CN113308396B

CN113308396B - 一种植物乳杆菌及在制备新冠疫苗免疫增强剂中的应用

Info

Publication number: CN113308396B
Application number: CN202110542690.3A
Authority: CN
Inventors: ***; 徐建青; 任志鸿; 曹康丽
Original assignee: SHANGHAI PUBLIC HEALTH CLINICAL CENTER
Current assignee: SHANGHAI PUBLIC HEALTH CLINICAL CENTER
Priority date: 2021-05-18
Filing date: 2021-05-18
Publication date: 2023-03-21
Anticipated expiration: 2041-05-18
Also published as: CN113308396A; WO2022242446A1

Abstract

本发明公开了一种植物乳杆菌冠克株，所述菌株的保藏号为CGMCCNO.21720，保藏日期为2021年01月22日，保藏分类命名为植物乳杆菌冠克株(LACTOBACILLUS PLANTARUM GUANKE)，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。本发明提供的菌株发可显著提高新冠病毒血清中和抗体滴度，延长保护时间。本发明还提供了所述菌株在制备疫苗免疫增强剂中的应用。

Description

一种植物乳杆菌及在制备新冠疫苗免疫增强剂中的应用

技术领域

本发明涉及一种植物乳杆菌保藏菌株及应用，属于微生物和疫苗领域。

背景技术

新冠病毒传播力强、传播范围广、传染途径多，全球已经有222个国家、地区发生疫情，报告确诊病例数超过1.1亿，疫苗是控制新冠病毒传播的有力武器。全球在研新冠病毒疫苗超百种。评价新冠病毒自然感染或疫苗接种后获得的免疫保护效力，多用中和抗体作参考指标。部分新冠病毒感染者发病后第1-4天可产生中和抗体，第10-15天后抗体水平开始显著升高，第31-40天抗体水平达到峰值后维持稳定状态或略微下降。60％左右的感染者(包括确诊病例和无症状感染者)约发病2个月左右，中和抗体水平开始下降。新冠疫苗免疫后刺激产生的血清中和抗体能够在高位持续多久，公开发表的数据很少，尚无明确结论。但是，应该和新冠病毒感染者产生的保护力相似。普遍认为，需要增加免疫次数，才可延长免疫保护时间。

在西班牙开展的一项随机、双盲、安慰剂对照的人体试验表明，接种了三价流感疫苗的60名65-85岁的住院志愿者，在口服含有植物乳杆菌的脱脂奶粉3个月后，可使流感特异性IgA和IgG抗体水平升高。一项随机、双盲、安慰剂对照的包括50名志愿者的人体临床试验表明，口服发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum CECT5716)可增强抗流感疫苗的免疫应答，并可通过增强辅助性T细胞I型应答和病毒中和抗体，增强机体对感染的保护作用。有限的研究提示，某些益生菌菌株可能具有佐剂样功能，能够刺激增强某些细菌性疫苗，或者某些病毒疫苗，产生的特异性抗体水平，增强免疫保护作用。

本发明目的就是提供一种能够上调新冠等病毒疫苗及志贺菌等细菌疫苗接种者血清中和抗体滴度、增强免疫效果、延长保护时间的植物乳杆菌，解决目前新冠病毒疫苗接种者血清中和抗体迅速下降、保护力迅速下降的问题。

发明内容

基于上述发明目的，本发明首先提供了一种植物乳杆菌菌株，所述菌株的保藏号为CGMCC NO.21720，保藏日期为2021年01月22日，保藏分类命名为LactobacillusPlantarum(植物乳杆菌)GUANKE株，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

在一个优选的实施方案中，所述菌株的16S rRNA的序列如SEQ ID NO.1所示。

其次，本发明还提供了上述菌株在制备疫苗免疫增强剂中的应用。

在一个优选的实施方案中，所述疫苗包括乙肝疫苗、卡介苗、脊髓灰质炎减毒活疫苗、无细胞百白破联合疫苗、麻腮风联合疫苗、甲肝疫苗、脑膜炎球菌多糖疫苗、乙脑疫苗、麻疹疫苗、新型冠状病毒疫苗、流感疫苗、狂犬疫苗、艾滋疫苗、埃博拉疫苗、西尼罗河病毒疫苗、黄热病疫苗、轮状病毒疫苗、水痘疫苗、伤寒VI多糖疫苗、肺炎球菌疫苗、B型流感嗜血杆菌结合疫苗、细菌性痢疾疫苗或者HPV疫苗。

