CN113321743A

CN113321743A - 一种靶向赖氨酰氧化酶1的嵌合抗原受体及其用途

Info

Publication number: CN113321743A
Application number: CN202110752178.1A
Authority: CN
Inventors: 代小勇; 苏明
Original assignee: Hainan Precision Medical Technology Co ltd
Current assignee: Hainan Precision Medical Technology Co ltd
Priority date: 2021-07-02
Filing date: 2021-07-02
Publication date: 2021-08-31
Anticipated expiration: 2041-07-02
Also published as: CN113321743B

Abstract

本发明涉及靶向赖氨酰氧化酶1的嵌合抗原受体及其用途，具体提供给了一种分离的嵌合抗原受体，其包含抗赖氨酰氧化酶1的结合结构域、跨膜结构域以及细胞内信号传导结构域，所述抗赖氨酰氧化酶1的结合结构域为包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含重链互补决定区1‑3，所述轻链可变区包含轻链互补决定区1‑3。本发明还提供了一种免疫效应细胞，其包含本发明所述的嵌合抗原受体。本发明的免疫效应细胞具有显著抑制肿瘤的效果。

Description

一种靶向赖氨酰氧化酶1的嵌合抗原受体及其用途

技术领域

本发明涉及生物技术和生物医药领域，具体的涉及一种靶向赖氨酰氧化酶1的嵌合抗原受体及其用途。

背景技术

1.1乳腺癌

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，其发病率在全球范围内居于恶性肿瘤首位，也是死亡率最高的恶性肿瘤之一。根据美国癌症协会报道，2008年全球有超过138万女性罹患乳腺癌，占女性癌症新发病例数的23％，有超过45万人死于乳腺癌，占癌症死亡总人数的14％，且发达国家如西欧和北美等地区乳腺癌的发病率高于欠发达国家。2016年美国预计癌症新发病例数约为168.5万，癌症死亡例数为59.5万，其中乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，新发病例约为24.6万，占女性恶性肿瘤总发病例的29％；约4.05万人死于该病，占女性癌症死亡人数的14％。而在我国，乳腺癌的发病率近年来呈明显上升趋势。在1998年至2007年间，城市妇女和农村妇女的乳腺癌发病率年增长分别为3.9％和6.3％。根据中国抗癌协会公布的统计数字显示，我国每年新发乳腺癌病例约21万，发病率以每年3％的速度递增，在北京、上海、天津、广州等大城市已位居首位。从1991年至2000年间，我国乳腺癌患者死亡率增长了38.9％，成为死亡率增长最快的恶性肿瘤，已然成为了妇女健康的最大威胁。

乳腺癌早已是一种公认的全身性疾病，治疗主要是***性的多学科综合治疗，包括手术治疗、辅助放化疗、生物靶向治疗及内分泌治疗。随着乳腺钼靶X线摄片检查的普及、外科手术新技术的开展、放化疗技术的更新以及生物靶向治疗的推广等，乳腺癌的治疗已经取得了巨大进步，其治愈率得到了显著改善。但由于乳腺癌是一种具有高度异质性的恶性肿瘤，仍然使我们在治疗中面临着很大的困难，即使是早期乳腺癌患者，仍约有30％的患者治疗失败、出现转移。转移是乳腺癌患者死亡的首要原因，一旦发生复发转移，治愈率低于5％，预后不佳。因此，怎样针对乳腺癌的复发和转移进行有效的靶向治疗，对提高乳腺癌患者生存率和生活质量、改善预后具有重要实际意义。

1.2赖氨酰氧化酶(Lysyl Oxidase，LOX)

LOX是一种铜(Cu)依赖的氨基氧化酶，其基因位于人类常染色体5q23.1，由七个外显子和六个内含子组成。LOX是一种在细胞外基质形成和修复过程中起着重要作用的基质重塑酶，是细胞外基质中胶原与弹力蛋白聚合起始阶段稳定细胞外基质的关键酶。在Cu²⁺的辅助下，LOX能氧化细胞外基质中的胶原蛋白和弹性蛋白上特殊的氨基酸残基并使两者形成共价交联，调节组织的抗张强度、抵抗胶原酶的水解。LOX与配体结合后，在多种靶细胞内发挥生物学效应，包括调控细胞信号传导与基因转录，影响细胞运动迁移与细胞粘附等。

