高密度发酵方法，使菌体干重达到40-48g/L，较不进行补料的发酵方法的菌体干重增加328％，较其他传统连续补料方法提高了70～135％。
具体实施方式
LB培养基(W/V)：胰蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，氯化钠1％，pH 7.0。
NA固体培养基(W/V)：胰蛋白胨1％，牛肉浸粉0.3％，氯化钠0.5％，琼脂2％，pH7.3。
种子培养基(W/V)：胰蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，氯化钠1％，葡萄糖1％，pH7.0。
实施例1不同分批补料的进料方法对蜡样芽胞杆菌高密度培养的影响
(1)将实验室保存的蜡样芽孢杆菌ATCC 14579转接到NA固体斜面培养基中，于30℃的恒温培养箱中培养24h，传代两次后置于4℃保存。
(2)从培养基上挑取两环活化后的菌苔，接种于装有50mL LB液体培养基的250mL摇瓶中，在30℃，200r/min条件下培养14～16h，获得一级种子液。
(3)将步骤(2)获得一级种子液以体积比2％的接种量接种于含有100mL种子培养基的500mL锥形瓶中培养14～16h，获得种子液。
(4)将步骤(3)获得种子液以体积比10％的接种量接种于含有2.5L发酵初始培养基的发酵罐中，温度(32℃±0.5)、pH(6.5±0.1)，通气量2.5L/min，搅拌转速200r/min。
发酵初始培养基：25g/L葡萄糖，10g/L酵母提取物，10g/L大豆蛋白胨，3g/LMgSO4·7H2O，3g/L(NH4)2SO4，0.5g/L MnSO4。
进料培养基：葡萄糖-300g/L、MgSO4-3 g/L、酵母提取物-50g/L、大豆蛋白胨-75g/L、磷酸二氢钾-2g/L。
针对供料，评价了不同的进料方法，尝试了五种不同的供料方法用于补料分批发酵，所有补料分批实验的发酵条件相同，在补料分批发酵过程中维持以下参数，温度(32℃±0.5)、pH(6.5±0.1)，发酵总时间为30h。
1、pH-stat方法：通过设定pH点来控制pH-stat进料，其中当培养物的pH升至高于7.2～7.5时补料，将进料培养基加入到培养基中，而当培养基中的pH降至低于6时，减缓或停止流加营养物质。
2、DO-stat方法：通过设定DO点来控制DO-stat进料，其中当培养物的DO升至高于30％时，将进料培养基加入到培养基中，而当培养基中的DO降至低于10％时，减缓或停止流加营养物质。
3、指数供料方法：菌体培养至对数生长期进行补料，流加进料培养基，进料速率从0.25mL/min开始，并且随着菌液OD的提高而增加。对于每6单位OD的增量，进料速率提高0.125mL/min，恒速流加改为0.6mL/min，待菌体生长达到稳定期时停止流加。
4、恒定速率供料方法：菌体培养至对数生长期进行补料，以恒速1mL/min流加进料培养基，持续整个对数生长期，待菌体生长达到稳定期时停止流加。
5、定时脉冲供料方法：菌体培养至对数生长期期间，每隔2h以脉冲方式补加一次进料培养基，补加量为60mL/次，待菌体生长达到稳定期时停止补料。
表1：不同供料方法的蜡样芽孢杆菌菌体干重
Figure BDA0003166543820000041
从表1可以看出，当不进行补料时，发酵30h，获得的菌体干重仅达到11.21g/L，其中定时脉冲供料方法能使菌体干重达到30.42g/L，较不进行补料的菌体干重提高了171％。
实施例2不同进料培养基对蜡样芽胞杆菌高密度培养的影响
(1)将实验室保存的蜡样芽孢杆菌ATCC 14579转接到NA固体斜面培养基中，于30℃的恒温培养箱中培养24h，传代两次后置于4℃保存。
(2)从培养基上挑取两环活化后的菌苔，接种于装有50mL LB液体培养基的250mL摇瓶中，在30℃，200r/min条件下培养14～16h，获得一级种子液。
(3)将步骤(2)获得一级种子液以体积比2％的接种量接种于含有100mL种子培养基的500mL锥形瓶中培养14～16h，获得种子液。
(4)将步骤(3)获得种子液以体积比10％的接种量接种于含有2.5L发酵初始培养基的发酵罐中，温度(32℃±0.5)、pH(6.5±0.1)，通气量2.5L/min，搅拌转速200r/min，菌体生长至对数生长期进行补料。