在一个更为优选的实施方案中，所述疫苗为新型冠状病毒疫苗。

更为优选地，所述新型冠状病毒疫苗为新型冠状病毒重组质粒疫苗、新型冠状病毒重组腺病毒载体疫苗或者新型冠状病毒细胞载体疫苗。

最后，本发明还提供了含有上述的菌株组合物，所述组合物含有制药学上可接受的载体。

在一个优选的实施方案中，所述组合物被制备为注射剂、胶囊、冻干粉、喷雾剂、悬液或者片剂。

在一个更为优选的实施方案中，所述组合物还含有靶向药物或者胸腺肽。

更为优选地，所述靶向药物包括靶向PD-1/PD-L1(Programmed cell deathprotein)、CTLA-4(Cytotoxic-T-lymphocyte-Antigen-4)、CD24、EGFR(Epidermal GrowthFactor Receptor)、VEGFR(Vascular Endothelial Growth Factor Receptor)、HER-2(Human Epidermal Growth Factor Receptor 2)、CLAUDIN18.2、glypican-3、FAP(Fibroblast Activation Protein)、PSMA(Prostate-Specific Membrane Antigen)、PSA(Prostate-Specific Antigen)、CEA(Carcinoembryonic Antigen)、AXL、CD20、CD19、BCMA(B-cell Maturation Antigen)、CD22、ROR1、CD24、MTOR(Mechanistic Target ofRapamycin)、ALK(Anaplastic Lymphoma Kinase)、C-KIT或者MUC1(mucin1)。

本发明是从健康人粪便中分离纯化得到具有免疫增强作用的益生菌植物乳酸杆菌。实验证明分离得到的植物乳酸杆菌对动物无害，且经动物实验确证具有增强接种新冠病毒疫苗个体血清特异性中和抗体的滴度。所述植物乳酸杆菌冠克能够有效维持接种后小鼠的血清中中和抗体水平滴度，显示出在制备新冠疫苗免疫增强制剂中的优异应用前景。

附图说明

图1-图6为植物乳杆菌GUANKE增强志贺菌疫苗免疫小鼠抗志贺菌特异性抗体的应用，实验所用小鼠为18-22g SPF级Balb/c小鼠雌雄各半，免疫原为志贺菌疫苗；其中，

图1：ELISA方法检测灌胃给予志贺菌疫苗后30天灌胃给予植物乳杆菌宿主粪便中抗I型痢疾志贺菌IgG结合抗体的滴度；横坐标为时间点，纵坐标为结合抗体的滴度，***表示p<0.001；

图2：ELISA方法检测灌胃给予志贺菌疫苗后30天灌胃给予植物乳杆菌宿主粪便中抗I型痢疾志贺菌IgA结合抗体的滴度；横坐标为时间点，纵坐标为结合抗体的滴度，***表示p<0.001；

图3：ELISA方法检测灌胃给予志贺菌疫苗后30天灌胃给予植物乳杆菌宿主粪便中抗I型痢疾志贺菌IgM结合抗体的滴度；横坐标为时间点，纵坐标为结合抗体的滴度；

图4：ELISA方法检测灌胃给予志贺菌疫苗后30天灌胃给予植物乳杆菌宿主血清中抗I型痢疾志贺菌IgG结合抗体的滴度；横坐标为时间点，纵坐标为结合抗体的滴度，**表示p<0.01，***表示p<0.001；

图5：ELISA方法检测灌胃给予志贺菌疫苗后30天灌胃给予植物乳杆菌宿主血清中抗I型痢疾志贺菌IgA结合抗体的滴度；横坐标为时间点，纵坐标为结合抗体的滴度；

图6：ELISA方法检测灌胃给予志贺菌疫苗后30天灌胃给予植物乳杆菌宿主血清中抗I型痢疾志贺菌IgM结合抗体的滴度；横坐标为时间点，纵坐标为结合抗体的滴度，**表示p<0.01，***表示p<0.001。

图7-图14为新冠疫苗免疫五个月后植物乳杆菌GUANKE灌胃对小鼠的抗体滴度的影响，实验所用小鼠为6-8周龄雌性ICR，免疫原为细胞载体疫苗K562-S；其中，

图7：ELISA方法检测免疫结束后，灌胃之前一系列时间点小鼠血清中IgG结合抗体的滴度；横坐标为时间点，纵坐标为结合抗体的滴度；

图8：ELISA方法检测灌胃结束后一系列时间点小鼠血清中IgG结合抗体的滴度；横坐标为时间点，纵坐标为结合抗体的滴度，*表示p<0.05，**表示p<0.01；

图9：ELISA方法检测灌胃结束后一系列时间点小鼠血清中IgG结合抗体的滴度；横坐标为时间点，纵坐标为该时间点结合抗体滴度与灌胃前结合抗体滴度的比值，**表示p<0.01；

图10：ELISA方法检测灌胃结束后一系列时间点小鼠血清中IgG结合抗体的滴度；横坐标为时间点，纵坐标为该时间点植物乳杆菌组结合抗体均值与PBS组结合抗体均值的比值；

图11：293T-ACE2细胞检测免疫结束后，灌胃之前一系列时间点小鼠血清中中和抗体的滴度；横坐标为时间点，纵坐标为中和抗体的滴度(ID50)；

图12：293T-ACE2细胞检测免疫结束后一系列时间点小鼠血清中中和抗体的滴度；横坐标为时间点，纵坐标为中和抗体的滴度(ID50)；

图13：293T-ACE2细胞检测免疫结束后一系列时间点小鼠血清中中和抗体的滴度；横坐标为时间点，纵坐标为该时间点中和抗体滴度与灌胃前中和抗体滴度的比值，**表示p<0.01；