近年来，越来越多的学者通过研究发现赖氨酰氧化酶1(LOX-1)与恶性肿瘤的侵袭转移密切相关。LOX-1在癌细胞中的过表达可促使其具有侵袭性，并可抗癌细胞失巢凋亡，增加其运动能力和侵袭性，而LOX-1反义寡核苷酸能够抑制癌细胞的侵袭转移能力。有研究发现，LOX-1蛋白在乳腺癌组织中的表达显著高于癌旁正常乳腺组织及乳腺良性病变组织、在有腋窝***转移的乳腺癌高于无腋窝***转移者。韦薇等通过建立乳腺癌裸鼠原位移植瘤模型，接种转染LOX-RNAi-LV的MDA-MB-231细胞于裸鼠，待成瘤后测量移植瘤的体积和质量并进行对比，发现干扰MDA-MB-231乳腺癌细胞中LOX-1的表达可抑制乳腺癌裸鼠移植瘤的生长及侵袭。

1.3嵌合抗原受体T细胞免疫治疗技术

嵌合抗原受体T细胞免疫治疗技术也称CAR-T细胞治疗。CAR-T全称ChemericAntigenreceptor T-cell Immunotherapy，是将针对特定肿瘤的抗原的抗体与T细胞内的CD3ζ、FcεRIγ相结合后在患者T细胞上表达并进行体外扩增、筛选，并大量回输入患者体内。基本原理就是利用病人自身的免疫细胞来清除癌细胞，这是一种细胞疗法。CARs由T细胞受体(Tcell receptor，TCR)的胞内信号区(如CD3ζ和CD28)、跨膜区以及胞外抗原结合区组成。重组的CARs依赖抗原，但不依赖MHC的呈递，有效避免了MHC下调这一免疫逃逸机制。根据胞内信号域结构的差异，CAR可划分为四代，第一代CAR结构只有一个胞内信号组分(TCR/CD3ζ链和FcεRIγ链)，能够识别靶抗原并激活T细胞，无共刺激分子，不能转导增殖信号和诱导细胞因子产生，T细胞无法增殖，因而杀伤肿瘤效果甚微。第二代CAR细胞内增加了一个共刺激分子，如CD28、CD27、41BB(CD137)、OX40(CD134)或者可诱导共刺激分子(inducible co-stimulatorymolecule，ICOS)，即便没有外源性共刺激分子T细胞也能持续增殖并释放细胞因子。虽然二代CAR大大提高了T细胞抗肿瘤疗效，但仍未全面开启T细胞的杀伤能力，于是诞生了包含两个共刺激分子(CD28、4-1BB和CD3ζ)的第三代CAR。小鼠实验表明三代CAR能够增强细胞因子的分泌、抑制肿瘤生长。

由于受实体瘤中微环境复杂，免疫逃逸机制多样，肿瘤抗原靶点繁杂，且实体瘤体积大、CAR-T细胞难以归巢到肿瘤组织等多方面因素的影响，CAR-T在实体瘤的治疗实践中仍有部分障碍。卵巢癌是预后最差的妇科恶性肿瘤，近半个世纪以来其临床诊治无突破性进展，是最早尝试CAR-T治疗的实体瘤之一。二、三代CAR-T现处于临床研发中。目前世界范围内正在进行针对不同实体瘤抗原靶点的CAR-T细胞多中心临床研究，具有代表性的抗原靶点还包括：mesothelin用于治疗间皮瘤、胰腺癌、卵巢癌、肺癌；CEA用于治疗肺癌、结肠癌、胃癌、乳腺癌和胰腺癌；MUC-1用于治疗肝癌、肺癌、胰腺癌、结肠癌、胃癌、乳腺癌；GPC3用于肝癌；EGFR-vIl用于神经胶质瘤、头颈部肿瘤；PSMA用于***癌等。目前，随着CAR-T技术在血液肿瘤中的成功应用，CAR-T细胞技术进入了一个崭新的时代，也为肿瘤患者带来了新的希望。然而，尽管CAR-T细胞在血液肿瘤中显示了良好的治疗效果，但在实体瘤的应用中还面临诸多困难，如缺乏特异性的靶点、CAR-T细胞不能有效浸润入肿瘤组织和免疫抑制性微环境对CAR-T细胞的抑制性作用等。CAR-T细胞治疗的最终目标是治愈肿瘤，因此寻找新型高特异性的肿瘤表面抗原靶点或选择多个靶点进行治疗，可以促进CAR-T细胞向肿瘤组织的迁移浸润，解除肿瘤微环境的免疫抑制性，提高CAR-T细胞在实体瘤中的抗肿瘤效果。

发明内容

本发明提供了一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包含SEQ ID.1所示的氨基酸序列，本发明还提供编码所述嵌合抗原受体的核酸、包含所述核酸的载体、包含所述嵌合抗原受体、所述核酸分子和/或所述载体的免疫效应细胞、制备所述免疫效应细胞的方法、包含所述免疫效应细胞的组合物以及所述嵌合抗原受体的用途。

