CN113320144A - 用于修复跟腱缺损的3d打印支架及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于修复跟腱缺损的3D打印支架及其制备方法，其中，制备方法包括以下步骤：将不同比例的Pluronic‑F127与聚己内酯共混，得到打印溶液，聚己内酯与Pluronic‑F127的质量比为6:0.1‑0.5；然后将打印溶液进行3D电流体喷射打印，在电场作用下打印出具有多层多孔结构的3D打印支架。本发明采用Pluronic‑F127改性PCL，获得生物相容性、降解速率与机械性能之间的平衡，构造出具备良好纤维孔隙及生物相容性的支架，该支架可填充间充质干细胞，达到修复跟腱缺损的疗效。

Description

用于修复跟腱缺损的3D打印支架及其制备方法
技术领域
本发明涉及组织工程支架领域，尤其涉及一种用于修复跟腱缺损的3D打印支架及其制备方法。
背景技术
跟腱缺损的修复是临床骨科诊疗中常见难题和热点之一。跟腱缺损常继发于跟腱断裂或局部的软组织肿瘤切除术后。跟腱断裂早期进行手术干预往往预后良好，但如若漏诊、治疗不当或术后不适当的功能锻炼易导致陈旧性跟腱断裂，从而产生局部缺损。此外，肿瘤或手术对病损区组织的过度清理也会导致跟腱缺损，严重影响跟腱及踝关节的功能。作为人体最强大的肌腱组织，跟腱的缺损修复已成为临床诊疗中的常见难点。
近年来随着材料科学的进步和干细胞技术的发展，组织工程技术成为肌腱再生研究的新方向，其原理是构建一个满足组织基础框架性能的细胞生长支架，将细胞与支架相结合，通过模拟天然细胞外基质和生物活性因子对细胞的机械及生物化学诱导，刺激细胞生长、增殖、分化形成跟腱样组织，从而替代跟腱缺损，该方式为跟腱缺损的修复与重建提供了新的思路和方向。
目前，研究者们使用静电纺丝、电化学法、冷冻干燥等技术制造肌腱组织工程支架。静电纺丝是目前应用最为广泛的构建组织工程支架技术，其中有研究者制造出包含随机纤维和定向纤维的电纺PLGA支架。为了调节支架的理化性能和生物相容性，研究者开发了混合静电纺丝，多个喷嘴从不同方向将多种材料共同沉积在收集器上形成复合支架。静电纺丝技术在构建支架方面有着诸多优势：技术相对简单，工艺参数可控性高，适用于多种生物材料，能够构建高孔隙率的支架。电化学沉积法能够制造出直径为50-400mm的胶原纤维束，其机械强度是随机定向交联的胶原凝胶的30倍，编织后的胶原纤维束可促进成纤维细胞在束间的增殖、定向和迁移，可用于批量加工且能够制造出类肌腱的长绳结构。还有一些用于肌腱组织工程的制造技术，例如胶原纤维挤出、微纤维熔融拉伸等。
总之，目前多数组织工程支架的构建技术仍难以便捷地构建具有连通孔隙的微纳米级可控三维结构支架，从而导致其应用失败。如支架结构的不可控导致的力学性能不均匀，薄弱处的早期断裂；并且没有足够的孔隙从而阻碍细胞的渗透和胞外基质的沉积，甚至组织的血管化，进一步阻碍组织再生。静电纺丝无法制造出利于细胞长入的孔隙结构，电化学法对材料和条件的限制较为严苛，冷冻干燥利于制造孔隙结构却无法对结构精确控制。
此外，在跟腱缺损的材料方面，聚己内酯(PCL)因其良好的机械性能、生物降解性和灵活性而被广泛应用于电流体3D打印技术。它是一种人工合成的可生物降解的脂肪族聚酯，不同于其他生物材料，它价格合理，易于塑性，具有良好的热稳定性；且已被FDA批准应用于各类组织工程。因PLA降解速率远低于PCL、PGA等材料，其在肌腱韧带等需要长期发挥力学作用的组织工程中具备更广泛的应用前景。但是，PLA的降解速率过于缓慢，无法满足体内正常组织的生长渗入。PCL具有良好的生物相容性、足够的机械强度、较高的弹性以及较长的降解时间，但其疏水性可能导致细胞附着和增殖能力差。其他的天然聚合物和人工合成可降解聚合物如胶原与丝素蛋白等天然聚合物支架在机械强度及免疫原性等方面都存在不足，而PGA在人体内的降解速率较快，约2-4周，这无法满足肌腱组织的需要。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种用于修复跟腱缺损的3D打印支架及其制备方法，采用Pluronic-F127改性PCL，获得生物相容性、降解速率与机械性能之间的平衡，构造出具备良好纤维孔隙及生物相容性的支架，该支架可填充间充质干细胞，达到修复跟腱缺损的疗效。