图14：293T-ACE2细胞检测免疫结束后一系列时间点小鼠血清中中和抗体的滴度；横坐标为时间点，纵坐标为该时间点植物乳杆菌组中和抗体均值与PBS组中和抗体均值的比值。

图15-图20为新冠疫苗免疫后立刻植物乳杆菌GUANKE灌胃对小鼠的抗体滴度及T细胞应答的影响，实验所用小鼠为6-8周龄雌性ICR，免疫原为DNA-S及AdC68-RHAF；其中，

图15：ELISA方法检测灌胃结束后一系列时间点小鼠血清中IgG结合抗体的滴度；横坐标为时间点，纵坐标为结合抗体的滴度，*表示p<0.05，**表示p<0.01；

图16：ELISA方法检测灌胃结束后一系列时间点小鼠血清中IgG结合抗体的滴度；横坐标为时间点，纵坐标为该时间点结合抗体滴度与灌胃前结合抗体滴度的比值，*表示p<0.05；

图17：ELISA方法检测灌胃结束后一系列时间点小鼠血清中IgG结合抗体的滴度；横坐标为时间点，纵坐标为该时间点植物乳杆菌组结合抗体均值与PBS组结合抗体均值的比值；

图18：293T-ACE2细胞检测免疫结束后一系列时间点小鼠血清中中和抗体的滴度；横坐标为时间点，纵坐标为中和抗体的滴度(ID50)，**表示p<0.01；

图19：ELISPOT方法检测免疫结束后各个时间点小鼠脾细胞的T细胞应答；横坐标为时间点，纵坐标为每百万个脾细胞中分泌IFN-γ的细胞数量；*表示p<0.05；

图20：ELISPOT方法检测免疫结束后各个时间点小鼠肺灌洗液中的T细胞应答。横坐标为时间点，纵坐标为每百万个脾细胞中分泌IFN-γ的细胞数量；*表示p<0.05。

具体实施方式

下面结合具体实施案例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的保护范围构成任何限制。

实施例1植物乳杆菌GUANKE的分离、保藏和鉴定

1.植物乳杆菌GUANKE的分离

1)从保菌管中取出人粪便来源的粪便标本100μL，加入到预装900μL无菌PBS的EP管中，依次对样本进行梯度稀释，粪便标本浓度稀释至10^-6倍；

2)取不同稀释度的样品100μL涂布于MRS培养基上，放入培养箱中；

3)在37℃，0.5％CO2环境中培养48h；

4)取出培养皿，用无菌接种环挑取不同形态特征的菌落，转接至新的MRS固体培养基中进行纯化，37℃厌氧培养48h，连续转接3次，将纯化菌株在pH＝3.5的液体MRS中培养，筛选耐酸生长优良的菌株可用于实验或冷冻保藏。

2.菌种保藏

本实验室用含25％甘油的培养基作为保菌液进行菌种的冷冻保藏，方法如下：

1)将容量为2mL的保菌管经121℃，15min高压灭菌处理后以备使用；

2)细菌在固体培养基上连续转接3次后，向培养皿上加入1.5mL的无菌保菌液；

3)用L棒对培养皿进行刮涂，使菌落充分融入保菌液中

4)将菌液转移到保菌管中，混匀后于-80℃保藏。

3.菌落外观和菌体形态观察

乳杆菌属兼性厌氧菌，在厌氧条件下生长良好，菌落呈乳白色、表面光滑；在有氧条件下，乳杆菌亦可生长，大部分菌种菌落表面较粗糙，菌落颜色多为乳白色。镜下观察乳杆菌细胞形态为多形性，多呈细长杆状、较粗杆状、球杆状等，排列呈栅栏状、链状等。

4.细菌总DNA的提取

将单个菌落接种于BHI培养基上，37℃厌氧过夜培养，按照细菌基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN)说明书操作，提取DNA。

5.细菌通用引物16S rRNA PCR扩增

细菌16S rRNA鉴定：提取细菌基因组DNA，扩增乳杆菌通用引物16SrDNA PCR产物并测序，序列在NCBI上进行BLAST比对，进行初步鉴定。

本实验所用的细菌16S rRNA PCR扩增的引物以及PCR反应的条件如下：

通用引物16S rRNA PCR扩增条件：

95℃5min；95℃45s,54℃45s 72℃1.5min(32个循环)；72℃10min。

引物序列：

27F：5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'

1492R：5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3

实验全部用50μL的PCR体系。通过对待测乳杆菌通用引物16S rRNA PCR产物测序结果在NCBI上进行BLAST比对，鉴定。挑选具有代表性的样本PCR产物测序。经测序，获得一株16S rRNA如SEQ ID NO.1的菌株，基因组大小为3.3M，编码基因2000个。选择NCBI-16Sribosome RNA sequences(Bacteria and Archaea)数据库，利用BLASTn在线比对，完成对植物乳杆菌的初步鉴定。比对结果显示，该菌株的16S rRNA序列与植物乳杆菌4333的序列一致性分别为100％。该菌株的保藏信息为：菌株保藏号为CGMCC NO.21720，保藏日期为2021年01月22日，保藏分类命名为植物乳杆菌(Lactobacillus Plantarum GUANKE)，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101。