本发明所述的嵌合抗原受体至少包含以下一种有益效果：(1)在免疫细胞(例如，T细胞)表面稳定表达，表达量高；(2)具有较强的杀伤LOX-1阳性靶细胞的能力；(3)促进免疫细胞分泌细胞因子，例如，使T细胞分泌细胞因子(INF-γ或IL-6)的能力增强至少1倍、2倍或3倍以上；(4)无溶血性，不引起红细胞溶血或凝聚；(5)无血管刺激性，给药后不引起给药局部或全身异常；(6)无致瘤性，体内或体外不致瘤；(7)延长肿瘤患者的生存时间；(8)有效缓解肿瘤(如乳腺癌)病情；和，(9)安全性高，引起副作用(例如，细胞因子释放综合征或CAR-T细胞相关性脑病综合征)的风险较低。

一方面，本发明提供一种分离的嵌合抗原受体，其包含抗赖氨酰氧化酶1的结合结构域、跨膜结构域以及细胞内信号传导结构域，所述抗赖氨酰氧化酶1的结合结构域为包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述重链可变区包含重链互补决定区1(CDR-H1)、重链互补决定区2(CDR-H2)和重链互补决定区3(CDR-H3)，所述轻链可变区包含轻链互补决定区1(CDR-L1)、轻链互补决定区2(CDR-L2)和轻链互补决定区3(CDR-L3)，其中，

重链互补决定区1序列如SEQ ID No.11所示

SerSerAsnTrpTrpSer SEQ ID No.11；

重链互补决定区2序列如SEQ ID No.13所示

GluIleTyrHisSerGlySerThrAsnTyrAsnProSerLeuLysSer SEQ ID No.13；

重链互补决定区3序列如SEQ ID No.15所示

LeuLeuGlyGlyIleAlaGlyArgTrpPheAspPro SEQ ID No.15；

轻链互补决定区1序列如SEQ ID No.4所示

ArgAlaSerGlnSerValSerSerHisLeuAla SEQ ID No.4；

轻链互补决定区2序列如SEQ ID No.6所示

AspThrSerThrArgAlaThr SEQ ID No.6；

轻链互补决定区3序列如SEQ ID No.8所示

GlnGlnTyrGlySerSerProGlyTyrThr SEQ ID No.8。

进一步地，所述抗赖氨酰氧化酶1的结合结构域包含抗赖氨酰氧化酶1的单链可变片段(scFv)，所述抗赖氨酰氧化酶1的单链可变片段系列如SEQ ID NO.2所示。

进一步地，细胞内信号传导结构域中包含基础信号传导结构域，所述基础信号传导结构域选自CD3ζ、TCRζ、FcRIγ、FcRIβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD278(ICOS)、FcεRI、DAP10、DAP12或CD66d中的至少一种。

进一步地，细胞内信号传导结构域中包含还包含至少一种共刺激分子结构域，所述共刺激分子选自4-1BB、CD28、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CDS、ICAM-1、B7-H3、ICOS、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM、KIRDS2、SLAMF7、NKp80、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1、SLAMF4、CD84、CD96、CEACAM1、CRTAM、Ly9、CD160、PSGL1、CD100、CD69、SLAMF6、SLAM、BLAME、SELPLG、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a、CD28-OX40、CD28-4-1BB。优选地，包含两种共刺激分子结构域。

进一步地，跨膜结构域选自选自CD8、CD3ε、T细胞受体的α、β或ζ链、CD45、CD4、CD5、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137或CD154的跨膜结构域。

另一方面，本发明还提供一种编码嵌合抗原受体分离的核酸分子，其编码本发明上述的嵌合抗原受体。

另一方面，本发明还提供编码嵌合抗原受体的分离的核酸分子，其中，编码所述抗赖氨酰氧化酶1的结合结构域的核酸序列如SEQ ID NO.2所述。

另一方面，本发明还提供一种载体，其包含本发明所述的核酸分子。

进一步地，所述的载体选自DNA载体、RNA载体、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体或逆转录病毒载体。

另一方面，本发明还提供一种免疫效应细胞，其包含本发明所述的嵌合抗原受体、所述的核酸分子和/或所述的载体。

在某些实施方式中，所述免疫效应细胞选自以下组：T淋巴细胞和自然杀伤细胞。

在某些实施方式中，所述免疫效应细胞的表面表达本发明所述的嵌合抗原受体。

另一方面，本发明还提供制备免疫效应细胞的方法，其包括以下的步骤：向免疫效应细胞中转导本发明所述的载体。

另一方面，本发明还提供一种抗肿瘤的药物组合物，其包含本发明所述的免疫效应细胞。

另一方面，本发明还提供所述的嵌合抗原受体、所述的核酸分子、所述的载体和/或所述的免疫效应细胞用于制备药物的用途，其中所述药物用于治疗与赖氨酰氧化酶1的表达相关的疾病或病症，或用于提高细胞因子分泌。