本发明的第一个目的是公开一种用于修复跟腱缺损的3D打印支架的制备方法，包括以下步骤：
(1)将Pluronic-F127与聚己内酯的酸性溶液混匀，得到打印溶液；其中，聚己内酯与Pluronic-F127的质量比为6:0.1-0.5，聚己内酯的分子量为50000-100000，Pluronic-F127的分子量为10000-20000；
(2)将打印溶液进行3D电流体喷射打印，在电场作用下打印出具有多层多孔结构的3D打印支架；其中，打印溶液的挤压速度为1-3μl/min，施加至3D打印针头的电压的大小为2-3kV。
进一步地，在步骤(1)中，聚己内酯的酸性溶液的浓度为58-62％w/v，优选为60％w/v。
进一步地，在步骤(1)中，打印溶液中，Pluronic-F127的浓度为1-5wt％，优选为5wt％。目的是避免3D电流体喷射打印过程中出现的过度放电现象。
进一步地，在步骤(1)中，聚己内酯的酸性溶液中使用的酸为冰醋酸。
步骤(1)中，通过调节聚己内酯与Pluronic-F127的比例，可调节PCL的生物特性，进而获得生物相容性、降解速率与机械性能之间的平衡，构造出具备良好纤维孔隙及生物相容性的支架。
进一步地，在步骤(1)中，需保证打印溶液均一且无气泡。
进一步地，在步骤(2)中，在打印之前，对打印溶液进行预挤压，待打印头挤出均匀恒速的PCL流体时，再进行打印。
进一步地，在步骤(2)中，打印过程中，3D打印针头流出的打印溶液呈泰勒锥形。
进一步地，在步骤(2)中，打印过程中，自下而上层层打印。
进一步地，在步骤(2)中，采用接收板接收3D打印支架，3D打印针头与接收板的间距为2-3mm。
进一步地，在步骤(2)中，接收板的移动加速度为1500mm/s2，移动速度为200mm/s。
进一步地，接收板的材质优选为硅片。
进一步地，在步骤(2)中，3D打印支架中，多孔结构的直径为200-500μm，优选为400μm。
本发明的第二个目的是提供一种采用上述制备方法所制备的用于修复跟腱缺损的3D打印支架，其包括聚己内酯与Pluronic-F127，聚己内酯与Pluronic-F127的质量比为6:0.1-0.5，3D打印支架具有多层多孔结构。
进一步地，多孔结构的直径为200-500μm，优选为400μm。
进一步地，多孔结构呈网格状。
进一步地，3D打印支架的孔隙率>90％。
进一步地，3D打印支架为10-20层。
进一步地，3D打印支架上结合有多个间充质干细胞。在本发明一具体实施例中，将间充质干细胞种植于支架上，5％F127占比的PCL支架上CaAM/PI染色结构显示细胞良好的存活率，EdU染色中显示加入F127使得黏附在支架上的细胞明显增多，相较于单纯PCL支架组差异具有统计学意义，且F-actin染色提示5％F127/PCL支架组F-actin(+)面积占比明显增加，且有统计学意义。表明本发明的3D打印支架有利于细胞的黏附和生长，具备优良的生物相容性。
借由上述方案，本发明至少具有以下优点：
1.本发明通过3D电流体打印构建具备可控纤维及良好孔隙的组织工程支架。使用不同比例的F127能改善PCL的亲水性能，添加5％的F127使得材料水接触角从68°下降到24°，显著提高了其亲水性能。同时，从体外降解实验中可看出添加越多占比的F127，该支架的降解速率也提高最多，因此5％F127/PCL支架降解最快。另一方面，电镜下可见支架表面出现较多的蜂窝状孔隙，证实5％F127/PCL获得了最优异的微米级结构和纳米孔隙的组织工程支架，可用于进一步的体内外实验。