实施例2植物乳杆菌GUANKE增强志贺菌疫苗免疫小鼠抗志贺菌特异性抗体的应用

体重18-22g SPF级Balb/c小鼠雌雄各半，每只小鼠灌胃5×10⁸CFU表达I型痢疾志贺菌脂多糖抗原的志贺菌苗DOM3(林继胜，志贺氏菌基因工程-微生态疫苗初探。中国预防医学科学院硕士研究生论文，1998年)进行免疫，30天后灌胃给与NaHCO3溶液和5×10⁹CFU植物乳酸杆菌GUANKE进行免疫调节，对照组给与0.4mL 0.25mol/L NaHCO₃溶液。每只小鼠尾静脉取血50μL稀释20倍2,000rpm离心10min收获血清。粪便10倍稀释后匀浆液12,000rpm离心15min用于多种志贺菌特异性抗体检测。抗体检测方法如下：

(1)用每孔100μL浓度为1×10⁸CFU/mL的S.dysenteriae I 112菌液包被96孔板4℃过夜；

(2)用PBST洗三遍后，每孔加200μL封闭液(PBST中含3％脱脂奶)37℃封闭1h后洗三遍；

(3)每孔加入100μL稀释的血清或粪便匀浆液，37℃孵育1h；

(4)洗三遍后，结合辣根过氧化物酶的羊-抗小鼠IgA,IgG,IgM(Sigma chemicalco.,St.Louis,Mo)稀释1∶16,000倍，每孔加100μL，37℃孵育1h；

(5)洗三次后，每孔加入含0.02％H₂O₂的邻苯二胺(o-phenylenediamine)溶液(0.4mg/ml柠檬酸盐缓冲液pH 5.0)100μL，37℃孵育20min；

(6)每孔加用50μL的2mol/L H₂SO₄终止反应，BioTekthe酶标仪读取492nm的吸光度值表示不同样本之间抗体水平的相对高低。

结果显示：小鼠免疫I型痢疾志贺菌疫苗3天后在粪便中可检测出抗I型痢疾志贺菌的特异性IgG、IgA、IgM并持续增高至14天达到高峰，所有免疫小鼠的特异性抗体水平均显著高于未免疫空白组(p<0.01)。之后三种抗体水平逐渐降低，30天接近免疫前水平。免疫后30天，分别经口给与植物乳杆菌GUANKE和PBS，一周后益生菌组小鼠粪便中抗I型痢疾志贺菌的IgG(图1)和IgA(图2)达到高峰，IgG两周后、IgA四周后降低至乳杆菌处理前的抗体水平。IgM水平无显著变化(图3)。

小鼠免疫I型痢疾志贺菌疫苗后3天至30天血清中仅可检测出很低水平的抗志贺菌的特异性IgG、IgA、IgM，所有免疫小鼠血清中的三种特异性抗体水平与未免疫空白组均无显著差异。免疫后30天，分别经口给与植物乳杆菌GUANKE和PBS，益生菌组小鼠血清中抗I型痢疾志贺菌的IgG在益生菌处理一周和两周显著高于PBS处理组，两周达到高峰，四周后降低至与未处理组无显著差异(图4)。血清IgM在益生菌处理三天、一周和两周均显著高于PBS处理组，处理一周达到高峰后逐渐降低，四周后降低至与未处理组无显著差异(图6)。血清IgA在菌苗免疫和益生菌免疫调节过程中无显著变化(图5)。

实施例3新冠疫苗免疫五个月后植物乳杆菌GUANKE灌胃对小鼠的抗体滴度的影响

实验中涉及到的实验动物、免疫方式、免疫原、假病毒及检测方法如下：

1.实验动物：

6-8周龄雌性ICR小鼠，购自北京唯尚立拓科技有限公司。

2.免疫方式：

对小鼠左、右后肢分别进行肌肉注射，具体剂量见实施例。

3.免疫原的选择：细胞载体疫苗：K562-S作为骨髓红细胞系细胞株，不表达移植排斥抗原(MHC I类与II类)，也不表达血型抗原，因此人体对于这样的细胞产品具有很好的耐受性。我们以K562细胞为载体，在其表面表达并展示丰富的新冠棘突蛋白(Spike,S)免疫原(Genebank:NC_045512.2)，从而构建成为K562-S新冠疫苗。

4.免疫剂量：免疫原的制备参见实施例1，在实施例中所采用的免疫原免疫剂量如下：

细胞载体疫苗：K562-S(溶于无菌PBS中)与铝佐剂(Aluminium，InvivoGen，货号5200)按照体积比1:1混合后进行免疫，1E6 cells/只小鼠，100μL；

5.免疫间隔：具体免疫间隔见下文描述。

6.SARS-CoV2包膜假病毒(Pseudovirus)包装

(1)转染前一天准备293T细胞，用于包装质粒的转染与表达。用DMEM完全培养基将细胞稀释至5×10⁶个/mL细胞，取1mL稀释好的细胞，铺在10cm的皿中，37℃，5％CO₂，培养过夜；