在某些实施方式中，所述与赖氨酰氧化酶1的表达相关的疾病或病症包括血液肿瘤和实体瘤。

在某些实施方式中，所述实体瘤包括乳腺癌、肝癌、结直肠癌、非小细胞肺癌、***癌、胰腺癌、脑胶质瘤。

在某些实施方式中，细胞因子选自IFN-γ、IL-6和颗粒酶B中的至少一种。

再一方面，本发明提供了一种***的方法，所述方法包括将所述的嵌合抗原受体、所述的核酸分子、所述的载体和/或所述的免疫效应细胞施用时受试者的步骤。

进一步地，所述的免疫效应细胞的来源于受试者，并在体外向免疫效应细胞中转导本发明所述的载体，获得的免疫效应细胞施用于受试者。

本领域技术人员能够从下文的详细描述中容易地洞察到本发明的其它方面和优势。下文的详细描述中仅显示和描述了本发明的示例性实施方式。如本领域技术人员将认识到的，本发明的内容使得本领域技术人员能够对所公开的具体实施方式进行改动而不脱离本发明所涉及发明的精神和范围。相应地，本发明的附图和说明书中的描述仅仅是示例性的，而非为限制性的。

有益效果

本发明筛选获得了一种靶向LOX-1的抗原结合片段，并将其应用于嵌合抗原是受体中，所述的抗原结合受体在免疫细胞表面表达。所述免疫效应细胞具有显著抑制肿瘤的效果。

附图说明

图1靶向LOX-1的嵌合抗原受体结构图；

图2为实施例3靶向LOX-1的嵌合抗原受体T细胞对肿瘤细胞杀伤效果的影响图；

图3为实施例4靶向LOX-1的嵌合抗原受体T细胞IL-6分泌水平图；

图4为实施例4靶向LOX-1的嵌合抗原受体T细胞IFN-γ分泌水平图；

图5为实施例4靶向LOX-1的嵌合抗原受体T细胞颗粒酶B分泌水平图；

图6为实施例5靶向LOX-1的嵌合抗原受体T细胞对小鼠肿瘤体积影响图；

注：^#是Non-T组与PBS对照组相比；^*是CAR-LOX-1T组与PBS对照组相比。

具体实施方式

为了更清楚地理解本发明，现参照下列实施例及附图进一步描述本发明。实施例仅用于解释而不以任何方式限制本发明。实施例中，各原始试剂材料均可商购获得，未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照仪器制造商所建议的条件。

术语“嵌合抗原受体”或者“CAR”是指重组多肽构建体，该重组多肽构建体至少包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和包含源自如下定义的刺激分子的功能性信号传导结构域的胞质信号传导结构域(本文还称为“细胞内信号传导结构域”)。

术语“scFv”是指融合蛋白，该融合蛋白包含至少一个包含轻链可变区的抗体片段和至少一个包含重链可变区的抗体片段，其中该轻链和重链可变区通过短的柔性多肽接头连续地连接，并且能够表达为单链多肽，并且其中该scFv保留了衍生其的完整抗体的特异性。除非另有说明，否则如本文所用，scFv可以例如相对于多肽的N末端和C末端以任何顺序具有VL和VH可变区，该scFv可以包含VL-接头-VH或者可以包含VH-接头-VL。

在本发明的一些实施例中，胞内信号区包含初级信号传导结构域，例如CD3-ζ的初级信号传导结构域。在一个方面，胞质信号传导结构域进一步包含源自如下定义的至少一种共刺激分子的一个或多个功能性信号传导结构域。在一个方面，共刺激分子选自41BB(即，CD137)、CD27、ICOS和/或CD28。在一个方面，CAR包含嵌合融合蛋白(其包含细胞外抗原识别结构域)、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域(其包含衍生自刺激分子的功能信号传导结构域)。在一个方面，CAR包含嵌合融合蛋白(其包含细胞外抗原识别结构域)、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域(其包含衍生自共刺激分子的功能信号传导结构域和衍生自刺激分子的功能信号传导结构域)。在一个方面，CAR包含嵌合融合蛋白(其包含细胞外抗原识别结构域)跨膜结构域和细胞内信号传导结构域(其包含衍生自一种或多种共刺激分子的两个功能信号传导结构域和衍生自刺激分子的功能信号传导结构域)。在一个方面，CAR包含嵌合融合蛋白(其包含细胞外抗原识别结构域)|跨膜结构域和细胞内信号传导结构域(其包含衍生自一种或多种共刺激分子的至少两个功能信号传导结构域和衍生自刺激分子的功能信号传导结构域)。在一个方面，CAR包含CAR融合蛋白的氨基末端(N-ter)处的任选前导序列。在一个方面，CAR还包含在细胞外抗原识别结构域的N末端的前导序列，其中前导序列任选地在细胞加工和CAR定位至细胞膜期间从抗原识别结构域(例如，scFv)切割。