使用定时脉冲供料的方法进行补料分批发酵，在菌体的对数生长期期间，每隔2h以脉冲方式补加一次进料培养基，补加量为60mL/次，在补料分批发酵过程中维持以下参数，温度(32℃±0.5)、pH(6.5±0.1)，发酵总时间为30h。
针对进料培养基，评价了不同的供料，将以下的不同培养基用于发酵过程中的供料：
1、葡萄糖-300g/L；
2、葡萄糖-300g/L、MgSO4-3 g/L；
3、葡萄糖-300g/L、MgSO4-3 g/L、酵母提取物-50g/L；
4、葡萄糖-300g/L、MgSO4-3 g/L、大豆蛋白胨-75g/L；
5、葡萄糖-300g/L、MgSO4-3 g/L、酵母提取物-50g/L、大豆蛋白胨-75g/L；
6、葡萄糖-300g/L、MgSO4-3g/L、酵母提取物-50g/L、大豆蛋白胨-75g/L、磷酸二氢钾-2g/L；
7、葡萄糖-300g/L、MgSO4-3 g/L、酵母提取物-50g/L、大豆蛋白胨-75g/L、磷酸二氢钾-2g/L、氯化钠-4g/L。
表2：针对不同进料培养基组合物的蜡样芽孢杆菌菌体干重
Figure BDA0003166543820000051
由表2可以看出，当进料培养基为组合物6时，菌体干重获得最大值为35.41g/L，后续实施例中均采用组合物6的进料培养基。
实施例3不同维持pH的碱液对蜡样芽胞杆菌高密度培养的影响
(1)将实验室保存的蜡样芽孢杆菌ATCC 14579转接到NA固体斜面培养基中，于30℃的恒温培养箱中培养24h，传代两次后置于4℃保存。
(2)从培养基上挑取两环活化后的菌苔，接种于装有50mL LB液体培养基的250mL摇瓶中，在30℃，200r/min条件下培养14～16h，获得一级种子液。
(3)将步骤(2)获得一级种子液以体积比2％的接种量接种于含有100mL种子培养基的500mL锥形瓶中培养14～16h，获得种子液。
(4)将步骤(3)获得种子液以体积比10％的接种量接种于含有2.5L发酵初始培养基的发酵罐中，温度(32℃±0.5)、pH(6.5±0.1)，通气量2.5L/min，搅拌转速200r/min，菌体生长至对数生长期进行补料。
使用定时脉冲供料的方法进行补料分批发酵，在菌体的对数生长期期间，每隔2h以脉冲方式补加一次进料培养基，补加量为60mL/次，在补料分批发酵过程中维持以下参数，温度(32℃±0.5)、pH(6.5±0.1)，发酵总时间为30h。
进料培养基：葡萄糖-300g/L、MgSO4-3 g/L、酵母提取物-50g/L、大豆蛋白胨-75g/L、磷酸二氢钾-2g/L。
菌体在生长发酵过程中，培养基pH值会随之下降，为了维持培养基的pH(6.5±0.1)，评价了不同的维持pH的碱液，将以下不同碱液用于发酵的pH调控：
1、2mol/L氢氧化钠；
2、25％氨水；
3、25％氨水(菌体生长达到稳定期前)、2mol/L氢氧化钠(菌体生长达到稳定期后)；
4、50％氨水(菌体生长达到稳定期前)、2mol/L氢氧化钠(菌体生长达到稳定期后)。
表3：用于蜡样芽孢杆菌高密度发酵的补料分批发酵的pH维持的碱液
Figure BDA0003166543820000061
当使用氢氧化钠与氨水转换用于维持pH时，其将更利于蜡样芽孢杆菌高密度发酵，当只使用氨水维持pH时，菌体生长进入稳定后，不能利用过量的铵盐，造成铵盐过剩，从而影响菌体的正常生理与生殖代谢。然而，当细菌菌体生长进入对数生长期后，将碱液换成氢氧化钠，既能稳定调节发酵液pH，又能解决铵盐过剩问题，从而使得细菌菌体能够有较高产量。
实施例4不同转速与Gas Flo对对蜡样芽胞杆菌高密度培养的影响
(1)将实验室保存的蜡样芽孢杆菌ATCC 14579转接到NA固体斜面培养基中，于30℃的恒温培养箱中培养24h，传代两次后置于4℃保存。
(2)从培养基上挑取两环活化后的菌苔，接种于装有50mL LB液体培养基的250mL摇瓶中，在30℃，200r/min条件下培养14～16h，获得一级种子液。
(3)将步骤(2)获得一级种子液以体积比2％的接种量接种于含有100mL种子培养基的500mL锥形瓶中培养14～16h，获得种子液。
