CN113321691B - 一种鸟苷提纯方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物发酵技术领域,具体涉及一种鸟苷提纯方法,步骤为:A、将鸟苷发酵液调节pH值为9.5~11.5,加热后利用陶瓷膜过滤***分离发酵液得含鸟苷的滤液,所述加热温度为80~100℃;B、将步骤A的滤液流经大孔活性炭填充柱,吸附分离滤液中的大分子蛋白和杂质,得到澄清的收集液;C、将步骤B的收集液,利用热泵蒸发器浓缩得浓缩液;D、将步骤C的浓缩液,用盐酸调节pH6.5~7.5,降温结晶,析出鸟苷晶体,15~25℃分离得到粗品;粗品加入溶解罐,加热溶解,加入聚硅铁絮凝,脱色,过滤,滤液降温结晶,分离得到精品,烘干得到鸟苷成品。本发明提纯工艺成本低,鸟苷质量、收率提高。
Description
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域,具体涉及一种鸟苷提纯方法。
背景技术
鸟苷(Guanosine),也称为鸟嘌呤核苷,又名9-β-D-呋喃核糖基鸟嘌呤,难溶于冷水,易溶于温水,18℃下1320mL水中溶解1g;然而在沸水浴中,33mL水中就能溶解1g。还可溶于酸碱,如稀盐酸、热乙酸等;不溶于有机溶剂,如醇、醚、氯仿和苯等。鸟苷的用途十分广泛,是食品和医药产品的重要中间体,由于其磷酸化的5’-鸟苷酸二钠具有呈味特性,加之与谷氨酸钠有协同效应,因此可提高味精鲜味数倍至数十倍。同时它还是利巴韦林、阿昔洛韦、无环鸟苷、三氮唑核苷、三磷酸鸟苷钠等核苷类抗病毒药物的重要原料。目前,鸟苷需求以每年10~20%的速度增加。现有的从发酵液中提纯分离鸟苷的方法为发酵液过膜除去菌体,得到的滤清液再通过超滤膜除蛋白、再进一步精制获得鸟苷。然而,现有的鸟苷提取方法主要存在以下问题:首先,超滤膜脱除蛋白投入成本高、纯化不完全、清洗难度大和运行耗电量大,膜组件在实际使用的过程中由于温度高和碱性大且难以再生完全,损坏频繁,严重影响正常生产的进行;其次,膜滤液结晶的过程中,由于鸟苷浓度低,结晶液体积大,需要耗用大量的冷媒降温结晶,且结晶不完全,母液量大,难以回收,鸟苷损失较多;再次,精制用普通的絮凝剂和活性炭脱色难以除去残余的杂蛋白,导致精制后的鸟苷含量难以提高,鸟苷品质需要进一步提高,才能达到市场使用要求。
发明内容
针对上述技术缺陷,本发明解决现有提取工艺中鸟苷收率较低的问题,同时保证所提取的鸟苷品质。本发明提供一种鸟苷提纯方法。
为解决上述技术问题,本发明的技术方案是:一种鸟苷提纯方法,包括以下步骤:A、将鸟苷发酵液调节pH值为9.5~11.5,加热后利用陶瓷膜过滤***分离发酵液,浓缩液为菌体溶液,干燥成饲料蛋白,透析液为含鸟苷的滤液,所述加热温度为80~100℃;B、将步骤A的滤液流经大孔活性炭填充柱,吸附分离滤液中的大分子蛋白和杂质,得到澄清的收集液;C、将步骤B的收集液,利用热泵蒸发器浓缩,得到鸟苷浓度为15~35%,温度为75~85℃的浓缩液;D、将步骤C的浓缩液,用盐酸调节pH6.5~7.5,降温结晶,析出鸟苷晶体,15~25℃分离得到粗品;E、在溶解罐中加入水,将步骤D的粗品加入溶解罐,加热溶解,再加入聚硅铁絮凝,脱色,过滤,滤液降温结晶,分离得到精品,烘干得到鸟苷成品。