实施例1：LOX-1人源化抗体scFV筛选

1.1建立永久高表达LOX-1的293T细胞系：293T-LOX-1+/+:

(1)选取生长旺盛的可发光的人293T细胞，在转染前一天以5×10⁵个/孔，接种于6孔板中，培养至第二日后，细胞融合度为60％；

(2)第二日进行转染，以6孔板的一个培养孔为单位，用200μL的opti-MEM培养基稀释3μg质粒，另以200μL的opti-MEM培养基稀释6μL脂质体Lipofectamine2000，分别轻轻混匀后，室温放置5分钟；

(3)将两管稀释液轻轻混合，室温静置20分钟后，向混合后的稀释液中轻轻加入600μL的opti-MEM培养基；

(4)将待转染的细胞用PBS轻轻漂洗一次，然后将混合好的稀释液轻轻加入培养孔中，置于二氧化碳培养箱中培养；

(5)培养4～6h后弃尽转染所用培养基，向孔中加入3mL完全培养基；

(6)48小时后选用含有1μg/mL嘌呤霉素(puromycin)的培养基进行筛选；待细胞不再出现死亡后即得到稳定表达LOX-1的293T细胞系。

1.2进行LOX-1人源化抗体scFV的淘选、扩增、纯化、测序及鉴定

第一轮筛选：在6孔板上铺板1×10⁷个293T-LOX-1^+/+细胞；用PBST溶解BSA至浓度3％，300μL/孔，37℃封闭2h，洗板3次；每孔加入100μL的噬菌体库溶液，37℃孵育2h，洗板3次；加入甘氨酸缓冲液室温下轻摇10min，吸出洗脱液，然后加入的Tris-HCl缓冲液中和反应。将100μL洗脱液加入至5mL对数生长期的TG1菌种，37℃感染30min，随后加入含抗生素的培养基中，37℃过夜培养。取培养液4℃，4000rpm，离心15min，收集上清液加入5mL PEG/NaCl，冰浴30min，4℃，8000rpm，离心15min，弃去上清，用1mL的PBS重悬，4℃，12000rpm，离心10min，所得沉淀即为噬菌体抗体颗粒。

第二轮筛选：在6孔板上铺板1×10⁷个293T-LOX-1^+/+细胞。用3％的脱脂奶粉，洗板3次；每孔加入100μL的噬菌体库溶液，37℃孵育2h，洗板5-8次；其余操作同第一轮筛选。

第三轮筛选：在6孔板上铺板1×10⁷个293T-LOX-1^+/+细胞。用3％的BSA封闭，洗板3次；每孔加入100μL的噬菌体库溶液，37℃孵育2h，洗板5-8次；其余操作同第一轮筛选。

筛选完成后，用噬菌体感染TG1细菌，涂布于培养皿中，从培养后的平板上随机挑取50个单克隆，通过酶联免疫反应方法，以可溶解的人LOX-1为抗原，筛选阳性克隆，进行测序鉴定。根据测序结果，选取10条序列用于后续实验。

1.3目标抗体的表达与分析

提取阳性克隆质粒并转化至大肠杆菌感受态细胞，以100mM IPTG诱导抗体蛋白表达，采用膜分离与树脂分离相互配合的方式纯化目标抗体蛋白。应用Fortebio生物分子相互作用平台检测亲和力，选择其中亲和力最高的抗体用于构建嵌合抗原受体。

1.4抗体序列分析

测定上述scFv抗体的氨基酸序列结构，将该氨基酸序列置于结构数据库中进行同源结构的搜索和抗体序列结构比对分析，确定其互补决定区(CDR区)。序列如下所示，

表1 LOX-1人源化scFV DNA序列

表2 LOX-1人源化scFV蛋白序列

表格3 LOX-1人源化CDRs区蛋白序列

实施例2：CAR-T细胞的制备

2.1含有嵌合抗原载体的载体制备

通过PCR法扩增并获得CAR LOX-1核苷酸序列，通过引物设计在目标序列两端引入酶切位点，将目标基因片段与慢病毒载体质粒pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP-T2A-Puro进行双酶切反应，37℃，孵育60min。酶切反应结束后，将所述核酸片段采用琼脂糖凝胶纯化(使用Taraka公司凝胶纯化试剂盒)，具体操作步骤按照试剂盒操作说明书进行。经凝胶纯化后的目标核酸分子，在T4连接酶的作用下16℃孵育10-12h，获得的连接产物通过电击转入DH5α感受态细胞中，将所获得的感受态细胞转入未添加抗生素的液体LB培养基中，37℃摇床200rpm，培养2h，然后4000rpm离心2min，然后离心重悬于新鲜LB培养基中，将所述菌液均匀涂布至含有抗生素的固体LB培养基中，37℃培养箱中培养过夜，挑取并鉴定阳性克隆，将阳性克隆菌株于-70℃冰箱中保存。