(4)将步骤(3)获得种子液以体积比10％的接种量接种于含有2.5L发酵初始培养基的发酵罐中，温度(32℃±0.5)、pH(6.5±0.1)，通气量2.5L/min，搅拌转速200r/min，菌体生长至对数生长期进行补料。
使用定时脉冲供料的方法进行补料分批发酵，在菌体的对数生长期期间，每隔2h以脉冲方式补加一次进料培养基，补加量为60mL/次，在补料分批发酵过程中维持以下参数，温度(32℃±0.5)、pH(6.5±0.1)，发酵总时间为30h。
进料培养基：葡萄糖-300g/L、MgSO4-3 g/L、酵母提取物-50g/L、大豆蛋白胨-75g/L、磷酸二氢钾-2g/L。
蜡样芽孢杆菌属于兼性厌氧菌，溶氧对于菌体生长有着至关重要的作用。将以下溶氧调控方式用于蜡样芽孢杆菌高密度发酵的补料分批发酵过程中：
1、全程保持转速为350rpm，Gas Flo为3.75L/min；
2、全程保持转速为250rpm，Gas Flo为2.75L/min；
3、全程保持转速为350rpm，Gas Flo为4.5L/min；
4、在对数生长期中期前保持转速为250rpm、Gas Flo为2.5L/min、在对数生长期中期后到稳定期前保持转速为350rpm、Gas Flo为3.5L/min，在菌体生长达到稳定期后，保持转速为250rpm、Gas Flo为4.5L/min。
表4：针对不同溶氧调控策略的蜡样芽孢杆菌菌体干重
Figure BDA0003166543820000071
Figure BDA0003166543820000081
因此，本发明的补料分批发酵的方法的蜡样芽孢杆菌菌体干重达到45-48g/L，较实施例1中不进行补料的发酵方法的菌体干重增加328％，较实施例1中其他传统连续补料方法提高了70～135％。
本领域技术人员将清楚本发明不限于之前说明性的实施例的详细内容并且本发明可以具体表现为其他特定形式，而没有脱离其基本属性，并且因此期望本发明的实施方案和实施例在所有方面中都被认为是说明性的，而非限制性的，参照所附权利要求。

Claims (6)

1.一种蜡样芽孢杆菌的高密度培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
(a)将活化的蜡样芽胞杆菌接种于培养基中培养获得种子液；
(b)将步骤(a)中的种子液接种于发酵初始培养基中，当发酵至对数生长期时，每隔1.5～2.5h以脉冲方式补加进料培养基，当菌体达到稳定期时，停止补加进料培养基，当发酵至25～35h，停止发酵；
步骤(b)中，所述进料培养基含有碳源、镁盐和氮源；
步骤(b)中，通过流加碱液维持pH在6～7；
步骤(b)中，搅拌转速为200～400rpm、通气量Gas Flo为2～5L/min；
步骤(b)中，在蜡样芽胞杆菌对数生长期中期前保持转速为200～300rpm、通气量GasFlo为2～3L/min，在对数生长期中期到稳定期前保持转速为300～400rpm、通气量Gas Flo为3～4L/min，在稳定期保持转速为200～300rpm、通气量Gas Flo为4～5L/min；
在菌体生长达到稳定期前流加氨水，在菌体生长达到稳定期后流加氢氧化钠；
所述进料培养基按g/L计由以下成分组成：200～400的葡萄糖、25～75的酵母提取物、50～100的大豆蛋白胨、2～4的硫酸镁和1～3的磷酸二氢钾。
2.根据权利要求1所述的一种蜡样芽孢杆菌的高密度培养方法，其特征在于，步骤(b)中，进料培养基还含有磷酸氢二钾、氯化锰和/或氯化钙。
3.根据权利要求1所述的一种蜡样芽孢杆菌的高密度培养方法，其特征在于，步骤(b)中，进料培养基的补加量为50～70mL/次。
4.根据权利要求1所述的一种蜡样芽孢杆菌的高密度培养方法，其特征在于，步骤(b)中，温度为31～33℃。
5.根据权利要求1所述的一种蜡样芽孢杆菌的高密度培养方法，其特征在于，氢氧化钠浓度在1-3mol/L，氨水的浓度在10-50％。
6.权利要求1～5所述一种蜡样芽孢杆菌的高密度培养方法在制备益生菌菌剂方面的应用。
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