(2)吸取SARS-CoV2膜蛋白质粒pcDNA3.1-S 4μg和pNL4-3Δenv骨架质粒8μg(NIHAIDS Reagent Program,3418)加入500μL双无(无血清、无双抗，双抗为青链霉素混合液)的DMEM中，室温孵育5min；

(3)用双无DMEM将24μL TurboFect(Thermo Fisher Scientific)稀释，终体积为500μL/样品，室温孵育5min；

(4)将(2)与(3)两者混匀，1000μL/样品终体积，室温孵育20min，孵育结束后加到10cm培养皿的293T细胞中。6h后更换新鲜的15mL完全培养基，继续在细胞培养箱中培养48h；

(5)培养结束后，收集10cm皿的细胞培养上清，于15mL离心管里，然后4000g，4℃，离心10min，用0.45μm的滤器过滤到新的15mL离心管中，冻存于-80℃保存，滴定后备用。

7.构建稳定表达hACE2受体的293T细胞

(1)人工合成人源ACE2(hACE2)序列(Genebank#NCBI_NP_001358344.1)，序列5’端带有Age1酶切位点，3’端带有Xba1酶切位点，合成片段与载体质粒pHAGE-MCS-puro使用Age1酶切(Thermo Scientific公司，货号FD1464)与Xba1酶切(Thermo Scientific公司，FD0685)，并通过凝胶电泳后切胶回收，采用Sanprep柱式DNA胶回收试剂盒(Promega公司，货号A9282)回收酶切片段。

(2)基因回收产物与酶切线性化载体用T4 DNA连接酶的方法连接(ThermoScientific公司，货号2011A)：将连接产物转化至大肠杆菌E.coli Stable，在含氨苄霉素的培养板上过夜生长。第2天，随机挑取单菌落进行测序，突变位点校正，验证全部序列正确后，成功克隆出hACE2基因的慢病毒表达质粒(pHAGE-hACE2-puro)。

(3)取10cm皿，在每个皿中接种约5×10⁶个293T细胞，保证第二天转染时使细胞密度达90％为宜；将pHAGE-hACE2-puro、慢病毒包装质粒psPAX以及VSVG三种质粒，按照质量比1：2：1的比例转染293T细胞。

(4)37℃，5％的孵箱培养48h左右，具体时间根据细胞情况而定，收集细胞上清。将收集的细胞上清用0.45μm的滤器进行过滤，再用PEG 8000进行浓缩，即可得到较为纯化的hACE2慢病毒。

(5)提前一天铺5×10⁵个的293T细胞于12孔板的一个孔内，次日向铺好的细胞中加入步骤2中浓缩的病毒500μL，1000g，离心2h。

(6)离心感染结束后，继续在37℃，5％的孵箱培养12h左右，将培养基换成添加1μg/mL嘌呤霉素(puro)的细胞培养基培养，最后能够存活的细胞便是整合有hACE2基因的293T细胞，并通过流式分选筛选出稳定表达hACE2的293T细胞(能与S蛋白结合)。

8.检测方法：

(1)采血：通过眼眶静脉采血的方法采集小鼠外周全血，收集于1.5mL EP管中，室温静置使其自然凝血，凝固后的小鼠血清于7000g，离心15min。将小鼠血清转移至新的1.5mL EP管中。实验前需要将样品在56℃灭活30min，来破坏血清内的补体活性。灭活前短暂离心，避免管壁和瓶盖上的样品残存。水浴液面要没过样品液面，但不能超过瓶盖。

(2)ELSIA检测结合抗体

1)用4℃预冷的ELISA包被液稀释检测的抗原蛋白(S1，购自北京义翘神州科技有限公司；RBD，购自上海近岸生物科技有限公司)，至终浓度为1μg/mL。在ELISA板的每孔加入100μL包被抗原溶液，4℃过夜；

2)第二天，取出ELISA板，弃掉包被液，用0.05％的PBST缓冲液洗板3次，每次220μL；

3)洗涤完毕后，在吸水纸上拍干，每孔用200μL ELISA封闭液(0.5％脱脂奶粉，PBST溶解)进行封闭，室温封闭2h；

4)封闭结束后，用0.05％的PBST洗板3次，每次220μL；

5)对于血清或者血浆，用ELISA样品稀释液(0.5％脱脂奶粉，PBST溶解)稀释，从1:100起始，进行2倍比稀释。用未免疫的小鼠血清设置为阴性对照。设置空白孔，只加样品稀释液，每个样品需做2个复孔，每孔终体积为100μL，室温孵育3h；

6)样品孵育结束后，继续用PBST洗板5次，每次220μL；

7)用ELISA封闭液(0.5％脱脂奶粉，PBST溶解)稀释相对应比例的二抗(山羊抗鼠，购自北京中杉金桥生物技术有限公司，货号ZB-2305)，每孔加入100μL，室温孵育1-1.5h；