2.2慢病毒载体的制备

将测序正确并保存的菌液复苏并接种至20mL含抗生素的液体LB培养基37℃摇床200rpm，过夜培养，4000rpm离心收集菌体，采用Takara公司质粒提取试剂盒提取质粒，具体操作步骤按照试剂盒操作说明书进行。酶切鉴定，目标序列是否正确。同时，培养293T细胞，在37℃、5％CO₂条件下稳定培养2-3代后，将1×10⁶个293T细胞接种至六孔板，37℃、5％CO₂条件下培养至对数生长期，更换新鲜培养基。按上述含有目标核酸质粒与VSVG包膜蛋白质粒按3:1的比例混合，后加入Opti-MEM培养基补足体积5mL，逐滴将质粒与转染试剂的混合溶液滴加至293T细胞培养液中，37℃、5％CO₂条件下培养48h。培养完成后，2500rpm离心20min收集上清，使用0.45μm滤膜和0.22μm滤膜依次过滤除去细胞碎片和其他杂质，获得携带有CAR LOX-1基因的慢病毒。

2.3 CAR-T细胞的制备

招募健康志愿者，采集100mL外周血，通过流式细胞仪法分离并获得外周血中的CD4⁺、CD8⁺T细胞，调整CD4⁺：CD8⁺比例为1:1，以备后续使用。将获得的T细胞接种于含10％FBS的RPMI1640培养基中，传代培养3-5代，以备达到稳定状态。采用6孔板培养T细胞，每孔接种5×10⁶个细胞，于37℃、5％CO₂条件下培养对数生长期，然后分别加入携带有CAR LOX-1基因的慢病毒，37℃孵育3h，而后弃去上清，采用新鲜培养基洗涤3-5次，然后37℃、5％CO₂条件下培养，继续培养5-7天，收集CAR-LOX-1T细胞用于后续实验。

实施例3 CAR-T细胞体外抗肿瘤效果

为验证相关CAR-T细胞的抗肿瘤效果，首先在体外细胞实验中进行验证，以便进行初步筛选。在本发明细胞学实验中，选用乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞作为实验对象。取液氮中保存的MDA-MB-231细胞株(本实验室保存)，于温水中快速复苏，然后加入DMEM培养基混合均匀后，2000rpm离心5min收集细胞，采用新鲜培养基洗涤3次，然后加入含10％FBS的DMEM培养基于37℃、5％CO₂条件下培养3-5代。将转染慢病毒后制备获得的CAR-LOX-1T细胞，与MDA-MB-231细胞按照1:1、2:1、4:1、8:1、16:1比例进行混合，同时采用PBS和未转染的T细胞(Non-T)按照相同比例作为对照组。将上述各组混合细胞接种于6孔培养板中，5％CO₂、37℃培养箱培养24h后检测肿瘤细胞杀伤效果。具体检测方式为：混合培养完成后，每孔加入10μL CCK-8，37℃孵育2h后，酶标仪检测450nm波长，测量OD值，杀伤率＝[1-(实验组OD值-效应细胞对照组OD值)/靶细胞对照组OD值]×100％。如图2所示，在本发明构建的CAR-LOX-1T细胞能有效发挥肿瘤细胞抑制作用，相比于PBS和未转染组，CAR-LOX-1T治疗组均具有显著性差异，且随着混合比例的增大，抗肿瘤作用也逐渐增大，具有“剂量依赖性”。这说明了本发明中所筛选并获得的靶向LOX-1抗体能够有效结合目标抗原，介导抗肿瘤作用的发挥。

实施例4 CAR LOX-1T细胞与靶细胞共培养后分泌细胞因子的检测

将实施例3中的各孔混合培养上清样品从-20℃冰箱取出，室温融化；使用ELISA试剂盒(厂家：南京建成)，按说明书操作处理各样品，检测各组中IFN-γ、IL-6和颗粒酶B的分泌水平。结果如图3、图4、图5所示，相比于PBS和未转染组，CAR-LOX-1T治疗组与MDA-MB-231细胞共培养后，其IFN-γ、IL-6和颗粒酶B的分泌量明显增加，并且随着混合比例的增大，分泌量逐渐增高，具有“剂量依赖性”。