进一步:在上述鸟苷提纯方法中,所述步骤B中大孔活性炭填充柱的活性炭孔径在2~100nm,颗粒为10~40目,吸附杂质后,用水反冲除去固体杂质,加碱再生,洗水,脱除大分子蛋白和杂质;所述步骤E中的溶解控制鸟苷浓度为3~10%,加热温度为80~95℃。所述步骤E中的絮凝过程为加入溶液总体积0.1~1%的絮凝剂聚硅铁,保温絮凝15~30min。传统使用的聚合硫酸铝、聚合氯化铝含有铝离子,对人体有害;聚丙烯酰胺中残留及使用过程中分解的丙烯酰胺具有毒性;聚合氯化铝挥发盐酸,危害健康;聚合硫酸铝酸性,需要加入较多碱去中和。聚硅铁适用范围广,PH值5~13范围内可使用,中性条件使用效果好;不含铝离子,对人体无毒无害;絮凝速度快、矾花密实、絮体尺寸大,沉降速度快、沉降性能优异,大幅降低了过滤难度和过滤时间;絮凝效率高,比聚铝、聚铁类产品用量更少。
所述步骤E中的脱色过程为加入溶液总体积0.2~2%的粉末活性炭,保温脱色15~30min,分离温度5~15℃。步骤E脱色过滤,采用两步过滤法。首先,料液经过烛式过滤器(一级粗过滤器),截留大量活性炭,然后料液经过陶瓷膜(二级精密过滤器),截留微小杂质。相比传统采用PA过滤器一步过滤法,两步过滤法具有如下优点:1、鸟苷溶解度小,溶解温度高,90~100℃才能溶解清澈,因此,需要90~100℃保温过滤,传统PA过滤器使用的PA滤棒高温容易老化,更换频繁,费用高;两步法一级粗过滤器选用耐高温滤布的烛式过滤器,二级精密过滤器选用陶瓷膜,可以耐受高温的使用条件。2、鸟苷溶解液杂质多,传统PA过滤器孔径小、精度高,截留杂质容易堵塞PA棒微孔,过滤速度很快衰减,需要频繁反冲洗,过滤时间长,相同过滤面积,流量小,且大量的活性炭累积在滤棒表面,充满空间,经常使滤棒接口断裂,造成漏碳,停止生产;两步法首先粗过滤,再精过滤,大量的活性碳截留在粗过滤器,精密过滤活性炭量少,保证了总过滤速度。3、传统PA过滤器过滤完毕排出的是活性碳渣和水的混合液,需要进一步将固液分离,才能得到固体炭渣,进行环保处理;两步法过滤完毕,直接从粗过滤器排出干炭渣,利于后续环保处理。所述步骤A陶瓷膜孔径为20~200nm。所述步骤C热泵蒸发器为单效、双效或多效浓缩炉中的任意一种。所述步骤E烘干是指利用闪蒸干燥器,条件为进风温度控制在150~200℃,混合温度控制在120~180℃。
本发明将收集液采用多效热泵蒸发浓缩。热泵蒸发器工作原理是二次蒸汽的压力和温度比较低,难以通过换热器换热利用,但是,二次蒸汽与生蒸汽的焓值相差并不大,通过提高二次蒸汽的压力,则二次蒸汽中的热能可得到反复应用,而此过程需要的外加能量远小于由此可收回的可利用能量,从而达到节能的目的。采用热能压缩器,利用较高压力的工作蒸汽,将蒸发出来二次蒸汽压缩,提高其压力,进而作为蒸发器加热蒸汽,二次蒸汽得到循环利用,节能降耗,增加了结晶液中鸟苷的浓度,减少了分离鸟苷后母液的体积,鸟苷损失少。本发明将粗品溶解液用聚硅铁絮凝后再脱色,进一步脱除杂质,使产品含量提高,提高了产品品质。本发明采用的大孔活性炭填充柱提纯、多效蒸发和聚硅铁絮凝脱色的提纯工艺,有利于质量、收率的提高和成本的降低。即根据鸟苷的特点,本发明对于各个提取阶段的浓度、温度及pH值参数进行了有效的调控,能够有效的去除蛋白和其他杂质,提高收率,另外通过各个阶段的投料配方,絮凝剂,脱色剂等手段控制,进一步提高鸟苷品质。本方法应用于工业大规模生产鸟苷具有重要的意义。