8)二抗孵育结束后，用0.05％的PBST洗板5次，每次220μL；

9)取一对金银片OPD底物，溶解于20mL去离子水中，随后每孔加入100μL，避光反应5min；

10)显色结束后，用50μL 2nM H₂SO₄进行终止，在酶标仪上读取OD₄₉₂-OD₆₃₀值；

11)以最后一个稀释度OD₄₉₂大于2倍的(negative mean+SD)值对应的血清稀释比的倒数作为抗体滴度。

9.293T-ACE2细胞检测中和抗体：

(1)取96孔透明底黑板进行中和实验，第一列设置细胞对照(CC)(150μL)，第二列设置病毒对照(VC)(100μL)，其他均为样品孔，对血清样品进行倍比稀释，最终孔中体积为100μL。

(2)除细胞对照组外，每孔加50μL SARS-CoV-2假病毒稀释液，使每孔最终含假病毒为200TCID₅₀。

(3)轻轻震荡混匀，将上述96孔底黑板置于细胞培养箱中，37℃，5％CO₂孵育1h。

(4)当孵育时间至20min时，开始准备293T-hACE2靶细胞，并用完全培养基将细胞稀释至10⁵个细胞/mL。

(5)当孵育时间至1h，向96孔透明底黑板中每孔加100μL靶细胞，使每孔细胞为10⁴个。

(6)前后左右轻轻晃动96孔透明底黑板，使孔中的细胞均匀分散，再将板子放入细胞培养箱中，37℃，5％CO₂培养48h。

(7)培养48h后，从细胞培养箱中取出96孔透明底黑板，吸掉孔中上清，每孔加入100μL PBS清洗一遍，吸去PBS，每孔加入50μL 1×的裂解缓冲液(购自Promega公司Cat#E153A)，室温在水平摇床上孵育30min使细胞充***解；

(8)加30μL荧光素酶的底物(购自Promega公司，Cat#E1501)于96孔黑板中，用仪器

96微孔板发光-检测仪检测荧光素酶活性。

(9)导出荧光素读值，计算中和抑制率，结合中和抑制率结果，利用GraphpadPrism 5.0软件计算ID₅₀。

在实施例2中，我们发现针对细菌疫苗，给予植物乳杆菌GUANKE能够提高小鼠粪便及血清中的结合抗体滴度。因此我们想要验证在病毒疫苗中是否有同样的效果。我们采用6-8周雌性ICR小鼠用新冠疫苗K562-S疫苗肌肉注射免疫，4周后加强免疫一次。免疫23周后，即五个月后，饮水中给与1g/L的氨苄预处理小鼠的肠道菌群定植抗性，5天后换正常饮用水，每日经口灌胃给与5×10⁹CFU植物乳杆菌GUANKE，连续灌胃三天进行免疫调节。植物乳杆菌GUANKE灌胃前及灌胃后1、2、3、6周采集眼眶静脉血。免疫30周后，重复氨苄预处理和植物乳杆菌GUANKE的免疫调节，免疫调节后1、2、3、4周采集眼眶静脉血检测抗体应答。结果显示：免疫后小鼠的血清中的结合抗体和中和抗体在第2周达到峰值，随后缓慢下降(图7、11)。两次干预后各组小鼠血清结合抗体及中和抗体的滴度如图8、12，植物乳杆菌二次灌胃后结合抗体有明显提升，中和抗体也有上升趋势，而PBS组则缓慢下降中。同时比较灌胃后各个时间点的抗体滴度与灌胃前本底低毒的比值我们发现，植物乳杆菌灌胃后，结合抗体及中和抗体的提升相比于PBS有显著性(图9、13)。同时，我们通过比较每个点植物酸杆菌灌胃组抗体滴度与PBS灌胃组抗体滴度的比值，我们发现，和灌胃前比较，结合抗体及中和抗体的比值都在上升，提示植物乳杆菌冠克株摄入能有效阻止新冠病毒抗体下降，甚至能够提高抗体水平，对新冠感染的防治有重要意义(图10、14)。

实施例4新冠疫苗免疫后立即植物乳杆菌GUANKE灌胃对小鼠的抗体滴度及T细胞应答的影响

1.实验动物：6-8周龄雌性ICR小鼠，购自北京唯尚立拓科技有限公司。

2.免疫方式：对小鼠左、右后肢分别进行肌肉注射；或进行滴鼻。具体剂量见实施例。

3.免疫原的选择：重组质粒疫苗(DNA)：pcDNA3.1-S DNA疫苗不像减毒活疫苗会产生回复突变，也比灭活疫苗安全；使用灵活，可作用于肌肉(骨骼肌)、皮下或粘膜组织；常温下稳定、可以长期保持活性，便于储存、运输。因此我们采用传统的表达载体pcDNA3.1,在其多克隆位点***新冠棘突蛋白(Spike,S)免疫原(Genebank:NC_045512.2)，从而构建成为pcDNA3.1-S新冠疫苗。

重组腺病毒载体疫苗：AdC68-RHAF黑猩猩腺病毒载体AdC68是一种线性DNA病毒，基因组大小26-45kb，相比于其他腺病毒(如Ad5和Ad26)而言，其在人群中预存免疫低，会避免载体自身带来的疫苗效果削弱，同时黑猩猩腺病毒的Hexon与凝血因子X结合后不稳定，不在肝脏富集，更为安全。我们以黑猩猩腺病毒AdC68为载体，携带含有新冠病毒受体结合域(RBD)的免疫原RHAF(Genebank:NC_045512.2，Genebank:AGI60292.1，Genebank:M97164.1)，构成了AdC68-RHAF新冠疫苗。