2.本发明的3D打印支架有利于细胞的黏附和生长，具备优良的生物相容性。F127的加入使材料获得更优良的细胞黏附性能，2周时在细胞密度上就显现出明显优势。本发明有利于提高3D打印支架修复跟腱缺损的疗效，为未来临床组织工程跟腱的应用提供实验基础。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合详细附图说明如后。
附图说明
图1是用于修复跟腱缺损的3D打印支架的结构示意图；
图2是打印完成的支架(A)及拉压力试验机装置(B)；
图3是不同F127占比的PCL支架的应力应变曲线及机械性能测试结果；
图4是不同F127占比的PCL的水接触角对比图；
图5是不同支架的电镜表征结果；
图6是体外降解测试实验中，不同F127占比的PCL支架质量丢失比例统计结果；
图7是不同支架在种植细胞后第1天的Ca-AM/PI染色结果；
图8是不同支架在种植细胞后第3天的Ca-AM/PI染色结果；
图9是不同支架在种植细胞后第7天的Ca-AM/PI染色结果；
图10是不同支架在种植细胞后第1天的EdU染色及EdU(+)细胞比例结果；
图11是不同支架在种植细胞后第3天的EdU染色及EdU(+)细胞比例结果；
图12是不同支架在种植细胞后第7天的EdU染色及EdU(+)细胞比例结果；
图13是不同支架在种植细胞后第2天的F-actin染色及其面积比例对比结果；
图14是不同支架在种植细胞后第5天的F-actin染色及其面积比例对比结果；
图15是大鼠跟腱缺损手术操作过程的照片；
图16图示了支架缝合于跟腱断端处的情况；
图17是支架在体内移植2周和4周时，各组大鼠跟腱最大抗拉强度测试结果；
图18是第二周各实验组大鼠的肌腱HE染色结果；
图19是第四周各实验组大鼠的肌腱HE染色结果。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
以下实施例中，所使用的PCL的分子量为80000，Pluronic-F127的分子量为12000。
下列实施例中，3D打印时所使用的打印机为电流体3D机，购买自AeroTech公司。
实施例1
用于修复跟腱缺损的3D打印支架的制备方法，步骤如下：
1)称量聚己内酯6g置入50ml离心管，后于通风橱内缓慢加入冰醋酸10ml，制成质量体积比为60％的溶液，为让冰醋酸与PCL溶解，于80℃超声波水浴锅内加热90分钟后取出，顺时针搅拌均匀，直至冰醋酸将聚己内酯完全溶解，待该溶液粘稠度下降后再次放入超声波水浴锅内加热90分钟，直至PCL充分溶解，溶液呈清亮透明，注意缓慢操作以避免溶液产生较多气泡影响后续实验。
2)在通风橱将步骤1)制备的PCL冰醋酸溶液倒入10ml注射器中，为排出溶液内小气泡，注射器头朝上37℃静置过夜，然后推动注射器，以将气泡排出注射器外。
3)在10mL60％w/v的PCL冰醋酸溶液中分别加入0.1g，0.3g，0.5g Pluronic-F127(如表1)配置成打印溶液。需要注意的是：由于Pluronic-F127的特殊性，如添加含量过多，在电流体打印过程中可能会出现过度放电现象。
表1不同占比的F127溶液配置比例
Figure BDA0003136817100000051
4)将步骤3)得到的打印溶液装配至注射器中，将装配好打印溶液的注射器安装至3D打印机挤压模块装置中，调整挤压速度为3μl/min，使用20号针头，预挤压5min，待打印头挤出均匀恒速的PCL束时，准备打印。
5)打印平台下方放置硅片，调整针头的针尖与硅片间距离为2.5mm，平台移动加速度为1500mm/s2，移动速度为200mm/s，同时设置软件中打印路径及直径，自下而上层层打印，相邻两层间形成网格状孔，孔直径为400μm，打印支架的层数为12层(以从起点出发后回到该点为一次循环)。如图1所示，图中网格上的箭头方向为打印方向。
6)在平台未移动前，施加电压至打印针头PCL液滴由半球形变成圆锥形，此形态成为“泰勒锥”，此时电压为2.5kv。