与现有技术相比,本发明将发酵液经陶瓷膜处理后直接大孔活性炭填充柱处理,除去发酵液中的大分子蛋白和杂质,收集液杂质少,纯净的结晶液利于结晶体析出,降低结晶母液中有效成分的含量,提高粗品的质量和收率。
具体实施方式
本发明的主旨是通过从发酵液提纯鸟苷,该方法具有粗品质量好、产品品质高的特点,克服了现有技术存在的粗品含杂质多、分离困难、能耗高、收率低的缺点,使鸟苷的收率和质量得到显著提高。下面将通过本发明的实施例进行更加详细的说明。但以下这些实施例只是为了对本发明进行详细的说明而列举的示例,本发明的范围并不只局限于这些实施例。
实施例1
发酵液85立方,鸟苷含量46.5g/L,在搅拌条件下,调pH值至9.5,蒸汽将发酵液加热至96℃,进行陶瓷膜微滤***过滤,压力0.2~0.5MPa,得到滤清液,加入洗水,一边过滤一边洗涤菌体,过滤完毕,菌体抽去制作菌体蛋白饲料,合并洗水和透析液,通过孔径为50~80nm,颗粒大小为15~35目的大孔活性炭填充柱,得到澄清收集液,用三效热泵蒸发器浓缩,得到鸟苷浓度25.5%的浓缩液,用盐酸调节pH值至7.1,然后6h内缓慢降温至18℃进行结晶、分离,得到鸟苷粗品。再将粗品加入装有水的溶解罐,溶液浓度为4.6%,温度95℃,向其中加入溶液总体积0.3%的絮凝剂聚硅铁,保温絮凝20min,随后加入溶液总体积1%的粉末活性炭,保温脱色15min,过滤,滤液5h内降温至10℃结晶,分离得到鸟苷湿精品,湿品利用闪蒸干燥器烘干,进风温度158℃,混合温度控制在132℃,得到鸟苷成品3.54吨。鸟苷成品的收率89.5%,鸟苷含量99.3%,灼烧残渣0.3%。
实施例2
发酵液88立方,鸟苷含量44.3g/L,在搅拌条件下,调pH值至10.3,蒸汽将发酵液加热至95℃,进行陶瓷膜微滤***过滤,压力0.2~0.5MPa,得到滤清液,加入洗水,一边过滤一边洗涤菌体,过滤完毕,菌体抽去制作菌体蛋白饲料,合并洗水和透析液,通过孔径为50~80nm,颗粒大小为15~35目的大孔活性炭填充柱,得到澄清收集液,用三效热泵蒸发器浓缩,得到鸟苷浓度20.1%的浓缩液,用盐酸调节pH值至6.8,然后6h内缓慢降温至17℃进行结晶、分离,得到鸟苷粗品。再将粗品加入装有水的溶解罐,溶液浓度为3.2%,温度93℃,向其中加入溶液总体积0.5%的絮凝剂聚硅铁,保温絮凝20min,随后加入溶液总体积0.8%的粉末活性炭,保温脱色15min,过滤,滤液5h内降温至10℃结晶,分离得到鸟苷湿精品,湿品利用闪蒸干燥器烘干,进风温度155℃,混合温度控制在138℃,得到鸟苷成品3.48吨。鸟苷成品的收率89.3%,鸟苷含量99.5%,灼烧残渣0.4%。
实施例3
发酵液77立方,鸟苷含量47.2g/L,在搅拌条件下,调pH值至11.2,蒸汽将发酵液加热至94℃,进行陶瓷膜微滤***过滤,压力0.2~0.5MPa,得到滤清液,加入洗水,一边过滤一边洗涤菌体,过滤完毕,菌体抽去制作菌体蛋白饲料,合并洗水和透析液,通过孔径为50~80nm,颗粒大小为15~35目的大孔活性炭填充柱,得到澄清收集液,用三效热泵蒸发器浓缩,得到鸟苷浓度23.2%的浓缩液,用盐酸调节pH值至6.9,然后6h内缓慢降温至19℃进行结晶、分离,得到鸟苷粗品。再将粗品加入装有水的溶解罐,溶液浓度为3.1%,温度94℃,向其中加入溶液总体积0.6%的絮凝剂聚硅铁,保温絮凝20min,随后加入溶液总体积0.7%的粉末活性炭,保温脱色15min,过滤,滤液5h内降温至10℃结晶,分离得到鸟苷湿精品,湿品利用闪蒸干燥器烘干,进风温度153℃,混合温度控制在136℃,得到鸟苷成品3.30吨。鸟苷成品的收率90.7%,鸟苷含量99.4%,灼烧残渣0.3%。