4.免疫剂量：免疫原的制备参见实施例1。

在实施例中所采用的免疫原免疫剂量如下：

重组质粒疫苗(DNA)：100μg/只小鼠，100μL，溶于无菌生理盐水中；

重组腺病毒载体疫苗：5E10 vp/只小鼠，100μL(肌肉注射)；5E10 vp/只小鼠，30μL(滴鼻)。

5.免疫间隔：具体免疫间隔见下文。

ELISPOT检测T细胞应答：

1.小鼠脾脏单细胞分离：

1)将小鼠仰卧，剖开右侧腹部皮肤，打开腹膜，取下小鼠脾脏，放入加有5mL完全RPIM1640培养基的小平皿中；

2)用无菌镊子将脾脏用无菌纱布包裹起来，用小弯镊夹起纱布，轻轻磨碎脾脏，可使脾细胞全部释放到培养基中；

3)随后用5mL移液器将脾细胞悬液经纱布吸到无菌的15mL离心管中，800g，离心5min；

4)弃掉离心后的上清，轻敲15mL离心管重悬细胞沉淀，每个离心管中加入3mL红细胞裂解液裂解红细胞，颠倒混匀后室温静置5min，使红细胞充***解又不会损伤脾细胞；

5)裂红结束后，用5mLRPIM1640培养基终止裂红。800g，离心5min；

6)弃掉离心后的上清，用5mL RPIM1640培养基洗1次，800g离心5min；

7)弃离心后上清，脾细胞放于冻存液(90％FBS和10％DMSO)中进行冻存备用。

2.ELISpot实验操作按照Mouse IFN-γ/Monkey IFN-γ说明书进行。

1)用纯化IFN-γ抗体包被试剂盒(购自BD，货号551083)提供的Millipore板，比例1：250，4℃过夜包被；

2)甩掉板中的包被抗体溶液，用200μL RPMI 1640完全培养基洗板一遍，随后用200μL RPMI 1640完全培养基封闭液封闭Millipore板，室温孵育2h；

3)弃掉孔板中的封闭液，根据不同的实验设计，在Millipore板中加入刺激肽库(苏州强耀生物科技有限公司合成单肽，每条单肽15个氨基酸，覆盖RBD序列，共65条单肽，每个肽库5条单肽，共13个肽库，50μL/孔，每条肽的浓度为5μg/mL。在阴性对照孔加入50μLRPMI 1640完全培养基；阳性对照孔中加入50μL佛波醇酯类多克隆刺激剂(PMA，购自Sigma，货号FXP012)(终浓度100ng/mL)和离子霉素(Ionomycin，终浓度2μg/mL)的RPMI1640完全培养基；

4)对小鼠脾细胞进行计数，将细胞调整为4×10⁶个细胞/mL，每孔加入50μL细胞，最终使每孔的细胞数为2×10⁵个细胞。将Millipore板放入湿盒，在37℃5％CO₂培养箱中孵育20-22h，期间切勿摇动板子，以免造成细胞的偏移；

5)培养孵育结束后，从培养箱中取出Millipore板，将板中的液体弃掉，用预冷的去离子水洗两遍，每次220μL，每次清洗孵育3min；

6)用0.05％的PBST(PBS+0.05％Tween-20)洗板3次，每次200μL；

7)用10％FBS的PBS抗体稀释液稀释生物素化检测抗体(Biotinylated Detectionantibody，比例1：200)，每孔加入100μL，室温孵育2h；