7)待泰勒锥稳定形成后，启动打印路径程序，按照步骤5)设定的程序进行打印，同时下方平台开始移动将PCL纤维束收集于硅片上。
8)支架打印完成后放置过夜晾干，将PCL支架从硅板上轻轻剥离下，保证完整后备用。
按照下列方法对打印后的支架进行理化性质评估：
用拉压力试验机测试其机械性能，计算杨氏模量。步骤如下：
将上述打印好的支架(如图2A，总尺寸约为4cm×4cm×0.5mm)卷曲成圆柱形，直径约5mm，安装至拉压力试验机上进行单轴拉伸测试(如图2B)，测试其机械强度，设置测力器移动速度为1mm/s，每组支架测试5个样本，其纵坐标为应力，需除以该支架的横截面积，横坐标为形变长度，需除以其原始长度计算形变百分比，后绘制应力应变曲线，后计算其杨氏模量。
图3是不同F127占比的PCL支架的应力应变曲线及机械性能测试结果，图3B为图3A的部分细节放大图。
另外，根据材料的水接触角评估其润湿性能，步骤如下：
将表1中各组配置好的溶液放入干燥箱中40℃真空干燥一周，取出后用滚筒制成饼状，后在300bar，80℃下压制3小时成薄膜状，将去离子水滴在该薄膜表面，用水接触角仪器测量其水接触角，每组测量5个样品。
图4是不同F127占比的PCL支架的水接触角对比图，其中，***表示P＜0.001。
此外进行了支架的表面特征及孔隙率计算，步骤如下：
将打印好的支架喷金(20mA，40s)后在电子扫描显微镜下观察。根据电镜及光学显微镜下结构，计算支架的孔隙率。孔隙率(％)＝(V–W/ρ)/V×100％，V为支架体积，W为支架质量，ρ为PCL的密度。
图5是不同支架的电镜表征结果，其中，a1-a4为纯PCL垂直角度下的观察结果及斜45度角观察结果；b1-b4为1％F127/PCL垂直角度下的观察结果及斜45度角观察结果；c1-c4为3％F127/PCL垂直角度下的观察结果及斜45度角观察结果；d1-d4为5％F127/PCL垂直角度下的观察结果及斜45度角观察结果。计算各支架的孔隙率，结果如下：
表2不同占比的F127支架的孔隙结果
PCL 1％F127/PCL 3％F127/PCL 5％F127/PCL
细度(um) 25.75±1.74 23.36±2.01 21.75±3.99 20.61±1.59
孔径(μm) 374.85±12.53 376.84±10.89 378.05±18.97 379.60±9.70
孔隙率(％) 91.8±1.9 91.2±2.3 92.4±1.1 92.1±1.7
支架的体外降解测试，根据体外酶降解质量丢失占比计算对比各组支架的降解速率，步骤如下：
将干燥的3D打印支架置于含有0.1mg/ml蛋白酶K的磷酸缓冲液(10mM,pH 7.4)中模拟生理降解过程，同时添加双抗以防止污染，该降解溶液每周更换一次，所有样品都被放置于培养箱(37℃，5％CO2)内，每组5个样品，分别降解1周、2周、4周取出，40℃真空干燥后进行称重，以质量丢失比例计算降解率，并绘制随时间质量丢失曲线，即为降解曲线，支架喷金后在扫描电镜下表征。降解率(％)＝(Ws–Wt)/Ws×100％，Ws为支架初始质量，Wt为不同时间降解后支架质量。
图6是体外降解测试实验中，不同F127占比的PCL支架质量丢失比例统计结果。
此外，对打印的支架进行体外细胞实验：将小鼠间充质干细胞C3H10T1/2种植于支架上，分为5％F127/PCL支架组和纯PCL支架组，分别在第1、3、7天内进行细胞活死染色(CaAM/PI染色)评估细胞活死，EdU染色评估细胞在支架上的数量及增殖率，F-actin染色评估细胞在不同支架上的运动迁移能力。具体步骤如下：
1)选用纯PCL与5％F127/PCL支架用于细胞及动物实验(以下实验内容及图表中均使用F127代指5％F127/PCL支架)，使用糯米刀将制备的打印完成的正方形支架(约4cm×4cm)裁剪成直径为14mm的圆形以适用于24孔板内放置培养，同时为防止支架在培养基中漂浮，不利于细胞黏附，准备直径为12mm钛圈用于按压圆形支架于孔板底部。