上述实施例1-3的测试方法如下:
含量
准确称取于105℃±2℃干燥3h的试样0.25g,用新配PH7.0磷酸盐缓冲液溶解,并定容至1000mL,充分摇匀,吸10mL至250mL容量瓶中用PH7.0缓冲液定容至刻度,此溶液即为试样液。将试样液注入10mm石英比色皿,以pH7.0缓冲溶液作空白,于紫外分光光度计252nm波长下,测定吸收度。计算鸟苷含量。
灼烧残渣
将干净的坩埚置于高温箱形电阻炉,打开盖于(800±20)℃下灼烧至恒重(1h),取出坩埚,盖上坩埚盖,于石棉网上放置3min,再将坩埚放于干燥器中冷却至室温,称量,加入试样1g,精确到0.0001g于电炉上加热,使试样炭化至黑色,冷却后,再加入1mL浓硫酸(A.R.),再放入电炉上加热至无烟,将坩埚送入温度800℃的高温箱形电阻炉中,打开坩埚盖,关闭炉门,逐渐升高温度,(800士20)℃下灼烧至恒重,取出坩埚,盖上坩埚盖,于石棉网上放置3min,再放入干燥器中冷却至室温,称重。计算灼烧残渣。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种鸟苷提纯方法,其特征在于,包括以下步骤:
A、将鸟苷发酵液调节pH值为9.5~11.5,加热后利用陶瓷膜过滤***分离发酵液得含鸟苷的滤液,所述加热的温度为80~100℃;
B、将步骤A的滤液流经大孔活性炭填充柱,吸附分离滤液中的大分子蛋白和杂质,得到澄清的收集液;所述大孔活性炭填充柱的活性炭孔径在2~100nm,颗粒为10~40目;
C、将步骤B的收集液,利用热泵蒸发器浓缩,得到鸟苷浓度为15~35%,温度为75~85℃的浓缩液;
D、将步骤C的浓缩液,用盐酸调节pH6.5~7.5,降温结晶,析出鸟苷晶体,15~25℃分离得到粗品;
E、在溶解罐中加入水,将步骤D的粗品加入溶解罐,加热溶解,再加入聚硅铁絮凝,脱色,过滤,滤液降温结晶,分离得到精品,烘干得到鸟苷成品;所述絮凝的过程为加入溶液总体积0.1~1%的絮凝剂聚硅铁,保温絮凝15~30min。
2.根据权利要求1所述鸟苷提纯方法,其特征在于:所述步骤E中的溶解控制鸟苷浓度为3~10%,加热温度为80~95℃。
3.根据权利要求2所述鸟苷提纯方法,其特征在于:所述步骤E中的脱色过程为加入溶液总体积0.2~2%的粉末活性炭,保温脱色15~30min,分离温度5~15℃。
4.根据权利要求1所述的鸟苷提纯方法,其特征在于:所述步骤A陶瓷膜孔径为20~200nm。
5.根据权利要求1所述的鸟苷提纯方法,其特征在于:所述步骤C热泵蒸发器为单效、双效或多效浓缩炉中的任意一种。
6.根据权利要求1所述的鸟苷提纯方法,其特征在于:所述步骤E烘干是指利用闪蒸干燥器,条件为进风温度控制在150~200℃,混合温度控制在120~180℃。
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