实施例5 CAR-T细胞体内抗肿瘤效果

选取6-8周龄NSG雌性小鼠，于实验室洁净环境中饲养。复苏并培养MDA-MB-231细胞。每只小鼠采用皮下注射方式注射1×10⁶个MDA-MB-231细胞，每只注射100μL细胞悬液。然后每天观察小鼠生长状态和肿瘤组织发展情况，约3-5天后可见明显瘤块出现，说明肿瘤小鼠模型建立成功。将上述荷瘤小鼠随机分为5组，分别为生理盐水组、T细胞对照组Non-T(注射未转染的T细胞，2×10⁷细胞/只)、CAR-LOX-1T低剂量组(5×10⁶细胞/只)、CAR-LOX-1T中剂量组(1×10⁷细胞/只)、CAR-LOX-1T高剂量组(2×10⁷细胞/只)进行治疗，分别于治疗后2周和4周测量肿瘤体积。结果如图6所示，所有CAR-LOX-1T治疗组均可抑制肿瘤的增长，在第四周时，CAR-LOX-1T治疗组与对照组的中肿瘤体积具有显著性差异，其中高剂量组的抑制效果最为明显。说明本发明制备获得的CAR-LOX-1T细胞具有抑制肿瘤的作用，且持续时间较长。

本领域技术人员应该理解的是，本发明的使用不受限于上述特定应用。就本文描述或描绘的特定元素和/或特征而言，本发明也不局限于其优选实施方案。应当理解的是，本发明不限于所公开的实施方案例或各个实施方案，且在不脱离由以下权利要求所阐述和限定的本发明的范围的情况下能够进行许多重新布置、修改和替换。

SEQUENCE LISTING

<110> 海南精准医疗科技有限公司

<120> 一种靶向赖氨酰氧化酶1的嵌合抗原受体及其用途

<130> CP121010601C

<160> 16

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 753

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gaaattgtgt tgacgcagtt tccaggcacc ctgtcttttg tctccagggg aaagagccac 60

cctctcctgc agggccagtc agagtgttag tagccactta gcctggtacc agcagaggcc 120

tggccagcct cccaggctcc tcatctatga tacatccacc agggccactg gtatccccgc 180

caggttcagt ggcagtgggt ctgggacaga gttcactctc accatcagca gcctggagtc 240

tgaagatttt gcagtgtatt actgtcagca gtatggtagc tcaccggggt acacttttgg 300

ccaggggacc aagctggaga tcaaacgttc cggaggtcga ccataacttc gtataatgta 360

tactatacga agttatcctc gagcggtacc caggtgcagc tgcagcagtc gggcccagga 420

ctggtgaagc cttcggggac cctgtccctc acctgcgctg tctctggtgg ctccatcagc 480

agtagtaact ggtggagttg ggtccgccag cccccaggga aggggctgga gtggattggg 540

gaaatctatc atagtgggag caccaactac aacccgtccc tcaagagtcg agtcaccata 600

tcagtagaca agtccaagaa ccagttctcc ctgaagctga gctctgtgac cgccgcggac 660

acggccgtgt attactgtgc gagactcctg ggggggatag cggggaggtg gttcgacccc 720

tggggccagg gaaccctggt cactgtctcc tca 753

<210> 2

<211> 249

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Glu Ile Val Leu Thr Gln Phe Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser His

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Pro Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Thr Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Gly

85 90 95

Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ser Gly Gly

100 105 110

Arg Pro Leu Arg Ile Met Tyr Thr Ile Arg Ser Tyr Pro Arg Ala Val

115 120 125

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gly

130 135 140

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser

145 150 155 160

Asn Trp Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

165 170 175

Ile Gly Glu Ile Tyr His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu

180 185 190

Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Gln Phe Ser

195 200 205

Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

210 215 220

Ala Arg Leu Leu Gly Gly Ile Ala Gly Arg Trp Phe Asp Pro Trp Gly

225 230 235 240

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

245

<210> 3

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Glu Ile Val Leu Thr Gln Phe Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys

20

<210> 4

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser His Leu Ala

1 5 10

<210> 5

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Pro Pro Arg Leu Leu Ile Tyr

1 5 10 15

<210> 6

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 6

Asp Thr Ser Thr Arg Ala Thr

1 5

<210> 7

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 7

Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr

1 5 10 15

Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys

20 25 30

<210> 8

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 8

Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Gly Tyr Thr

1 5 10

<210> 9

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 9

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

1 5 10

<210> 10

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 10

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gly

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser

20 25 30

<210> 11

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 11

Ser Ser Asn Trp Trp Ser

1 5

<210> 12

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 12

Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly

1 5 10

<210> 13

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 13

Glu Ile Tyr His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser

1 5 10 15

<210> 14

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 14

Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys

1 5 10 15

Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg

20 25 30

<210> 15

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 15

Leu Leu Gly Gly Ile Ala Gly Arg Trp Phe Asp Pro

1 5 10

<210> 16

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 16

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

Claims

1.一种分离的嵌合抗原受体，其特征在于，其包含抗赖氨酰氧化酶1的结合结构域、跨膜结构域以及细胞内信号传导结构域，所述抗赖氨酰氧化酶1的结合结构域为包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含重链互补决定区1、重链互补决定区2和重链互补决定区3，所述轻链可变区包含轻链互补决定区1、轻链互补决定区2和轻链互补决定区3，其中，