2)在进行种植前，先进行消毒灭菌处理，将支架及钛圈泡入75％酒精中30min，后将两者放入超净台内洁净培养皿中紫外照射灭菌，正反面各照射1h备用。
3)确保支架正面向上放置于超低吸附24孔板内，后放置钛圈按压于底部，在孔板内加入PBS缓冲液800μl冲洗支架两遍，吸出PBS缓冲液，后加入成纤维细胞完全培养基(高糖DMEM)适量浸没过支架过夜备用。
4)从培养箱中取出培养有小鼠胚胎成纤维细胞(C3H10T1/2)的培养皿，于显微镜下观察细胞融合度达80％以上，吸出皿内培养基弃去，用PBS缓冲液冲洗两遍弃去。
5)加入胰酶1ml，适当摇晃均匀使胰酶浸没皿内各处，将皿放入37℃电热板或培养箱内孵育1min。
6)待在镜下观察至细胞呈非贴壁时的梭形状态，即游离圆盘状，后用枪头轻柔地吹打皿底，确保所有细胞都被从皿底吹落下，吹打过程中避免产生过多气泡。后1000r/min离心3min，弃上清，加入2ml新鲜培养基重悬，轻柔地吹打均匀。
7)细胞计数：吸取100μl重悬细胞液于2ml离心管中，再加入900μl PBS缓冲液稀释，充分吹打均匀，取10μl至细胞计数板上计数，计算出稀释浓度及重悬细胞液浓度，用于种植的细胞合适浓度约为100×104/ml。
8)吸去超低吸附24孔板内预置的完全培养基，按照每孔种植10*104细胞数计算出所需细胞总量，以此调整重悬细胞液体积，为了提高细胞攀附支架的成功率，首先每孔加入100μl总细胞量为106的细胞悬液，进行预吸附，在移液枪向支架注射细胞悬液时，需枪头紧贴支架，缓慢注入，避免细胞在皿底分布不均而影响黏附效果，种植完成后放置于培养箱内培养，后于2小时后补加入剩下的400μl培养基，每天观察细胞状态并更换新鲜培养基。
细胞活死染色(CaAM/PI染色)步骤如下：
1)配置Ca-AM/PI工作液：将Ca-AM和PI试剂原液在室温平衡半小时后取2.5μl16mM的PI原液加入至10mL的PBS中，震荡混匀，再加入5μl 4mM的Ca-AM原液，充分混匀。制成2μM Ca-AM、4μM PI共10ml的工作液用于染色，4℃保存，现用现配。
2)染色开始前，用PBS缓冲液温和洗涤贴壁细胞两遍后弃去，确保除去培养基中含有的活性酯酶。
3)向24孔板中每孔加入配置好的Ca-AM/PI工作液200μl，确认工作液完全浸没支架。
4)37℃培养箱内孵育30分钟后吸出染色液终止孵育。用PBS冲洗两次，后加入50-100μl PBS防止水分蒸发细胞死亡，尽快完成荧光显微镜观察。
5)分别于细胞种植于支架上第1、3、7天进行活死染色评估，使用共聚焦显微镜每组拍摄5张，计算死亡细胞数量占比。
细胞增殖实验(EdU染色)步骤如下：
1)光学显微镜下观察至细胞处于正常生长阶段。
2)EdU标记：以下实验均使用24孔超低吸附细胞培养板，按照产品说明书，将完全培养基与EdU溶液(试剂A)按1000：1的比例稀释制备工作用EdU培养基，其浓度为50μM。每孔加入150μl EdU培养基置入细胞培养箱内培养2小时，弃培养基后PBS清洗两次。
3)细胞固定、渗透：每孔中加入150μl细胞固定液(4％多聚甲醛)室温孵育30min后弃去；再加入150μl中和液(2mg/mL甘氨酸溶液)孵育5min后弃去；PBS清洗一遍后弃去；再加入渗透剂(0.5％TritonX-100的PBS)孵育10min；PBS清洗一遍后弃去。
4)细胞的Apollo染色、渗透：以下实验注意全程避光操作，每个培养孔加入300μl的1×Apollo染色反应液(按产品说明书配置，现用现配，注意避光，半小时内用完)，室温、避光下孵育30min后弃去；后加入渗透剂孵育2次，每次10min后弃去。
5)细胞核染色：以下实验注意全程避光操作，按说明书制备Hoechst染色工作液，每孔加入150μl工作液，避光、室温下孵育半小时后弃去；用PBS清洗2次，后加适量PBS淹没过材料及细胞以保湿，在共聚焦显微镜下观察。