8)孵育结束后，再用0.05％的PBST洗板3次，每次220μL；

9)将链霉亲和素-HRP偶联抗体用抗体稀释液进行稀释(比例1：100)，每孔加入100μL，室温孵育1h；

10)孵育结束后，用0.05％的PBST洗板4次，每次220μL；

11)再用PBS清洗板子2次，每次220μL；

12)准备底物溶液(1mL的底物缓冲液加1滴底物溶液)，每孔加入100μL底物溶液。反应5-60min，孵育时间根据斑点形成的情况而定。

13)用去离子水冲洗终止反应，室温晾干后进行计数；

14)利用ChampSpot III型酶联斑点图像分析仪进行斑点形成细胞SFC(spotforming cell，SFC)的计数以及QC。

在实施例3中，我们发现在免疫结束后半年，给予小鼠植物乳杆菌GUANKE，能够明显减弱结合抗体及中和抗体的下降，甚至能够再次提升抗体水平。因此，我们想要观察免疫结束后立即给予小鼠植物乳杆菌GUANKE灌胃，对于疫苗引起的T细胞应答和抗体水平是否有提升。我们采用6-8周龄雌性ICR小鼠，新冠疫苗DNA-S疫苗肌肉注射进行初次免疫，12周后采用新冠疫苗AdC68-RHAF肌肉注射加滴鼻加强免疫一次。同实施例3给与氨苄预处理小鼠和植物乳杆菌GUANKE进行免疫调节。益生菌灌胃后第3、7、14天处死小鼠，采集血、肺灌洗液细胞及脾细胞，其中7、14天血清进行结合抗体及中和抗体的检测(检测方法同实施例3)，3、7、14天灌洗液细胞及脾细胞进行T细胞应答的检测。结果显示：植物乳杆菌灌胃的小鼠在7天时结合抗体水平明显高于PBS灌胃组，中和抗体趋势一致(图15-18)，这说明植物乳杆菌能够对抗体有一定水平的提高；同时我们检测T细胞应答发现，植物乳杆菌灌胃组脾细胞中的T细胞应答维持到14天都几乎不下降，而PBS组则在7天就有明显下降，植物乳杆菌灌胃组脾细胞T细胞应答在第7天(均值+SD vs均值+SD，p<0.05)和第14天(均值+SD，p<0.05)均显著高于PBS组(图19)；同时肺灌洗液细胞的T细胞应答，植物乳杆菌灌胃组也能够维持7天不下降，而PBS组则在14天几乎降为0，植物乳杆菌灌胃组14天的数值与PBS7天的数值接近(图20),植物乳杆菌灌胃组肺灌洗液细胞T细胞应答在第7天(均值+SD vs均值+SD，p<0.05)和第14天(均值+SD，p<0.05)均显著高于PBS组。该实验数据显示，经口给与植物乳杆菌GUANKE，可提高抗新冠病毒的结合抗体与中和抗体滴度、以及抗新冠的特异性T细胞应答，延长抗体与T细胞保护时间，对新冠感染的防治有重要意义。

序列表

<110> 上海市公共卫生临床中心

<120> 一种植物乳杆菌及在制备新冠疫苗免疫增强剂中的应用

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1444

<212> DNA

<213> Lactobacillus Plantarum

<400> 1

ctatacatgc agtcgaacga actctggtat tgattggtgc ttgcatcatg atttacattt 60

gagtgagtgg cgaactggtg agtaacacgt gggaaacctg cccagaagcg ggggataaca 120

cctggaaaca gatgctaata ccgcataaca acttggaccg catggtccga gtttgaaaga 180

tggcttcggc tatcactttt ggatggtccc gcggcgtatt agctagatgg tggggtaacg 240

gctcaccatg gcaatgatac gtagccgacc tgagagggta atcggccaca ttgggactga 300

gacacggccc aaactcctac gggaggcagc agtagggaat cttccacaat ggacgaaagt 360

ctgatggagc aacgccgcgt gagtgaagaa gggtttcggc tcgtaaaact ctgttgttaa 420

agaagaacat atctgagagt aactgttcag gtattgacgg tatttaacca gaaagccacg 480

gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata cgtaggtggc aagcgttgtc cggatttatt 540

gggcgtaaag cgagcgcagg cggtttttta agtctgatgt gaaagccttc ggctcaaccg 600

aagaagtgca tcggaaactg ggaaacttga gtgcagaaga ggacagtgga actccatgtg 660

tagcggtgaa atgcgtagat atatggaaga acaccagtgg cgaaggcggc tgtctggtct 720

gtaactgacg ctgaggctcg aaagtatggg tagcaaacag gattagatac cctggtagtc 780

cataccgtaa acgatgaatg ctaagtgttg gagggtttcc gcccttcagt gctgcagcta 840

acgcattaag cattccgcct ggggagtacg gccgcaaggc tgaaactcaa aggaattgac 900

gggggcccgc acaagcggtg gagcatgtgg tttaattcga agctacgcga agaaccttac 960

caggtcttga catactatgc aaatctaaga gattagacgt tcccttcggg gacatggata 1020

caggtggtgc atggttgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg ttgggttaag tcccgcaacg 1080

agcgcaaccc ttattatcag ttgccagcat taagttgggc actctggtga gactgccggt 1140

gacaaaccgg aggaaggtgg ggatgacgtc aaatcatcat gccccttatg acctgggcta 1200

cacacgtgct acaatggatg gtacaacgag ttgcgaactc gcgagagtaa gctaatctct 1260

taaagccatt ctcagttcgg attgtaggct gcaactcgcc tacatgaagt cggaatcgct 1320

agtaatcgcg gatcagcatg ccgcggtgaa tacgttcccg ggccttgtac acaccgcccg 1380

tcacaccatg agagtttgta acacccaaag tcggtggggt aacctttagg aaccagccgc 1440

taaa 1444

Claims

1.一种植物乳杆菌菌株在制备新型冠状病毒疫苗免疫增强剂中的应用，其特征在于，所述菌株的保藏号为CGMCC NO.21720，保藏日期为2021年01月25日，保藏分类命名为Lactobacillus Plantarum，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述新型冠状病毒疫苗为新型冠状病毒重组质粒疫苗。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述新型冠状病毒疫苗为新型冠状病毒重组腺病毒载体疫苗。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述新型冠状病毒疫苗为新型冠状病毒细胞载体疫苗。