轻链互补决定区1序列如SEQ ID No.4所示；

轻链互补决定区2序列如SEQ ID No.6所示；

轻链互补决定区3序列如SEQ ID No.8所示；

重链互补决定区1序列如SEQ ID No.11所示；

重链互补决定区2序列如SEQ ID No.13所示；

重链互补决定区3序列如SEQ ID No.15所示；

优选地，所述抗赖氨酰氧化酶1的结合结构域包含抗赖氨酰氧化酶1的单链可变片段；

更优选地，所述抗赖氨酰氧化酶1的单链可变片段系列如SEQ ID NO.2所示。

2.根据权利要求1所述的分离的嵌合抗原受体，其特征在于，细胞内信号传导结构域中包含基础信号传导结构域，所述基础信号传导结构域选自CD3ζ、TCRζ、FcRIγ、FcRIβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD278(ICOS)、FcεRI、DAP10、DAP12或CD66d中的至少一种；

优选地，细胞内信号传导结构域中包含还包含至少一种共刺激分子结构域，所述共刺激分子选自4-1BB、CD28、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CDS、ICAM-1、B7-H3、ICOS、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM、KIRDS2、SLAMF7、NKp80、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1、SLAMF4、CD84、CD96、CEACAM1、CRTAM、Ly9、CD160、PSGL1、CD100、CD69、SLAMF6、SLAM、BLAME、SELPLG、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a、CD28-OX40、CD28-4-1BB；更优选地，包含两种共刺激分子结构域。

3.根据权利要求1所述的分离的嵌合抗原受体，其特征在于，跨膜结构域选自选自CD8、CD3ε、T细胞受体的α、β或ζ链、CD45、CD4、CD5、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137或CD154的跨膜结构域。

4.一种编码嵌合抗原受体分离的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1-3任一项所述的嵌合抗原受体；

优选地，编码所述抗赖氨酰氧化酶1的结合结构域的核酸序列如SEQ ID NO.2所示。

5.一种载体，其特征在于，所述载体包含权利要求4中所述的核酸分子；

优选地，所述的载体选自DNA载体、RNA载体、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体或逆转录病毒载体。

6.一种免疫效应细胞，其特征在于，所述免疫效应细胞包含权利要求1-3任一项所述的嵌合抗原受体、权利要求4所述的核酸分子和权利要求5所述的载体中的至少一种；

优选地，所述免疫效应细胞选自T淋巴细胞和自然杀伤细胞中的至少一种；

优选地，所述免疫效应细胞表面表达权利要求1所述的嵌合抗原受体。

7.一种制备免疫效应细胞的方法，其特征在于，所述方法包括以下的步骤：向免疫效应细胞中转导权利要求5所述的载体；

优选地，所述免疫效应细胞选自T淋巴细胞和自然杀伤细胞中的至少一种。

8.一种抗肿瘤的药物组合物，其特征在于，所述组合物包含权利要求6所述的免疫效应细胞。

9.权利要求1-3任一项所述的嵌合抗原受体、权利要求4中所述的核酸分子、权利要求5所述的载体和/或权利要求6所述的免疫效应细胞用于制备药物的用途，其特征在于，所述药物用于治疗与赖氨酰氧化酶1的表达相关的疾病或病症，或用于提高细胞因子分泌；

优选地，所述与赖氨酰氧化酶1的表达相关的疾病或病症包括血液肿瘤和实体瘤；更优选地，所述实体瘤包括乳腺癌、肝癌、结直肠癌、非小细胞肺癌、***癌、胰腺癌、脑胶质瘤；

优选地，细胞因子选自IFN-γ、IL-6和颗粒酶B中的至少一种。

10.一种***的方法，其特征在于，所述方法包括将权利要求1-3任一项所述的嵌合抗原受体、权利要求4中所述的核酸分子、权利要求5所述的载体和/或权利要求6所述的免疫效应细胞施用时受试者的步骤；

优选地，所述的免疫效应细胞的来源于受试者，并在体外向免疫效应细胞中转导本发明所述的载体，获得的免疫效应细胞施用于受试者。