分别于细胞种植于支架上第1、3、7天进行EdU染色，使用共聚焦显微镜每组拍摄5张照片，每个视野都包括支架交叉点。计算细胞总数量(total cellular score)及处于增殖期细胞数量(EdU阳性细胞)占比(proliferation rate)。
骨架蛋白(F-actin)染色步骤如下：
1)细胞固定：PBS轻柔地洗涤细胞支架2次(勿用摇床)，使用细胞固定液固定细胞支架约10分钟。
2)细胞渗透、染色：用细胞渗透剂洗涤3次，每次约5分钟后弃去，按产品说明书用含5％BSA和0.1％Triton X-100的PBS按照100:1的比例稀释F-actin-Tracker Green原液，即为染色工作液。24孔板中每孔加入染色工作液250μl，室温避光孵育半小时。用含0.1％Triton X-100的PBS洗3次，每次约5分钟后弃去。
3)细胞核染色：以下实验注意全程避光操作，按说明书制备Hoechst染色工作液，每孔加入150μl工作液，避光、室温下孵育半小时后弃去；用PBS清洗2次，后加适量PBS淹没过材料及细胞以保湿，在共聚焦显微镜下观察。
4)分别于细胞种植于支架上第2、5天进行骨架蛋白染色，于共聚焦显微镜下每组拍摄5张照片，每个视野都包括支架交叉点。使用ImageJ软件计算视野下荧光面积进行半定量分析。F-actin阳性面积比＝F-actin阳性面积/单个视野总面积×100％。
图7是不同支架在种植细胞后第1天的Ca-AM/PI染色结果，图8是不同支架在种植细胞后第3天的Ca-AM/PI染色结果，图9是不同支架在种植细胞后第7天的Ca-AM/PI染色结果。
图10是不同支架在种植细胞后第1天的EdU染色及EdU(+)细胞比例结果，图11是不同支架在种植细胞后第3天的EdU染色及EdU(+)细胞比例结果，图12是不同支架在种植细胞后第7天的EdU染色及EdU(+)细胞比例结果。
图13是不同支架在种植细胞后第2天的F-actin染色及其面积比例对比结果，图14是不同支架在种植细胞后第5天的F-actin染色及其面积比例对比结果。
最后，对支架进行动物体内试验，制备免疫抑制的大鼠跟腱缺损模型，将完成细胞种植的支架移植于跟腱缺损处，分别于术后第2、4周处死大鼠后取样，从跟腱力学强度及组织HE染色评估该组织工程支架治疗跟腱缺损的疗效。
免疫抑制大鼠模型的构建步骤如下：
1)免疫抑制大鼠模型的建立依据文献方案进行(张俊，Yong-SeongShin etal.2015,马盼盼，叶军et al.2018)，选用足龄SPF级大鼠，体质量为180±20g，动物房适应性饲养2d，以35mg/kg的剂量连续腹腔注射环磷酰胺(50mg加入生理盐水15ml)3d，CTX配药浓度为3mg/ml。
2)给药方案：以给药第一天计建模开始，前三天每天给药一次，之后每周以相同剂量腹腔注射1次，分别于第1、2、3、11、18、25天腹腔注射环磷酰胺，建模第5天行跟腱缺损移植手术。
制备跟腱缺损大鼠模型的步骤如下：
1)使用上述制作的免疫抑制大鼠，于首次注射CTX第5天行手术建立跟腱缺损模型。
2)麻醉前大鼠禁食4h，腹腔水合氯醛注射麻醉，配置浓度为4％质量体积比，给药浓度为0.7ml/100g。
3)剔除大鼠跟腱周围2cm毛发，消毒铺巾后，于左侧跟腱止点上3mm处作纵向切口，平行于跟腱长轴。首先在跟腱内侧分离出跖肌腱(如图15A)，将其切除，因其止点与跟腱相同，保留跖肌腱会影响实验结果。切除跖肌腱后，暴露并分离跟腱，在直视下切断跟腱，最终制备长约5mm的缺损(图15B)。后进行支架移植手术，移植手术完成后用8-0号线缝合皮肤(图15C)。
支架移植手术步骤如下：
1)将以上构建的跟腱缺损大鼠模型分为五组：空白对照组，单纯PCL支架组，PCL支架注射细胞组，PCL支架种植细胞组，5％F127/PCL支架种植细胞组，每组3只大鼠，使用左侧跟腱作为术侧。用于跟腱强度测试大鼠共15只，每组3只，用于组织切片大鼠共10只，每组两只。
2)空白对照组：于缺损处注入生理盐水300μl后使用8-0号不可吸收缝线缝合跟腱断端。
3)单纯PCL支架组：将已在酒精中浸泡半小时，紫外照射1小时的支架卷曲成卷，不可吸收缝线缝合于跟腱断端(如图16)。
4)PCL支架注射细胞组：将已在酒精中浸泡半小时、紫外照射1小时的支架卷曲成卷，缝合于跟腱断端，缝合皮肤后，使用CM-Dil进行标记细胞：使用D-PBS重悬细胞，每1ml细胞悬液(浓度为：1×107/ml)加入8μl CM-Dil染色储存液(50μg CM-Dil加50μl DMSO配成1mg/mL的储存溶液，-20℃避光保存)，最终染料的浓度为8μM。放置于37℃培养箱内5min，4℃冰箱内放置15min，后用D-PBS洗涤细胞两次，再重悬于适当浓度(约100×104/ml)。使用1ml针筒抽取50μl细胞重悬液(约10×104个细胞)注射于支架周围。
5)PCL和5％F127/PCL支架种植细胞组：取已体外种植C3H10T1/2细胞的支架，(需要计算细胞数量)，确保超过70％的支架孔隙已长满细胞，使用CM-Dil标记支架上细胞后，其余方法同上。
6)所有的大鼠术后健侧大腿予以注射青霉素4*104单位/只以预防感染。
上述支架移植手术成功后的大鼠的跟腱强度测试步骤如下：
1)分别于手术后两周、四周处死以上不同试验组的大鼠，取出术侧跟腱，对跟腱进行拉力强度测试。
2)跟腱标本保留小腿肌肉群及跟骨。使用砂纸固定小腿部分以增加接触摩擦力。使用螺母及骨水泥固定跟骨于水平位置。随后将两端固定在拉力测试仪上准备测试。
3)将拉力调校零，以5mm/min的拉伸速度开始进行拉力测试，测量并记录跟腱最大抗拉力(N)。
跟腱力学强度测试结果如图17所示，图17A、B分别是不同支架体内移植2周和4周时，各组大鼠跟腱最大抗拉强度测试结果。
上述支架移植手术成功后的大鼠的组织切片染色实验步骤如下：
1)分别于手术后两周、四周处死大鼠，取出术侧跟腱，对组织进行染色。
2)跟腱组织固定：取术侧(左侧)跟腱组织(从腓肠肌上部至整个足部)，清理周围皮肤软组织等，放入10％的***中固定48h。
3)清洗、脱水、透明、浸蜡：将固定完成的跟腱标本放入组织包埋盒，使用油性笔对标本进行标记。使用不同浓度乙醇进行梯度脱水，将跟腱组织分别放入70％、80％、90％、100％乙醇各1h，随后将跟腱组织放入无水正丁醇中8h，用于透明跟腱。最后将包埋盒放入第一个液体石蜡缸4h，随后将包埋盒放入第二个液体石蜡缸4h进行浸蜡。
4)包埋：将包埋机操作台及石蜡缸温度设置为70℃，将蜡嘴处温度设置为60℃。将包埋用模具放入石蜡缸中预热，预热完成后将跟腱组织取出放入模具中，调整跟腱标本位置使跟腱长轴与模具长轴平行，并且保持跟腱底面与模具完全接触。随后放入包埋机器中间的冻台上使之凝固，从而将跟腱黏附在模具上。最后将包埋盒置于模具上方并加少许石蜡液并冷却凝固，30min从模具上取下包有组织的石蜡块。
5)切片：先将蜡块固定于切片机的持蜡器上，随后将切片刀固定好。调整持蜡器的位置，使蜡块表面平行于切片刀。切片前检查蜡块及切片刀固定好。预切片时使用20μm切片厚度进行修片，待切至所需层面调整切片厚度为6μm后开始正式切片，注意匀速转动切片机以保证厚薄均匀。
6)摊片：将摊片机温度设为40℃。用毛笔和镊子各吸附朱切片的两端，均匀摊入水中，30s后用载玻片将切片捞出。
7)烤片：将载有组织的载玻片置于烤片机上，设置温度为60℃，烤片30min后放入切片盒内，为便于保存，可将切片置于37℃恒温箱中12h将其水分蒸发。
8)HE染色，光学显微镜下观察拍摄。
图18是第二周各实验组大鼠的肌腱HE染色结果，图19是第四周各实验组大鼠的肌腱HE染色结果。图18-19中，白色箭头指向毛细血管，黑色箭头指向形态规则的胶原纤维，PCL+cell为PCL注射细胞组，PCL P cell为PCL支架种植细胞组，F127 P cell为F127支架种植细胞组。
上述结果表明：
1、使用不同比例的F127能改善PCL的亲水性能，添加5％的F127使得材料水接触角从68°下降到24°，显著提高了其亲水性能。同时，从体外降解实验中可看出添加越多占比的F127，该支架的降解速率也提高最多，因此5％F127/PCL支架降解最快。另一方面，电镜下可见支架表面出现较多的蜂窝状孔隙，证实5％F127/PCL获得了最优异的微米级结构和纳米孔隙的组织工程支架，可用于进一步的体内外实验。
2、将间充质干细胞C3H10T1/2种植于支架上，5％F127占比的PCL支架上CaAM/PI染色结构显示细胞良好的存活率，EdU染色中显示加入F127使得黏附在支架上的细胞明显增多，相较于单纯PCL支架组差异具有统计学意义，且F-actin染色提示5％F127/PCL支架组F-actin(+)面积占比明显增加，且有统计学意义。
3、将C3H10T1/2细胞和支架移植到跟腱缺损大鼠体内，在HE染色结果中，组织工程支架使早期胶原纤维的排列较为有序，利于细胞外基质的沉积。外源成纤维细胞的加入为后期跟腱修复提供更为有利的条件。F127的加入使材料获得更优良的细胞黏附性能，2周时在细胞密度上就显现出明显优势。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种用于修复跟腱缺损的3D打印支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将Pluronic-F127与聚己内酯的酸性溶液混匀，得到打印溶液；所述打印溶液中，聚己内酯与Pluronic-F127的质量比为6:0.1-0.5，所述聚己内酯的分子量为50000-100000，所述Pluronic-F127的分子量为10000-20000；
(2)将所述打印溶液进行3D电流体喷射打印，得到所述3D打印支架；其中，打印溶液的挤压速度为1-3ul/min，施加至3D打印针头的电压的大小为2-3kV。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：在步骤(1)中，所述聚己内酯的酸性溶液的浓度为58-62％w/v。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：在步骤(1)中，所述打印溶液中，Pluronic-F127的浓度为1-5wt％。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：在步骤(1)中，所述聚己内酯的酸性溶液中使用的酸为醋酸。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：在步骤(2)中，打印过程中，3D打印针头流出的打印溶液呈泰勒锥形。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：在步骤(2)中，采用接收板接收3D打印支架，3D打印针头与接收板的间距为2-3mm。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：在步骤(2)中，3D打印支架中，多孔结构的直径为200-500μm。
8.一种权利要求1-7中任一项所述的制备方法所制备的用于修复跟腱缺损的3D打印支架，其特征在于，包括聚己内酯与Pluronic-F127，所述聚己内酯与Pluronic-F127的质量比为6:0.1-0.5，所述3D打印支架具有多层多孔结构。
9.根据权利要求8所述的用于修复跟腱缺损的3D打印支架，其特征在于：多孔结构的直径为200-500μm。
10.根据权利要求8所述的用于修复跟腱缺损的3D打印支架，其特征在于：所述3D打印支架上结合有多个间充质干细胞。
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